DE69712910T2

DE69712910T2 - Mikrosensor zur qualitativen und quantitativen Bestimmung einer Substanz in einer Umgebung

Info

Publication number: DE69712910T2
Application number: DE69712910T
Authority: DE
Inventors: Thomas Kjaer; Hauer Larsen; Peter Revsbech
Original assignee: Unisense AS
Current assignee: Unisense AS
Priority date: 1996-11-12
Filing date: 1997-11-10
Publication date: 2002-11-21
Anticipated expiration: 2017-11-11
Also published as: JP2001505662A; EP0941305A1; DE69712910D1; AU4940697A; EP0941305B1; DK126596A; DK172855B1; WO1998021309A1; US6225108B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Mikrosensor zur Messung der Konzentration eines Primärmediums in einer Umgebung, z. B. einer Flüssigkeit, eines Gases oder einer Matrix, wobei der Mikrosensor einen Transducer und eine Reaktionskammer mit einer Öffnung umfasst. Dieser Mikrosensor ist von einem Typ, welcher ein Gehäuse oder ein Behältnis um den Transducer herum aufweist. Der Mikrosensor ist mit einer Öffnung versehen und die Spitze des Transducers ist in einem gewissen Abstand zu dieser Öffnung angeordnet. Zwischen der Öffnung und der Spitze ist eine Reaktionskammer gebildet. Ferner betrifft die Erfindung die Anwendung eines derartigen Mikrosensors.
Erfindungsgemäß ist der Mikrosensor primär zur Messung der Vorhandenseins und der Konzentration von Nitrat, NO&sub3;&supmin;, vorgesehen. Nachfolgend wird Nitrat auch als das Primärmedium bezeichnet, dessen Vorhandensein und Konzentration bestimmt werden soll. Diese Bestimmung ist von Interesse im Zusammenhang mit der Analyse der Konversion von Nitrat bei der landwirtschaftlichen Kultivierung. Außerdem ist die Nitratkonzentration von Interesse bei der Bestimmung des Verschmutzungsgrades von Oberflächenwasser, Grundwasser und Abwasser. Der erfindungsgemäße Mikrosensor kann jedoch auch dazu verwendet werden, das Vorhandensein und die Konzentration anderer Substanzen, wie z. B. Sulfat, SO&sub4;²&supmin;, zu messen.
In "Applied and Environmental Microbiology", April 1996, Seiten 1248- 1251 ist ein Mikrosensor beschrieben, der das Vorhandensein und die Konzentration von Nitrat messen kann. Hier ist das Primärmedium Nitrat und die Messung der Konzentration von diesem wird indirekt durchgeführt, indem eine Konzentration eines Sekundärmediums, Distickstoffoxid, N&sub2;O, gemessen wird. Distickstoffoxid bildet sich als Sekundärmedium nach der Reduktion des Primärmediums Nitrat, NO&sub3;&supmin;. Die Reduktion wird aufgrund denitrifizierender Bakterien durchgeführt.
Der bekannte Mikrosensor umfasst einen Transducer mit einer Spitze. Ein Gehäuse oder eine Einhausung umgibt den Transducer und weist eine Öffnung auf. Zwischen der Öffnung des Behälters und der Spitze des Transducers ist eine Reaktionskammer mit Bakterien angeordnet. Die Bakterien sind in der Reaktionskammer mit Hilfe einer Alignat-Matrix immobilisiert. Das Gehäuse ist am Transducer mit Hilfe von Wachs befestigt, welches zwischen dem Transducer und dem Behälter angeordnet ist.
Dieser bekannte Mikrosensor weist einige Nachteile auf. Messungen mit dem bekannten Mikrosensor können nur in Umgebungen durchgeführt werden, die Nährstoffe für die Bakterien aufweisen, da ansonsten deren Aktivität aufhört. Die Zufuhr von Nährstoffen zu den Bakterien in Umgebungen ohne gelöste Nährstoffe basiert in dieser Druckschrift des Standes der Technik auf Körnchen von Glykogen oder Polyhydroxybutyrat innerhalb der verwendeten Bakterien. Diese Körnchen sind jedoch ohne Zugabe eines Elektronendonors nach ungefähr 1 bis 2 Stunden verbraucht.
Der Messbereich und die Responszeit des bekannten Sensors sind linear proportional. Deshalb kann dieser Sensor für Messungen in Umgebungen mit einer 500 uM übersteigenden NO&sub3;&supmin;-Konzentration nicht verwendet werden. Ferner ist es in keiner Weise möglich, das Verhältnis zwischen der NO&sub3;&supmin;-Konzentration in der Messumgebung und der N&sub2;O-Konzentration beim Transducer zu vergrößern. Folglich ist es nicht möglich, einen sich über 5 bis 500 uM NO&sub3;&supmin; hinaus erstreckenden Messbereich des Mikrosensors zu erhalten. Der bekannte Mikrosensor ist daher zur Messung des Vorhandenseins und der Konzentration z. B. von Nitrat in natürlichen Umgebungen nicht brauchbar.
Andere bekannte Sensoren sind die auf Ionentauscher basierenden Sensoren, die zur Messung von Nitrat in einer Flüssigkeit verwendet werden. Dieser Sensortyp weist jedoch einen wesentlichen Nachteil auf. Seine Sensitivität hinsichtlich einer Wechselwirkung mit anderen Ionen, wie z. B. Chlorid, Cl&supmin;, und Hydrogencarbonat, HCO&sub3;&supmin;, trägt zu Fehlern in mit diesem Sensortyp durchgeführten Messungen bei. Dieser bekannte Sensor ist daher für Messungen, z. B. in Meerwasser und alkalischem Wasser, wie z. B. in Grundwasser oder Oberflächenwasser, nicht brauchbar. Ferner bedeutet die Sensitivität im Blick auf eine Wechselwirkung mit HCO&sub3;&supmin;, dass die auf Ionentauschern basierenden Sensoren unter einer verstärkten Wechselwirkung in biologisch sehr aktiven Umgebungen mit einer extensiven Erzeugung von HCO&sub3;&supmin; leiden, wie z. B. in Kläranlagen.
