JP4054379B2 - インピーダンス式検出システム及びその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、オリゴヌクレオチド、抗原、酵素、ペプチド、抗体、ＤＮＡフラグメント及びＲＮＡフラグメントなどといった１対の化学物質又は分子構造の間での結合反応を電子的に検出するための改良されたセンサーに関するものである。
本発明は、さらにこの改良されたセンサーの新規な製造方法を提供する。
サンプル溶液中の酵素、ペプチド、オリゴヌクレオチド、抗原、抗体、ＤＮＡフラグメント及びＲＮＡフラグメントなどといった特定の物質及び分子構造を検出するためのセンサー及び技術は当該技術分野でよく知られている。ある特定の分類に属するセンサーにおいては、２つの電極間のインピーダンスの測定に関連する原理が用いられる。電極間でのＤＮＡ分子又は抗体もしくは抗原の存在又は不存在は、電極間での透過度及び／又は導電度に影響を与える。分析物に対して特定の親和性を有する結合物質エレメントを用いることにより、試料溶液中の所定の分析物の存在及び／又は濃度を測定するための種々の技術が提案された。このような特定の結合反応は、例えば、酵素とその基質との間、抗体と抗原との間、ＤＮＡとＤＮＡとの間、ＲＮＡとＲＮＡとの間、又はその他の分子構造の間で生じる。
ストーナー（Stoner）らは、１９７０年３月５日付けの物理化学誌（J.Phys.Chem.）の「コンデンサ技術を用いた金属上への血液蛋白質の吸着」との記事中において、金属電極上への蛋白質の吸着を評価するための微分容量測定を開示している。
アーウィン（Arwin）らは、米国特許第４，０７２，５７６号において、吸着されたポリペプチド基質を用いて、酵素活性の測定及び免疫の相互試験のための容量法を確立している。
ギアエバー（Giaever）は、米国特許第４，０５４，６４６号において、金属基質を抗原で被覆することにより、溶液中の抗体の存在を測定する電気的方法を教示している。電極をサンプル溶液で培養した後、彼は分子シートの厚さを容量的に測定している。すなわち、彼は水銀の液滴を第２の電極として用いることにより、単分子及び２分子層の間を確認している。
ニューマン（Newman）は、国際特許出願ＷＯ８７／０３０９５号において、化学的な分析及び測定のための容量式センサーを開示している。上記センサーは、バクテリア、ウイルス、抗体、抗原、酵素基質及びホルモンを含んでいる広範囲の分析物を検出するために用いられることができる。薄い絶縁層が基質と導体の表面にコーティングされ、開かれたたコンデンサを形成する。生物種の結合剤は導体間の絶縁層の表面上で不動化される。生物種の結合剤の誘電定数は、生物種の結合剤でもって検出されている分析物の結合によって変更される。同様の検出原理が、米国特許第５，１１４，６７４号中に開示されている。
バタイラード（Battailard）らは１９８８年に分析化学誌（Anal.Chem.）の第６０巻の２３７４〜２３７９頁において、そしてさらに最近ではクライン（Klein）らが１９９５年にセンサー及びアクチュエータ誌（Sensors and Actuators)のＢ２６〜２７の４７４〜４７６頁において、金属−半導体−絶縁体のデバイスが、同様の方法でＭＩＳ（金属−絶縁体−半導体、meta1-insulator-semiconductor）コンデンサとして用いられることができることを開示している。該デバイスは第２の参照電極といっしょに溶液中に浸漬される。該デバイスの金属層と参照電極との間の交流容量を測定することにより、直流バイアス電圧が同時に印加されたときに、該システムの平坦な帯状電圧が、ＭＩＳコンデンサの場合と同様に、同様の方法で実際に測定される。平坦な帯状電圧が、絶縁体−液体の界面で吸着された種によって変化させられることができるということが証明された。この原理でもって、イオン感応性電界効果トランジスタＩＳＦＥＴ及び遺伝子感応性電界効果トランジスタＧＥＮＦＥＴが動作する。
リチャード・エバソール（Richard Ebersole)に付与された米国特許第４，２１９，３３５号は、リアクタンス・タッグ（指標）が付された免疫試薬の使用を論じている。これらのタッグは、テスト面の誘電特性、導電特性又は磁気特性を変化させるので、電気的に検出されることができる。
同様に、Ｓ．Ｊ．ムロコフスキー（S.J.Mroczkowki）に付与された欧州特許ＥＰ０ ２４１ ７７１は、導電性測定による抗体が付された金属の検出を教示している。抗原が２つの電極間で不動化されたときには、金属が付された抗体との特定の相互作用が、電極間の媒体の抵抗の減少により測定される。
Ｍ．マルムロスは（M.Malmros）、米国特許第４，３３４，８８０号において、２つのプレナー電極間の半導体性の重合層の伝導度変化について開示している。上記高分子は、いずれにせよ、特定の分析物を確認することができる何らかの分子を含んでいる。該確認手順は、重合層の導電度変化を誘発する。
さらに、このインピーダンス式の検出についての中心的なアイデアにおける変形例が、当該技術分野、欧州特許ＥＰ０ ５４３ ５５０、欧州特許ＥＰ０ ２４１ ７７１、英国特許ＧＢ２，１３７，３６１、米国特許３，９９９，１２２にあらわれている。インピーダンス式センサーにおいては、必須的に、１対の電極の上、その間、あるいはその聞及び上の両方において不動化される。上記分子は、サンプル溶液にさらされたときに特定の分析物を「認識」する。この認識プロセスは、結局、電極の近傍の空間部の導電度及び／又は透過度の変化において、直接又は間接に終了する。最後に、２つの電極間のインピーダンスを測定することにより、認識プロセスの測定が確立されることができる。
上記のようないわゆるセンサーに関連する問題は、良好な分解能を備えるためには、不動化された層が完全に均一化されなければならず、かつ穴を含んではいてはならないということであるが、これを達成することは困難である。
