DE69632921T2

DE69632921T2 - System und verfahren zur bestimmung der impedanz und herstellungsverfahren

Info

Publication number: DE69632921T2
Application number: DE69632921T
Authority: DE
Inventors: Peter Van Gerwen; Kris Baert; Rudi Rossau
Original assignee: Innogenetics NV SA; Interuniversitair Microelektronica Centrum vzw IMEC
Current assignee: Fujirebio Europe NV SA; Interuniversitair Microelektronica Centrum vzw IMEC
Priority date: 1995-12-01
Filing date: 1996-11-29
Publication date: 2005-07-14
Anticipated expiration: 2016-11-30
Also published as: CA2238003C; DE69632921D1; ES2223067T3; EP0876601A1; EP0876601B1; CA2238003A1; ATE271219T1; WO1997021094A1; JP4054379B2; AU1066997A; AU719454B2; US6440662B1; JP2000501503A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen verbesserten Sensor zum elektronischen Nachweis einer Bindungsreaktion zwischen molekularen Strukturen eines Paars chemischer Substanzen, wie z. B. Oligonucleotiden, Antigenen, Enzymen, Peptiden, Antikörpern, DNA- und RNA-Fragmenten.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein neues Produktionsverfahren für diesen verbesserten Sensor bereit.
Techniken und Sensoren zum Nachweis molekularer Strukturen und spezifischer Substanzen, wie z. B. Enzymen, Peptiden, Oligonucleotiden, Antigenen, Antikörpern, DNA- und RNA-Fragmenten, in einer Lösungsprobe sind im Fachgebiet bekannt. Bei einer spezifischen Klasse von Sensoren wird das Prinzip der Messung der Impendanz zwischen zwei Elektroden angewandt. Das Fehlen oder Vorhandensein von DNA-Molekülen oder Antikörpern oder Antigenen zwischen den Elektroden beeinflußt die Permittivität und/oder die Leitfähigkeit zwischen den Elektroden. Verschiedene Techniken wurden zur Messung des Vorhandenseins und/oder der Konzentration eines gegebenen Analyten in einer Probenlösung unter Verwendung eines Bindungssubstanzelements mit spezifischer Aktivität für den Analyten vorgeschlagen. Solche spezifischen Bindungsreaktionen finden beispielsweise zwischen Enzymen und ihren Substraten, Antikörpern und Antigenen, zwischen DNA-DNA, zwischen RNA-DNA oder anderen molekularen Strukturen statt.
Eine differenzielle Kapazitätsmessung zur Beurteilung der Proteinabsorption auf metallischen Elektroden wird von Stoner et al. in „Adsorption of blood proteins on metals using capacitance techniques", J. Phys. Chem., 74, 5. März 1970, beschrieben.
Von Arwin et al. im US-Patent Nr. 4,072,576 wird ein adsorbiertes Polypeptidsubstrat verwendet und ein kapazitives Verfahren zur Messung enzymatischer Aktivität sowie der immunologische Wechselwirkungsassay realisiert.
Von Giaever wird im US-Patent Nr. 4,054,646 ein elektrisches Verfahren gelehrt, bei dem das Vorhandensein von Antikörpern in einer Lösung mittels Beschichten eines metallischen Substrats mit einem Antigen gemessen wird. Nach Inkubation der Elektroden mit der Probelösung wird dabei die Dicke des molekularen Films kapazitiv gemessen, d. h. es wird zwischen der mono- und bimolekularen Schicht unterschieden, indem ein Quecksilbertropfen als zweite Elektrode verwendet wird.
Von Kenneth wird in Patentanmeldung GB 2215 846 ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Messung der Art und Konzentration von Ionenspezies in Flüssigkeiten offenbart. In dem Dokument wird eine Zelle beschrieben, die ein zur Bereitstellung wenigstens einer Furche, in die Flüssigkeit eintreten kann, geätztes Halbleitersubstrat umfaßt und Elektroden auf entgegengesetzten Seiten der Furche trägt, die vom Substrat isoliert sind.
Von Newman wird in der Patentanmeldung WO 87/03095 ein kapazitiver Sensor zur chemischen Analyse und Messung offenbart. Der Sensor läßt sich zum Nachweis einer großen Bandbreite von Analyten, einschließlich Bakterien, Viren, Antikörpern, Antigenen, Enzymsubstraten und Hormonen, verwenden. Dabei wird die Oberfläche von Leitern sowie ein Substrat mit einer dünnen Isolierungsschicht unter Bildung eines offenen Kondensators beschichtet. Ein biospezifisches Bindungsreagens wird auf die Oberfläche der Isolierungsschicht zwischen den Leitern immobilisiert. Dabei wird die Dielektrizitätskonstante des biospezifischen Bindungsreagens durch Bindung des nachgewiesenen Analyten an das biospezifischen Bin dungsreagens verändert. Ein ähnliches Wahrnehmungsprinzip ist im US-Patent 5,114,674 offenbart.
Von Battailard et al., 1988, Anal. Chem., 60, 2374–2379 sowie in einer neueren Arbeit von Klein et al., 1995, Sensors and Actuators, B 26–27, S. 474–476 wird gezeigt, daß sich eine Metall-Halbleiter-Isolator-Vorrichtung auf ähnliche Weise wie ein MIS (Metalinsulator-Semiconductor)-Kondensator verwenden läßt. Dabei ist die Vorrichtung zusammen mit einer zweiten Referenzelektrode in eine Lösung eingetaucht. Durch Messen der AC [= Wechselstrom]-Kapazität zwischen der Metallschicht der Vorrichtung und der Referenzelektrode bei gleichzeitigem Anlegen von DC [= Gleichstrom]-Vorspannungen wird in Wirklichkeit die Flachbandspannung des Systems auf ähnliche Weise wie im Fall eines MIS-Kondensators gemessen. Es wurde bewiesen, daß sich die Flachbandspannung von an der Isolierung-Flüssigkeit-Grenzfläche adsorbierten Spezies modulieren läßt. Nach diesem Prinzip arbeiten der ionensensitive Feldeffekttransistor, ISFET, und der gensensitive Feldeffekttransistor, GENFET.
In dem Richard Ebersole erteilten US-Patent 4,219,335 wird die Verwendung von mit Blindwiderstand-Tags markierten Immunreagentien diskutiert. Diese Tags lassen sich elektrisch nachweisen, da sie die dielektrischen, leitenden oder magnetischen Eigenschaften der Testoberfläche verändern.
In ähnlicher Weise wird in dem S. J. Mroczkowski erteilten EP 0 241 771 der Nachweis metallmarkierter Antikörper durch Leitfähigkeitsmessungen gelehrt. Bei der Immobilisierung von Antigenen zwischen zwei Elektroden wird die spezifische Wechselwirkung mit einem metallmarkierten Antikörper mittels der Widerstandsabnahme des Zwischenelektrodenmediums gemessen.
Von M. Malmros wird im US-Patent 4,334,880 eine Leitfähigkeitsschwankung einer zwischen zwei Flachelektroden liegenden polymeren Halbleiterschicht beschrieben. Dabei sind in dem Polymer auf die eine oder die andere Weise bestimmte, zur Erkennung spezifischer Analyte fähige Moleküle eingebaut. Der Erkennungsprozeß induziert Leitfähigkeitsänderungen der Polymerschicht.