Aus der japanischen Patentanmeldung JP 60117143 ist ein Sensordesign bekannt, bei dem Enzyme von einem separaten externen Reservoir durch eine Röhre hin zu einer immobilisierten Enzym-Membran zugeführt werden. Auf diese Weise bleiben die Enzyme aktiv und verlängern daher den Aktivitätszeitraum des Sensors. Das externe Reservoir und die vorstehende Röhre machen diesen Sensor jedoch größer und empfindlicher hinsichtlich mechanischer Einflüsse verglichen mit dem erfinderischen Design mit nur einem einzigen äußeren Gehäuse. Ferner ist dieser Sensor keine in sich abgeschlossene Einheit. Die Enzymversorgung erfolgt von einer externen Quelle mit dem Zweck der Wiederauffüllung.
Ein anderer auf Enzymen basierender Sensor umfasst einen optischen Biosensor zur Detektion von Nitrat, welcher in der WO 95/33068 beschrieben ist und bei dem das Nitrat biochemisch bei Vorhandensein einer Nitrat- Reduktase und eines Cofaktors reduziert wird, welcher seinerseits durch die Reduktion von Nitrat oxidiert wird. Die Oxidation des Cofaktors, der NADPH sein kann, ist mit einer Alkoholdehydrogenase gekoppelt, die ein Substrat für ein Luziferase-Enzym bildet, was zur Erzeugung von Photonen führt. Der Biosensor umfasst einen Photodetektor, der den Lichtausstoß misst. Die Enzymzusammensetzung wird auf der Oberfläche des optischen Transducers immobilisiert.
Andere bekannte Sensoren setzten Bakterien zur Konversion von z. B. Nitrat zu Ammoniak ein. In "Analytical Chemistry" 51 (8): 1122-1125 (R. K. Kobos et al., 1979) ist die Verwendung des Bakteriums Azotobacter vinelandii zusammen mit einer Sensorelektrode für Ammoniakgas beschrieben. Nitrat wird zu Ammoniak über einen zweistufigen Prozess reduziert, welcher die Enzyme Nitrat und Nitrit-Reduktase, die in den Bakterienzellen enthalten ist, einsetzt. Die Bakterien werden auf die gasdurchlässige Membran der Ammoniak-Elektrode verteilt und mittels einer Dialyse- Membran am Ort gehalten. Solange sie nicht gebraucht wird, muss die Bakterien-Elektrode in einem geeigneten Wachstumsmedium gelagert sein, damit die Bakterien mit Nährstoffen versorgt sind. Es gibt keine Möglichkeit, die Bakterien während der Benutzung des Sensors mit Nährstoffen zu versorgen.
In der US 5,104,804 ist eine Einrichtung offenbart, die eine poröse Mikrokammer mit darin eingeschlossenen lebenden Zellen umfasst. Die Zellen werden innerhalb der porösen Mikrokammer zurückbehalten, während es einer Flüssigkeit ermöglicht wird, über Einlass- und Auslassröhren hindurch zu fließen, welche an der oberen durchlässigen Membran angebracht sind. Änderungen bei den die Zellen umgebenden Medien können mittels einer Siliziumeltektrode gemessen werden, die in Kontakt mit der unteren durchlässigen Membran der Mikrokammer steht. Die Zufuhr von Medien aus einem Reservoir findet über die Einlassröhren statt. Das Reservoir ist kein integraler Teil der Zelle und der Massentransport findet nicht ausschließlich über Diffusion statt.
Es besteht weiterhin ein Bedarf für einen Mikrosensor zur Detektion von NO&sub3;&supmin;, welcher eine vergrößerte Lebensdauer aufweist und kein Wiederauffüllen der Bakterien oder ihrer Nährstoffe von Hand erfordert.
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Sensor zu schaffen, der nicht unter den bekannten Nachteilen leidet, und mit dem die Messung der Konzentration eines Primärmediums, d. h. Nitrat, NO&sub3;&supmin;, präziser wird und zu einer geringeren Empfindlichkeit in Bezug auf eine Wechselwirkung mit anderen Substanzen führt.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, einen Sensor zu schaffen, der das Prinzip des Stoffabbaus durch Bakterien nutzt, eine verlängerte Lebensdauer hat, handlich und robust ist und kein Wiederauffüllen der Bakterien oder ihrer Nährstoffe von Hand erfordert.
Wie in Anspruch 1 beschrieben, werden diese Aufgaben gelöst durch die Verwendung eines Mikrosensors desjenigen Typs, welcher Bakterien zur Messung des Vorhandenseins und der Konzentration einer Substanz in Form eines Primärmediums in einer Flüssigkeit, einem Gas oder einer Matrix verwendet, wobei der Mikrosensor aus einem Gehäuse, welches eine Reaktionskammer umgibt, und einem Transducer besteht, der in dem Gehäuse angeordnet ist, und wobei die Reaktionskammer zwischen der Spitze des Transducers und einer Öffnung des Gehäuses eine biologisch aktive Substanz, wie z. B. Bakterien, enthält, die das Primärmedium zu einem Sekundärmedium abbaut, und bei dem der Transducer die Konzentration des Sekundärmediums als indirekte Meßgröße für das Primärmedium misst. Der Mikrosensor ist dadurch gekennzeichnet, dass das Gehäuse eine Kammer oder ein Reservoir enthaltend Nährstoffe begrenzt und dadurch die Nährstoffe einschließt, die sich am Gehäuse vorzugsweise direkt anlagern, und dass ein Durchtritt zwischen Reaktionskammer und Reservoir angeordnet ist. Durch diesen Durchtritt diffundieren Nährstoffe vom Reservoir zur Reaktionskammer, damit sie von den Bakterien verbraucht werden. Durch diesen Durchtritt diffundiert außerdem Sekundärmedium aus der Reaktionskammer heraus, d. h. in einer Richtung, die der Richtung des Nährstoffs entgegengesetzt verläuft.