ミクロ電子技術の出現に伴って、これをミクロセンサーを開発するために用いるための絶え間ない努力がなされている。ミクロ電子技術でもって実現されるセンサーは、低コストな製造、製造プロセスの高い再生産性、均一性、検出精度及び開発の柔軟性などといった利点を提供する。このようなミクロ電子センサーは、再生可能で均一な電気特性を備えた多数の個々の検査位置を含むことができ、これによりセンサーの検出感度が高められている。検出部位は、検出されなければならない分子の寸法のオーダーの寸法でもってつくられることができる。空間的な制限は、器械の使用技術の状態とプローブ（探査針）の密度とによって指令されるデバイスの感度と、製造技術の分解能とである。配置もまた実現されることができ、ここにおいて個々の試験位置は、上記試験部位で検出されることになっている特定の分子に応じて、それぞれ異なるタイプの信号を生成することができる。
ミクロ電子技術のもう１つの重要な特徴はその平坦性である。このようにパターン化されたミクロ電極は、基本的には平坦な素子である。この特徴は、インピーダンス式デバイスの利点ではない。平坦なインピーダンス式構造においては、電場線は、現実の３次元構造に比べて、対象となっている領域からデバイス表面のさらに上まで伸びる。これは、対象となっている領域が空間内に制限されるとき、すなわちそれが該構造の表面で吸着された分子層又は酵素もしくは高分子膜であるときには、とくに大きな欠点となる。対象となっているこの領域を通過するどの電場線も、測定に対するノイズと考えられる分路インピーダンスをインピーダンス式応答に導入する。
さらに、電極の幾何学的態様、すなわち寸法及び間隔に応じて、全信号の大半が、図１に示されているように、デバイスの表面の上のある領域に閉じ込められる。同じ図から、だれでも、デバイスのごく近傍における空間を探査するインピーダンス式平坦構造を得る上においては、小型化すなわちＬの減少が決定的であるということを演繹することができる。寸法が縮小された図はデシルバらによって与えられた。
デシルバ（DeSilva）らは、１９９５年に、バイオセンサー及びバイオエレクトロニクス（Biosensors & Bioelectronics）の１０巻の６７５〜６８２頁において、共有結合の抗体不動化技術を単純なインピーダンス応答法を組み合わせたバイオセンサー構造を報告している。該バイオセンサーは、抗ＳＥＢ抗体を、シリコンチップの上に堆積された、超薄型で島状で電気的に連続なＰｔフィルムの上に、共有結合させることにより製作された。それらは、ＳＥＢと特定の相互作用を起こしたときにインピーダンスの減少を記録する。
しかしながら、製造工程でのいくぶんかランダムな挙動、すなわちＰｔの堆積及び不動化手法に起因して、再生産性が低くなる。
実際の電極パターニングプロセスは、該構造の良好な再生産性を確実化し、かつセンサーの挙動の制御を改善するようである。パターン化された特徴をもつ数１００ｎｍ（ナノメータ）の寸法を有するデバイスは、３００ベースのＤＮＡフラグメントすなわちおよそ１８０ｎｍの全分子長を呈するもの、又は酵素もしくは抗体のようなその他の高分子（直径数１０ナノメータ）に対して高い感度を示すものと期待されている。この寸法領域は、普通、次に示す２つの手法で達成される。
１．深紫外線又はＸ線リソグラフィ、およそ１００ｎｍの形状が十分に最適化されたプロセスでもって達成されることが可能な技術
２．電子ビームパターニング、数１０ｎｍの形状を得ることが可能な冗長で非常に高価な技術
分子構造の存在又は不存在を測定するのに適した電気化学センサーを提供することが本発明の１つの目的である。
上記のものを製造する方法を提供することが本発明のもう１つの目的である。
サンプル中の分子構造の存在を検出するための方法を提供することが本発明のさらにもう１つの目的である。
本発明は、分析物を伴った電極の間の電場の干渉に基づく新規な電気化学センサーに関するものである。試験されるべき分析物は、プローブによって構造の近傍の近接位置にもってこられる。
より詳しくは、本発明は、サンプル溶液が露出されている範囲内で、分子構造を特定するためのセンサーに関するものである。該センサーは、内部に複数の中間チャンネルを伴った、基本的には同一方向を向いている絶縁層を含んでいる。上記チャンネルは、上記方向に沿って、少なくとも２つの背向する側壁と、底部とを有している。さらに該チャンネルはミクロン下の寸法を有している。基本的には各チャンネルの上記２つの背向している側壁の１つの上と、上記チャンネルの間の絶縁層の頂部の上とに、金属被膜が形成され、これによりチャンネルの間及び内部に上記サンプル溶液を伴ったインピーダンス式デバイスを形成している。上記分子構造に結合するための随時のプローブが、上記センサーにすでに応用されている。上記プローブは、チャンネルの絶縁部（上記チャンネルのもう一方の側壁及び上記底部）か、電極の表面か、あるいはチャンネルの絶縁部及び電極の表面の両方に応用されることができる。さらに、金属被膜の上に電圧を印加する手段、さらには電極の間でのインピーダンスを測定する手段が設けられている。
本発明にかかる電気化学センサーあるいは略してセンサーという語句は、（生物）化学の情報を電気信号に変換するデバイスを意味する。
本発明は、従来技術にかかるセンサー及び方法に比べて、感度の問題を克服している。この新規な仕様の１つの重要な特徴は、高度な小型化である。これは、該構造のノイズを低減し、その結果その感度を高めるものと思われる。提案された該センサーのもう１つの顕著な特徴は、その３次元形状である。これは、対象となっている領域内における電場の透過を改善し、その結果として感度の上昇が伴われる。上記センサーは、たとえ大きな活性領域に対してでも、安価な方法で製造されることができる組み合わされた電極構造を有している。
