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Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Mischen und Zentri-
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fugieren von Proben und insbesondere zum Mischen der Proben mit einer
Behandlungsflüssigkeit und vorzugsweise eine Vorrichtung zur Feststellung pathogener
Mikroben in Proben von Körperflüssigkeit.
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Eine der schwersten Infektionskrankheiten ist die Septikämie, also
die Anwesenheit von pathogenen Mikroorganismen im Blut.
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Die Sterblichkeit von Septikämiepatienten liegt bei etwa 25 %.
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Wenn darüber hinaus die Septikämie von einem Schock begleitet ist,
steigt die Mortalität über 60 %. Besonders anfällig gegenüber Septikämie sind Patienten
mit zehrenden Krankheiten, Patienten nach schweren Operationen oder Patienten, die
Immunsuppressiva oder Zytostatika erhalten haben. Da die Septikämie eine überaus
schnelle Verschlechterung des Zustandes des Patienten bewirkt, ist eine frühzeitige
Diagnose und Behandlung besonders wichtig. Der Arzt muß nicht nur wissen, daß der
Patient an Septikämie leidet, sondern muß schnell den betreffenden infizierenden
Mikroorganismus erkennen können,
so daß die genaue Diagnose der
Septikämie von einer möglichst schnellen und wirksamen quantitativen Analyse des
Patientenblutes abhängt.
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Die bislang üblichen Verfahren und Vorrichtungen zur Bestimmung der
im Blut vorhandenen Mikroorganismen haben erhebliche Nachteile, wie beispielsweise
eine lange Bestimmungszeit, das Unvermögen verschiedene Arten pathogener Mikroben
in einer Blutprobe zu unterscheiden und ferner den Nachteil, daß man mit diesem
Verfahren kaum eine quantitative Information erhält, wobei schließlich noch die
Gefahr besteht, daß eine Kontamination durch die Laborluft oder durch das Laborpersonal
auftritt.
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Aus der US-PS 3 928 139 ist ein verbessertes Verfahren zur Bestimmung
der Mikroben entwickelt worden, welches schnell und quantitativ ohne die Gefahr
einer Kontamination der Probe durchgeführt werden kann. Bei diesem Verfahren zur
Bestimmung der pathogenen Mikroben wird eine Körperflüssigkeitsprobe, beispielsweise
Blut, auf ein Flüssigfiltermedium in einer umschlossenen sterilen Zone aufgebracht.
Das Flüssigfiltermedium hat eine größere Dichte als die Flüssigkeitsprobe und stellt
eine sterile wässrige Lösung dar, die selektiv pathogene Mikroben aus der Flüssigkeitsprobe
aufnimmt. Anschließend wird die umschlossene sterile Zone zentrifugiert, wobei die
Flüssigkeitsprobe
gegen das Filtermedium gedrückt wird, wodurch die pathogenen Mikroben veranlaßt
werden, selektiv in das Filtermedium überzugehen und sich von der Masse der Flüssigkeitsprobe
abzutrennen. Danach wird das flüssige Filtermedium mit den darin enthaltenen pathogenen
Mikroben vom Rest der Flüssigkeitsprobe abgetrennt und Proben vom flüssigen Filtermedium
werden den üblichen Kulturbedingungen unterworfen.
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Vorrichtungen zur Durchführung dieses Verfahrens sind beispielsweise
in der US-PS 3 875 012 beschrieben.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine verbesserte Misch-
und Zentrifugiervorrichtung vorzuschlagen, welches ein längliches Zentrifugierröhrchen
aufweist und einen evakuierten Raum umschließt und an einem Ende einen durchstechbaren
Verschluß besitzt, der eine Kammer für eine Behandlungsflüssigkeit für die Probe
enthält. Die Probenbehandlungsflüssigkeit ist in der Kammer für die Behandlungsflüssigkeit
angeordnet. Gemäß Erfindung wird eine neuartige Injektionsnadel vorgesehen, die
an ihrer Wand Öffnungen aufweist, die in Längsrichtung einen Abstand aufweisen,
so daß beim Einstechen der Nadel in den Verschluß mindestens eine Öffnung mit der
Kammer für die Behandlungsflüssigkeit in Verbindung steht. Bei der Injektion einer
Probe in den evakuierten Raum des Zentrifugierröhrchens wird die Probe mit der Behandlungsflüssigkeit
vermischt, wobei das Vermischen
durch die Öffnung oder durch die
Öffnungen der neuartigen Injektionsnadel erleichtert wird, so daß die Probe mit
der Behandlungsflüssigkeit in guten Mischkontakt gelangt, worauf beide Flüssigkeiten
in den evakuierten Bereich des Zentrifugierröhrchens gespritzt werden.
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Vorzugsweise wird gemäß Erfindung ein flüssiges Filtermedium verwendet,
daß eine größere Dichte als die Probeflüssigkeit besitzt und daß zur selektiven
Aufnahme von pathogenen Mikroben aus der Probenflüssigkeit dient. Dieses flüssige
Filtermedium ist in dem evakuierten Bereich des Zentrifugierröhrchens angeordnet,
wobei das andere Ende des Zentrifugiergefäßes gegenüber dem ersten Ende mit einem
zweiten durchstechbaren Verschluß abgedichtet ist.