Die Erfindung löst dadurch das Problem der Nährstoffversorgung der denitrifizierenden Bakterien, die in der Reaktionskammer angeordnet sind. Durch die Schaffung eines Reservoirs mit durch das Gehäuse eingeschlossenen Nährstoffen und eines Durchtritts, der vom Reservoir zur Reaktionskammer führt, wird ein in sich abgeschlossener regenerativer Sensor erreicht. Das Reservoir wirkt als eine interne, konstant diffusive Nährstoffquelle, die die Bakterien regeneriert, indem ein kontinuierliches Wachstum in der Spitze des Sensors ermöglicht wird. Die Reaktionskammer wirkt daher als verlässlicher Mikro-Chemostat. Vorzugsweise umgibt das Gehäuse gemäß Anspruch 2 sowohl das Reservoir als auch die Reaktionskammer, wodurch eine praktikable, in sich abgeschlossene Einheit hergestellt werden kann. Gemäß Anspruch 3 wird der Durchtritt vom Transducer auf einer Seite und vom Gehäuse auf der anderen Seite gebildet, was zu einem engen Kanal führt, durch den die Nährstoffe zugeführt werden. Gemäß Anspruch 4 sollten die im Reservoir angeordneten Nährstoffe entweder einen Elektronenakzeptor oder einen -donor enthalten, abhängig davon, ob das Primärmedium von der biologisch aktiven Substanz in der Reaktionskammer oxidiert oder reduziert wird.
Ferner kann der Durchtritt gemäß Anspruch 5 Mittel zur Erleichterung oder Beeinflussung der Diffusion eines Nährstoffs oder eines Sekundärmediums (des Nettoflusses von Molekülen) enthalten. Bei einer Situation mit wechselnder Konzentration des Primärmediums ist es wichtig, die Diffusion zu führen oder zu beeinflussen. Ein plötzlicher Abfall der Konzentration des Primärmediums in beispielsweise dem Meerwasser würde eine Richtungsumkehr der natürlichen Diffusion des Sekundärmediums verursachen. Sekundärmedium, welches sich angesammelt hat, würde hingegen nun vom Reservoir zur Reaktionskammer diffundieren, was zu einer unkorrekten Messung führen würde. Durch die Zugabe gewisser Mittel zum Durchtritt kann diese Situation vermieden werden.
Indem der Durchtritt so ausgeführt wird, dass er in einem Reservoir im Gehäuse hinter der Transducer-Spitze endet, wird ein Vorteil dahingehend erreicht, dass der Durchtritt zur Zugabe von Nährstoffen zu den Bakterien verwendet werden kann, so dass die bakterielle Aktivität erhalten werden kann. Durch das Vorsehen eines Durchtritts, der sich hinter der Transducer-Spitze erstreckt, werden erhebliche Verbesserungen bei der Messung des Vorhandenseins und der Konzentration z. B. von Nitrat in der Umgebung erzielt.
Der Transducer ist von einem bekannten Typ, einem sogenannter Clark- Typ, der elektrochemisch ist und aus einer Glaskapillare mit einer Spitze besteht. Es können aber auch ganz andere Transducer-Typen, wie z. B. ein faseroptischer Transducer, der aus dem Stand der Technik bekannt ist, im Zusammenhang mit der Erfindung eingesetzt sein. An der Spitze des Sensors vom Clark-Typ befindet sich eine Öffnung, in die ein gasdurchlässiger Silikonstöpsel oder eine gasdurchlässige Silikonmembran eingesetzt ist. Kurz hinter dem Stöpsel befindet sich in der Glaskapillare eine Silberkathode. Andere Arten von Kathoden können jedoch ebenfalls eingesetzt sein. Die ionendurchlässige Membran ist vorzugsweise aus einem nicht abbaubaren Polymer hergestellt. Andere Arten ionendurchlässigen Materials können jedoch ebenfalls eingesetzt sein.
Ein Nährstoffmedium wurde dem erfinderischen Mikrosensor zugegeben. Wenn das Primärmedium ein negativ geladenes Ion ist, kann es vorteilhaft sein, dem in dem Reservoir angeordneten Nährstoff ein Salz mit einer geringen Migrationsgeschwindigkeit positiver Ionen, wie z. B. LiCI, zuzugeben. Wenn das Primärmedium ein positiv geladenes Ion ist, sollte das dem Nährstoff zugegebene Salz negative Ionen mit geringer Migrationsgeschwindigkeit enthalten, z. B. KH&sub2;PO&sub4;.
Der Mikrosensor basiert auf bakterieller Aktivität, welche zur Produktion des Sekundärmediums durch Transformation des Primärmediums führt. Erfindungsgemäß dient der Mikrosensor primär zur Detektion des Vorhandenseins von Nitrat und außerdem zur Messung der Konzentration von Nitrat als Primärmedium, indem die Aktivität denitrifizierender Bakterien eingesetzt wird. Diesen Bakterien fehlt das N&sub2;O-Reduktase-Enzym. Es können Bakterien vom Genus Agrobacterium Radiobacter sein. Durch die bakterielle Aktivität wird Nitrat, NO&sub3;&supmin;, durch Reduktion zu Distickstoffoxid, N&sub2;O, abgebaut. Eine gewisse Menge Distickstoffoxid diffundiert in den Transducer und wird an der Kathode des Transducers reduziert. Die Menge Distickstoffoxid, die an der Kathode des Transducers reduziert wird, ist direkt proportional zur NO&sub3;&supmin;-Konzentration in der Umgebung, in der die Messung stattfindet.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform gemäß Anspruch 6 ist der Mikrosensor dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zur Erleichterung oder Beeinflussung der Diffusion eines Nährstoffs oder eines Sekundärmediums aus einer Konizität des Gehäuses bestehen und daß die Konizität des Gehäuseteils, welches das Reservoir umgibt, größer ist als die Konizität des Teils, welches die Reaktionskammer umgibt. Der Durchtritt endet in einem Volumen im Gehäuse dort, wo dieses Volumen sich hinter der Spitze des Transducers erstreckt und wo der obere Teil des Gehäuses eine Konizität aufweist, die diejenige des Teils der Reaktionskammer übersteigt. Dies ist vorteilhaft aufgrund der vergleichsweise größeren Volumenzunahme im oberem Teil verglichen mit der Volumenzunahme des Teils der Reaktionskammer. Diese Maßnahme führt zu einer Verdünnung des kleinen Anteils Distickstoffoxid, welches zum Reservoir durch den Durchtritt diffundiert. Diese Diffusion überschüssigen Distickstoffoxids durch den Durchtritt in das Volumen, welches sich hinter der Spitze des Transducers erstreckt, führt daher nicht zu einer signifikanten Ansammlung von N&sub2;O hinter der Transducer-Spitze. Eine derartige Ansammlung würde andernfalls zu einem fehlerhaften Hintergrundsignal beitragen. Vorzugsweise ist gemäß Anspruch 7 nur der Teil des Gehäuses, welcher das Reservoir umgibt, konusförmig, während der Teil, welcher die Reaktionskammer umgibt, parallele oder fast parallele Seiten aufweist.