本発明にかかるプローブは、もう１つの分子と反応して複合物を生成し、及び／又は２次的な反応を誘発することができ分子として機能的に定義される。プローブが酵素、抗体、抗原、ペプチド、ＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント又はオリゴヌクレオチドであることができるということは、例示のつもりであって限定のつもりではない。本発明にかかる好ましいプローブは、本願出願人の１人によって保持されている次の特許及び特許出願に記載されている。ＥＰ ０ ３３７ ８９６、ＥＰ ０ ３４５ ３７５、ＥＰ ０ ６５７ ５３２、ＥＰ ０ ４１９ ３５５、ＥＰ ０ ５２５ ０９５、ＥＰ ０ ４９４ ３１７、ＥＰ ０ ４８９ ９６８、ＥＰ ０ ６４４ ２０２、ＷＯ９２／１０５１４、ＥＰ ０ ４９９ ００３、ＷＯ９２／１１３６６、ＷＯ９２／１６６２８、ＷＯ９２／１９７７０、ＷＯ９３／０８３０２、ＷＯ９３／１８０５４、ＥＰ ０ ５６１ ０８７、ＷＯ９３／２２４３７、ＷＯ９４／０１５５４、ＥＰ ０ ６３７ ３４２、ＷＯ９４／１３７９５、ＷＯ９４／１８３２５、ＷＯ９４／２１８１８、ＷＯ９４／２５６０１、ＷＯ９５／１２６６６、ＷＯ９５／１７４２９、ＷＯ９５／３３８５１、ＷＯ９６／００２９８、ＷＯ９６／０４３０９、ＥＰ ０ ７２１ ５０５、ＷＯ９６／１３５９０、ＷＯ９６／１３６０８、ＷＯ９６／１７０６５、及び９６／０３０９１、９６／０４１４６の番号で出願されたＰＣＴ出願、さらには９５８７０１３６．９、９６８７０００６．２、９６８７００８１．５、９６８７００５３．４、９６８７０１２２．８又は９６８７０１３１．８の番号で出願された欧州特許出願。この書面で参照されているこれらの特許（出願）及びその他の文書の内容は参照文献として編入されているのものと考えられるべきである。プローブさらにはこれらのプローブの製作方法は、上記文書中でさらに論議されている。これらのプローブが、当該技術分野で知られている何らかの合成方法により製作されることができ、あるいは生体源から精製されることができるということは、明白であるというべきである。
サンプル又は分析物中で検出されるべき目標物は、上記プローブと結合又は反応するサンプル中に存在するどのような分子であってもよい。かくして、該目標物はまた、酵素、抗体、抗原、ペプチド、ＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、オリゴヌクレオチド又は全体細胞でさえも含むことができる。目標物のタイプ及び応用のタイプに応じて、目標物の検出に関連する情報を処理するための特定のタイプの認識回路には、センサーが一緒に又は個別に設けられる。
サンプルは、健康なもしくは病気の人間又は動物から直接に採取され、又は培養（増殖）された後で検出されるべき目標物分子を含んでいるどのような生物サンプル（組織又は流体）であってもよい。より詳しくは、これらのサンプルは、あらゆる種類の喀出物、血液、プラズマ、痰などの気道サンプル、気管支洗浄物、皮膚組織、バイオプシー、リンパ血液培養物質、コロニー、脳脊髄液、脳組織、尿、胃腸管、食物、供給物又は環境サンプルを含むことができる。上記サンプルは、当該技術分野で知られているどのような方法ででも準備され又は抽出されることができる。
該サンプルはまた、以下に記述されるようなどのような調製本（尿素等）又はその他の工業製品であってもよい。
これに代えて、試験されるべきサンプルは、溶液に溶解された、例えば拡張されたヌクレオチドなどといった、部分的もしくは全面的に精製された目標物又は
分析物を含んでいてもよい。これらの溶液は、特定のプローブとその目標物との間の結合反応を確立するのに適した、当該技術分野で知られているどのようなタイプの溶液から選択されてもよい。
ヌクレオチドの検出の場合においては、サンプル物質は、遺伝子ＤＮＡもしくは前駆体ＲＮＡ又はこれらの拡張されたもののいずれか１つを含むであろう。該溶液は、ハイブリッド溶液と称されるものとなるであろう。「本発明にかかる望ましいハイブリッド特性」と称されるものであるハイブリッドにおいては、プローブ（この場合はオリゴヌクレオチド）は、そのために設計された特定の有機体又は分子からＤＮＡ又はＲＮＡをハイブリッド化するだけであり、特定のサンプル中にも存在するかもしれない異種のもしくは変化した分子又は密接に関連する有機体などといった、その他の有機体又は分子からＤＮＡ又はＲＮＡはハイブリッド化しないであろう。実際には、これはしばしば、、目標物のないシーケンスに比較して、プローブが設計された有機体からの目標ＤＮＡ又はＲＮＡに関して、ハイブリッド化信号の強度が少なくとも、２、３、４、５倍あるいは１０倍も強くなることを意味する。多くの場合、プローブのヌクレオチドと完全に整合するヌクレオチドを検出することは望ましくかつ達成可能である（不整合が検出されるハイブリッド化条件が用いられることを意味する）。
ハイブリッド化条件は、媒体又は溶液の成分の濃度及び性質、並びにハイブリッドが形成され及び洗浄される際の温度などといった、いくつかのパラメータに応じて監視されることができる。修正が導入されたときには、それがプローブ又は媒体のいずれかにおいてであれば、ヌクレオチドのプローブが要求される特性を得るために用いられる温度が、１９８５年に英国オックスフォードのＩＲＬプレスから発行された、編集者ハムス（Hames）及びヒギンズ（Higgins）にかかる核酸のハイブリダイゼーションの実用研究などに記載されている既知の関係に従って変化させられるべきである。
該プローブは、例えば分解能プローブ分配システムによって不動化された、あるいは現場で合成された、当該技術分野で既知のあらゆる方式の本発明にかかるセンサーに応用されることができる。
本発明の範囲内に含まれるもう１つの装置においてもまた、サンプルはセンサーに適用されることができ、そしてプローブは溶液内においてセンサーの活性的な試験部位領域に加えられ、検出されることができる認識をもたらす。