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Ferner wird nach einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführung diese
Zentrifugier- und Mischvorrichtung mit einer Spritze versehen, um das flüssige Filtermedium
aus dem evakuierten Raum zu entfernen, wobei eine Injektionsnadel vorgesehen ist,
die eine geschlossene Spitze und eine oder mehrere öffnungen an ihrer Wand besitzt,
so daß beim Durchführen durch den zweiten Verschluß oder durch die zweite Durchstichkappe
die Öffnungen nahe an der Innenfläche des zweiten Verschlusses liegen. Wenn das
flüssige Filtermedium abgesogen wird, soll eine kleine Menge der Flüssigkeitsprobe
oberhalb der Grenzschicht
des flüssigen Filtermediums abgezogen
werden, um sicherzustellen, daß die Mikroorganismen an dieser Grenzschicht aufgenommen
werden. Wenn die Spritze zur Entfernung des flüssigen Filtermediums in dem Zentrifugierröhrchen
verwendet wird, wird sie gleichmäßig in Richtung auf die Innenfläche des zweiten
Verschlusses und in die Öffnungen der Injektionsnadel gezogen, so daß keine überschüssigen
Teile der Probenflüssigkeit mit Ausnahme einer kleinen Menge oberhalb der Grenzfläche
des flüssigen Filtermediums in die Spritze gesaugt wird Die Erfindung wird anhand
von Zeichnungen im einzelnen näher erläutert; es zeigen: Fig. 1 einen Querschnitt
einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform des Zentrifugierröhrchens; Fig.
2 bis 8 schematische Darstellungen des Verfahrens zur Bestimmung pathogener Mikroben
mittels der erfindungsgemäßen Vorrichtung; Fig. 9 und 10 zwei Ansichten der neuartigen
Injektionsnadel zum Injizieren einer Probe in das Zentrifugierröhrchen; Fig. 11
eine Ansicht einer neuartigen Injektionsnadel zur Entfernung und Abtrennung eines
Teiles des flüssigen Filtermediums, das im Zentrifugierröhrchen enthalten ist.
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Die Misch- und Zentrifugiervorrichtung 10 besteht aus einem länglichen
Zentrifugierröhrchen 12 mit einer das untere Ende des Zentrifugierröhrchens verschließenden
Durchstichkappe 14 und einer das obere Ende des Zentrifugierröhrchens dichtend verschließenden
Durchstichkappe 16.
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Das Zentrifugierröhrchen 12 kann aus Glas oder hartem Kunststoff,
z.B. eines Polykohlenwasserstoff oder Polypropylen bestehen. Die Durchstichkappen
14 und 16 können selbstdichtende Gummistopfen sein. Die Durchstichkappe 14 hat eine
flache Innenfläche 18, die im wesentlichen rechtwinklig zu der Wand des Zentrifugierröhrchens
verläuft. Diese flache Innenfläche verhindert die Ablagerung von pathogenen Mikroben
an hochstehenden Innenlippen, die bei üblichen Stopfen für Röhrchen und dergleichen
vorhanden sind. Darüber hinaus erleichtert die flache Innenfläche eine deutliche
Betrachtung des Gemisches aus der Probe und dem Filtermedium während der verschiedenen
Trennschritte.
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In der Durchstichkappe 16 ist eine Kammer 16a für Behandlungsflüssigkeit
20 vorgesehen. Diese Kammer wird dadurch gebildet, daß man einen Endverschluß 22
auf das offene Ende eines hohlen rohrförmigen Stopfens in den Randbereichen 22a
verklebt. Dieser Verschlußteil 22 wird beim Einbringen der Injektionsnadel
nicht
aus seiner Stellung verdrängt, so daß die Kammer 16a für die Behandlungsflüssigkeit
beim Durchstoßen ihre Struktur beibehält. Demzufolge wird das Vermischen der Behandlungsflüssigkeit
mit der Probe nicht dadurch erzielt, daß man beide Flüssigkeiten zusammen in den
evakuierten Raum 40 eintreten läßt. Statt dessen wird die im folgenden beschriebene
Injektionsnadel verwendet, um ein gründliches Durchmischen der Flüssigkeit in der
Kammer für die Behandlungsflüssigkeit und/oder in dem Kanal der Injektionsnadel
zu ermöglichen.
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Die Kammer für die Behandlungsflüssigkeit ist mittig in dem Stopfen
16 angeordnet und im allgemeinen zylindrisch geformt.
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Die Kammer für die Behandlungsflüssigkeit kann jedoch jede beliebige
Form und Ausdehnung besitzen, je nach dem welche Behandlungsflüssigkeit verwendet
wird. Darüber hinaus ist eine mittige Anordnung nicht unbedingt erforderlich; sie
kann an einer beliebigen Stelle des Stopfens angeordnet sein, so lange nur die Injektionsnadel
eingeführt werden kann und eine Verbindung mit dem evakuierten Raum des Zentrifugierröhrchens
stattfindet. Vorzugsweise wird die Behandlungsflüssigkeit mittels einer Spritze
seitlich in den Verschlußstopfen 16 eingespritzt; der dann auf das Zentrifugierröhrchen
12 aufgesetzte Stopfen läßt keine Behandlungsflüssigkeit austreten, da das Einstichloch
an der Glaswand anliegt.