Beim Einsatz eines erfindungsgemäßen Mikrosensors beeinflussen andere Substanzen in der Umgebung als Nitrat, NO&sub3;&supmin;, die Messungen nicht besonders. Zusätzlich zu Nitrat tragen Nitrit, NO&sub2;&supmin;, und Distickstoffoxid, N&sub2;O, aus der äußeren Umgebung zu einem Fehler der Messergebnisse bei, wenn der Sensor einer Änderung der Konzentration des wechselwirkenden Stoffs ausgesetzt wird. Sie tragen zu einem Signal vom Transducer mit einem Faktor 1 bzw. einem Faktor 2 bei, verglichen mit dem Signal einer entsprechenden Nitratkonzentration. Die Mengen von Nitrit und Distickstoffoxid sind jedoch in den meisten Umgebungen, in denen der erfinderische Mikrosensor eingesetzt werden soll, sehr klein. Oft (z. B. in Kläranlagen) ist es vorteilhaft, Nitrit und Nitrat in ein Signal zu integrieren. Die geringe Empfindlichkeit gegenüber einer Wechselwirkung mit anderen Substanzen bedeutet, dass der Mikrosensor zu Messungen in Meerwasser trotz des Vorhandenseins anderer Ionen, wie z. B. Chlorid, Cl&supmin;, in Meerwasser, eingesetzt werden kann.
Der Mikrosensor ist nur zu einem kleinen Anteil empfindlich in Bezug auf eine Bewegung in der Umgebung, in der Messungen durchgeführt werden. Ferner weist der Mikrosensor eine geringe Empfindlichkeit in Bezug auf die Temperatur in der Umgebung auf, in der Messungen durchgeführt werden. Ein Abfall der Temperatur in der Umgebung führt zu einer Verringerung der bakteriellen Aktivität. Messungen sind jedoch solange sichergestellt, wie die bakterielle Aktivität das Primärmedium in ein Sekundärmedium abbauen kann, wie z. B. die Transformation von Nitrat in Distickstoffoxid. Bei einer Temperatur von 5ºC oder darunter, ist die bakterielle Aktivität nahe Null und der Mikrosensor ist daher nicht in der Lage, bei Temperaturen unter 3ºC zu messen. Bakterien können jedoch isoliert werden, die gegenüber Kälte weniger empfindlich sind, so dass der Mikrosensor in der Lage ist, bei Temperaturen zu messen, die erheblich unter 3ºC liegen. Die Umgebungstemperatur ist nur in Bezug auf die Temperatur wichtig, für die der Transducer kalibriert ist. Es kann aber eine Kalibrierung für verschiedene Temperaturen durchgeführt werden. Bei einer Ausführungsform des Mikrosensors kann diese Kalibrierung mit einem Temperatursensor versehen sein, so dass die Temperatur zur gleichen Zeit gemessen wird wie die Konzentration des Primärmediums, z. B. Nitrat.
Der erfindungsgemäße Mikrosensor kann das Vorhandensein und die Konzentration von Nitrat ab 1 uM aufwärts messen. Der Konzentrationsmessbereich von Nitrat hängt vom Design des Mikrosensors ab.
Die Reaktionskammer zwischen der Öffnung des Gehäuses und der Transducer-Spitze kann verschiedene Größen haben. Um die Responszeit für den Mikrosensor innerhalb akzeptabler und praktikabler Grenzen zu halten, ist eine Länge von ungefähr 400 uM für den Abstand zwischen der Öffnung des Gehäuses und der Transducer-Spitze in der Praxis eine bevorzugte maximale Größe der Reaktionskammer. Für Reaktionskammern mit einem größeren Abstand zwischen der Öffnung des Gehäuses und der Transducer- Spitze nimmt die Responszeit erheblich zu. Wenn die Reaktionskammer einen größeren Abstand zwischen der Transducer-Spitze und der Öffnung aufweist, wird die Empfindlichkeit reduziert, aber der Messbereich, in dem der Sensor eingesetzt werden kann, wird vergrößert. Ferner bedeutet eine Vergrößerung der Konizität der Reaktionskammer eine vergrößerte Responszeit, einen vergrößerten Messbereich und eine verringere Empfindlichkeit. Es ist daher möglich, ein Optimum für die Responszeit des Sensors, für die Empfindlichkeit, für den Durchmesser und den Messbereich zu erzielen, abhängig von der spezifischen Messaufgabe.
Bei einer Ausführungsform des Mikrosensors gemäß Anspruch 8 umfasst der Mikrosensor ein "Fenster", welches sich um den Transducer herum erstreckt. Das Fenster ist zwischen dem Transducer und dem Gehäuse angeordnet und umgibt den Transducer. Dies erleichtert die Diffusion des Sekundärmediums. Das Fenster ist mit Hilfe eines zusätzlichen Gehäuses gebildet, welches den Transducer umgibt und zwischen dem äußeren Gehäuse und dem Transducer angeordnet ist. Das zusätzliche Gehäuse ist in einer Position hinter der Transducer-Spitze angeordnet und enthält ein sauerstofffreies Gas und dient dazu, das Sekundärmedium schneller abzuführen, als es der Fall wäre, wenn das äußere Gehäuse oder das Reservoir allein vorliegen würden. Bei einer Ausführungsform umfasst der erfindungsgemäße Mikrosensor ein Fenster, welches zwischen dem Transducer und dem Gehäuse angeordnet ist, und den Transducer umgibt. Das Fenster weist eine Öffnung auf, die hinter der Detektionszone des Transducers angeordnet ist. Die Öffnung enthält eine diffusionsoffene Barriere.
