DE69633932T2

DE69633932T2 - Gefäss zur Trocknung von biologischen Proben, Verfahren zur Herstellung desselben und Verfahren zu seinem Gebrauch

Info

Publication number: DE69633932T2
Application number: DE69633932T
Authority: DE
Inventors: Geoffrey L. Kidd
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1995-09-22
Filing date: 1996-09-20
Publication date: 2006-03-02
Anticipated expiration: 2016-09-21
Also published as: CA2232673A1; US5958778A; ATE283346T1; AU7245696A; EP0854911A1; EP0854911B1; AU705412B2; DE69633932D1; US6503455B1; CA2232673C; WO1997011155A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf sterile Behälter zum Trocknen von biologischen Proben und auf verwandte Verfahren. Genauer bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Mikrozentrifugengläser und Verfahren zur Verwendung derselben.
Allgemeiner Stand der Technik
Häufig wird gewünscht, biologische Proben zu trocknen, um deren Haltbarkeit und Wirksamkeit zu bewahren. Eine Trocknungstechnik ist die Lyophilisierung, welche eine häufig angewandte Gefriertrockungstechnik ist. Es wird gewünscht, auch noch andere biologische Materialien, wie z. B. langkettige DNA-Moleküle und Zellbestandteile, bei einer Temperatur über 0°C, d. h. über dem Gefrierpunkt, zu trocknen, um deren Zerstörung durch die Kräfte des Gefrierens zu verhindern. Angesichts der Tatsache, dass sich die vorliegende Erfindung nicht auf die Lyophilisierung beschränkt, wird das Trocknen über und unter dem Gefrierpunkt in austauschbarer Weise besprochen.
Üblicherweise wird die gefriergetrocknete Verbindung nach Beendigung eines Lyophilisierungsverfahrens in einem Gefrierraum z. B. bei –70°C gelagert, obwohl eine Lyophilisierung manchmal den Bedarf an einem Gefrieren überhaupt überflüssig machen kann. Beispielsweise ist gemäß dem Produktprofilblatt des Herstellers der Zusatz für das Endothelzellwachstum (ECGS) mindestes 18 Monate lang stabil, wenn er bei 4°C in gefriergetrockneter Form gelagert wird, aber nur einen Monat lang stabil, wenn er bei –20°C in gelöster Form gelagert wird.
Die Gefriertrocknung von Verbindungen ist besonders nützlich beim Züchten von Zellen in einem Nährmedium, wo die gefriergetrockneten Verbindungen Peptide oder Wachstumsfaktoren umfassen. Diese Verbindungen werden aufgrund ihrer Kosten und/oder ihrer Wirksamkeit im Allgemeinen in winzigen Mengen bereitgestellt und sind üblicherweise äußerst leicht verderblich. Es ist zu beobachten, dass eine Gefriertrocknung deren Haltbarkeit verlängert.
Eine Gefriertrocknung wird typischerweise in einem Zentrifugalapparat wie z. B. einer Speed-Vac°-Zentrifuge durchgeführt. Die Speed-Vac° wird in eine Vakuumkammer gegeben. Die Probe wird in ein Mikrozentrifugenglas gegeben, das ein kleines Kunststoffröhrchen (0,5, 1 oder 2 ml) ist, welches typischerweise spitz zulaufend, konisch oder abgerundet und an einem Ende geschlossen ist. Da das bei der Gefriertrocknung angewandte Vakuum extrem hoch ist (z. B. 6,665–66,65 Pa (50–500 Millitorr), verdampft ein Teil der Flüssigkeit im Mikrozentrifugenglas sofort und zwingt viel von der restlichen Lösung aus dem Röhrchen. Durch das Aufbringen einer Zentrifugalkraft wird die Flüssigkeit im Bemühen, ein Herausströmen der Flüssigkeit beim Vergasen der Flüssigkeit zu verhindern, bis auf den Boden des Röhrchens hinuntergedrückt. Nach Beendigung der Gefriertrocknung wird das Vakuum abgestellt, wodurch ermöglicht wird, dass die Vakuumkammer und der Innenraum des Röhrchens zum Umgebungsdruck zurückkehren.
Um verwendet zu werden, müssen gelagerte getrocknete Verbindungen aufgelöst werden (falls sie nicht bereits in Lösung gelagert werden) und danach filtriert-sterilisiert werden, wodurch alle lebenden Zellen, Staub und andere unerwünschte Materialien herausgefiltert werden. Das Volumen der Lösung ist in dieser Stufe gering, es beträgt z. B. 1 ml. Nach der Filtersterilisation werden die Verbindungen üblicherweise in Aliquote, z. B. zu jeweils 50 μl, aufgeteilt, und nicht verwendete Aliquote werden in einem Gefrierraum gelagert. Dies vermeidet die Notwendigkeit eines wiederholten Gefrierens und Auftauens der Verbindungen, was deren Haltbarkeit verkürzt.
Ein weiteres Gefriertrocknungsverfahren bedingt, dass der Deckel des Mikrozentrifugenglases während der Gefriertrocknung offen gelassen wird. Nach Beendigung des Vakuums wird der Deckel daraufhin geschlossen. Dieses Verfahren ergibt eine nicht sterile Probe, welche durch Filtersterilisation erneut sterilisiert werden muss. Bei diesem Verfahren geht jedoch jener Teil der gelagerten Probe verloren, der zum Filter hin adsorbiert wird.