Man kann auch die Behandlungsflüssigkeit
für die Probe in die Kammer 16a einfüllen und dann anschließend den Verschlußteil
22 an den umlaufenden Randbereichen 22a festkleben.
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Die in den Fig. 9 und 10 wiedergegebene bevorzugte Injektionsnadel
23 zur Injektion der Probe in das Zentrifugierröhrchen besitzt mindestens zwei Öffnungen
24 und 26 in der Nadelwand, die in Längsrichtung voneinander einen Abstand aufweisen,
so daß bei der Injektion beide Öffnungen in der Kammer 16 mit der Behandlungsflüssigkeit
Platz haben. Ferner ist zwischen den beiden Öffnungen eine Sperranordnung 28 beispielsweise
in Form einer zusammengekniffenen Stelle vorgesehen, um die Verbindung des Kanals
der Injektionsnadel zwischen den beiden Öffnungen 24 und 26 zu unterbinden, so daß
die injizierte Probe aus der Öffnung 24 in die Kammer 16a ausgespritzt wird.
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Die Öffnung 26 unterhalb der Sperranordnung steht in Verbindung mit
dem evakuierten Bereich des Zentrifugierröhrchens über den Kanal der Injektionsspritze
und eine weitere öffnung 30. Wenn die Probe aus der Injektionsnadel 23 durch die
Öffnung 24 in die Kammer 16a ausgespritzt wird, ergibt sich eine Turbulenz in der
Kammer für die Behandlungsflüssigkeit, wodurch eine intensive Vermischung der Probe
mit der Behandlungsflüssigkeit 20 erfolgt. Diese Mischung aus Behandlungsflüssigkeit
und Probe tritt dann wieder in die Injektionsnadel durch die zweite Öffnung 26 ein
und wird von dem Vakuum
in dem evakuierten Bereich 40 des Zentrifugierröhrchens
durch den unteren Teil des Kanals der Injektionsnadel abgesogen und tritt aus der
Öffnung 30 am Ende dieser Nadel 23 auf das Filtermedium.
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Sowohl oberhalb der Sperranordnung als auch unterhalb derselben können
mehrere Öffnungen vorgesehen sein. Die Sperranordnung kann entweder in Form eines
Stopfens in dem Kanal der Injektionsnadel oder wie in den Fig. 9 und 10 durch ein
Zusammendrücken der Nadelwand ausgebildet sein. Die Spitze der Injektionsnadel kann
wie üblich ausgebildet sein, jedoch wird eine abgeflachte spatenartige Spitze 32
mit zwei Öffnungen 30 direkt oberhalb der Abflachung bevorzugt, um eine gleichmäßige
Verteilung der Mischung aus Probe und Behandlungsflüssigkeit in dem evakuierten
Bereich 40 des Zentrifugierröhrchens 12 zu ermöglichen.
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Es wurde festgestellt, daß es nicht unbedingt erforderlich ist, zwei
durch eine Sperranordnung getrennte Öffnungen vorzusehen, um ein gründliches Mischen
zu ermöglichen. Demzufolge reicht es auch aus, eine öffnung an der Wand der Injektionsnadel
mit einem gewissen Längsabstand vorzusehen, um eine Verbindung mit der Kammer für
die Behandlungsflüssigkeit bei der Injektion zu ermöglichen. Bei der Injektion der
Probe saugt die Öffnung in der Kammer für die Behandlungsflüssigkeit
diese
Behandlungsflüssigkeit in den Kanal der Injektionsnadel und die Behandlungsflüssigkeit
wird gründlich mit der Probe darin vermischt. Die Mischung aus Probe und Behandlungsflüssigkeit
wird dann in den evakuierten Bereich 40 im Zentrifugierröhrchen 12 eingebracht.
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Fig. 11 zeigt eine neuartige Injektionsnadel 35 zur Entfernung einer
dünnen Flüssigkeitsschicht nahe an der flachen Innenfläche 18 des zweiten Verschlußteiles,
nämlich der Durchstichkappe 14. Die Nadel 35 kann beliebig lang sein, und zwar so
lang sein, daß die zweite Durchstichkappe durchbohrt wird. Ein wesentliches Merkmal
ist es, daß die Spitze 34 der Nadel 35 geschlossen ist und daß mindestens eine öffnung
36 in einem gewissen Längsabstand an der Wand der Nadel so angeordnet ist, daß beim
vollen Einstechen der Nadel durch die Durchstichkappe 14 die Öffnungen 36 etwas
oberhalb der flachen Innenfläche 18 des Verschlußteiles 14 zu liegen kommt. Bei
einer bevorzugten Ausführungsform gemäß Fig. 11 ist die Spitze 34 der Nadel 35 zur
besseren Abdichtung abgeflacht und besitzt zwei koaxiale öffnungen 36, die durch
die Wand der Nadel 35 führen. Der Längsabstand zwischen den Öffnungen bis zur Nadelschulter
soll etwas größer als die Dicke des zweiten Verschlußteiles 14 sein. Die Nadellänge
zwischen den Öffnungen 36 bis zur Spitze 34 kann beliebig gewählt werden.