Bei einer anderen Ausführungsform enthält das oben genannte Fenster ein sauerstofffreies Gas, z. B. Wasserstoff. Aufgrund der höheren Diffusionsrate in Gasen verglichen mit Flüssigkeiten erfolgt das Abführen des Sekundärmediums in Gasen schneller als in Flüssigkeiten. Dieses Fenster- Design kann gemeinsam mit der Konizität des äußeren Gehäuses oder, falls ein raumsparendes schlankes Design gewünscht ist, ohne das äußere Gehäuse ohne jede Konizität eingesetzt sein. Bei einer Ausführungsform sind die Wände des Gehäuses im wesentlichen parallel zu den Wänden des Fensters. In diesem Fall ist der Durchtritt ein langer Kanal, wobei die Wände auf einer Seite vom Fenster und auf der anderen Seite vom äußeren Gehäuse gebildet sind. Bei einem solchen Design diffundiert nur ein kleiner Anteil des Sekundärmediums in das Reservoir.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform gemäß Anspruch 11 ist der Mikrosensor dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionskammer Bakterien enthält, die Nitrat reduzieren, dass das Primärmedium Nitrat ist, dass das Sekundärmedium Distickstoffoxid ist, dass die Bakterien Nitrat durch Produktion von Distickstoffoxid reduzieren und dass der Transducer ein N&sub2;O- Transducer ist.
Die Ansprüche 12 und 13 beschreiben zwei mögliche Sensor- oder Detektortypen.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform gemäß Anspruch 14 weist bei einem erfindungsgemäßen Mikrosensor die Öffnung des Gehäuses eine Membran auf. Die Membran in der Öffnung des Gehäuses schließt die Bakterien innerhalb der Reaktionskammer ein und verhindert, dass unerwünschte Mikroorganismen in die Reaktionskammer eindringen.
Anspruch 15 beschreibt die Anwendung des erfindungsgemäßen Mikrosensors zur Messung von Nitrat.
Ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung betrifft daher die Anwendung eines erfindungsgemäßen Mikrosensors bei der Messung des Vorhandenseins und der Konzentration von Nitrat.
Ebenfalls beschrieben ist ein bevorzugtes Verfahren zur Messung der Konzentration eines Mediums in einer Umgebung, speziell die Messung von Nitrat. Mit Hilfe des Fickschen Diffusionsgesetzes kann ein Modell des Diffusionsprozesses in der Reaktionskammer erstellt werden.
Die Erfindung wird nachfolgend detaillierter bezugnehmend auf die beiliegende Zeichnung beschrieben. In dieser zeigen:
Fig. 1 eine erste Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mikrosensors;
Fig. 2 eine zweite Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mikrosensors;
Fig. 3 den Fluss von NO&sub3;&supmin; und N&sub2;O in der Reaktionskammer des Mikrosensors;
Fig. 4 eine Kalibrierungskurve für den Mikrosensor;
Fig. 5 eine Kurve mit Messungen des Vorhandenseins und der Konzentration von Nitrat in einem Sediment.
Fig. 1 zeigt eine erste Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Mikrosensors. Der Mikrosensor weist einen Transducer 1 auf Der Transducer 1 umfasst eine Glaskapillare 2 mit einer Kathode 3, die bei der gezeigten Ausführungsform eine Silberkathode ist. Die Glaskapillare 2 weist eine Spitze 4 mit einer Öffnung 5 auf. In der Öffnung 5 befindet sich ein Stöpsel aus Silikon. Ein Gehäuse 7-bei der gezeigten Ausführungsform aus Glas oder aus Kunststoff-umgibt den Transducer 1. Das Gehäuse 7 weist eine Öffnung 8 mit einer in der Öffnung angeordneten Membran 9 auf. Diese Membran 9 ist aus Titanoxid, TiO&sub2;. Die Öffnung 8 ist in einem Abstand a von der Spitze 4 des Transducers 1 angeordnet. Im Gehäuse 7 zwischen der Spitze 4 des Transducers 1 und der Öffnung 8 des Gehäuses 7 befindet sich eine Reaktionskammer 10. Im Gehäuse 7 hinter der Spitze 4 des Transducers 1 befindet sich eine Kammer oder ein Reservoir 11, welches über einen Durchtritt 12 Verbindung mit der Reaktionskammer 10 hat.
Ehe Reaktionskammer 10 enthält aktive Bakterien, die durch den Durchtritt 12 aus dem Reservoir 11 mit Nährstoffen versorgt werden. Auf diese Weise kann eine ausreichende bakterielle Aktivität im Mikrosensor erhalten bleiben, ohne dass es erforderlich ist, Nährstoffe von außen zuzuführen.
Der Mikrosensor ist eine in sich abgeschlossene Einheit mit eigenem Nahrungsspeicher für die Bakterien. Die Nährstoffe werden der Reaktionskammer durch den Durchtritt 12 mittels Diffusion zugeführt. Die aktiven Bakterien führen eine Transformation oder einen Abbau eines Primärmediums aus einer Umgebung 13 außerhalb der Membran 9 durch, welches in die Reaktionskammer 10 diffundiert ist. Der Stoffabbau führt zur Produktion eines Sekundärmediums, welches vom Transducer 1 detektiert wird.
Neben dem Durchgang von Nährstoffen und kleinen Mengen überschüssigen Sekundärmediums durch den Durchtritt 12 bewegen sich auch inaktive, absterbende oder überschüssige Bakterien aus der Reaktionskammer 10 durch den Durchtritt in das Reservoir 11. Dies resultiert aus dem kontinuierlichen Wachstum der Bakterien, welches, falls der Durchtritt 12 nicht vorliegenden würde, zu einer Verformung der Membran 9 bis zum Bersten von dieser führen würde, wodurch der Mikrosensor zerstört würde. In diesem Sinne wirkt der Durchtritt auch als Druckablass.
Zwischen dem Transducer 1 und dem Gehäuse 7 führt der Durchtritt 12 von der Reaktionskammer 10 zum Reservoir 11, welches hinter der Spitze 4· des Transducers 1 angeordnet ist. Mit Hilfe des Durchtritts 12 kann überschüssiges Sekundärmedium, welches im Zuge der bakteriellen Aktivität erzeugt wurde und nicht vom Transducer 1 verbraucht wurde, durch den Durchtritt 12 in das Reservoir 11 diffundieren. Im Durchtritt 12 ist kein Hindernis ausgebildet. Eine Bewegung durch den Durchtritt erfolgt mittels Diffusion.