多数のプローブを伴った認識結果を同時につくりだす能力は、本発明にかかるセンサーの顕著な利点であるということが強調されるべきである。
サンプル中に存在する抗体を検出する場合においては、プローブは、当該技術分野で既知の非特異性抗体又はプローブは抗原（例えば、ペプチド又はポリペプチド）であろう。サンプル中におそらく存在するペプチドもしくはポリペプチド又は抗原を検出する場合においては、プローブは、何らかの抗原と特別に結合している抗体又はその誘導体、何らかのペプチド又はポリペプチドと特別に結合している不感性ペプチド、上記ポリペプチド又はペプチドと特別に結合している化学分子又はレセプタであろう。サンプル中に存在するおそらく調製され又は精製された目標物物質がその中に溶解している溶液は、上記結合分子の間に結合が起こるのを許容する何らかの溶液であろう。この形成が生じるであろう条件は、当該技術分野ではよく知られており、さらに例えば本願出願人の１人にかかる前記の特許及び特許出願にも記載されている。
本発明はまた、サンプル物質内の分子構造を確定するためのセンサーの製造方法にも関するものである。この方法は、絶縁層内に複数の中間チャンネルを形成するステップを含み、ここで上記チャンネルは本質的には同一方向を有しており、かつ上記方向に沿って少なくとも２つの反対向きの側壁と底部とを有している。さらに、該方法は、上記絶縁層の上に金属層を堆積させる一方、上記堆積方向に沿った上記チャンネル（流路）の側壁と上記チャンネルの底部とが金属によって遮られるものの被覆はされないようにして、上記誘電体層を金属堆積源に関して一列に並ばせ、これによりチャンネルの間と内側とに上記サンプル物質を伴ったインピーダンス式デバイスを形成し、その結果として上記分子構造との結合のためのプローブを不動化するステップを含んでいる。ここで、上記プローブは、チャンネルの絶縁部（上記チャンネルのもう１つの側壁及び上記底部）、もしくは電極の表面、又はチャンネルの絶縁部及び電極の表面の両方のいずれかに加えられる。
本発明は、広い応用分野における重要なツールを示しているが、これは次のような特定の相互作用を測定するのに適した例示のものであって限定するものではない。酵素とその基質との間の反応。あるいは、抗体と抗原との間の、ＤＮＡとＤＮＡとの間の、ＲＮＡとＤＮＡとの間の、又はその他の分子構造での認識反応。上記特定の相互作用の反応動力学の研究において。ペプチド、酵素、ヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びこれに類するものなどの分子配列のため。遺伝子変異の検出のため。疫学及び遺伝子型又は血清型又は例えばＨＬＡ及びＨＣＶのため。淋菌中のテトラサイクリン及びベータ・ラクタマーゼに対する耐性、リファンピシン耐性の人の結核菌株の検出、又はＨＩＶ中のＡＺＴ耐性の検出などといった薬剤感受性試験のため。スクリーニング及び診断において。ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ヘルペス及び類似のもの、ＣＭＶ、ＨＰＶ、又はＨＴＬＶの場合におけるようなウィルス診断。性的感染症の場合におけるような細菌診断。大脳脊髄液分析。異なるミコバクテリア種の検出。好気性感染、耳炎、気道、胃腸管、歯周病、病原性真菌の評価。のう胞性線維症、アルツハイマーのような遺伝病。ミトコンドリア変異、血小板抗原、薬剤レセプタ、アテロームスクレロシス及び冠状心臓病に対する危険因子、ガン、ＡＰＯＥ、ＡＣｈＥ、ＡＰＯＢ、ＬＤＬ等々の検出。導電性尿素又はクレアチニン定量の場合におけるような医療分析。
センサーの高度な小型化はまた、多重パラメータの同時検出、すなわち多重パラメータ試験及び最終スクリーニング分析が可能な一体化されたミクロ診断デバイスの構築をも許容する。
略語
ＢＣＢ ベンゾサイクロブチン
ＬＰＣＶＤ 低圧化学蒸着
ＰＥＣＶＤ プラズマ強化化学蒸着
ＰＭＭＡ ポリメチルメタクリレート
ＰＥＥＫ ポリ（エーテルエーテル）ケトン
ＰＣ ポリカーボナート
ＰＶＥ ポリビニルエチリーン
ＰＥＩ ポリエチレンイミン
ＣＭＶ サイトメガロウィルス
ＨＰＶ 人の乳頭腫ウィルス
ＨＴＬＶ 人のＴ細胞白血病ウィルス
ＡＰＯＥ アポリポ蛋白Ｅ
ＡＰＯＢ アポリポ蛋白Ｂ
ＡｃｈＥ アセチルコリンエステラーゼ
ＬＤＬ 低密度リポ蛋白
ＨＬＡ 人の白血球抗原
ＨＣＶ Ｃ型肝炎ウィルス
ＨＩＶ 人の免疫欠損ウィルス
ＨＢＶ Ｂ型肝炎ウィルス
ＬＩＧＡ リソグラフィ・ガルバニック型（Abformung）
【図面の簡単な説明】
図１は、平坦構造の場合における電場貫通深さの、電極形状（（電極幅）／（電極間隔）の比が異なる）及び寸法Ｌについての依存性を示す図である。
図２は、本発明にかかる生物電子センサーの実施の形態における活性的なセンサーの試験位置領域の模式図である。図２〜７で用いられる番号は次のとおりである。すなわち、（１）は金属の堆積又は蒸発の方向であり、（２）は１つのセンサーの第１結合パッドであり、（３）は１つのセンサーの第２結合パッドであり、（４）は電極フィンガー「偶数の」面であり、（５）は電極フィンガーの「奇数の」面であり、（６）は面（５）から面（４）をブロックする丘部であり、（７）はチャンネルであり、（８）は異なるセンサーを分離するためのマスクであり、（９）は遮蔽された（金属の堆積から遮蔽された）配列であり、（１０）はプローブであり、（１１）は電圧が印加されたセンサーの電場線であり、（１２）は検出されるべき分子であり、（１３）は分離ステップにおける犠牲電極であり、（１４）は１つのセンサーの全部とも組み合わせられた電極の幅であり、（１５）は別の機能を伴ったデバイスないしは電極の左側であり、（１６）プローブを伴った上記デバイスないしは領域の右側である。
図３ａは本発明の実施の形態にかかる２×２配列のセンサー（例示のつもりであって限定のつもりではない）をつくるためのベースプレートを示す模式図である。図３ｂ、３ｃ及び３ｄは、本発明にかかる１つのセンサーの詳細な横断面を示している。（用いられている番号は図２のところで記載したとおりである）