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Da die öffnungen 36 nahe an der flachen Innenfläche des
Verschlußteiles
über der Durchstichkappe liegen, werden im allgemeinen gleichmäßige Mengen in dem
Querschnittsbereich der Flüssigkeit in dem Zentrifugierröhrchen gleichmäßig abgenommen.
Die Möglichkeit, daß man diese Flüssigkeit gleichmäßig vom Boden des Zentrifugierröhrchens
entnehmen kann, erleichtert die erforderliche Abtrennung des flüssigen Filtermediums,
das die pathogenen Mikroben enthält, von den übrigen Anteilen der Mischung aus Probe
und Filtermedium. Wenn man dagegen eine übliche Injektionsnadel mit einem offenen
Ende verwendet, ergibt sich beim Absaugen ein trichterförmiger Flüssigkeitskegel,
wodurch unerwünschte Mengen der Probe mit eingesogen werden, so daß demzufolge Teile
des flüssigen Filtermediums nicht aus dem Zentrifugierröhrchen entfernt werden.
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Der sterile Inhalt des Zentrifugierröhrchens 12 enthält ein flüssiges
Filtermedium 38 und einen evakuierten Raum 40, der ein vollständiges oder teilweises
Vakuum darstellen kann.
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Der evakuierte Raum 40 wird auf einem vorgegebenen Wert bei unteratmosphärischem
Druck gehalten, so daß das Zentrifugierröhrchen eine bekannte Flüssigkeitsmenge
durch Injektion durch die Durchstichkappe 16 aufnehmen kann, ohne daß ein Überdruck
innerhalb des Zentrifugierröhrchens aufgebaut wird, der die Durchstichkappen 14
und 16 aus den öffnungen des Zentrifugierröhrchens 12 herausdrücken würde.
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Das flüssige Filtermedium 38 kann ein beliebiges Filtermedium sein,
wie es beispielsweise in der US-PS 3 928 139 zum Nachweis von pathogenen Mikroben
bekannt ist. Es enthält im allgemeinen eine wässrige Lösung eines beliebigen gelösten
Stoffes, der gegenüber den darin suspendierten Mikroorganismen nicht toxisch ist
und eine ausreichende Dichte aufweist, um rote und weiße Blutkörperchen oder Zellreste
zu suspendieren. Der gelöste Stoff ist vorzugsweise nicht-ionisch.
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Das flüssige Filtermedium hat daher eine größere Dichte als 3 Blut,
beispielsweise mehr als 1,06 g/cm und suspendiert Blutzellen oder Blutzellreste,
kann aber pathogene Mikroben aufnehmen.
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Ferner enthält das flüssige Filtermedium vorzugsweise eine geringe
Menge eines thermisch empfindlichen Geliermittels.
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Als geeignete, in Lösung befindliche Stoffe für das flüssige Filtermedium
können Zucker eingesetzt werden wie Saccharose, Glucose, Maltose, Fruktose, Manitol,
Sorbitol und ähnliche.
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Das flüssige Filtermedium 38 enthält mindestens etwa 40 Gew.% Zucker
und kann gegebenenfalls den Zucker bis zur Sä.ttigungsgrenze enthalten. Vorzugsweise
beträgt der Gehalt an Zucker etwa 40 bis 50 Gew.% des flüssigen Filtermeiums 42.
Im allgemeinen werden Zucker und insbesondere Saccharose bevorzugt als flüssiges
Filtermeidum 42 eingesetzt, da diese Lösungen bei einem physiologischen plr-rQert
wie 6,0 bis 7,0 gehalten werden und in Verbindung mit Gelatine im Autoclaven behandelt
werden können.
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Als gelöste Stoffe können aber auch andere Verbindungen eingesetzt
werden, solange die Lösung eine höhere Dichte als Blut aufweist und Blutkörperchen
und insbesondere rote Blutkörperchen und Zellreste von roten Blutkörperchen zurückhalten
und suspendieren kann und gegenüber den pathogenen Mikroben nicht toxisch ist. Zu
anderen geeigneten Verbindungen gehört beispielsweise "Hypaque"-Natrium C118J3N2Na04
(3,5-Diacetamido-2,4,6-trijod-benzoesäure als Natriumsalz). Diese Verbindung kann
in wäßriger Lösung in gleichen Konzentrationen wie die oben angegebenen Zucker verwendet
werden. Andere in Lösung vorliegende und als wäßrige Filtermedien geeignete Verbindungen
sind makromolekulare Stoffe, die im wäßrigen Medium ein flüssiges Gel aufbauen können,
das eine so geringe Porendichte aufweist, daß rote Blutkörperchen oder deren Zellreste
nicht eindringen können, wobei aber die Porengröße groß genug ist, um pathogene
Mikroben durchzulassen. Geeignet zu diesem Zweck als gelöster Makromolekularstoff
ist beispielsweise ein wasserlösliches vernetztes Polymeres, das im löslichen Netzwerk
mikroporenartige öffnungen aufweist. Ein derartiges wasserlösliches Polymeres ist
beispielsweise das Copolymere aus Saccharose und Epichlorhydrin mit einem mittleren
Molekulargewicht von 300 000 bis 500 000, einer Strukturviskosität von etwa 0,17
dl/g, einer spezifischen DrehungCd3 D von + 56,50 und enthält dialysierbaren Stoff
in Mengen von weniger als 1 Gew.%.