Wiederum ein weiteres Verfahren besteht darin, die Gefriertrocknung in einer sterilen Umgebung, wie z. B. in einem Reinraum, durchzuführen. Dies erfordert jedoch das Aufbringen von zusätzlichen Aufwendungen zur Aufrechterhaltung von Reinraumbedingungen.
Wiederum ein weiteres Verfahren schlägt einen sterilen Gasaustausch durch eine Membran in einer geschlossenen sterilen Umgebung vor, siehe beispielsweise das U.S.-Patent 5,398,837, sowie einen von Costar hergestellten Zellkulturkolben (Katalognummer 3056). Keines dieser Verfahren ist jedoch zum Gefriertrocknen unter Verwendung einer Zentrifuge geeignet, da die Zellkulturkolben bei hohen Geschwindigkeiten nicht geschleudert werden können. Überdies bieten die Zellkulturkolben einen langsamen Gasaustausch zwischen der Außenumgebung und der Zellkultur, die gezüchtet wird. Weiters ist die Porosität der Membran solcherart, dass sie für Gas, aber nicht für Mikroben, die z. B. Durchmesser von mehr als etwa 0,22 μm haben, durchlässig ist.
Die US-A-5 309 649 beschreibt ein Gefriertrocknungsverfahren, bei dem das zu behandelnde Material unter sterilen Bedingungen in einen Behälter eingebracht wird, dessen Seiten zumindest teilweise aus einer hydrophoben, keim- und mikrobenundurchlässigen, dampfdurchlässigen Membran mit einem bevorzugten Porendurchmesser < 0,2 μm bestehen.
Demgemäß besteht ein Bedarf an einem Behälter für Material, welcher hohen Zentrifugalkräften, wie während eines Trocknungsvorgangs, ausgesetzt werden kann, der jedoch einen sterilen Gasaustausch zwischen dem Inneren des Behälters und der Außen umgebung zulässt.
Kurzfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist für ein beanspruchtes Verfahren zum Trocknen einer festen, flüssigen oder gasförmigen Probe, welche ein verdampfbares Material enthält, wie z. B. beim Trocknen eines festen Materials eines flüssigen Lösungsmittels für das feste Material. Ein solches Verfahren umfasst das Bereitstellen eines die Probe enthaltenden Behälters, welcher eine Öffnung definiert, wobei die Öffnung im Wesentlichen durch ein Filterelement (eine Filtereinrichtung), wie z. B. eine Membran, verschlossen ist. Das Filterelement gestattet das Durchdringen des verdampfbaren Materials, z. B. eines Gases, eines Feststoffs, einer Flüssigkeit oder einer Kombination davon, während das Durchdringen von Mikroben in den Behälter im Wesentlichen verhindert wird. Das Trocknungsverfahren bedingt weiters das Zulassen, dass zumindest ein Teil des verdampfbaren Materials durch die Filtereinrichtung dringt, einschließlich des Unterziehens der Probe einer Zentrifugation, wodurch zumindest eine teilweise Trocknung der Probe ohne erhebliche mikrobielle Verunreinigung erzielt wird.
Die vorliegende Erfindung ist auch für ein Verfahren zum Belüften einer Probe mit ihrer Umgebung. Wie hier verwendet, bezieht sich „Belüften" auf das Zulassen, dass der Inhalt eines Behälters mit einem Gas außerhalb des Behälters in Kontakt gerät, und zwar entweder indem von außen ein Gasstrom in den Behälter gelassen wird oder indem zugelassen wird, dass flüchtige Bestandteile im Behälter die Außenumgebung passieren. Eine solche Belüftungsmethode bedingt das Bereitstellen eines Behälters, bei dem eine Öffnung im Wesentlichen durch eine Filtereinrichtung verschlossen ist, welche das Durchdringen von zumindest einem Gas zulässt und das Durchdringen von Mikroben im Wesentlichen verhindert. Vorzugsweise ist der Behälter dazu ausgelegt, einer Hochgeschwindigkeitszentrifugation von 50 mal der Schwerkraft oder mehr standzuhalten, und ermöglicht, dass das Gas in den Behälter dringt oder aus diesem austritt, indem es durch die Filtereinrichtung dringt. Ein solches Verfahren ermöglicht dabei das Belüften der Probe im Behälter ohne erhebliche Verunreinigung der Probe mit Mikroben.
Ein Aspekt des Behälteraufbaus der Erfindung umfasst einen Behälter mit einem geschlossenen Ende und einem offenen Ende, der einen Innenraum definiert, wobei der Behälter in der Lage ist, einer Zentrifugation von etwa 50 mal der Schwerkraft oder mehr standzuhalten. Der Behälteraufbau umfasst auch eine Kappe mit einer offenen Position und einer geschlossenen Position zum Verschließen des offenen Endes des Behälters, welche Kappe eine mikrobenundurchlässige Filtereinrichtung trägt, welche einen Gasstrom von außerhalb des Behälters in den Innenraum ermöglicht und einen Gasstrom aus dem Innenraum heraus ermöglicht.