Weitere Variationen dieser zentralen Idee der Wahrnehmung mittels Impedanzmessung sind in EP 0 543 550 , EP 0 241 771 , US-Patent 4,453,126, GB 2,137,361, US 3,999,122 des Standes der Technik aufgeführt. In einem Sensor zur Impedanzmessung sind bestimmte Moleküle im wesentlichen auf der Oberseite eines, zwischen einem oder sowohl auf der Oberseite eines als auch zwischen einem Elektrodenpaar immobilisiert. Diese Moleküle „erkennen" einen spezifischen Analyten, wenn sie einer Probelösung ausgesetzt werden. Dieser Erkennungsprozeß endet letztendlich direkt oder indirekt in einer Veränderung der Leitfähigkeit und/oder Permittivität des Raums in der Nachbarschaft der Elektroden. Schließlich läßt sich durch Messung der Impedanz zwischen den beiden Elektroden eine Messung des Erkennungsprozesses realisieren.
Das Problem im Zusammenhang mit den sogenannten Sensoren, wie sie oben bezeichnet sind, besteht darin, daß die immobilisierte Schicht vollkommen homogen sein und keine Löcher enthalten sollte, was schwer zu erreichen ist.
Seit dem Aufkommen der Mikroelektronik bemüht man sich ständig darum, diese Technologie bei der Entwicklung von Mikrosensoren zu verwenden. Mit der Mikroelektroniktechnologie realisierte Sensoren bieten Vorteile, wie z. B. eine kostengünstige Produktion, eine erhöhte Reproduzierbarkeit des Produktionsprozesses, Einheitlichkeit, Nachweisgenauigkeit sowie Flexibilität bei der Entwicklung. Solche mikroelektronischen Sensoren können eine Vielzahl individueller Teststellen mit reproduzierbaren, einheitlichen elektrischen Eigenschaften umfassen, wodurch die Nachweisempfindlichkeit des Sensors verbessert wird. Die Teststellen lassen sich mit Abmessungen in der Größenordnung der Abmessungen der nachzuweisenden Moleküle herstellen. Die räumlichen Beschränkungen dabei sind die Auflösung der Fertigungstechnologie sowie die Empfindlichkeit der Vorrichtung, die durch den Stand der Gerätetechnik und die Dichte der Sonden diktiert wird. Es läßt sich auch eine Konfiguration realisieren, bei der die individuellen Teststellen jeweils eine unterschiedliche Art von Signal gemäß dem jeweiligen Molekül, das in der Teststelle nachzuweisen ist, ergeben.
Eine weitere wichtige Eigenschaft der Mikroelektroniktechnologie ist ihre Flächigkeit: bei den auf diese Weise mit einem Strukturmuster versehenen Mikroelektroden handelt es sich im wesentlichen um flache Elemente. Dieses Merkmal ist kein starker Punkt bei den Impedanzmeßvorrichtungen. Bei einer flächigen Impedanzmeßstruktur dehnen sich im Vergleich mit tatsächlichen 3-D-Strukturen die elektrischen Feldlinien eher oberhalb der Vorrichtungsoberfläche und aus dem interessierenden Bereich heraus aus. Dies ist ein erheblicher Nachteil, vor allem wenn der interessierende Bereich räumlich begrenzt ist, d. h. wenn es sich dabei um eine enzymatische oder Polymermembran oder um eine adsorbierte molekulare Schicht an der Oberfläche der Struktur handelt. Jede Feldlinie, die über diesen interessierenden Bereich hinausreicht, führt zu einer Shunt-Impedanz bei der Impedanzmeßantwort, die als Meßrauschen betrachtet werden kann.
Dennoch ist, je nach der Elektrodengeometrie, d. h. Abmessungen und Beabstandung, das Gesamtsignal in großer Mehrheit in einem bestimmten Bereich oberhalb der Oberfläche der Vorrichtung, wie in 1 gezeigt, eingeschlossen. Aus der gleichen Figur läßt sich schließen, daß Miniaturisierung, d. h. eine Abnahme von L, entscheidend ist, um flächige Impedanzmeßstrukturen zu erhalten, die den Raum in sehr enger Nachbarschaft der Vorrichtung sondieren. Die Verkleinerung der Abmessungen wurde von DeSilva et al. veranschaulicht.
Von DeSilva et al. wurde 1995 in Biosensors & Bioelectronics, 10, S. 675–682, über eine neue Biosensorstruktur berichtet, bei der eine kovalente Antikörperimmobilisierungstechnik mit einem einfachen Impedanzantwortverfahren kombiniert wurde. Der Biosensor wurde hergestellt, indem Anti-SEB-Antikörper auf einem auf einem Siliziumchip abgeschiedenen ultradünnen, inselähnlichen, elektrisch kontinuierlichen Pt-Film kovalent gebunden wurden. Sie registrieren eine Impedanzabnahme, wenn die spezifische Wechselwirkung mit SEB stattfindet.
Die Reproduzierbarkeit ist jedoch aufgrund des etwas willkürlichen Verhaltens des Herstellungsprozesses, d. h. der Pt-Abscheidung und des Immobilisierungsvorgangs, niedrig.
Bei einem echten Elektrodenstrukturierungsverfahren ist es wahrscheinlich, daß eine gute Reproduzierbarkeit der Strukturen gewährleistet ist und die Kontrolle des Sensorverhaltens verbessert wird. Von Vorrichtungen mit Strukturmustermerkmalen, wobei die Merkmale Abmessungen von einigen Hundert Nanometern aufweisen, darf man erwarten, daß sie gegenüber DNA-Fragmenten von 300 Basen, d. h. mit einer gesamten Moleküllänge von etwa 180 nm, oder gegenüber anderen großen Molekülen, wie Enzymen oder Antikörpern (Durchmesser im Zehn-Nano-meter-Bereich), hochempfindlich sind. Dieser Abmessungsbereich wird üblicherweise auf zwei Wegen erreicht:

1. tiefe UVF- oder Röntgen-Lithographie, Techniken, bei denen sich bei einem volloptimierten Verfahren Merkmale mit etwa 100 nm erzielen lassen.
2. Elektronenstrahlstrukturierung, eine umständliche und sehr teure Technik, mit der sich Merkmale im Zehn-nm-Bereich erhalten lassen.

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen zur Messung des Vorhandenseins oder Fehlens molekularer Strukturen geeigneten elektrochemischen Sensor bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung, wie oben definiert, bereitzustellen.
Noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins molekularer Strukturen in einer Probe bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen elektrochemischen Sensor, der auf der Interferenz eines elektrischen Felds zwischen Elektroden mit dem Analyten basiert. Dabei wird der zu testende Analyt mittels Sonden in enge Nachbarschaft zu der Struktur gebracht.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere einen Sensor zur Identifizierung molekularer Strukturen in einer Probenlösung ist offenbart. Der Sensor umfaßt eine Isolierungsschicht mit darin befindlichen mehreren voneinander beabstandeten Kanälen, die im wesentlichen die gleiche Ausrichtung aufweisen. Dabei weisen die Kanäle jeweils einen Boden und wenigstens zwei gegenüberliegende Seitenwände entlang der Ausrichtung auf. Die Kanäle weisen weiterhin Abmessungen im Submikronbereich auf. Eine Metallbeschichtung wird auf eine der beiden gegenüberliegenden Seitenwände von im wesentlichen jedem Kanal und auf der Oberseite der Isolierungsschicht zwischen den Kanälen aufgetragen, wodurch eine Impedanzmeßvorrichtung gebildet wird, wobei sich die Probenlösung innerhalb der und zwischen den Kanälen befindet. Sonden zur Bindung der molekularen Strukturen sind gegebenenfalls bereits auf dem Sensor aufgetragen. Die Sonden können entweder auf den isolierenden Teil der Kanäle (den Boden und die andere Seitenwand der Kanäle) oder auf die Oberfläche der Elektroden oder sowohl auf den isolierenden Teil der Kanäle als auch auf die Oberfläche der Elektroden aufgetragen werden. Weiterhin werden Mittel zum Anlegen einer Spannung auf den Metallbeschichtungen ebenso wie Mittel zur Messung der Impedanz zwischen den Elektroden bereitgestellt.