Wie in Fig. 1 dargestellt, ist das Reservoir 11 hinter der Spitze 4 des Transducers 1 hauptsächlich konusförmig und hat eine Konizität C, die größer ist als eine Konizität c der Reaktionskammer. Bei der gezeigten Ausführungsform ist die Konizität der Reaktionskammer Null. Eine relative Vergrößerung des Volumens des Reservoirs 11 längs einer zentralen Längsachse A des Mikrosensors ist daher größer als eine entsprechende Volumenvergrößerung der Reaktionskammer 10. In der Konsequenz findet eine "Verdünnung" statt, d. h. eine Verdünnung des Teils des Sekundärmediums, welcher vom Transducer nicht verbraucht wurde und durch den Durchtritt 12 diffundiert ist. Dies bedeutet, dass ein Fehlerbeitrag, der vom Überschuss des Sekundärmediums im Reservoir 11 hinter der Spitze 4 des Transducers 1 herrührt, ignoriert werden kann.
Fig. 2 zeigt eine zweite Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Mikrosensors. Der in Fig. 2 gezeigte Mikrosensor hat ein sogenanntes Fenster 20, welches den Transducer 1 und das Gehäuse 7 umgibt. Das Fenster 20 erstreckt sich hinter der Spitze 4 des Transducers 1 und weist einen diffusionsoffenen Stöpsel 21 auf, der in einer Öffnung 22 des Fensters 20 angeordnet ist. Das Fenster 20 hat den Zweck, das Sekundärmedium abzuführen, welches durch den Durchtritt 12 diffundiert und zu Messfehlern beitragen kann. Das Erfordernis einer "Verdünnung" von Distickstoffoxid mittels einer Konizität des Reservoirs 11 wird hierdurch eliminiert. Ein Reservoir 23 im Fenster 20 zwischen dem Transducer 1 und einer Wand 24 für das Fenster 20 enthält ein Gas. Das Gas im Reservoir 23 kann Umgebungsluft sein, ist jedoch vorzugsweise ein sauerstofffreies Gas.
Messungen mit Hilfe des Mikrosensors können grundsätzlich, wie oben erwähnt, in Verbindung mit der bakteriellen Reduzierung von NO&sub3;&supmin; zu N&sub2;O und einer nachfolgenden elektrochemischen Detektion des erzeugten N&sub2;O stattfinden. Immobilisierte Bakterien werden ständig mit Elektronendonoren und Nährstoffen mittels Diffusion vom Reservoir 11 versorgt, welches sich hinter der Spitze 5 des Transducers 1 erstreckt. Das Nährstoffe enthaltende Volumen im Reservoir ist verglichen mit der Bakterienmenge in der Reaktionskammer so groß, dass die Bakterien praktisch von einer gleichbleibenden Quelle versorgt werden, was eine lange Lebensdauer sicherstellt. Das Substrat enthält Mikro-Nährstoffe und entweder Elektronendonoren oder -akzeptoren, abhängig vom Primärmedium in der Reaktionskammer. In diesem Sensor ist das Primärmedium Nitrat, NO&sub3;&supmin;, welches einen Elektronenakzeptor darstellt. Das Substrat enthält daher einen Elektronendonor. Tryptische Soja-Nährlösung (TSB) z. B. kann vorteilhaft als Substrat eingesetzt werden, da es sowohl Mikro-Nährstoffe als auch einen Elektronendonor enthält. Die Bakterien in der Reaktionskammer 10 sind insbesondere anaerob und in der Lage, organisches Material aus der Reaktionskammer 10 in Gegenwart von Sauerstoff, O&sub2;, oder NO&sub3;&supmin;, welche Elektronenakzeptoren darstellen, zu oxidieren. Die Bakterien, die der Öffnung der Reaktionskammer 10 am nächsten sind, reduzieren den gesamten Sauerstoff, O&sub2;, welcher in die Reaktionskammer 10 diffundiert. Der größte Teil der Reaktionskammer ist daher sauerstofflos und eine Denitrifizierung, die zu einer Produktion von N&sub2;O führt, ist die einzige Atmungsmöglichkeit für den größten Teil der Bakterien in der Reaktionskammer 10. Ein zum aus der Reduktion von NO&sub3;&supmin; produzierten N&sub2;O proportionaler Anteil diffundiert in den Transducer, wo N&sub2;O von der negativ geladenen Kathode 3 reduziert wird (vgl. Fig. 1). Die Reduktion erzeugt einen Elektronenfluss von der Anode zur Kathode 3, der mit einem Piko-Amperemeter gemessen wird. Der Elektronenfluss ist direkt proportional zu einem N&sub2;O-Fluss in den Transducer. Ein kleiner Anteil N&sub2;O diffundiert durch den Durchtritt 12 in entgegengesetzter Richtung zu den Nährstoffen und der Rest diffundiert nach außen zum externen Medium.
Fig. 3 ist eine Darstellung einer zylindrischen Reaktionskammer 10 eines erfindungsgemäßen Mikrosensors. Im Rahmen der nachfolgenden Erklärung wird die Reduktionszone als Punkt-zu-Punkt-Verbindung dargestellt und die Reaktionskammer wird als zylindrisch angesehen. Es wird gezeigt werden, daß ein erfindungsgemäßer Mikrosensor, bei dem die Reduktionszone eine Länge und/oder eine konusförmige Reaktionskammer aufweist, ein Stromsignal liefern kann, welches von der Konzentration von NO3 linear abhängt. Der NO&sub3;&supmin;-Fluss in die Reaktionskammer 10 wird durch das Ficksche Diffusionsgesetz (erstes Ficksches Gesetz) beschrieben:
F(NO&sub3;&supmin;) = D(NO&sub3;&supmin;)·(C(NO&sub3;&supmin;), X&sub0;/z
Hierbei ist F der Fluss, D der Diffusionskoeffizient, C, X&sub0; ist die Konzentration bei einer Position X&sub0; an der Öffnung der Reaktionskammer und z ist ein Abstand von der Öffnung der Reaktionskammer bis zu einer Position X&sub1; längs einer Länge L der Reaktionskammer, wobei die Konzentration C(NO&sub3;&supmin;) bei X&sub1; Null ist.
Mittels stöchiometrischer Überlegungen kann das erste Ficksche Gesetz mittels der folgenden Formel bestimmt werden:
F(NO&sub3;&supmin;) = 2·(F(N&sub2;O, heraus) + F(N&sub2;O, herein)