図４ａ、４ｂ及び４ｃは、本発明にかかるセンサーの金属化工程を模式的に示している。（用いられている番号は図２のところで記載したとおりである）
図５ａは、最終構造を達成するために遮蔽マスクがどのように適用されるかを示す図である。図５ｂは、このマスクを介してのエッチングの後におけるセンサー配列を示している。（用いられている番号は図２のところで記載したとおりである）
図６は、本発明の１つの可能な実施の形態にかかるセンサーの動作原理を示している。図６ａは、「認識された」分子を伴わないセンサーを示し、図６ｂは「認識された」分子を伴ったそれを示している。（用いられている番号は図２のところで記載したとおりである）
図７ａ及び７ｂは、本発明にかかる生物電子センサーの特定の実施の形態を示している。（用いられている番号は図２のところで記載したとおりである）
本発明の詳細な説明及び実施例
以下、添付の図面を参照しつつ、本発明の好ましい典型的な実施の形態が説明されるであろう。提示される実施例は単に本発明を教示することを目的とするだけのものであって、この特許出願の精神及び技術範囲は、添付のクレームの記載によってのみ限定されるということが理解されるべきである。
本発明にかかるセンサーは、その頂部に金属電極を備えた絶縁層を含んでいる。該絶縁層の中にはミクロン下（サブミクロン）のパターンがつくられている。頂部金属層は特定の形状であり、これによりセンサーの検出感度を高めている。上記センサーはさらにベース層を含むことができる。
図２は、本発明にかかる電子センサーの好ましい実施の形態の詳細な図を示している。この図は、模式図中にセンサーの活性的な試験部位領域を示している。このセンサー又は試験部位は以下で詳しく説明されるとおり、一連のステップで製作されることができる。
基板が設けられるべきである。上記ベース層を示している上記基板は、結晶ウエハ（水晶、ケイ素、ゲルマニウム）、アモルファス材料（ガラスウエハ）、高分子（ＰＭＭＡ、ＰＣ、ＰＥＥＫ、ＰＶＥ、ＰＥＩ）又はＡｌ₂Ｏ₃などの薄いフィルム状基板であってもよい。上記基板の上には絶縁層が形成されている。該絶縁層は、ポリイミド又はＢＣＢなどといった高分子層であってもよい。誘電層又は絶縁層は、ＬＰＣＶＤ又はＰＥＣＶＤの技術によって堆積されたＳｉ₃Ｎ₄のようなものであることができる。それはまた、上記シリコンウエハの上に熱的成長又は堆積されたＳｉＯ₂層であってもよい。この後、既知のリソグラフィ技術、例えばフォトリソグラフィ、好ましくはＵＶリソグラフィ、さらに好ましくは深ＵＶリソグラフィを用いて特定の形状がパターニングされることができ、これに続いてＳｉＯ₂層の中に選択エッチング施される。特定の形状を備えたこのような絶縁構造をつくるもう１つの方法は、モールドプロセスを用いることである。この後、インジェクションモールド又はその他の複製物をつくる方法により再生産が行われる。この後、該モールドは、非常に小さい寸法を達成することを許容する、フォトリソグラフィ、好ましくはＵＶリソグラフィ、より好ましくは深ＵＶリソグラフィ又はＸ線を用いたＬＩＧＡでつくられることができる。ＰＭＭＡ、ＰＥＥＫ、ＰＶＥ及びＰＥＩなどといったプラスチックは基板として用いられることができる。ミクロ構造をつくるためにこれらのプラスチックを用いるといったことは当該技術分野でよく知られている。
上記の方法により製作されたモールドは、さらなる複製プロセスのためのツールとして、例えばミクロモールド又は反応インジェクションモールドのためのモールドインサートとして再度使用されることができる。複製プロセスに用いられるべき材料は、普通、熔融された高分子及び鋳造用樹脂である。金型の中で硬化させた後、モールド材料は十分な強度に到達し、そしてモールドとモールドインサートとを分離させることができる。ミクロモールド及びミクロ反応インジェクションモールド（射出成形）を実現するためには、ＬＩＧＡで製作されたモールドインサートの壁部の粗度を極端に低くすることが最も重要である。
ミクロ複製に用いられている材料は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリオキシメチレン（ＰＯＭ）、ポリアミド（ＰＡ）、又はポリカーボネートのような低粘度の熱可塑性高分子を含み、さらにはメタクリレート、シリコーン及びカプロラクタムをベースとする反応樹脂を含む。しかしながら、さらに多くの材料が用いられることができるであろう。充填されたモールド材料を除けば、マクロ型モールドに適したほぼ全部の材料がミクロモールドのために用いられることができる。
セラミックのミクロ構造が、ゾル・ゲルプロセスを用いて、又は電気泳動プロセス及びその他のプロセスにより、スラリー鋳造によって製作されることができる。例えば、ＬＩＧＡで製作された高分子構造のギャップを、ミクロ結晶のセラミックパウダーのスラリーで満たすことが可能である。乾燥及び焼成の後、高分子は崩壊し、蒸発し、又は酸化され、その結果セラミックのミクロ構造となる（型滅失法）。セラミック構造の特徴的な寸法は、焼成プロセス時の収縮に起因して、高分子の型よりも小さくなる。かくして、機械的に非常に安定しかつ耐熱性がある材料、ピエゾ電気材料及びイオン導体が、ＬＩＧＡプロセスによってミクロ構造化されることができる。