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Eine derartige Verbindung wird unter der Marke "FICOLL" von der Pharmacia
FINE Chemicals Inc., 800 Centennial Avenue,
Piscastaway, N.J.,
auf den Markt gebracht. Andere geeignete Polymeren sind Dextrane mit mittleren Molekulargewichten
von 10 000 bis 2 000 000 und vorzugsweise etwa 50 000. Nach dem Auflösen in Wasser
wirken diese Polymeren als flüssige Filtermedien für pathogene Mikroben, da sie
in dem wasserlöslichen Netzwerk Mikroporenöffnungen mit einer Größe von etwa 1 bis
7 1um zu haben scheinen.
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Die wasserlöslichen Polymeren oder die gelösten Makromolekularstoffe
liegen in der wäßrigen Lösung in Konzentrationen von etwa 10 bis 40 und vorzugsweise
etwa 20 bis 30 Gew.96 vor.
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Unter dem Begriff "thermisch empfindliches Geliermittel" wird jede
Verbindung verstanden, die in der wäßriqen Lösung des Filtermediums 42 bei einer
unter Zimmertemperatur liegenden Temperatur geliert, aber bei höheren Temperaturen
wieder flüssig wird, und zwar bei solchen, die für pathogene Mikroorganismen unschädlich
sind, wie beispielsweise unter 500C und vorzugsweise nicht über 420C. Geeignete
thermisch empfindliche Geliermittel sind jeweils solche, die gegenüber der Lösung
oder der Analysenprobe keine nachteiligen Wirkungen ausjlben. Derartige Verbindungen
sind beispielsweise die Gelatinen, d.h. also aus Collagen durch Kochen von Haut,
Bändern, Sehnen, Knochen oder ähnlichen im Wasser enthaltene: Proteine. Es kann
jede geeignete Menge einrs thermisch empfindlichen Geliermittels verwendet werden,
beispielsweise etwa 0,5 bis 5 Gew.% des Filtermediums.
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Gemäß Erfindung kann vorzugsweise in dem flüssigen Filtermedium ein
Mittel zur Vernichtung von Sauerstoff und/oder ein sauerstoffempfindlicher Farbstoff
vorhanden sein, um sicherzustellen, daß das Innere der Misch- und Zentrifugiervorrichtung
10 unter anaeroben Bedingungen steht. Da das medizinische Interesse sich im wesentlichen
auf die anaeroben bakteriellen Infektionen des menschlichen Körpers richtet, ist
die Isolierung und Bestimmung von pathogenen Mikroben unter aeroben Bedingungen
ungeeignet, da die anaeroben Bakterien nicht festgestellt werden können. Aus diesem
Grunde ist die Anwesenheit kleiner Mengen von Sauerstoff vernichtenden Mitteln,
wie beispielsweise Reduktionsmitteln, im flüssigen Filtermedium 38 besonders vorzuziehen.
Als Reduktionsmittel können gemäß Erfindung unter anderem L-Cystin, Natriumthioglykolat,
Ascorbinsäure und dergleichen verwendet werden, wobei eine Mischung aus L-Cystin
und Natriumthioglykolat bevorzugt werden. Ferner wird gemäß Erfindung vorgezogen
eine kleine Menge eines sauerstoffempfindlichen Farbstoffes im flüssigen Filtermedium
vorzusehen, um dadurch die Anwesenheit oder die Abwesenheit des Reduktionsmittels
zu erkennen. Der Farbstoff ist vorzugsweise bei Abwesenheit von Sauerstoff farblos
und ändert seine Farbe in Berührung mit Sauerstoff.
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Eine Farbänderung zeigt also das Vorhandensein von Sauerstoff im Inneren
der Misch- und Zentrifugiervorrichtung 10 an, bzw.
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einen Abfall des Vakuums im Inneren der Vorrichtung. Geeignete
sauerstoffempfindliche
Farbstoffe, die gemäß Erfindung eingesetzt werden können, sind Resazurin und Methylenblau.
Es können auch andere sauerstoffempfindliche Farbstoffe verwendet werden, die das
flüssige Filtermedium 38 nicht beeinträchtigen und das Trennverfahren nicht stören.
Ein typisches flüssiges Filtermedium gemäß Erfindung enthält die folgenden Bestandteile:
50 Gew.% Succrose, 1,5 Gew.% Gelatine, 0,05 Gew.% L-Cystin, 0,05 Gew.% Natriumthioglykolat,
0,0001 bis 0,0002 Gew.% Resazurin, wobei der pH-Wert vorzugsweise auf 6,0 gestellt
ist.
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Im allgemeinen werden etwa 0,01 bis 0,2 Gew.% Reduktionsmittel bezogen
auf das flüssige Filtermedium und etwa 0,001 bis 0,0005 Gew.% sauerstoffempfindlicher
Farbstoff eingesetzt.