Der Begriff elektrochemischer Sensor oder kurz Sensor bezieht sich gemäß der vorliegenden Erfindung auf eine Vorrichtung, die eine (bio)chemische Information in ein elektrisches Signal umwandelt.
Im Vergleich mit Sensoren und Verfahren des Standes der Technik wird das Empfindlichkeitsproblem durch die vorliegende Erfindung überwunden. Ein wichtiges Merkmal dieses neuen Designs ist der hohe Grad an Miniaturisierung. Dadurch wird wahrscheinlich das Rauschen der Struktur reduziert und anschließend ihre Empfindlichkeit erhöht. Ein weiteres bemerkenswertes Merkmal des vorgeschlagenen Sensors ist seine dreidimensionale Geometrie. Dadurch wird das Eindringen des elektrischen Feldes in den interessierenden Bereich bei einem möglichen Anstieg der Empfindlichkeit verbessert. Der Sensor weist eine interdigitale Elektrodenstruktur auf, die auf kostengünstige Weise, selbst für große aktive Bereiche, hergestellt werden kann.
Die Sonden der vorliegenden Erfindung sind funktionell definiert als Moleküle, die zur Reaktion mit einem anderen Molekül unter Bildung eines Komplexes und/oder zur Induktion einer Sekundärreaktion in der Lage sind. Beispielhaft und ohne darauf beschränkt zu sein, kann es sich bei den Sonden um Enzyme, Antikörper, Antigene, Peptide, DNA-Fragmente, RNA-Fragmente oder Oligo nucleotide handeln. Erfindungsgemäße bevorzugte Sonden sind in den von einem der Anmelder der vorliegenden Erfindung gehaltenen Patenten und Patentanmeldungen beschrieben: EP 0 337 896 ; EP 0 345 375 ; EP 0 657 532 ; EP 0 419 355 ; EP 0 525 095 ; EP 0 494 317 ; EP 0 489 968 ; EP 0 644 202 ; WO 92/10514; EP 0 499 003 ; WO 92/11366; WO 92/16628; WO 92/19770; WO 93/08302; WO 93/18054; EP 0 561 087 ; WO 93/22437; WO 94/01554; EP 0 637 342 ; WO 94/13795; WO 94/18325; WO 94/21818; WO 94/25601; WO 95/12666; WO 95/17429; WO 95/33851; WO 96/00298; WO 96/04309; EP 0 721 505 ; WO 96/13590; WO 96/13608; WO 96/17065 und unter der Nummer 96/03091, 96/04146 eingereichten PCT-Anmeldungen ebenso wie die unter Nr. 95870136.9, 96870006.2, 96870081.5, 96870053.4, 96870122.8 oder 96870131.8 eingereichten EP-Anmeldungen. Der Inhalt dieser Patente (Patentanmeldungen) sowie aller weiteren Dokumente, auf die in diesem Text Bezug genommen wird, sind hiermit als durch Bezugnahme aufgenommen zu betrachten. Die Sonden werden ebenso wie die Verfahren zur Herstellung dieser Sonden in den obenerwähnten Dokumenten weiter erörtert. Dabei sollte ersichtlich sein, daß diese Sonden aus einer Lebendquelle gereinigt oder mittels eines beliebigen, im Fachgebiet bekannten Syntheseverfahrens hergestellt werden können.
Bei den in der Probe oder dem Analyten nachzuweisenden Zielmolekülen kann es sich um ein beliebiges, in einer Probe vorhandenes Molekül handeln, das an die Sonden binden oder mit ihnen reagieren kann. Zu den Zielmolekülen lassen sich somit ebenso Enzyme, Antikörper, Antigene, Peptide, DNA-Fragmente, RNA-Fragmente, Oligonucleotide oder selbst ganze Zellen zählen. Je nach Art der Zielmoleküle und Art der Anwendung kann eine spezifische Art von Erkennungsschaltkreis zur Bearbeitung der mit dem Zielnachweis verbundenen Information mit oder getrennt vom Sensor bereitgestellt werden.
Bei der Probe kann es sich um eine beliebige, nachzuweisende Zielmoleküle enthaltende biologische Probe (Gewebe oder Flüssigkeit) handeln, die direkt oder nach Kultivierung (Anreicherung) einem gesunden oder infizierten Menschen oder Tier entnommen wurde. Insbesondere können diese Proben Expektorantien aller Art, Blut, Plasma, Artemwegsproben, wie z. B. Speichel Bronchiallavagen, Hautgewebe, Biopsien, Lymphozytenblutkulturmaterial, Kolonien, Liquor, Hirngewebe, Urin, Proben aus dem Magen-Darmtrakt, Lebensmittel-, Futter- oder Umweltproben umfassen. Die Proben können mit einem beliebigen im Fachgebiet bekannten Verfahren präpariert oder extrahiert werden.
Bei der Probe kann es sich auch um eine beliebige, wie unten beschriebene Präparation (wie z. B. Harnstoff) oder ein anderes beliebiges Industrieprodukt handeln.
Als Alternative kann die zu testende Probe teilweise oder vollständig gereinigte Ziel- oder Analytmoleküle, wie z. B. amplifizierte Nukleotide, enthalten, die in einer Lösung solubilisiert worden sind. Diese Lösungen lassen sich aus allen Arten von im Fachgebiet bekannten Lösungen, die zur Realisierung einer Bindungsreaktion zwischen der spezifischen Sonde und ihrem Ziel geeignet sind, wählen.
Im Falle eines Nukleotidnachweises enthält das Probenmaterial entweder genomische DNA oder Vorläufer-RNA oder amplifizierte Versionen davon. Die Lösung wird dabei als Hybridisierungslösung bezeichnet. Nach Hybridisierung unter den als „gewünschte Hybridisierungseigenschaften gemäß der vorliegenden Erfindung" bezeichneten Hybridisierungseigenschaften hybridisiert die Sonde (in diesem Fall ein Oligonucleotid) nur an die DNA oder RNA aus den spezifischen Organismen oder Molekülen, für die sie konstruiert wurde, und nicht an die DNA oder RNA aus anderen Organismen oder Molekülen, wie z. B. nahe verwandten Organismen oder Molekül varianten oder mutierte Moleküle, die auch in einer bestimmten Probe vorhanden sein können. Dies führt in der Praxis häufig dazu, daß die Intensität des Hybridisierungssignals mindestens zwei-, drei-, vier-, fünf- oder sogar zehnmal stärker bei der Ziel-DNA oder -RNA aus den Organismen, von denen die Sonden konstruiert wurden, im Vergleich mit Nicht-Zielsequenzen ist. Häufig ist es wünschenswert und erreichbar, Nukleotid nachzuweisen, das mit dem Sondennukleotid perfekt übereinstimmt (was bedeutet, daß Hybridisierungsbedingungen gewählt werden, bei denen eine Fehlpaarung nachweisbar ist).