Diesbezüglich wird auch ein Behälteraufbau in Betracht gezogen, welcher einen Behälter mit einem geschlossenen Ende und einem offenen Ende umfasst, der einen Innenraum definiert, wobei der Behälter so geformt ist, um der Form eines Zentrifugenrotors oder -kastens zu entsprechen. Der Behälteraufbau umfasst auch eine Kappe mit einer offenen Position und einer geschlossenen Position zum Verschließen des offenen Endes, wobei die Kappe eine mikrobenundurchlässige Filtereinrichtung umfasst, so wie obenstehend beschrieben.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist als Mikrozentrifugenglas ein Instantbehälter vorgesehen. Bei einer weiteren Ausführungsform kann der Behälter eine Zentrifugenflasche sein, welche entweder einem Kasten entspricht, der an einem Zentrifugenrotor festgehakt ist, oder einer Mulde entspricht, die im Rotor der Zentrifuge vorgesehen ist. Eine solche Zentrifugenflasche hat üblicherweise ein Fassungsvermögen von 100 mL oder mehr und besitzt einen flachen Boden, der von der Mulde oder dem Kasten getragen wird, in die bzw. in den sie gegeben wird.
Es wird auch ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Behälteraufbaus und einer dazugehörigen Kappe in Betracht gezogen, welches das Bereitstellen einer Kappe bedingt, die eine Öffnung definiert, wobei die gesamte Öffnung durch eine Filtereinrichtung bedeckt ist, die im Wesentlichen kein Durchdringen von Materialien mit einem Durchmesser von zumindest etwa 0,2 μm zulässt, und wobei die Filtereinrichtung durch Klebstoff, Zement, eine Schweißung oder eine mechanische Halterung an der Kappe befestigt ist.
Wiederum andere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann aus der nachfolgenden detaillierten Beschreibung ersichtlich, wobei nur bevorzugte Ausführungsformen dargestellt und beschrieben sind. Demgemäß sind die Zeichnungen und die Beschreibung von ihrer Beschaffenheit her lediglich als erläuternd und nicht als einschränkend zu erachten.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt eine seitliche Querschnittsansicht eines Zentrifugenglases gemäß einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar, wobei sich die Kappe in der offenen Position befindet.
2 ist eine Querschnittsansicht des Zentrifugenglases der 1, wobei sich die Kappe in der geschlossenen Position befindet.
3 ist eine Draufsicht auf das Zentrifugenglas der 2 gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung.
4 ist eine Draufsicht auf das Zentrifugenglas der 2 gemäß einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
5 ist eine seitliche Querschnittsansicht eines Zentrifugenglases, welches einen Deckel gemäß einer dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst.
6 ist eine seitliche Querschnittsansicht einer Kappe gemäß einer vierten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung ist ein Verfahren zum Trocknen, z. B. Gefriertrocknen, einer Probe in einem Behälter, welche Probe ein verdampfbares Material enthält. Ein „verdampfbares Material", wie es hier verwendet wird, bezieht sich auf einen Feststoff, eine Flüssigkeit oder ein Gas oder eine Kombination davon, wie z. B. ein Aerosol, welches in die Dampfphase eintreten kann. Vorzugsweise ist ein solches verdampfbares Material ein Lösungsmittel für ein oder mehrere biologische Moleküle, wobei bevorzugt ein Entfernen des Lösungsmittels aus dem Behälter gewünscht wird.
Bevorzugte Proben zum Trocknen mit einem Instantbehälter umfassen synthetische und natürliche Peptide, DNA, RNA, Oligonucleotide, wie z. B. PCR-Primer, Proteine und Hybridmoleküle. Zellen und intrazelluläre Strukturen können ebenfalls verwendet werden. In manchen Fällen ist es notwendig, die Probe ausreichend zu erhitzen, um deren Gefrieren zu verhindern, z. B. wenn die Probe Materialien enthält, die durch ein Gefrieren beschädigt würden.
Ein Behälter, der für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet ist, kann aus jeglichem Material gefertigt sein, das nicht mit den in ihm platzierten Komponenten reagiert und das den auf ihm lastenden Zentrifugaldrücken standhält. Ein bevorzugtes Röhrchen ist somit ein Wegwerf-Polypropylenmikrozentrifugenglas mit einem angebrachten Deckel, wie z. B. jenes, das als Eppendorf Safe-Lock (TM) bekannt und bei Sigma Chemical Co (St. Louis, MO) erhältlich ist.
Was die Filtereinrichtung betrifft, die zur Verhinderung einer Mikrobenverunreinigung einer in einem Instantbehälter untergebrachten Probe verwendet wird, so besteht diese vorzugsweise aus einem Kunststoffmaterial, wie z. B. Nylon, es können jedoch auch andere Materialien genügen. Bei Verwendung von Nylon wird stets bevorzugt, den Nylonfilter mit einem Epoxyharz, welches das Nylon nicht auflöst, an einer Kappe anzukleben. Ein bevorzugtes Epoxyharz ist schnellhärtend, wie z. B. jenes, das bei Duro Corporation erhältlich ist.