図３は、２×２のセンサーを備えたプレートを示している。このプレートの化学組成は、それ自身の絶縁であってもよく、あるいはプレートが絶縁層（例えば、ＳｉＯ₂層）を備えた基板（例えば、シリコンウエハ）で構成されていてもよい。プレートの形状図は凹部（７）と丘部（６）とを示している。図３ｂは１つのセンサーを詳細に示し、図３ｃ及び３ｄは横断面を示している。好ましい実施の形態においては、凹部（７）は、検出されるべき分子と同じオーダーの大きさの寸法を有するチャンネル（７）である。ここで、チャンネルは、その深さがおよそ１００ｎｍであり、その幅がおよそ１００ｎｍであり、およそ１００ｎｍの間隔を隔てているのが好ましい。１つの方向のスペースは、隣り合う平面（４）（５）を画成する。チャンネルの寸法については、その深さはおよそ５００ｎｍからおよそ１０ｎｍまでの間の範囲とすることができ、その幅はおよそ５００ｎｍからおよそ１０ｎｍまでの間の範囲とすることができるが、深さが２５０ｎｍより小さく、幅が２５０ｎｍより小さいのが好ましい。この幅及び深さは独立的に変えることができる。２つのチャンネルの間のスペース（間隔）は、該チャンネルの幅及び深さと同じオーダーの大きさである。チャンネルは、生物電子センサーも活性的な試験位置領域の長さと同じ長さである。結局のところ、本発明を明瞭にするために、該長さは０．５ｍｍであると仮定される。１００μｍと１ｍｍの間の長さ、又はこれより小さいもしくは大きい長さとすることも可能である。活性的な領域は、どのような形状でつくられてもよいが、製造上は正方形であるのが好ましい。長方形であってもよい。チャンネルもまたどのような形状であってもよく、例えば台形、三角形、長方形又は円柱形とすることができる。
丘部（６）は特定の高さの高台である。この実施の形態においては、高さは１μｍであると仮定される。丘部の高さは、チャンネルの幅の上であればどのようなものでもよい。それらの目的は、チャンネルの間の平面（４）と平面（５）とを分離することである。丘部の形状は長方形であるのが好ましいが、そうしなければならない必要はない。丘部は、チャンネルの間の平面（４）（５）の端部に配置され、チャンネルの端部を強制的に狭めている。もし、センサーの１つの側部で、それらが「偶数」の平面（４）に配置されていれば、それらは、もう一方の側部では「奇数」の平面（５）に配置される（図２ｂ）。この実施の形態においては、丘部は、その長さがおよそ２００ｎｍであり、その幅はおよそ２００ｎｍである。
図４は、プロセス中の次のステップを示している。ある角度の下でプレートの上には、好ましくは電子ビーム蒸発により、金属層が堆積されている。堆積の方向は、大きな矢印（１）によって示されている。その方向性は、プレート上のいくつかの部位（９）が金属によって遮蔽されるが被覆されないようなものでなければならない。それゆえ、金属の堆積角は、プレートの表面に関して測定された場合において９０°より小さくなければならない。堆積角は、６０°より小さいのが好ましく、４５°さらには３０°よりも小さいのがさらに好ましく、例えば２０°、１０°、５°又は１°であるのが好ましい。上記部位（９）は、堆積方法（１）に沿う、チャンネル及び丘部の側壁にあり、そしてチャンネルの底部にある。堆積方向（１）に沿う側壁と、チャンネルの底部とには金属が存在しないので、チャンネルの間の平面（４）（５）は互いに絶縁されている。それらは、丘部（６）ののため端部でショートカット（短絡）されない（３次元表現の図２参照）。サンプル溶液と反応しないどのような金属でも用いることができる。具体例は、Ｐｔ、Ｐｄ、Ａｕ、あるいは電極での化学反応が駆逐されるＡｌ又はＡｇのような低級貴金属である。金属層ないしは金属皮膜の厚さは、およそ２ｎｍ、５０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ又はこれより厚い範囲内とされることができるが、金属厚さは２０ｎｍであるのが好ましい。金属の堆積は、熱蒸発、スパッタリング、電子ビーム堆積、あるいは金属の衝突流れなどといった金属を堆積させるための既知のその他の技術を用いて実行されることができる。
しかしながら、配列中の異なるセンサー（この例では２×２センサー）はまだショートカットされている。蒸発させられた金属の選択的エッチングは異なるセンサーを分離する。図５ａは、マスク（８）の適用を示している。このマスクは、リソグラフィでレジストパターンに移されることができ、又はそれはシャドーマスクであることができる。もし該構造がこのようにエッチングされれば、マスク層の下の構造は残留し、被覆されていない領域はエッチングされる。図５ｂは、分離されたセンサー中におけるこのエッチングの結果を示している。これらの分離されたセンサーは、可能な最終構造となることができる。その上に取り付けられたプローブを備えたこれらの分離されたセンサーもまた、可能な最終構造である。分離された結合パッド（２）及び（３）が実現され、その結果組み合わせられた電極構造が得られる。
図５ａ中のマスク（８）の遮蔽された領域は、センサーの活性的な配列と、正の結合パッド（２）及び負の結合パッド（３）とを決定する。マスクの開領域は、エッチングで除去され（上記、参照）、異なるセンサーを互いに分離する。マスク（８）の配列は決定的なものではない。この実施の形態については、配列の精度は１０μｍで十分である。図５ａの上側部及び下側部は、結合パッド（２）及び（３）を画成し、それらの最終寸法は決定的なものではない。図５ａの左側部及び右側部の寸法はいずれも決定的なものではない。すなわち、マスク（８）はすべてのチャンネルの幅（１４）よりは小さく５０μｍである。かくして、最終の活性的な領域はマスク（８）によって決定される。いくつかのフィンガ（１３）は、犠牲となりエッチングで除去される。これは、この５０μｍの幅の半分（すなわち、２５μｍ）の配列誤差は、何の影響も与えないことを意味する。なぜなら、活性的な領域は、金属化された平面である、結果として生じたフィンが電極（４）及び（５）とチャンネル（７）とによってまだ十分に被覆されているからである。この手法は、ミクロン下の分解能での構築方法の必要性をなくする。
異なるセンサーを分離するための当該技術分野で既知のその他の方法もまた、本発明の技術範囲内で用いられることができる。