Die Hybridisierungsbedingungen lassen sich in Abhängigkeit von mehreren Parametern, wie z. B. der Beschaffenheit und Konzentration der Bestandteile der Medien oder Lösungen sowie der Temperaturen, unter denen die Hybride gebildet und gewaschen werden, überwachen. Werden entweder in den Sonden oder den Medien Modifikationen eingeführt, so sollten die Temperaturen, bei denen die Nukleotidsonden verwendet werden können, um die benötigte Spezifität zu erhalten, gemäß bekannten Beziehungen, wie z. B. den in Hames und Higgins (Hrsg.) Nucleic acid hybridization. A practial approach, IRL Press, Oxford, UK, 1985, beschriebenen, geändert werden.
Die Sonden können auf den Sensor der vorliegenden Erfindung auf beliebige, im Fachgebiet bekannte Weise aufgetragen, beispielsweise mittels Sondenabgabesystemen mit hoher Auflösung immobilisiert, oder sogar an Ort und Stelle synthetisiert werden.
In einem weiteren Ansatz, der ebenso im Umfang der vorliegenden Erfindung enthalten ist, kann die Probe auf den Sensor aufgetragen werden, und die Proben können dann in Lösung zu dem aktiven Teststellenbereich des Sensors gegeben werden, so daß eine Erkennung stattfindet, die nachgewiesen werden kann.
Es sollte betont werden, daß die Fähigkeit zur gleichzeitigen Erzeugung von Erkennungsergebnissen mit einer Reihe von Sonden ein herausragender Vorteil der erfindungsgemäßen Sensoren ist.
Im Falle des Nachweises von in einer Probe vorhandenen Antikörpern handelt es sich bei der Sonde um ein Antigen (z. B. ein Peptid oder ein Polypeptid) oder einen im Fachgebiet bekannten antiidiotypischen Antikörper. Im Falle des Nachweises von in einer Probe möglicherweise vorhandenen Antigenen oder Polypeptiden oder Peptiden handelt es sich bei der Sonde um einen Antikörper oder ein Derivat davon, der bzw. das spezifisch an bestimmte Antigene bindet, ein Antisense-Peptid, das spezifisch an bestimmte Peptide oder Polypeptide bindet, ein Rezeptor oder chemisches Molekül, der bzw. das spezifisch an das Polypeptid oder Peptid bindet. Bei der Lösung, in der das in der Probe vorhandene möglicherweise präparierte oder gereinigte Zielmaterial gelöst werden kann, handelt es sich um eine beliebige Lösung, die die Bindung zwischen den Bindungsmolekülen stattfinden läßt. Die Bedingungen, unter denen diese Bildung stattfinden kann, sind im Fachgebiet allgemein bekannt und beispielsweise in den obenerwähnten Patenten und Anmeldungen eines der Anmelder weiter beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso ein Verfahren zur Herstellung eines Sensors zur Identifizierung molekularer Strukturen in einer Probensubstanz. Bei diesem Verfahren bildet man mehrere voneinander beabstandete Kanäle in einer Isolierungsschicht, die im wesentlichen die gleiche Ausrichtung und jeweils einen Boden und wenigstens zwei gegenüberliegende Seitenwände entlang der Ausrichtung aufweisen; scheidet eine Metallschicht auf der Isolierungsschicht ab, während die nichtleitende Schicht in bezug auf die Metallabscheidungsquelle so ausgerichtet wird, daß der Boden der Kanäle sowie die Seitenwände der Kanäle entlang der Abscheidungsrichtung im Schatten liegen und nicht von Metall bedeckt werden, so daß dadurch eine Impedanzmeßvorrichtung entsteht, wobei die Probensubstanz in den und zwischen den Kanälen liegt, und immobilisiert schließlich Sonden zur Bindung an die molekularen Strukturen, wobei die Sonden entweder auf dem isolierenden Teil der Kanäle (den Boden und die andere Seitenwand der Kanäle) oder auf die Oberfläche der Elektroden oder sowohl auf den isolierenden Teil der Kanäle als auch auf die Oberfläche der Elektroden aufgetragen werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ein wichtiges Werkzeug auf einem weiten Gebiet von Anwendungen dar und eignet sich beispielhaft und ohne darauf beschränkt zu sein zur Messung spezifischer Wechselwirkungen, wie etwa der Reaktion zwischen einem Enzym und seinem Substrat oder der Erkennungsreaktion zwischen einem Antikörper und einem Antigen, zwischen DNA-DNA, zwischen RNA-DNA oder andere molekularer Strukturen; bei der Untersuchung der Reaktionskinetiken dieser spezifischen Wechselwirkungen; zur Sequenzierung von Molekülen, wie z. B. Peptiden, Enzymen, Nukleotiden, DNA, RNA usw.; zum Nachweis von Genmutationen; zur Epidemiologie und Geno- oder Serotypisierung oder beispielsweise HLA und HCV; zum Testen der Arzneistoffempfindlichkeit, wie etwa dem Widerstand gegen beta-Lactamase und tetracyclin in Neisseria gonorrhoeae, dem Nachweis von Rifampicinresistenten Mycobacterium tuberculosis-Stämmen oder dem Nachweis der AZT-Resistenz in HIV; bei Screening und Diagnose: viraler Diagnose: wie etwa im Fall von HIV, HCV, HBV, Herpes und verwandten Viren, CMV, HPV oder HTLV; der bakteriellen Diagnose, wie etwa im Fall von Geschlechtskrankheiten, der Analyse von Liquor, dem Nachweis unterschiedlicher Mykobakterienspezies, der Beurteilung anaerober Infektionen, von Otitis, Krankheitskeimen der Atemwege, des Magen-Darmtrakts und des Periodontiums, von krankheitserregenden Pilzen; Erbkrankheiten, wie etwa zystischer Fibrose, Alzheimer, dem Nachweis mitochondrialer Mutationen, Plättchenanti genen, Arzneistoffrezeptoren, Risikofaktoren für Atheriosklerose und koronare Herzerkrankungen, Krebs, APOE, AChE, APOB, LDL usw.; bei der klinischen Analyse: wie etwa im Fall der Quantifizierung von Harnstoff oder Creatinin mittels Leitfähigkeitsmessung.

Die starke Miniaturisierung der Sensoren gestattet auch die Konstruktion integrierter mikrodiagnostischer Vorrichtungen, die zum gleichzeitigen Nachweis einer Vielzahl von Parametern, d. h. Multiparametertesten, fähig sind und letztendlich von Screening-Assays. ABKÜRZUNGEN

BCB	Benzocyclobuten
LPCVD	Low Pressure Chemical Vapour Deposition [Chemische Bedampfung unter niedrigem Druck]
PECVD	Plasma Enhanced Chemical Vapour Deposition [Chemische Bedampfung mit Plasmaverstärkung]
PMMA	Polymethylmethacrylat
PEEK	Poly(etherether)keton
PC	Polycarbonat
PVE	Polyvinylethylen
PEI	Polyethylenimin
CMV	Cytomegalovirus
HPV	Humanes Papillomavirus
HTLV	Humanes T-Zellen-Leukämievirus
APOE	Apolipoprotein E
APOB	Apolipoprotein B
AchE	Acetylcholinesterase
LDL	Low Density Lipoprotein [Lipoprotein mit niedriger Dichte]
HLA	Humanes Leukozytenantigen
HCV	Hepatitis-C-Virus
HIV	Humanes Immunschwächenvirus
HBV	Hepatitis-B-Virus
LIGA	Lithographie, Galvanik Abformung

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Bei 1 handelt es sich um eine Darstellung der Abhängigkeit der Eindringtiefe des elektrischen Feldes im Falle einer flächigen Struktur von der Elektrodengeometrie (unterschiedliche Verhältnisse von (Elektrodenbreite)/(Elektrodenbeabstandung)) und der Abmessung L.