Hierbei ist F(N&sub2;O, heraus) der N&sub2;O-Fluss aus der Reaktionskammer heraus, und F(N&sub2;O, herein) ist der Parameter, der das Transducer-Signal bestimmt. Der N&sub2;O-Fluss kann mit Hilfe des ersten Fickschen Gesetzes berechnet werden:
F(N&sub2;O, herein) = D(N&sub2;O)·C(N&sub2;O), X&sub1;/(L - z) und
F(N²O, heraus) = D(N&sub2;O)·C(N&sub2;O), X&sub1;/z
Dies führt zu vier Gleichungen mit den Unbekannten F(NO&sub3;&supmin;), z, F(N&sub2;O, heraus), F(N&sub2;O, herein) und C(N&sub2;O, X&sub1;). Einsetzen der Gleichungen ineinander führt zur folgenden Gleichung für den Fluss:
F(N&sub2;O, herein) = (0,5·C(NO&sub3;&supmin;)·D(NO&sub3;&supmin;)/L
Dies führt zur folgenden Gleichung für den Fluss:
Fluss(N&sub2;O, herein) = F(N&sub2;O, herein) A = π/2·C(NO&sub3;&supmin;)·D(NO&sub3;&supmin;)·r²/L
Hierbei ist A die Schnittfläche der Reaktionskammer und r der Radius des Schnitts der Reaktionskammer. Diese Gleichung zeigt, dass der N&sub2;O-Fluss in den Transducer von der Position von X&sub1; für eine NO&sub3;&supmin;-Reduktionszone in der Reaktionskammer unabhängig ist und dass der Fluss linear proportional zur NO&sub3;&supmin;-Konzentration ist. Da der N&sub2;O-Gradient ausgehend von der Position X&sub1; zum Transducer unabhängig von der Position von X&sub1; und unabhängig davon ist, ob das NO&sub3;&supmin;, welches in die Reaktionskammer diffundiert, vor oder nach der Position X&sub1; reduziert wird, beeinflussen Änderungen der O&sub2;-Konzentration die NO&sub3;&supmin;-Messungen nicht.
Wenn der Mikrosensor Umgebungen mit höheren NO&sub3;&supmin;-Konzentrationen ausgesetzt wird, vergrößert sich die Reaktionszone und NO&sub3;&supmin; diffundiert weiter in die Reaktionskammer hinein. NO&sub3;&supmin;-Konzentrationen außerhalb der Öffnung des Transducers, wo NO&sub3;&supmin;-Konzentrationen, die noch nicht reduziert wurden, direkt zur Öffnung 5 des Transducers diffundieren, bilden den höchsten Konzentrationstyp zur Messung eines linearen Signals. Höhere NO&sub3;&supmin;-Konzentrationen außerhalb der Öffnung 8 der Reaktionskammer führen zu einem nichtlinearen Signal.
Die Kapazität der Bakterien zur Reduktion von NO&sub3;&supmin; hängt von der Länge der sauerstofflosen Zone vor dem Transducer und von der Aktivität der Bakterien ab. Die maximale NO&sub3;&supmin;-Konzentration, die mit Hilfe des Mikrosensors bestimmt werden kann, hängt daher davon ab, ob die Umgebung sauerstoffhaltig oder sauerstofflos ist. Das Vorliegen einer physikalischen oder chemischen Substanz in der Umgebung, in der eine Messung stattfindet, welche die bakterielle Aktivität negativ beeinflusst, limitiert daher die maximale NO&sub3;&supmin;-Konzentration; die der Mikrosensor messen kann. Die physikalische oder chemische Substanz wird das Signal jedoch nicht beeinflussen, solange die Bakterien ausreichend aktiv sind, um zu verhindern, dass NO&sub3;&supmin; die Spitze des Transducers erreicht.
Fig. 4 zeigt eine Kalibrierungskurve eines erfindungsgemäßen Mikrosensors. Der kalibrierte Mikrosensor ist vom Typ eines Nitrat-Mikrosensors, der zur Messung des Vorhandenseins und der Konzentration von Nitrat NO³&supmin; gedacht ist. Die Messung wurde durchgeführt, indem eine Respons des Transducers, gemessen in Piko-Ampere (pA), als Funktion der NO&sub3;&supmin;&submin; Konzentration in einer Umgebung außerhalb der Membran in der Öffnung des Gehäuses bestimmt wurde. Die Kurve zeigt, dass die Respons des Transducers direkt proportional zur NO&sub3;&supmin;-Konzentration in der Umgebung bis hin zu einer Konzentration von 500 uM NO&sub3;&supmin; ist. Bei Konzentrationen, die 500 uM NO&sub3;&supmin; übersteigen, findet eine graduelle Verringerung des Gradienten der Kurve in der Grafik statt.
Fig. 5 zeigt eine Graphik mit verschiedenen Messungen, die mit dem Mikrosensor durchgeführt wurden. Die Messungen wurden in einem Sediment ausgeführt, wobei die Tiefe eines Sediments auf dem Meeresgrund als Funktion der Konzentration von Nitrat, NO&sub3;&supmin;, im Sediment bestimmt wurde. Die Graphik zeigt, dass die NO&sub3;&supmin;-Konzentration in der Oberfläche des Sediments, welche einer Tiefe von 0 mm entspricht, zwischen 170 und 180 uM ist. Je tiefer die Messungen im Sediment ausgeführt sind, desto geringer ist die NO&sub3;&supmin;-Konzentration. Bei einer Tiefe von ungefähr 3 mm im Sediment hat sich die NO&sub3;&supmin;-Konzentration auf ungefähr 0 uM verringert. Die Kurve zeigt, dass das Sediment NO&sub3;&supmin; vom Wasser über dem Sediment aufnimmt und dass NOT aufgrund von Denitrifizierung verbraucht wird.
Oben stehend ist die Erfindung bezugnehmend auf spezifische Ausführungsformen eines Mikrosensors beschrieben worden. Andere Arten von Ausführungsformen sind jedoch anwendbar. Die Größen und. Bereiche können andere Werte aufweisen und andere Materialien als diejenigen, die schon genannt wurden, können eingesetzt sein. Eine Membran aus einem anderen Material als ein nicht abbaubares Polymer, z. B. ein Hydrogel, kann eingesetzt sein, genauso wie andere Arten von Transducern als der genannte, z. B. faseroptische Transducer. Der erfinderische Mikrosensor kann außerdem zur Messung des Vorhandenseins und der Konzentration von anderen Substanzen als Nitrat, NO&sub3;&supmin;, eingesetzt sein, z. B. von Sulfat, SO&sub4;&supmin;&supmin;, wenn der Transducer ein H&sub2;S-Transducer ist und die Bakterien in der Reaktionskammer SO&sub4; reduzierend sind.