Eine bei der vorliegenden Erfindung verwendete Filtereinrichtung ist vorzugsweise eine Membran. Geeignete Membrane, die bei Millipore erhältlich sind, inkludieren beispielsweise die folgenden:
Durapore (Polyvinylidenfluorid), Porengröße 0,22 μm
MF-Millipore (gemischte Celluloseester), Porengröße 0,22 μm und geringer
Isopore-Polycarbonat, Porengröße 0,2 μm und geringer
Geeignete Membrane, die bei Pierce Chemical (Rockford, IL) erhältlich sind, inkludieren:
FilterPure (Nylon 66), Porengröße 0,2 μm
FilterPure (PTFE/Polypropylen), Porengröße 0,2 μm
Andere Lieferanten und Membranmaterialien können vom qualifizierten Anwender ohne übermäßiges Experimentieren leicht identifiziert werden.
Die Zentrifugengläser und -flaschen der vorliegenden Erfindung umfassen Kappen, in denen Filterelemente eingebaut sind. Die Filterelemente haben Porengrößen, die klein genug sind, also weniger als etwa 0,22 μm betragen, um zu verhindern, dass Schmutzstoffe wie z. B. Mikroben, Staub und andere unerwünschte Materialien beim Ablassen des Vakuums in die Röhrchen oder Behälter gezogen werden, während zugelassen wird, dass Luft oder andere Gase während der Gefriertrocknung in die Röhrchen oder Flaschen dringt bzw. dringen.
Die Kappen können von den Zentrifugengläsern oder -flaschen vollständig abnehmbar sein, oder die Kappen können durch gelenkige oder ähnliche Verbindungsstrukturen an den Röhrchen und Flaschen angebracht sein. Die Kappen können hinsichtlich der Art und Weise, wie sie mit den Röhrchen oder Flaschen verbindbar sind, in jedweder herkömmlichen Ausführung gestaltet sein. Das heißt, die Kappen können dazu ausgelegt sein, im offenen Ende der Röhrchen oder Flaschen aufgenommen zu werden, oder die Kappen können so ausgeführt sein, dass das offene Ende der Röhrchen oder Flaschen in einer unteren Vertiefung der Kappe aufgenommen wird. Alternativ können die Kappen ringförmige Vertiefungen (Kanten) umfassen, die durch konzentrische zylindrische Strukturen definiert sind, so dass das offene Ende der Röhrchen oder Flaschen in den ringförmigen Vertiefungen aufgenommen wird und die konzentrischen zylindrischen Strukturen das offene Ende der Röhrchen oder Flaschen überspannen. Es liegt auch innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung, Kappen zu verwenden, die an den Röhrchen oder Flaschen angebracht werden können, und zwar durch Innen- oder Außengewinde, die mit komplementären Außen- oder Innengewinden zusammenwirken, welche am Röhrchen oder an den Flaschen vorgesehen sind.
Die Röhrchen- und Flaschenkappen der vorliegenden Erfindung sind an ihrer Spitze mit einer oder mehreren Öffnungen versehen. Ein oder mehrere Filterelemente ist bzw. sind solcherart positioniert, um sich über die Öffnungen zu erstrecken. Die Filterelemente können an einer oberen oder an einer unteren Seite der Kappe vorgesehen sein, so lange es sich über die Öffnungen) erstreckt. Alternativ kann sich das Filterelement innerhalb der Öffnung befinden.
Die Öffnung kann jegliche gewünschte Form aufweisen; die Verwendung kreisförmiger Öffnungen könnte jedoch vom Standpunkt der Herstellung aus betrachtet zweckmäßiger sein. Es ist anzumerken, dass die Öffnungen ziemlich klein sein können, da sie zum Zweck der Belüftung vorgesehen sind. Bei erfolgreich getesteten Mustergeräten wurden die Öffnungen hergestellt, indem die Kappen der Mikrozentrifugengläser mit einer Nadel durchstochen wurden. Die resultierenden Öffnungen hatten einen Durchmesser von ungefähr 0,2–0,5 mm. Es gibt keine Obergrenze hinsichtlich dessen, wie groß die Öffnungen sein dürfen; bei größeren Öffnungen kann es jedoch notwendig sein, Stützstrukturen über den Öffnungen vorzusehen, um die Filterelemente zu stützen, so dass diese beim Ablassen des Vakuums nicht durch die Öffnungen gezogen werden.
Um das Filterelement (die Filtereinrichtung) zu schützen oder die Öffnungen) verstopfungsfrei zu halten, kann ein Deckel bereitgestellt werden, der an der Spitze der Kappe befestigt sein kann. Ein solcher Deckel kann in derselben Weise an der Kappe befestigt sein, wie die Kappe selbst am Röhrchen oder an der Flasche befestigt ist. Ansonsten kann der Deckel ein relativ flaches Element sein, welches durch Klebstoff an der Kappe befestigt ist. Der Deckel kann auch fest an der Kappe angebracht sein und einen Abschnitt umfassen, welcher abgerissen und entfernt werden kann, um das Filterelement freizulegen. Wenn der Deckel fest an der Kappe angebracht ist, sollte er belüftet werden.
Hinsichtlich der Trocknung einer Probe unter Verwendung eines Instantbehälters kann bevorzugterweise außerhalb des Behälters ein Trockenmittel platziert werden, um eine vollständige Trocknung der Probe sicherzustellen oder um zu verhindern, dass flüchtige Materialien erneut in den Behälter dringen. Geeignete Trockenmittel umfassen aktivierte Tonerde, Calciumchlorid, Kieselgel, Zinkchlorid und dergleichen.