Bei 2 handelt es sich um eine schematische Zeichnung des aktiven Sensor-Teststellenbereichs einer Ausführungsform eines bioelektronischen Sensors gemäß der vorliegenden Erfindung. Die in den 2–7 verwendete Bezifferung ist wie folgt: (1) Ausrichtung der Eindampfung oder Abscheidung von Metall; (2) erstes Bondpad des einen Sensors; (3) zweites Bondpad des einen Sensors; (4) „gerade" Ebenen der Elektrodenfinger; (5) „ungerade" Ebenen der Elektronenfiguren; (6) Hügel, Ebenen (4) von (5) blockierend; (7) Kanäle; (8) Maske zur Trennung der unterschiedlichen Sensoren; (9) abgeschattete Arrays (abgeschattet von der Metallabscheidung); (10) Sonden; (11) Feldlinien eines Sensors, an den eine Spannung angelegt ist; (12) nachzuweisende Moleküle; (13) beim Trennschritt geopferte Elektroden; (14) Breite aller Interdigitalelektroden zusammengenommen auf einem Sensor; (15) linke Seite der Vorrichtung mit getrennten Funktionen: Elektroden; (16) rechte Seite der Vorrichtung: Bereich mit Sonden.
Bei 3a handelt es sich um eine schematische Zeichnung, in der eine Grundplatte zur Herstellung eines Arrays aus 2 × 2 Sensoren (beispielhaft und ohne darauf beschränkt zu sein) gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung; in den 3b, 3c und 3d ist ein Querschnitt eines erfindungsgemäßen Sensors im Detail gezeigt (die verwendete Bezifferung ist wie bei 2 beschrieben).
In den 4a, 4b und 4c ist schematisch ein Metallisierungsprozeß des erfindungsgemäßen Sensors gezeigt (die verwendete Bezifferung ist wie bei 2 beschrieben).
In 5a ist dargestellt, wie eine Schattenmaske zur Erzielung einer Endstruktur angewandt wird. In 5b ist der Sensor-Array nach dem Ätzen durch diese Maske hindurch gezeigt (die verwendete Bezifferung ist wie bei 2 beschrieben).
In 6 ist das Arbeitsprinzip eines der möglichen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Sensors dargestellt. In 6a ist ein Sensor ohne „erkannte" Moleküle und in 6b mit „erkannten" Molekülen gezeigt (die verwendete Bezifferung ist wie bei 2 beschrieben).
In 7a und 7b ist eine spezifische Ausführungsform des erfindungsgemäßen bioelektronischen Sensors gezeigt (die verwendete Bezifferung ist wie bei 2 beschrieben).
BEISPIELE UND AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Bevorzugte beispielhafte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind im folgenden in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen beschrieben. Dabei versteht sich, daß die angegebenen Beispiele nur dem Zwecke des Lehrens der Erfindung dienen, wobei der Geist und Umfang dieser Patentanmeldung nur durch die Bedingungen der beigefügten Ansprüche eingeschränkt sind.
Der Sensor der vorliegenden Erfindung umfaßt eine Isolierungsschicht mit darüber liegenden Metallelektroden. In der Isolierungsschicht wird ein Strukturmuster im Submikronbereich hergestellt. Die oberen Metallschichten liegen in einer bestimmten Geometrie vor, wodurch die Nachweisempfindlichkeit des Sensors verbes sert wird. Der Sensor kann weiterhin eine Basisschicht umfassen.
In 2 ist eine Detailansicht einer bevorzugten Ausführungsform eines erfindungsgemäßen elektronischen Sensors gezeigt. Diese Figur zeigt den aktiven Teststellenbereich des Sensors in Form einer schematischen Zeichnung. Dieser Sensor oder diese Teststelle kann in einer Abfolge von Schritten, wie sie im folgenden im einzelnen dargestellt ist, hergestellt werden.
Ein Substrat ist bereitzustellen. Bei dem Substrat, das als Basisschicht bezeichnet wird, kann es sich um einen kristallinen Wafer (Quartz, Silicium, Germanium), um ein amorphes Material (Glas-Wafer), ein Polymer (PMMA, PC, PEEK, PVE, PEI) oder ein Dickfilmsubstrat, wie z. B. Al₂O₃, handeln. Auf dem Substrat wird eine Isolierungsschicht gebildet. Bei der Isolierungsschicht kann es sich um eine Polymerschicht, wie z. B. Polyimid oder BCB, handeln. Gleichfalls kann es sich bei der dielektrischen oder Isolierungsschicht um Si₃N₄ handeln, das mittels LPCVD- oder PECVD-Technik abgeschieden wird. Es kann sich dabei auch um eine Schicht aus SiO₂ handeln, die auf dem Silicium-Wafer abgeschieden oder thermisch aufgewachsen wird. Danach kann eine spezifische Geometrie unter Verwendung bekannter Lithographietechniken, z. B. Photolithographie, vorzugsweise UV-Lithographie, besonders bevorzugt tiefe UF-Lithographie, mit einem anschließenden selektiven Ätzen in die SiO₂-Schicht strukturiert werden. Eine weitere Art der Herstellung einer solchen Isolierungsstruktur mit einer spezifischen Geometrie besteht in der Verwendung eines Gußverfahrens. Dabei findet die Reproduktion mittels Spritzguß oder auf eine beliebige andere Weise zur Herstellung von Replikaten statt. Die Form kann dann mit der LIGA-Technik unter Verwendung von Röntgen- oder Photolithographie, vorzugsweise UV-Lithographie, besonders bevorzugt tiefer UV-Lithographie, durch die sich sehr kleine Abmessungen erzielen lassen, hergestellt werden. Als Substrat lassen sich Kunststoffe, wie z. B. PMMA, PEEK, PVE und PEI, verwenden. Die Verwendung dieser Kunststoffe zur Herstellung von Mikrostrukturen ist im Fachgebiet bekannt.
Die mittels der oben definierten Verfahren hergestellten Formen können wiederum als Werkzeug für weitere Replikationsvorgänge, z. B. als Formeinsätze für den Mikroguß oder den Reaktionsspritzguß, verwendet werden. Bei den für die Replikationsverfahren verwendeten Materialien handelt es sich üblicherweise um geschmolzene Polymere und Gießharze. Nach dem Härten in der Metallform haben die Formmaterialien eine ausreichende Stärke erreicht, so daß die Trennung von Form und Formeinsatz stattfinden kann. Bei der Durchführung des Mikroguß- und des Mikroreaktionsspritzgußverfahrens ist die extrem niedrige Rauheit der mit der LIGA-Technik hergestellten Formeinsätze sehr wichtig.
Zu den Materialien, die zur Mikroreplikation verwendet wurden, gehören thermoplastische Polymere mit niedriger Viskosität, wie etwa Polymethylmethacrylat (PMMA), Polyoxymethylen (POM), Polyamid (PA) oder Polycarbonat, ebenso wie auf Methacrylaten, Siliconen und Caprolactamen basierende Reaktionsharze. Es könnten jedoch noch viele weitere Materialien verwendet werden. Außer füllstoffhaltigen Gußmaterialien lassen sich fast alle für den makroskopischen Guß geeignete Materialien für den Mikroguß verwenden.