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Die Behandlungsflüssigkeit 20 kann geeignete weitere Bestandteile
enthalten, die zur Behandlung der Flüssigkeitsprobe vor Abtrennung der pathogenen
Mikroben zweckmäßig sind. Sie kann eine wässrige Lösung eines Lyse-Mittels für Blut
enthalten.
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Jede gegenüber den Mikroorganismen nicht toxische Lyse kann eingesetzt
werden, wie beispielsweise wässrige Saponinlösungen.
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Man war zwar der Auffassung, daß zahlreiche Saponine gegenüber pathogenen
Mikroben toxisch wirken, jedoch lassen sich z.B.
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gemäß US-PS 3 883 425 die toxischen Bestandteile aus dem bislang als
toxisch angesehenen Saponin entfernen. Zusätzlich
kann die wässrige
Lösung noch Antikoagulantien und/oder Sauerstoffvernichtungsmittel enthalten. Ein
geeignetes Antikoagulanz ist beispielsweise Natriumpolyanätholsulfonat (SPS) oder
Heparin. Natriumpolyanätholsulfonat wird bevorzugt, da es nicht nur als Antikoagulanz
wirkt, sondern auch die phagocytische Aktivität von Granulocyten und Monocyten und
die normale antibakterielle Aktivität des Serums und bestimmter Antibiotika wie
z.B. Streptomycin und Polymyxin hindert.
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Die Misch- und Zentrifugiervorrichtung gemäß Erfindung ermöglicht
eine praktische und kostensparende Kombination einer Blutprobe mit Behandlungsflüssigkeit
unmittelbar bevor Einbringung der Probe auf das flüssige Filtermedium. In einigen
Fällen haben sich gewisse Behandlungsflüssigkeiten wie Lyse-Mittel als unverträglich
mit dem flüssigen Filtermedium herausgestellt. Selbst wenn die Behandlungsmittel
mit dem flüssigen Filtermedium vermischt werden konnten, ließen sich erstere darüber
hinaus nicht leicht mit der Probe durch Diffusion vermischen. Wenn beispielsweise
eine Gerinnung des Blutes nicht erwünscht ist, muß das Antikoagulationsmittel in
der gesamten Blutprobe innerhalb von einigen Minuten dispergiert werden. Wenn jedoch
dieses Antikoagulationsmittel im Filtermedium vorhanden ist, benötigt man etwa 24
Stunden zur Diffusion des Antikoagulationsmittels in die Blutprobe.
Aus
diesen Grunde ist es unerwünscht, die Behandlungsflüssigkeit mit dem Filtermedium
vorzumischen, bevor das Filtermedium in der sterilen Atmosphäre des Zentrifugierröhrchens
verschlossen eingebracht ist. Es ist also unerwünscht, die Behandlungsflüssigkeit
mit der Probe zu vermischen, bevor diese in das Zentrifugierröhrchen gebracht werden,
da dieser Extraschritt es ermöglicht, daß die Probe durch die Laborumgebung kontaminiert
wird. Gemäß Erfindung ist es möglich, die Probe mit der Behandlungsflüssigkeit unmittelbar
vor dem Kontakt mit dem flüssigen Filtermedium derart zu vermischen oder vorzumischen,
daß eine Kontaminierung durch die Laborumgebung auf ein Mindestmaß herabgedrückt
wird. Dieses wird ermöglicht, indem man vorher die Kammer 1 6a für die Behandlungsflüssigkeit
in dem einen Verschluß 16 mit dem angemessenen Volumen der Behandlungsflüssigkeit
20 in einer der oben erwähnten Weisen versieht. Wenn dieses durchgeführt worden
ist und das Zentrifugierröhrchen mit dem flüssigen Filtermedium durch diesen einen
Verschluß oder durch die Durchstichkappe 16 dicht abgeschlossen ist, kann die Vorrichtung
zur Bestimmung eingesetzt werden. Natürlich ist das flüssige Filtermedium bereits
in dem Zentrifugierröhrchen vorhanden und der Raum oberhalb dieser Flüssigkeit ist
auf sterile Weise nach dem Verschließen evakuiert. Die neuartige Injektionsnadel
23 gemäß Fig. 9 und 10 wird nun durch die eine Durchstichkappe 16 so eingeführt,
daß die Öffnungen 24 und 26 an der Seitenwand
der Injektionsnadel
sich in der Kammer 16a für die Behandlungsflüssigkeit im Verschlußteil 16 befinden.
Beim Einspritzen der Probe wird diese mit der Behandlungsflüssigkeit in Kontakt
gebracht und vermischt. Die Mischung aus Probe und Behandlungsflüssigkeit wird dann
auf das flüssige Filtermedium abgegeben.
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Wie in Fig. 2 bis 8 gezeigt, erfolgt die Bestimmung der pathogenen
Mikroben mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Mischen und Zentrifugieren wie
folgt: Das flüssige Filtermedium 38 kann 1,5 ml einer wässrigen Lösung enthalten,
die 3,0 Gewichtsteile Gelatine, 97,0 Gewichtsteile Wasser, 100 Gewichtsteile Succrose,
0,8 Gewichtsteile L-Cystin, 0,8 Gewichtsteile Natriumthioglykolat und 0,0003 Gewichtsteile
Re sazur in enthält.