Wie in 1 gezeigt, ist eine Querschnittsansicht eines Zentrifugenglases gemäß einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dargestellt, wobei sich die Kappe in der offenen Position befindet. Das Zentrifugenglas 1 der 1 weist mit Ausnahme der Kappenstruktur einen herkömmlichen Aufbau auf. Alternativ können andere herkömmliche Zentrifugengläser oder -flaschen vorgesehen sein. Die Kappe 2, welche durch ein Scharnierglied 4 am Schlauchkörper 3 angebracht ist, umfasst eine Öffnung 5 in der Kappe 2. Die Öffnung 5 ist durch ein Filterelement 6 bedeckt. Wie obenstehend erörtert, kann das Filterelement 6 entweder an der oberen oder an der unteren Seite der Kappe 2 vorgesehen sein, solange es sich über die Öffnung 5 erstreckt. Alternativ kann sich das Filterelement 6 innerhalb der Öffnung 5 befinden.
Das Filterelement 6 kann durch Klebstoff oder Zement an der Kappe 2 befestigt sein. Alternativ kann das Filterelement 6 durch ein Schweißverfahren, wie z. B. Wärmeschweißen, HF-Schweißen oder Ultraschall-Schweißen, an der Kappe 2 befestigt werden. Es ist auch möglich, den Filter an der Kappe 2 oder in der Öffnung 5 der Kappe 2 zu befestigen, und zwar durch ein mechanisches Element wie z. B. einen Haltering oder eine Haltekerbe, mit dem/der oder durch den/die das Filterelement 6 an der Kappe angebracht ist. Ein Haltering mit einem Durchmesser, der größer als jener des Filterelements 6 ist, könnte beispielsweise über dem Filter platziert und an der Kappe 2 befestigt sein. Gleichermaßen könnte ein Stützring oder eine Stützleiste in der Bohrung der Öffnung 5 vorgesehen sein, und das Filterelement 6 könnte entweder direkt am Stützring befestigt sein oder das Filterelement könnte durch einen Haltering am Stützring befestigt sein.
Das Zentrifugenglas 1 ist aus einem Material/aus Materialien gefertigt, welches) nicht nachteilig mit den Verbindungen reagiert/reagieren, mit denen es in Kontakt geraten soll. Solche Zentrifugengläser und -flaschen sind herkömmlich gemäß dem Stand der Technik. Desgleichen sollten das Filterelement 6 und jegliche Stützstrukturen, einschließlich Klebstoffe und Zemente, so ausgewählt sein, dass sie Materialien, mit denen sie in Kontakt geraten, nicht verunreinigen. Ein für das Filterelement 6 bevorzugtes Material ist Nylon. Die Porengröße des Filterelements 6 kann nach Wunsch gewählt werden, um das Eindringen von Schmutzstoffen in das Zentrifugenglas 1 zu verhindern. Es wurden erfolgreich Mikrozentrifugengläser getestet, bei denen das Filterelement eine Porengröße von 0,2 μm hatte. Ein ringförmiger Verschlussteil 7 ertreckt sich von einer Unterseite der Kappe 2 nach unten, welcher Verschlussteil an einem distalen Ende einen sich nach außen erstreckenden, halbkreisförmigen Dichtungsteil 8 aufweist.
2 ist eine Querschnittsansicht des Zentrifugenglases 1 der 1, wobei sich die Kappe 2 in der geschlossenen Position befindet. Es ist wichtig, dass jegliche Filtereinrichtung oder die Filtereinrichtung stützende Kappenstruktur das Zentrifugenglas 1 ausreichend verschließt, so dass keinerlei Schmutzstoffe, z. B. Mikroben, in das Röhrchen gezogen werden können, außer durch das Filterelement 6, wenn die Kappe 2 am Schlauchkörper 3 befestigt ist. Demgemäß soll ein solcher Behälter, wie hier angemerkt, durch die Filtereinrichtung „im Wesentlichen verschlossen" sein. Diesbezüglich können die Kappen, wie obenstehend erörtert, hinsichtlich der Art und Weise, wie sie mit den Röhrchen oder Flaschen verbindbar sind, in jedweder herkömmlichen Ausführung gestaltet sein. Wie in 2 gezeigt, erstreckt sich der ringförmige Verschlussteil 7 nach unten in das Röhrchen 1. Der Dichtungsteil schafft eine sterile Abdichtung entlang einer Innenseite des Röhrchens 1.
3 ist eine Draufsicht auf das Zentrifugenglas der 2 gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. In 3 ist die Kappe 2 dargestellt, und zwar umfassend eine Mehrzahl von mit Zwischenraum angeordneten Löchern 9.
4 ist eine Draufsicht auf das Zentrifugenglas der 2 gemäß einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. In 4 ist die Kappe 2 dargestellt, und zwar umfassend eine einzige Öffnung 10, welche einen Durchmesser aufweist, der größer als jener des Röhrchens 1 ist.