Keramische Mikrostrukturen lassen sich durch Schlickergießen durch Verwendung von Sol-Gel-Prozessen oder mittels elektrophoretischer und anderer Verfahren herstellen. So ist es beispielsweise möglich, die Lücken einer mit der LIGA-Technik hergestellten Polymerstruktur mit einem Schlicker aus mikrokristallinem Keramikpulver zu füllen. Nach dem Trocknen und Brennen wird das Polymer abgebaut, verdampft oder wird oxidiert, was zu einer keramischen Mikrostruktur führt („Verfahren der verlorenen Form"). Aufgrund des Schrumpfens während des Brennvorgangs sind die charakteristischen Abmessungen der Keramikstrukturen kleiner als die der Polymerform. So können mittels der LIGA-Prozesstechnik mechanisch sehr stabile und temperaturbeständige Materialien, piezoelektrische Materialien und Ionenleiter mikrostrukturiert werden.
In 3 ist eine Platte mit 2 × 2 Sensoren gezeigt. Bei der chemischen Zusammensetzung dieser Platte kann es sich lediglich um eine Isolierung handeln, oder die Platte kann aus einem Substrat (z. B. einem Silicium-Wafer) mit einer darauf liegenden Isolierungsschicht (z. B. einer SiO₂-Schicht) zusammengesetzt sein. Die Topographie der Platte zeigt Vertiefungen (7) und Hügel (6). In 3b ist ein Detail eines Sensors, und in 3c und 3d sind Ansichten im Querschnitt gezeigt. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Vertiefungen (7) um Kanäle (7) mit Abmessungen in der gleichen Größenordnung wie die nachzuweisenden Moleküle. Somit sind die Kanäle vorzugsweise etwa 100 nm tief und etwa 100 nm breit, mit einem Abstand zueinander von jeweils 100 nm. Der Abstand in einer Richtung definiert benachbarte Ebenen (4) (5). Die Abmessungen der Kanäle können in einem Bereich von etwa 500 nm Tiefe und etwa 500 nm Breite bis zu etwa 10 nm Tiefe und etwa 10 nm Breite, vorzugsweise einer Tiefe von weniger als 250 nm und einer Breite von weniger als 250 nm, liegen. Diese Breite und Tiefe können unabhängig voneinander variieren. Der Abstand zwischen zwei Kanälen liegt in der gleichen Größenordnung wie die Breite und Tiefe der Kanäle. Die Länge der Kanäle entspricht der Länge des aktiven Teststellenbereichs des bioelektronischen Sensors. Nachfolgend sowie zwecks Erläuterung der Erfindung wird diese Länge mit 0,5 mm angenommen. Längen zwischen 100 μm und 1 mm oder kürzere oder größere Längen sind möglich. Der aktive Bereich kann in einer beliebigen Geometrie ausgeführt sein, wobei für Herstellungszwecke eine quadra tische Form bevorzugt ist. Er kann ebenso rechteckig sein. Ebenso können die Kanäle eine beliebige Form aufweisen, z. B. Trapez-, Dreiecks-, Rechtecks- oder Zylinderform.
Bei den Hügeln (6) handelt es sich um Erhebungen mit einer spezifischen Höhe. In dieser Ausführungsform wird eine Höhe von 1 μm angenommen. Die Höhe der Hügel kann einen beliebigen Wert aufweisen, der oberhalb der Breite der Kanäle liegt. Ihr Zweck besteht darin, die Ebenen (4) und (5) zwischen den Kanälen zu trennen. Die Form der Hügel ist vorzugsweise rechteckig, doch braucht dies nicht unbedingt der Fall zu sein. Die Hügel sind am Ende der Ebenen (4) (5) zwischen den Kanälen lokalisiert und müssen dabei über die Kante des Kanals hinausragen. Sind sie auf der einen Seite des Sensors in den „geraden" Ebenen (4) lokalisiert, so sind sie auf der anderen Seite (5) in den „ungeraden" Ebenen lokalisiert (2b). In dieser Ausführungsform sind die Hügel etwa 200 nm lang und etwa 200 nm breit.
In 4 ist der nächste Schritt der Bearbeitung veranschaulicht. Eine Metallschicht wird auf der Platte unter einem Winkel, vorzugsweise mittels Elektronenstrahlverdampfung, abgeschieden. Die Ausrichtung der Abscheidung ist durch den großen Pfeil (1) angedeutet. Die Art der Ausrichtung muß dabei so sein, daß einige Orte (9) auf der Platte im Schatten liegen und nicht von dem Metall bedeckt werden. Der Winkel der Metallabscheidung muß daher kleiner als 90° bei Messung mit Bezug auf die Oberfläche der Platte sein. Vorzugsweise ist der Abscheidungswinkel kleiner als 60°, 45° und noch kleiner als 30°, wie z. B. 20°, 10°, 5° oder 1°. Die Orte (9) befinden sich am Boden der Kanäle sowie an den Seitenwänden der Kanäle und der Hügel entlang der Abscheidungsrichtung (1). Die Ebenen (4) (5) zwischen den Kanälen werden voneinander isoliert, da sich am Boden der Kanäle sowie an den Seitenwänden entlang der Abscheidungsrichtung (1) kein Metall befindet. Aufgrund der Hügel (6) werden sie auch nicht an den Kanten kurzgeschlossen (siehe 2 für einen 3-D-Eindruck). Alle Metalle, die nicht mit der Probenlösung reagieren, können verwendet werden. Beispiele sind Pt, Pd, Au oder weniger edle Metalle, wie etwa Ag oder Al, vorausgesetzt, daß chemische Reaktionen an den Elektroden ausgestoßen werden. Die Dicke der Metallschicht oder Metallbeschichtung kann im Bereich von etwa 2 nm, 50 nm, 100 nm, 200 nm liegen oder dicker sein, und vorzugsweise beträgt die Metalldicke 20 nm. Die Metallabscheidung läßt sich durch thermische Verdampfung, Sputtern, Elektronenstrahlabscheidung oder eine beliebige andere Technik, die zur Abscheidung von Metallen bekannt ist, wie z. B. einen auftreffenden Metallfluß, erreichen.
Die unterschiedlichen Sensoren in einem Array (in diesem Beispiel 2 × 2 Sensoren) werden dennoch kurzgeschlossen. Die unterschiedlichen Sensoren werden durch selektives Ätzen des verdampften Metalls getrennt. In 5a ist die Anwendung einer Maske (8) gezeigt. Diese Maske kann lithographisch auf ein Lackmuster übertragen werden oder es kann sich dabei um eine Schattenmaske handeln. Wird die Struktur so wie hier geätzt, so bleiben die Strukturen unter der Maskenschicht erhalten und der nicht bedeckte Bereich wird geätzt. In 5b ist das Ergebnis dieses Ätzvorgangs in getrennten Sensoren gezeigt. Bei diesen getrennten Sensoren kann es sich um eine mögliche Endstruktur handeln. Diese getrennten Sensoren mit den daran angebrachten Sodnen sind ebenso eine mögliche Endstruktur. Es werden getrennte Bondpads (2) und (3) erhalten, und somit ergibt sich eine interdigitale Elektrodenstruktur.