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Die Behandlungsflüssigkeit 20 kann geeignete Bestandteile wie ein
Lyse-Mittel und/oder ein Antikoagulanz und gegebenenfalls ein Sauerstoffvernichtungsmittel
oder ein Reduziermittel in gewünschter Konzentration enthalten. Die Mengen an Antikoagulanz
und an Lyse-Mittel sollen der Menge der Blutprobe entsprechen. Beispielsweise können
0,3 ml einer wässrigen Lösung mit einem Gehalt von 12 Gew.% nichttoxischem Saponin
und etwa 2 Gew.96 Natriumpolyanätholsulfonat als Behandlungsflüssigkeit
20
verwendet werden. Anfänglich wird die erfindungsgemäße Misch- und Zentrifugiervorrichtung
10 in aufrechter Stellung wie in Fig. 2 gezeigt angeordnet, damit das flüssige Filtermedium
38 nach unten in Richtung auf die Durchstichkappe 14 fließt. Anschließend wird die
Misch- und Zentrifugiervorrichtung 10 in einer geeigneten Kühlvorrichtung hinreichend
abgekühlt, damit sich die Gelatine zur Verfestigung des flüssigen Filtermediums
38 beispielsweise auf 40C abkühlt, wie es in Fig. 3 gezeigt ist. Anschließend wird
eine Flüssigkeitsprobe wie beispielsweise 8 ml einer Blutprobe mit einer Spritze
42 mit einer üblichen Nadel entnommen, die dann durch die erfindungsgemäße Injektionsnadel
23 ersetzt wird. Die Injektionsnadel 23 wird dann durch den Verschluß bzw. durch
die Durchstichkappe 16 wie oben beschrieben eingestochen, worauf die Blutprobe wie
in Fig. 4 gezeigt, in die Zentrifugiervorrichtung 10 eingespritzt wird.
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Die Turbulenz, die durch das in den evakuierten Raum 40 eintretende
Blut entsteht, stört nicht das flüssige Filtermedium 38, welches als feste Bodenschicht
wie in Fig. 4 gezeigt, verbleibt.
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Das Vermischen der Blutprobe mit der das Lyse-Mittel enthaltenden
Behandlungsflüssigkeit 20 führt zu einer Lyse der roten Blutkörperchen, wodurch
ein mögliches Einfangen von Erythrocyten und/oder Lymphocyten verringert wird. Durch
dieses
Einfangen werden die Erythrocyten oder Lymphocyten während des Zentrifugierens oben
auf dem Filtermedium abgelegt und die pathogenen Mikroben bei ihrer Abwärtsbewegung
während des Zentrifugierens eingefangen, was sie daran hindert, das flüssige Filtermedium
zu erreichen. Darüber hinaus wirkt das Natriumpolyanätholsulfonat in der Behandlungsflüssigkeit
20 als Antikoagulanz und verhindert die phagocytische Aktivität von Granulocyten
und Monocyten und die normale antibakterielle Aktivität des Serums, wenn dieses
der Blutprobe beigemischt wird.
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Anschließend wird die Injektionsnadel 23 aus der Durchstichkappe 16
herausgezogen und das Zentrifugierröhrchen 10 mit dem erstarrten flüssigen Filtermedium
38 und der mit der Behandlungsflüssigkeit 20 vermischten Blutprobe, die in den Fig.
4 und 5 als Schicht 44 dargestellt ist, in aufrechter Stellung erwärmt, bis die
Gelatine weich wird und sich das flüssige Filtermedium verflüssigt. Die Misch- und
Zentrifugiervorrichtung 10 wird dann auf eine Temperatur erwärmt, die nicht zu einer
Zerstörung der gegebenenfalls in der Blutprobe vorhandenen pathogenen Mikroben führt,
aber andererseits ausreicht, die Gelatine zu verflüssigen. Beispielsweise kann das
Zentrifugierröhrchen in der in den Zeichnungen dargestellten Lage durch Eintauchen
in ein Wasserbad auf etwa 37 bis 420C erwärmt werden. Durch die Verflüssigung der
Gelatine
in dem flüssigen Filtermedium 38 bildet sich so eine flüssige wässrige Filterlösung,
die nun als Flüssigfilter für pathogene Mikroben dienen kann.
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Die Abtrennung der pathogenen Mikroben aus der Blutprobe erfolgt durch
Einsetzen des Zentrifugierröhrchens 10 in eine geeignete Zentrifuge, in der es zur
Trennung der pathogenen Mikroben von anderen Bestandteilen der Blutprobe einer ausreichenden
Zentrifugalkraft unterworfen wird. Geschwindigkeit und Zentrifugierzeit können je
nach Konstruktionsmaterial des Zentrifugierröhrchens 10 und nach Art der Zentrifuge
im weiten Umfang variieren. Ein ausreichendes Zentrifugieren wird erzielt, wenn
das Zentrifugierröhrchen 10 einer 100- bis 6000-fachen und vorzugsweise etwa 1400-
bis S000-fachen Schwerkraft unterworfen wird. Ein geeignetes Verfahren wird unter
Verwendung einer Schwingzentrifuge durchgeführt, bei welcher etwa 10 bis 20 Minuten
eine 2000- bis 4000-fache Schwerkraft aus das erfindungsgemäße System einwirkt.