図６は、本発明にかかるセンサーの動作原理の１つの可能な方法を示している。プローブ（１０）は、エポキシ結合、カルボジイミド、還元アミノ化、臭化シアン、スクシンイミド、カルボジイミダゾール、トレシル塩化物及びトシル塩化物、ジビニル塩化物、マレイミド、ヒドラジド、イソ（チオ）シアネート及びアミノシランとのより好ましいシラン化、エポキシシラン、チオシアネートシラン、イソシナネートシラン、無水コハク酸シラン、スルフヒドリルシラン、カプロラクタムシラン等々などといった、当該技術分野で既知のプローブ不動化方法に従っ
て、チャンネルの絶縁領域内で不動化されることができる。しかしながら、その他の測定配列及び／又は装置においては、プローブは選択的に不動化されることができる。
−金属表面でのみ、例えばＡｕ層での硫黄を含んでいる成分の吸着による
−又は活性的な試験位置領域全部にわたって絶縁層及び導電層の上で、例えば一連の不動化プロセスにより、又はアミノ、スルフヒドリル、アルデヒド、カルボキシル、ヒドロキシルなどといった反応基をもつ有機層のプラズマ重合による
本発明にかかるプローブは、例示のつもりであって限定するつもりではないが、（特定の基板に対する親和力を備えた）酵素、（特定のＤＮＡフラグメント及びＲＮＡフラグメントに対する親和力を備えた）オリゴヌクレオチド、（特定の抗原に対する親和力を備えた）抗体、（特定の抗体に対する親和力を備えた）抗原、又は分析物／共同分析物の複合物であるその他の成分であってもよい。
電気信号、すなわち電圧又は電流を結合パッド（３）及び結合パッド（２）に印加することにより、電場が生じ、その結果電場線（１１）が生じる。もし、検出されるべき分析物（１２）がサンプル溶液中に存在すれば、それは特定のプローブと結合し（図６ｂ）、その結果図６ａ中に記載された状態とは逆に、電場（１１）の変化を生じさせる。この変化は、適当な周波数及び／又は直流バイアスでインピーダンスを測定することによって定量化されることができる。この電気測定はインピーダンス分析であるのが好ましく、これは直流バイアスを含みもしくは含まない、ある周波数領域にわたる誘電損失及び／又は抵抗、電気容量、抵抗の測定、又はこれらの技術の組み合わせにゆだねることができる。
チャンネルのミクロン下の寸法に起因して、かつ電極の形状（ある角度での金属の堆積から出現する）に起因して、電場（１１）は不動化されたプローブ（１１）を伴った該領域を強力に貫く。平面（４）及び（５）の頂部に第２の絶縁層が形成されたときには、対象となっている領域中の電場のより強力な閉じ込めが実現されるであろう。このようにして、電場線は、結合された分析物が大半のスペースを占めるチャンネルの内部をさらに探査する。
本発明にかかる比較的小さい寸法（１００ｎｍ未満）のセンサーを製作するときには、検出されなければならない比較的大きい分子は、立体障害に起因してそれ以上チャンネルには入らないであろう。図７は、この問題がどのようにして克服されることができるかを模式的に示している。センサーは、２つに分割されることができるように製作されている。センサーの左側（１５）は、上で論じられたのと同じ方法で製作された、組み合わせられた電極構造を伴ったセンサーの配列で構成されている。右手側（１６）は、センサー配列の鏡像形状を有し、不動化されたプローブ（１０）で被覆されている。検出されるべき分子の構造及び要素を含んでいるサンプル溶液は、右手側（１６）の頂部に配置（培養）されている。ある分子（１２）はプローブ（１０）と結合するであろう。この認識プロセスの後、センサーは、折り畳むことによって閉じられる（図７ｂ）。機械的な力の印加は、プローブ（１０）及び分子（１２）の、組み合わせられた電極構造への十分な近接をもたらし、その結果、培養されたウィルスと培養されていない構造とのインピーダンス差が測定される。
本発明は、リアルタイム測定、すなわち例えば温度のような異なる条件の変化がある場合又はない場合における異なる培養ステップでの結合プロセスに適するセンサーを開示している。
本発明はまた、検出デバイスの表面の分析物の不動化及び溶液相に加えられた何らかのプローブの認識などといった、非常に柔軟性のある測定装置をも許容する。
上記の技術的プロセス及び高度なセンサーの小型化はまた、ミクロ診断デバイスの構築をも許容する。
異なるプローブを含んでいるセンサー配列は、ここに記載された方法で製作されることができ、その結果、ミクロ診断デバイスをもたらす。上記の一体化されたミクロ診断デバイスは、多重のパラメータの同時検出、すなわち多重パラメータ試験を行うことができる。これは、新生児の血液サンプルの場合のような限定されたサンプル状態に対して、臓器移植の免疫、自己免疫病又は血液感染の場合のような信頼性の高い診断要求に対して、そして最後にスクリーニング試験に対してとくに重要である。
このように並べられたミクロ診断配列は、いくつかの異なるサンプル同時に並行して処理することができるといった付加的な利点を有する。

Claims (30)

1. 同一方向を向く複数の互いに離間したチャンネルを内部に備えていて、上記チャンネルが上記方向に沿う少なくとも２つの背向する側壁と底部とを有している絶縁層と、
   各チャンネルの上記２つの背向する側壁の１つの少なくとも一部と、上記チャンネル間の絶縁層の頂部の少なくとも一部とに形成された金属被膜とを含んでいて、
   上記金属被膜が、２つの電極を含みインピーダンスを測定するデバイスの一部を形成しているセンサー。
2. さらに、丘部を含んでいて、上記丘部が、
   上記チャンネル間の平面の端部に配置され、
   上記チャンネルの幅よりも大きい高さを有し、
   かつ、上記チャンネル間の平面と、２つの隣り合うチャンネルの一部とに重なっている、請求項１に記載のセンサー。
3. さらに、試験されるべきサンプル中に存在する分子構造に結合するためのプローブを含んでいて、上記プローブがチャンネルの絶縁部及び／又は電極の表面に設けられている、請求項１又は２に記載のセンサー。
4. 上記絶縁層がベース層基板に形成されている、請求項１〜３のいずれかに記載のセンサー。