Der im Schatten liegende Bereich der Maske (8) in 5a bestimmt den aktiven Array des Sensors und die positiven (2) und negativen Bondpads (3). Der offene Bereich der Maske wird weggeätzt (vgl. oben) und trennt die unterschiedlichen Sensoren voneinander. Die Ausrichtung der Maske (8) ist nicht kritisch. Für diese Ausführungsform ist eine Ausrichtungsgenauigkeit von 10 μm ausreichend. Die Ober- und die Unterseite in 5a definieren die Bondpads (2) und (3), wobei deren Endabmessung nicht kritisch ist. Die Abmessungen der linken und der rechten Seite in 5a sind ebenfalls nicht kritisch. Denn die Maske (8) ist 50 μm kleiner als die Breite (14) aller Kanäle. Der endgültige aktive Bereich wird somit durch die Maske bestimmt (8). Einige Finger (13) werden geopfert und weggeätzt. Dies bedeutet, daß eine Fehlausrichtung um die Hälfte dieser Breite von 50 μm (d. h. 25 μm) gar keinen Einfluß hat, da der aktive Bereich immer noch vollständig mit Kanälen (7) und den erhaltenen Fingerelektroden (4) und (5), bei denen es sich um die metallisierten Ebenen handelt, bedeckt ist. Durch diese Vorgehensweise werden keine Strukturierungsverfahren mit einer Auflösung im Submikronbereich benötigt.
Andere, im Fachgebiet bekannte Verfahren zur Trennung der unterschiedlichen Sensoren können ebenso im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
In 6 ist ein möglicher Weg des Arbeitsprinzips eines Sensors der vorliegenden Erfindung gezeigt. Sonden (10) können in den Isolierungsbereichen der Kanäle nach Sondenimmobilisierungsverfahren, die im Fachgebiet bekannt sind, wie z. B. Epoxyverknüpfung, Carbodiimid, reduktive Aminierung, Cyanogenbromid, Succinimid, Carbodiimidazol, Tresyl- und Tosylchlorid, Divinylchlorid, Maleimid, Hydrazid, Iso(thio)cyanate und besonders bevorzugt Silanisierung mit Aminosilanen, Epoxysilanen, Thiocyanatsilanen, Isocyanatsilanen, Bernsteinsäureanhydridsilanen, Sulfhydrylsilanen, Caprolactamsilanen usw., immobilisiert werden. In anderen Meßkonfigurationen und/oder -ansätzen lassen die Sonden jedoch selektiv immobilisieren, und zwar:

– nur auf Metalloberflächen, beispielsweise durch Adsorption von schwefelhaltigen Gruppierungen an eine Au-Schicht,
– oder über den gesamten aktiven Teststellenbereich: auf den Isolierungs- und leitenden Schichten, beispielsweise mit einem sequenziellen Immobilisierungsverfahren oder durch Plasmapolymerisation einer organischen Schicht, die reaktive Gruppen, wie etwa Amino, Sulfhydryl, Aldehyde, Caroxyl, Hydroxyl usw., aufweist.

Bei den Sonden in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kann es sich beispielhaft und ohne darauf beschränkt zu sein, um Enzyme (mit Affinität für spezifische Substrate), Oligonucleotide (mit Affnität für spezifische DNA- und RNA-Fragmente), Antikörper (mit Affinität für spezifische Antigene), Antigene (mit Affinität für spezifische Antikörper) oder um beliebige andere Bestandteile eines Analyt/Coanalyt-Komplexes handeln.
Durch Anlegen eines elektrischen Signals, d. h. Spannung oder Strom, an Bondpad (3) und Bondpad (2) entsteht ein elektrisches Feld, was zu elektrischen Feldlinien führt (11). Befindet sich der nachzuweisende Analyt (12) in einer Probenlösung, so bindet er an die spezifischen Sonden (6b), was zu einer Änderung des elektrischen Felds (11) im Gegensatz zu der in (6a) dargestellten Situation führt. Diese Änderung läßt sich durch Messen der Impedanz bei der korrekten Frequenz und/oder DC-Vorspannung quantifizieren. Vorzugsweise handelt es sich bei dieser elektrischen Messung um eine Impedanzanalyse, die als Messung des Widerstands, der Kapazität, des dielektrischen Verlusts und/oder der Reaktanz über einen Frequenzbereich, wobei die DC-Vorspannung gegebenenfalls eingeschlossen ist, oder als eine Kombination aus diesen Techniken erfolgen kann.
Aufgrund der Submikron-Abmessungen der Kanäle und aufgrund der Form der Elektroden (die aus der Abscheidung von Metall unter einem Winkel hervorgeht), dringen die elektrischen Felder (11) stark in den Bereich mit den immobilisierten Sonden (11) ein. Eine noch stärkere Beschränkung der elektrischen Felder auf den interessierenden Bereich könnte erzielt werden, falls eine zweite Isolierungsschicht auf die Ebenen (4) und (5) aufgetragen wird. Auf diese Weise sondieren die elektrischen Feldlinien stärker das Innere der Kanäle, wo der gebundene Analyt den meisten Raum einnimmt.
Wird ein erfindungsgemäßer Sensor mit den kleineren Abmessungen (unter 100 nm) angefertigt, so besteht die Möglichkeit, daß größere Moleküle, die nachgewiesen werden sollen, aufgrund sterischer Hinderung nicht mehr in die Kanäle gelangen können. In 7 ist schematisch dargestellt, wie dieses Problem überwunden werden kann. Dazu wird ein Sensor angefertigt, der in zwei Teile geteilt werden kann. Die linke Seite (15) des
Sensors besteht aus einem Array aus Sensoren mit der interdigitalen Elektrodenstruktur, auf die gleiche Weise wie oben erörtert hergestellt. Die rechte Seite (16) weist ein Spiegelbild des Sensorarrays auf und ist mit immobilisierten Sonden (10) bedeckt. Die Probenlösung, die die molekularen Strukturen sowie Elemente, die nachgewiesen werden sollen, enthält, wird oben auf die rechte Seite (16) gegeben (inkubiert). Bestimmte Moleküle (12) binden an die Sonden (10). Nach diesem Erkennungsvorgang wird der Sensor durch Falten geschlossen (7b). Durch die Anwendung mechanischer Kraft werden die Sonden (10) und Moleküle (12) nahe genug an die Interdigitalelektronenstruktur geführt, so daß eventuell ein Unterschied in der Impedanz der inkubierten gegenüber der nichtinkubierten Struktur gemessen werden kann.
In der vorliegenden Erfindung werden Sensoren, die sich für Echtzeitmessungen eignen, d. h. den Bindungsvorgang während unterschiedlicher Inkubationsschritte, mit oder ohne verschiedene Bedingungsänderungen, wie z. B. Temperatur, beschrieben.
Die vorliegende Erfindung gestattet ebenso sehr flexible Meßansätze, wie z. B. der Immobilisierung von Analyten auf der Oberfläche der Sensorvorrichtung und Erkennung bestimmter, in der Lösungsphase aufgetragener Sonden.
Das beschriebene technische Verfahren und die starke Miniaturisierung der Sensoren gestatten ebenso die Konstruktion mikrodiagnostischer Vorrichtungen.