Der Zentrifugierschritt ist schematisch in Fig. 6 wiedergegeben.
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Nach dem Mischen und Zentrifugieren wird eine sterile Spritze 46 mit
der neuartigen Hohlnadel oder Injektionsnadel 35 durch die zweite Durchstichkappe
14 wie in Fig. 7 gezeigt eingestochen.
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Die Injektionsnadel kann beliebig lang sein, jedoch sind die Öffnungen
36 in der Wand der Injektionsnadel nahe an der flachen Innenfläche 18 der Durchstichkappe
14 beim Einstechen der Nadel
wie es in Fig. 7 gezeigt ist. Da die
Spitze 34 der Injektionsnadel abgeflacht bzw. zugeklemmt ist, wird die gleichmäßige
dünne Schicht des flüssigen Filtermediums, die an der flachen Innenwand der Durchstichkappe
14 liegt, abgezogen. Die flache Innenfläche der Durchstichkappe 14 gibt einen klaren
Sichtbereich durch die Wand des Zentrifugierröhrchens 10, so daß man leicht erkennen
kann, wann das Filtermedium abgesaugt ist. Gegebenenfalls kann eine übliche Spritze
mit einer Hohlnadel benutzt werden, um zuerst die Mischung 44 aus dem Zentrifugierröhrchen
abzuziehen und anschließend das flüssige Filtermedium zuzumischen und es beispielsweise
mit der neuartigen Injektionsnadel 35 abzuziehen. Das flüssige Filtermedium 38,
das mit der Spritze 46 abgezogen worden ist, wird dann vorzugsweise beispielsweise
durch Schütteln durchgerührt, damit die pathogenen Mikroben gründlich und gleichmäßig
vermischt werden. Das flüssige Filtermedium 38 mit den dispergierten, pathogenen
Mikroben wird dann auf einen geeigneten Nährboden für Bakterien aufgebracht, wie
es schematisch in Fig. 8 gezeigt ist.
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Beispielsweise kann im Falle von 1,5 ml flüssigen Filtermedium mit
pathogenen Mikroben eine Blutagarplatte 0,2 ml des Mediums aufnehmen und bei 370C
aerob inkubiert werden. Eine weitere Blutagarplatte kann 0,2 ml der wäßrigen Lösung
aufnehmen und bei 370c in einem Kerzenglas inkubiert werden. Eine andere Blutagarplatte
kann 0,2 ml der wäßrigen Lösung aufnehmen und bei 370C in einer anaeroben Umgebung
inkubiert werden. Weitere 0,2 ml
der Lösung können auf eine Sabouraud-Agarplatte
aufgebracht und bei 250C in einer aeroben Umgebung inkubiert werden. Wiederum 0,2
ml der Lösung können auf eine EMB-Platte (Eosinmethylenblaufarbstoff) aufgebracht
und bei 370C in einem Kcrzen<jlas inkubiert werden. Weitere 0,5 ml der Lösung
konnen in ein flüssiges Thioglykolatmedium gebracht und bei 370C inkubiert werden.
Die Nährböden können täglich auf Anwesenheit von Kolonien untersucht werden. Die
Anzahl der Mikroben in 1 ml Blut kann durch Multiplizieren der Anzahl der Kolonien
unter Berücksichtigung eines Korrekturfaktors bestimmt werden. Dieser Korrekturfaktor
zieht die Teilungsgeschwindigkeit eines bestimmten Keimes, die eingesetzten Volumina
an Blut und Filterflüssigkeit und die auf die Platte aufgebrachte Menge der endgültigen
Mischung ein. In dem oben angegebenen allgemeinen Beispiel beträgt der Korrekturfaktor
1,56.
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Wenngleich in Zusammenhang mit den Zeichnungen eine bevorzugte Ausführungsform
gemäß Erfindung zur Durchführung der oben beschriebenen Untersuchung auf pathogene
Mikroben beschrieben worden ist, können auch andere Ausführungsformen verwendet
werden.
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Beispielsweise kann ein einfaches Untersuchungsröhrchen anstelle des
Zentrifugierröhrchens 10 verwendet werden. In diesem Fall können die Durchstichkappe
16 und die neuartige Injektionsnadel 23 ohne die zweite Durchstichkappe 14 verwendet
werden. Man kann tatsächlich die neuartige Injektionsnadel und die Durchstichkappe
16,
die die Kammer für die Behandlungsflüssigkeit besitzt, in Kombination mit irgendeinem
Behälter verwenden, wenn man eine Flüssigkeit mit einer zweiten Flüssigkeit vollständig
vermischen will, bevor man das erhaltene Gemisch mit einer dritten Flüssigkeit im
Behälter vermischt. Die Durchstichkappe oder der Verschluß mit der Kammer für die
Behandlungsflüssigkeit kann auf beliebige Weise geformt sein, um das Gefäß dicht
abzuschließen.
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