Wie obenstehend in Bezug auf 3 erörtert, kann die Kappe 2 eine oder mehrere Öffnungen 9 umfassen, welche jegliche gewünschte Form aufweisen kann bzw. können. Da die Öffnungen) bereitgestellt ist/sind, um beim Verdampfen der darin befindlichen Flüssigkeit einen Gasaustausch oder -austritt zuzulassen und um beim Ablassen des Vakuums Luft hereinzulassen, reicht es aus, eine einzige Öffnung mit einem Durchmesser von 0,2–0,5 mm vorzusehen. Wenn größere Öffnungen verwendet werden, können über den Öffnungen Stützstrukturen vorgesehen sein, um die Filterelemente zu stützen, so dass sie beim Ablassen des Vakuums nicht durch die Öffnungen gezogen werden oder so dass die Filterelemente beim Anlegen des Vakuums nicht durch die Öffnungen gesaugt werden.
5 ist eine Querschnittsansicht eines Zentrifugenglases, welches einen Deckel gemäß einer dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst. Um das Filterelement 6 vor unbeabsichtigter Beschädigung zu schützen, kann ein Deckel 11 vorgesehen sein. Der Deckel 11 kann in derselben Weise an der Kappe 2 befestigt sein, wie die Kappe 2 selbst am Zentrifugenschlauchkörper 3 befestigt ist. Ansonsten kann der Deckel 11 ein relativ flaches Element sein, welches durch Klebstoff an der Kappe 2 befestigt ist. Der Deckel 11 kann auch fest an der Kappe 2 angebracht sein und einen Abschnitt umfassen, welcher abgerissen und entfernt werden kann, um das Filterelement 6 freizulegen, um zu ermöglichen, dass durch das Filterelement 6 und durch die Kappe 2 Luft strömt.
6 ist eine Querschnittsansicht einer Kappe gemäß einer vierten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Die Kappe 2 der 6 umfasst Innengewinde 12. Diese Kappe 2 kann an einem Zentrifugenglas oder an einer Zentrifugenflasche befestigt sein, welches bzw. welche angrenzend an das offene Ende kooperierende Außengewinde umfasst. Desgleichen können in der Kappe 2 und im Schlauchkörper 3 Verschlussstrukturen, wie z. B. Bajonettringe, eingebaut sein.
Die vorliegende Erfindung ist auf alle Arten von Gefäßen, die für die Gefriertrocknung verwendet werden, anwendbar, namentlich auf alle Arten von abgedeckten Teströhrchen, Zentrifugengläsern, Ampullen, Flaschen etc..
Bei Verwendung der erfindungsgemäßen Zentrifugengläser während eines sterilen Lyophilisierungsverfahrens wird Luft, die in das Zentrifugenglas gezogen wird, bei Beendigung des Vakuums nach der Gefriertrocknung filtersterilisiert. Das heißt, Schmutzstoffe wie z. B. Mikroben, Staub und andere unerwünschte Materialien werden vom Filterelement zurückgehalten, so dass sie nicht in das Zentrifugenglas dringen.
Eine erfindungsgemäße Vorrichtung kann zum Trocknen von Materialien verwendet werden, die in einer Mikroben-, Gewebe-, Organ- oder Pflanzenkultur zur Anwendung kommen, wie z. B. von Proteinen, Peptiden, Nucleinsäuren etc., und zwar insbesondere dort, wo ein geringes Volumen in kleinere Aliquote für die Lagerung aufgeteilt werden soll. Eine Filtersterilisation solcher Aliquote (z. B. 50 Mikroliter) ist schwierig, so dass eine Filtersterilisation am besten vor dem Aliquotieren und Gefriertrocknen durchgeführt wird.
Bei einem typischen sterilen Gefriertrocknungsvorgang gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Verbindung, die von Interesse ist, z. B. ein Protein, ein Peptid, eine Nucleinsäure etc., welches bzw. welche sich in Lösung befindet, in einen erfindungsgemäßen Behälter gegeben. Das Zentrifugenglas wird mit einer Kappe verschlossen, welche ein eingebautes Filterelement aufweist, so wie obenstehend beschrieben, und wird in einen Zentrifugalapparat wie z. B. den Speed-Vac° gegeben.
Ein Vakuum von ungefähr 6,665 bis 66,65 Pa (50 bis 500 Millitorr) wird an der Verbindung angelegt, während die Verbindung zentrifugiert wird. Das hohe Vakuum bewirkt, dass sich ein Teil der Flüssigkeit in der Lösung in Gas umwandelt und die Lösung verlässt. Diese Phasenänderung entzieht der Lösung Wärme und neigt dazu, gleichzeitig mit dem Trocknen des Materials ein Gefrieren zu bewirken. Wie obenstehend erörtert, tendiert die Zentrifugalkraft der Zentrifuge dazu, die Flüssigphase am Boden des Zentrifugenglases zu halten, so dass diese nicht mit dem vergasten Teil der Lösung ausströmt.
Nach Beendigung der Gefriertrocknung wird das Vakuum abgestellt und Umgebungsgas, wie z. B. Luft oder ein inertes Gas, wird durch das Filterelement in der Kappe in das Zentrifugenglas gezogen. Das Passieren des Umgebungsgases durch das Filterelement bewirkt eine Filtersterilisation des Umgebungsgases und verhindert somit eine Verunreinigung der gefriergetrockneten Verbindung.