Claims

1. Mikrosensor zur Messung des Vorhandenseins und der Konzentration einer Substanz in Form eines Primärmediums in einer Flüssigkeit, einem Gas oder einer Matrix, wobei der Mikrosensor besteht aus einem Gehäuse, welches eine Reaktionskammer umgibt, und einem Transducer, welcher in dem Gehäuse angeordnet ist, und wobei die Reaktionskammer zwischen der Spitze des Transducers und einer Öffnung des Gehäuses eine biologisch aktive Substanz enthält, die das Primärmedium in ein Sekundärmedium abbaut, und wobei der Transducer die Konzentration des Sekundärmediums misst, dadurch gekennzeichnet, dass das Gehäuse (7) eine Kammer oder ein Reservoir (11) begrenzt, welche oder welches Nährstoffe enthält, wobei die Nährstoffe sich an das Gehäuse anlagern, und dass ein Durchtritt (12) zwischen Reaktionskammer (10) und Reservoir angeordnet ist, durch welchen Nährstoffe vom Reservoir zur Reaktionskammer diffundieren und durch welche Sekundärmedium aus der Reaktionskammer heraus diffundiert.

2. Mikrosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Gehäuse (7) sowohl die Reaktionskammer (10) als auch das Reservoir (11) umgibt.

3. Mikrosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Durchtritt auf einer Seite vom Transducer (1) und auf der anderen Seite vom Gehäuse (7) gebildet ist.

4. Mikrosensor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Nährstoff, welcher im Reservoir (11) angeordnet ist, ein Substrat enthält, in welchem Mikro-Nährstoffe und ein Elektronenakzeptor oder ein Elektronendonor inkorporiert sind.

5. Mikrosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Durchtritt (12) Mittel (C, 20) zur Erleichterung oder Beeinflussung der Diffusion eines Nährstoffs oder eines Sekundärmediums aufweist.

6. Mikrosensor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel aus einer Konizität des Gehäuses bestehen, und dass die Konizität (C) des Teils des Gehäuses, welches das Reservoir umgibt, größer ist als die Konizität (c) des Teils, welches die Reaktionskammer umgibt.

7. Mikrosensor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass nur der Teil des Gehäuses, welcher das Reservoir (11) umgibt, konusförmig ist, wohingegen der Teil, welcher die Reaktionskammer einschließt, parallele Seiten aufweist.

8. Mikrosensor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel aus einem Fenster (20) bestehen, welches zwischen dem Transducer und dem Gehäuse angeordnet ist und den Transducer umgibt, und dass das Fenster eine Öffnung (22) aufweist, die hinter der Detektionszone des Transducers positioniert ist, und dass die Öffnung eine diffusionsoffene Barriere (21) enthält.

9. Mikrosensor nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Fenster (20) ein sauerstofffreies Gas, z. B. Wasserstoff, enthält.

10. Mikrosensor nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Wände des Gehäuses (7) im wesentlichen parallel zu den Wänden des Fensters (20) sind.

11. Mikrosensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionskammer Bakterien enthält, welche Nitrat reduzieren, dass das Primärmedium Nitrat (NO&sub3;&supmin;) ist, dass das Sekundärmedium Distickstoffoxid (N&sub2;O) ist, dass die Bakterien Nitrat (NO&sub3;&supmin;) reduzieren und Distickstoffoxid (N&sub2;O) produzieren, und dass der Transducer zur Detektion des Distickstoffoxid (N&sub2;O) dient.

12. Mikrosensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Transducer ein elektrochemischer Detektor ist.

13. Mikrosensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Transducer ein faseroptischer Detektor ist.

14. Mikrosensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Membran (9) in oder auf der Öffnung (8) der Reaktionskammer (10) angeordnet ist.

15. Verwendung eines Mikrosensors nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Messung des Vorhandenseins und der Konzentration von Nitrat (NO&sub3;&supmin;).