5. 上記基板がシリコンウエハである、請求項４に記載のセンサー。
6. 上記チャンネルの寸法が１０ｎｍから５００ｎｍの範囲内にある、請求項１〜５のいずれかに記載のセンサー。
7. 上記チャンネルが１００ｎｍの深さと１００ｎｍの幅とを有し、上記チャンネルが１００ｎｍの相互間隔で隔てられている、請求項６に記載のセンサー。
8. 上記絶縁層が、熱的に成長させられたＳｉＯ₂である、請求項１〜７のいずれかに記載のセンサー。
9. 上記絶縁層が高分子である、請求項１〜７のいずれかに記載のセンサー。
10. 絶縁層内に複数の互いに離間するチャンネルを形成するステップであって、上記チャンネルは同一方向を向き、上記チャンネルは上記方向に沿う少なくとも２つの背向する側壁と底部とを有し、かつ、上記チャンネルは丘部を含んでいて、上記丘部は、上記チャンネル間の平面の端部に配置され、上記チャンネルの幅よりも大きい高さを有し、かつ上記チャンネル間の平面と２つの隣り合うチャンネルの一部とに重なっている丘部を有しているステップと、
    上記絶縁層の上に金属層を堆積させるステップであって、上記チャンネルの上記２つの側壁の一方と上記チャンネルの底部とが金属堆積方向に関して遮蔽され、金属によって被覆はされず、これによりインピーダンスを形成するように、上記絶縁層を金属の堆積源に関して整列させるステップと、
    試験されるべきサンプル中に存在する分子構造と結合するためのプローブを印加するステップであって、上記プローブをチャンネルの絶縁部及び／又は金属層の表面に設けるステップとを含んでいるセンサーの製造方法。
11. 上記絶縁層に関する金属の堆積の角度が９０°より小さい、請求項１０に記載の方法。
12. さらに、上記絶縁層をベース層基板の上に形成するステップを含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
13. 上記基板がシリコンウエハであり、かつ上記絶縁層が熱的に成長させられたＳｉＯ₂である、請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
14. 上記チャンネルを形成するステップがミクロ電子パターニング技術を用いて実施される、請求項１０〜１３のいずれかに記載の方法。
15. 上記チャンネルを形成するステップがフォトリソグラフィ処理により実施される、請求項１４に記載の方法。
16. 上記絶縁層が高分子である、請求項１０〜１５のいずれかに記載の方法。
17. 上記高分子がミクロ構造のモールド成形により形成される、請求項１６に記載の方法。
18. 請求項１０〜１７のいずれかに記載された方法により得ることができるセンサー。
19. 請求項１〜９又は１８のいずれかにかかる複数のセンサーと、
    上記金属層の２つの分離された部分の間の上記チャンネルに電場を閉じ込めるために、上記センサーの上に形成された付加絶縁層と、
    金属皮膜の上に電圧を印加する手段と、
    センサーの電極の間におけるインピーダンス又は電気特性を測定し、どのプローブが関連する目標分子に結合したかを決定する手段とを含んでいる、サンプル溶液内の分子構造を確定するためのセンサー装置。
20. さらに、上記金属皮膜に対する接続手段を含んでいて、上記接続手段が、上記センサーの活性的な領域に結合し、かつ上記方向に関して垂直な方向に向き、そして上記電圧が上記接続手段に印加される、請求項１９に記載のセンサー装置。
21. 請求項１〜９又は１８のいずれか１つにかかるセンサーが幾何学的に配列されてなるセンサー配列であって、該センサー配列中の異なるセンサーが互いに平行となっているセンサー配列。
22. 請求項１〜９、１８又は２１のいずれかにかかる複数のセンサーに上記サンプル溶液を加えるステップであって、各センサーはその中に、関連する目標分子構造と結合するために加えられた１つ又はこれより多いプローブを有するステップと、
    センサーに電子信号を印加するステップと、
    センサーの電気特性を測定して、どのプローブが複数の異なる目標物が検出されることができるように関連する目標分子構造に結合しているかを決定するステップとを含んでいるサンプル溶液中の分子構造を確認するための方法。
23. 上記センサーが、その中に加えられる、１つ又はこれより多い型のオリゴヌクレオチドプローブを有している、請求項２２に記載の方法。
24. 上記センサーが、その中に加えられる、１つ又はこれより多い型の抗体プローブを有している、請求項２２に記載の方法。
25. 上記センサーが、その中に加えられる、１つ又はこれより多い型の抗原プローブを有している、請求項２２に記載の方法。
26. 上記センサーが、その中に加えられる、１つ又はこれより多い型のペプチドプローブを有している、請求項２２に記載の方法。
27. 上記プローブが上記センサーに共有結合又は非共有結合で取り付けられている、請求項２２〜２６のいずれか１つに記載の方法。
28. チャンネルの絶縁部及び／又は電極の表面に設けられる１つ又はこれより多いプローブを含み、上記プローブが、センサー中において関連する目標分子構造と結合するために設けられている、請求項１〜９又は１８のいずれかに記載のセンサー。
29. センサー中において関連する目標分子構造と結合するために上記センサーに設けられた１つ又はこれより多い型のプローブをも含んでいる、請求項１９又は２０のいずれかに記載のセンサー装置。
30. 請求項２１にかかるセンサーの配列を含む第１のパーツと、
    プローブが取り付けられることができる容器の配列を含む第２のパーツとを含んでいて、
    上記第１及び上記第２のパーツが、上記容器の配列が上記センサーの配列に対応するようにして、接触させられるようになっている、２つのパーツに分割されているセンサー。

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