Wie aus der obenstehenden Erörterung ersichtlich ist, besteht ein Hauptvorteil der vorliegenden Erfindung darin, dass sie gestattet, zahlreiche Arbeitsgänge der Reihe nach im gleichen Behälter durchzuführen. Insbesondere können manche oder alle der folgenden Schritte in einem einzigen Röhrchen oder in einer einzigen Flasche durchgeführt werden:

(1) Eine Probe kann in den Behälter aliquotiert werden;
(2) Der Behälter kann verschlossen werden, wobei durch die Filtereinrichtung Gase dringen und möglicherweise um die Kappe herumströmen, und zwar zwischen deren Berührungsfläche mit dem Behälterkörper (solange zwischen der Kappe und dem Behälterkörper keine Mikroben hindurchdringen können);
(3) Die Probe kann mit oder ohne Gefriertrocknung getrocknet werden;
(4) Die Probe kann mit der Außenumgebung belüftet werden;
(5) Die Probe kann gefriergetrocknet werden, einschließlich des Anlegens eines Vakuums und einer Zentrifugation;
(6) Die Probe kann im gleichen Behälter, z. B. in einem Gefrierraum, gelagert werden;
(7) Eine getrocknete Probe kann unter Verwendung von Wasser oder anderer Lösungsmittel im Behälter aufgelöst oder wiederhergestellt werden;
(8) Die Probe kann im Behälter bewegt werden, um die Bestandteile darin zu vermischen, durch welchen Vorgang üblicherweise an den Innenwänden des Behälters Material abgelagert wird;
(9) Die Probe kann zentrifugiert werden, um Bestandteile an den Wänden zurück zum Boden des Behälters zu drücken;
(10) Sollte sich partikuläres Material bilden, z. B. wenn ein Protein denaturiert wird, so werden im Schleuderschritt die Feststoffteilchen zusammengesammelt, was bei der zukünftigen Handhabung hilft, z. B. indem eine Pipette nicht verstopft wird;
(11) Die Probe kann für eine spätere Verwendung aus dem Behälter herausgenommen werden; und
(12) Sollte Probe übrig bleiben, kann diese erneut gefriergetrocknet werden und die vorhergehenden Schritte können wiederholt werden.

Claims

Verfahren zum Trocknen einer festen oder flüssigen Probe, einschließlich eines verdampfbaren Materials, in einem Behälter, umfassend die folgenden Schritte: das Bereitstellen des die Probe enthaltenden Behälters, wobei der Behälter eine Öffnung definiert, welche Öffnung im Wesentlichen durch eine Filtereinrichtung verschlossen ist, welche Filtereinrichtung zulässt, dass das verdampfbare Material durchdringt, und im Wesentlichen verhindert, dass Mikroben durchdringen; und das Zulassen, dass zumindest ein Teil des verdampfbaren Materials durch die Filtereinrichtung dringt, einschließlich des Unterziehens der Probe einer Zentrifugation, wodurch zumindest eine teilweise Trocknung der Probe ohne erhebliche mikrobielle Verunreinigung erzielt wird.
Verfahren zum Belüften einer in einem Behälter enthaltenen Probe, umfassend die folgenden Schritte: das Bereitstellen des die Probe enthaltenden Behälters, wobei der Behälter eine Öffnung aufweist, die im Wesentlichen durch eine Filtereinrichtung verschlossen ist, welche Filtereinrichtung zulässt, dass das zumindest eine Gas durchdringt, und im Wesentlichen verhindert, dass Mikroben durchdringen, wobei der Behälter dazu ausgelegt ist, einer Hochgeschwindigkeitszentrifugation von 50 mal der Schwerkraft oder mehr standzuhalten; und das Zulassen, dass das Gas in den Behälter dringt oder aus diesem austritt, indem es durch die Filtereinrichtung dringt, wodurch ein Belüften der Probe ohne erhebliche Verunreinigung der Probe mit Mikroben erzielt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Schritt des Bereitstellens das Hineingeben der Probe in den Behälter durch die Öffnung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 3, weiters umfassend, dass die Öffnung anschließend durch die Filtereinrichtung zumindest teilweise im Wesentlichen verschlossen wird.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Behälter eine an einem Schlauchkörper gelenkig angebrachte Kappe umfasst, wobei die Filtereinrichtung von der Kappe getragen wird und der Schritt des im Wesentlichen Verschließens das Verbinden der Kappe mit dem Schlauchkörper umfasst, um ein Hindurchdringen von Mikroben zwischen der Kappe und dem Schlauchkörper im Wesentlichen zu verhindern.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Schritt des Hineingebens der Probe in den Behälter die folgenden Schritte umfasst: das zumindest teilweise Einführen einer Probeneinspritzvorrichtung in den Behälter durch die Öffnung; und das Hineingeben von zumindest einem Teil der Probe in den Behälter durch die Probeneinspritzvorrichtung.