Unterschiedliche Sonden enthaltende Sensorarrays lassen sich in der gerade beschriebenen Weise unter Erhalt von mikrodiagnostischen Vorrichtungen herstellen. Mit diesen integrierten mikrodiagnostischen Vorrichtungen können gleichzeitig viele Parameter nachgewiesen werden, d. h. es kann damit ein Multiparametertest durchgeführt werden. Dies ist von besonderer Bedeutung für Situationen mit begrenzter Probenmenge, wie etwa im Fall von Blutproben von Neugeborenen, für die Anforderungen einer zuverlässigen Diagnose, wie etwa im Fall der Transplantationsimmunologie, von Autoimmunkrankheiten oder Blutinfektionen, und letztendlich für Screening-Assays.
Solche nebeneinandergestellte mikrodiagnostische Arrays besitzen den zusätzlichen Vorteil, daß damit mehrere unterschiedliche Proben parallel und gleichzeitig bearbeitet werden können.

Claims

Sensor, basierend auf einer Isolierungsschicht mit darin befindlichen mehreren voneinander beabstandeten Kanälen (7), die im wesentlichen die gleiche Ausrichtung und jeweils einen Boden und wenigstens zwei gegenüberliegende Seitenwände entlang der Ausrichtung aufweisen, wobei der Sensor weiterhin durch – die Gegenwart mehrerer Hügel (6), die an wenigstens einem Ende der zwischen den Kanälen gebildeten Ebene lokalisiert sind, sowie – eine Metallbeschichtung, die wenigstens teilweise auf den beiden gegenüberliegenden Seitenwänden jedes Kanals und wenigstens teilweise auf der Oberseite der Isolierungsschicht zwischen den Kanälen aufgetragen ist und dadurch einen Teil einer zwei Elektroden (4, 5) umfassenden Impedanzmeßvorrichtung bildet, gekennzeichnet ist.
Sensor nach Anspruch 1, wobei die Hügel: – eine größere Höhe als die Breite der Kanäle aufweisen und – die Ebene zwischen den Kanälen und teilweise zwei benachbarte Kanäle überlappen.
Sensor nach Anspruch 1 oder 2, weiterhin umfassend Sonden zur Bindung an in einer zu untersuchenden Probe enthaltene molekulare Strukturen, wobei die Sonden entweder auf den isolierenden Teil der Kanäle und/oder auf die Oberfläche der Elektroden aufgetragen werden.
Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Isolierungsschicht auf ein Basisschichtsubstrat aufgetragen wird.
Sensor nach Anspruch 4, wobei es sich bei dem Substrat um einen Silizium-Wafer handelt.
Sensor nach einem der Ansprüche 1 oder 5, wobei die Abmessungen der Kanäle in einem Bereich von 10 nm bis 500 nm liegen.
Sensor nach Anspruch 6, wobei die Kanäle eine Tiefe von 100 nm und eine Breite von 100 nm aufweisen und zwischen den Kanälen jeweils ein Abstand von 100 nm vorhanden ist.
Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei es sich bei der Isolierungsschicht um ein thermisch aufgewachsenes SiO₂ handelt.
Sensor nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei es sich bei der Isolierungsschicht um ein Polymer handelt.
Verfahren zur Herstellung eines Sensors, bei dem man: – mehrere voneinander beabstandete Kanäle in einer Isolierungsschicht bildet, die im wesentlichen die gleiche Ausrichtung und jeweils einen Boden und wenigstens zwei gegenüberliegende Seitenwände entlang der Ausrichtung aufweisen sowie gegebenenfalls Hügel mit der in den Ansprüchen 1 und 2 angegebenen Bedeutung; – eine Metallschicht auf der Isolierungsschicht abscheidet, während die Isolierungsschicht in bezug auf die Metallabscheidungsquelle so ausgerichtet wird, daß der Boden der Kanäle sowie die Seitenwände der Kanäle entlang der Abscheidungsrichtung im Schatten liegen und nicht von Metall bedeckt werden, so daß dadurch eine Impedanz entsteht; und – gegebenenfalls Sonden zur Bindung an in einer zu untersuchenden Probe enthaltene molekulare Strukturen aufträgt, wobei die Sonden entweder auf den isolierenden Teil der Kanäle und/oder auf die Oberfläche der Elektroden aufgetragen werden.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Winkel der Metallabscheidung in Bezug auf die Isolierungsschicht kleiner als 90° ist.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, bei dem man in einem weiteren Schritt die Isolierungsschicht auf ein Basisschichtsubstrat aufträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei es sich bei dem Substrat um einen Silizium-Wafer und bei der Isolierungsschicht um ein thermisch aufgewachsenes SiO₂ handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei der Schritt der Bildung der Kanäle mit mikroelektronischen Strukturierungstechniken ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Schritt der Bildung der Kanäle mit einem photolithographischen Verfahren ausgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15, wobei es sich bei der Isolierungsschicht um ein Polymer handelt.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Polymer mittels Mikrostrukturguß strukturiert wird.
Sensorvorrichtung zur Identifizierung molekularer Strukturen in einer Probenlösung, umfassend: – mehrere Sensoren nach einem der Ansprüche 1 bis 9; – gegebenenfalls eine zusätzliche, über dem Sensor aufgetragene Isolierungsschicht, um das elektrische Feld in dem Kanal auf den Raum zwischen den beiden getrennten Teilen der Metallschicht zu beschränken; – Mittel zum Anlegen einer Spannung an den Metallbeschichtungen; und – Mittel zum Messen der elektrischen Eigenschaften oder der Impedanz zwischen den Elektroden der Sensoren zur Bestimmung der Sonden, die an ein assoziiertes Zielmolekül bzw. an assoziierte Zielmoleküle gebunden haben.
Sensorvorrichtung nach Anspruch 18, weiterhin umfassend Verbindungsmittel zu den Metallbeschichtungen, wobei die Verbindungsmittel den aktiven Bereich des Sensors binden und im wesentlichen senkrecht zur Ausrichtung und zur an die Verbindungsmittel angelegten Spannung stehen.
Array aus Sensoren, bei dem es sich um eine geometrische Anordnung der Sensoren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 handelt, wobei die Kanäle unterschiedlicher Sensoren des Arrays im wesentlichen parallel zueinander liegen.
Verwendung eines Sensors nach Ansprüchen 1–9 zur Identifizierung molekularer Strukturen in einer Probenlösung, wobei man: – die Probenlösung auf mehrere Sensoren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder 20 aufträgt, wobei die Sensoren jeweils eine oder mehrere darin aufgetragene Sonden zur Bindung an eine assoziierte molekulare Zielstruktur aufweisen; – ein elektronisches Signal auf den Sensor gibt; und – die elektrischen Eigenschaften des Sensors zur Bestimmung der Sonden, die an eine assoziiertes molekulare Zielstruktur bzw. an assoziierte molekulare Zielstrukturen gebunden haben, mißt, so daß mehrere unterschiedliche Zielmoleküle nachgewiesen werden können.
Verwendung eines Sensors nach Anspruch 21, wobei der Sensor eine oder mehrere Arten von darin aufgetragenen Oligonukleotidsonden aufweist.
Verwendung eines Sensors nach Anspruch 21, wobei der Sensor eine oder mehrere Arten von darin aufgetragenen Antikörpersonden aufweist.
Verwendung eines Sensors nach Anspruch 21, wobei der Sensor eine oder mehrere Arten von darin aufgetragenen Antigensonden aufweist.
Verwendung eines Sensors nach Anspruch 21, wobei der Sensor eine oder mehrere Arten von darin aufgetragenen Peptidsonden aufweist.
Verwendung eines Sensors nach einem der Ansprüche 21 bis 25, wobei die Sonden kovalent oder nichtkovalent an den Sensor gebunden ist (sind).