Verfahren nach Anspruch 6, weiters umfassend die folgenden Schritte: das Einführen der Probeneinspritzvorrichtung durch die Filtereinrichtung; das Hineingeben von zumindest einem Teil der Probe in den Behälter durch die Probeneinspritzvorrichtung, während die Probeneinspritzvorrichtung durch die Filtereinrichtung eingeführt wird; und anschließend das Herausnehmen der Probeneinspritzvorrichtung aus der Filtereinrichtung.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Schritt des Zulassens, dass das verdampfbare Material durch die Filtereinrichtung dringt, das Aussetzen der Probe an ein Vakuum umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Probe gleichzeitig einer Zentrifugation und dem Vakuum ausgesetzt wird, um die Probe zumindest teilweise gefrierzutrocknen.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Probe unter Bedingungen, die keine Gefriertrocknung der Probe zulassen, gleichzeitig einer Zentrifugation und dem Vakuum ausgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Schritt des Zulassens, dass das verdampfbare Material durch die Filtereinrichtung dringt, das Bereitstellen von Mitteln außerhalb des Behälters zum Reduzieren des Vorhandenseins des Materials außerhalb des Behälters umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Behälter dazu ausgelegt ist, einer Hochgeschwindigkeitszentrifugation von etwa 1500 mal der Schwerkraft oder mehr standzuhalten.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Behälter dazu ausgelegt ist, einer Hochgeschwindigkeitszentrifugation von etwa 3000 mal der Schwerkraft oder mehr standzuhalten.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Schritt des Bereitstellens des die Probe enthaltenden Behälters das Hineingeben einer flüssigen Probe in den Behälter umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, weiters umfassend den Schritt des Verschließens der Öffnung im Behälter mit einer Kappe.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Behälter eine Zentrifugenflasche ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Behälter ein Zentrifugenglas ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Probe zumindest eines von einem Protein, einer Nucleinsäure, einem Peptid, einem Zucker und einem Lipid umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Probe ein Material umfasst, das einer Zersetzung oder Denaturierung unterliegt, wenn es nicht gefriergetrocknet ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Filtereinrichtung im Wesentlichen kein Durchdringen von Materialien mit einem Durchmesser von mehr als etwa 0,2 Mikrometern zulässt.
Behälteraufbau zum Hineingeben in eine Zentrifuge, umfassend: einen Behälter mit einem geschlossenen Ende und einem offenen Ende, der einen Innenraum definiert, wobei der Behälter in der Lage ist, einer Zentrifugation von etwa 50 mal der Schwerkraft oder mehr standzuhalten; und eine Kappe mit einer offenen Position und einer geschlossenen Position zum Verschließen des offenen Endes, wobei die Kappe eine mikrobenundurchlässige Filtereinrichtung umfasst, um einen Gasstrom von außerhalb des Behälters in den Innenraum zu ermöglichen und um einen Gasstrom aus dem Innenraum heraus zu ermöglichen.
Behälteraufbau zum Hineingeben in eine Zentrifuge, umfassend: einen Behälter mit einem geschlossenen Ende und einem offenen Ende, der einen Innenraum definiert, wobei der Behälter so geformt ist, um der Form eines Zentrifugenrotors oder -kastens zu entsprechen; und eine Kappe mit einer offenen Position und einer geschlossenen Position zum Verschließen des offenen Endes, wobei die Kappe eine mikrobenundurchlässige Filtereinrichtung umfasst, um einen Gasstrom von außerhalb des Behälters in den Innenraum zu ermöglichen und um einen Gasstrom aus dem Innenraum heraus zu ermöglichen.
Behälteraufbau nach Anspruch 21 oder 22, wobei der Behälter ein Mikrozentrifugenglas ist, das dazu ausgelegt ist, einer Hochgeschwindigkeitszentrifugation von etwa 1500 mal der Schwerkraft oder mehr standzuhalten.
Behälteraufbau nach Anspruch 21 oder 22, weiters umfassend ein im Innenraum enthaltenes Material, das einer Zersetzung oder Denaturierung unterliegt.
Behälteraufbau nach Anspruch 21 oder 22, wobei der Behälter einen zylindrischen Körper und einen konischen, halbkugelförmigen oder flachen Boden aufweist.
Behälteraufbau nach Anspruch 21 oder 22, weiters umfassend einen auf der Kappe platzierten Deckel zum Schützen der Filtereinrichtung.
Behälteraufbau nach Anspruch 26, wobei der Deckel eine luftdicht verschlossene Abdichtung um die Filtereinrichtung ergibt.
Behälteraufbau nach Anspruch 21 oder 22, wobei die Kappe eine Ringkante umfasst, die sich nach unten in den Behälter erstreckt, wenn sich die Kappe in der geschlossenen Position befindet.
Behälteraufbau nach Anspruch 21 oder 22, wobei die Kappe durch ein Scharnier mit dem Behälter verbunden ist.
Behälteraufbau nach Anspruch 21 oder 22, wobei die Kappe durch ein Gewinde mit dem Behälter verbunden ist.
Behälteraufbau nach Anspruch 21 oder 22, wobei das geschlossene Ende konisch geformt ist.
Behälteraufbau nach Anspruch 21 oder 22, wobei die Kappe eine Öffnung definiert und die Filtereinrichtung die Gesamtheit der Öffnung bedeckt.
Behälteraufbau nach Anspruch 32, wobei die Filtereinrichtung durch Klebstoff Zement, eine Schweißung oder eine mechanische Halterung an der Kappe befestigt ist.
Behälteraufbau nach Anspruch 21 oder 22, wobei die Filtereinrichtung eine Mehrzahl von durch die Kappe definierten Öffnungen bedeckt.
Behälteraufbau nach Anspruch 21 oder 22, wobei die Filtereinrichtung einen Membranfilter umfasst.