DE69611758T2

DE69611758T2 - N-1-carbocylalkyl derivate von lsd

Info

Publication number: DE69611758T2
Application number: DE69611758T
Authority: DE
Inventors: F. Sigler
Original assignee: Microgenics Corp
Current assignee: Microgenics Corp
Priority date: 1995-11-20
Filing date: 1996-11-20
Publication date: 2001-05-23
Anticipated expiration: 2016-11-21
Also published as: EP0830370B1; CA2211385A1; WO1997019100A1; US5843682A; DE69611758D1; CA2211385C; JPH11502419A; EP0830370A1; EP0830370A4

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige 1-Position-Carboxyalkyl-Derivate von Lysergsäurediethylamid (LSD), als auch Verfahren zur Herstellung dieser Derivate. Zu den Derivaten zählen Immunogene, die zur Stimuüerung der Antikörper- Produktion eingesetzt werden, und Polypeptid-Konjugate, die in Immunoassays zum Nachweis von LSD nützlich sind. Ebenso werden Hapten-Intermediate bereitgestellt, die in der Synthese der Immunogene und Polypeptid-Konjugate als auch einem nicht-isotopen Immunoassay für die Bestimmung des LSD Verwendung finden.
Obschon in der breiten Öffentlichkeit der Missbrauch von LSD nicht mehr als gesellschaftliches Problem wahrgenommen wird, liegen allerhand Beweise dafür vor, dass diese gesetzeswidrige Droge weiterhin konsumiert wird und ihr Missbrauch in einigen Teilen der Bevölkerung sogar zunimmt. Siehe Bonner, Drug Detection Report. 1 : 5 (1992). Bei LSD handelt es sich um eine der 20 kontrollierten Substanzen, die im Jahre 1985 in den Notfallstationen im ganzen Land am häufigsten auftraten, was ihren fortgesetzten Missbrauch und den Handel mit dieser verbotenen Droge wiederspiegelt. In den Vereinigten Staaten von Amerika verdoppelte sich die Zahl der Beschlagnahmen von LSD durch die Drug Enforcement Agency im Jahre 1990 gegenüber dem Vorjahr, und in England stieg die Zahl der Beschlagnahmen von LSD seit Mitte 1988 ständig. Siehe Microgram 23 : 228 (1990). Einen weiteren Grund zur Besorgnis liefern Berichte, dass LSD besonders unter Jugendlichen verbreitet ist und seine Popularität in einigen Regionen die von Kokain übersteigt. Siehe Seligmann, Newsweek, 3. Februar, S. 66 (1992). Faktoren, die zum fortgesetzten Missbrauch von LSD beigetragen haben, sind, dass es breit verfügbar ist, preiswert ist und der LSD-Missbrauch durch Analyse der Körperflüssigkeiten schwer nachweisbar ist.
Trotz der langen Geschichte des LSD-Missbrauchs ist wenig zur Disposition für LSD beim Menschen bekannt. Das Fehlen pharmakokinetischer Daten für LSD ist teilweise auf die technische Schwierigkeit des Nachweisens und Messens der Droge in physiologischen Proben zurückzuführen. LSD wird nicht als hochgiftig erachtet, obschon mindestens zwei Fälle berichtet wurden, bei denen der Tod offensichtlich als Folge der Toxizität von LSD eintrat. Der Hauptgrund jedoch, aus dem LSD vielfach für hochgradig gefährlich gehalten wird, ist, dass es ernstliche psychische und psychotische Auswirkungen haben kann, was den Konsumenten mitunter zu irrationalen Taten verleitet, die zu Verletzung oder Tod führen. Bei LSD handelt es sich um eine extrem wirksame psychedelische Droge, die in erster Linie am zentralen Nervensystem wirkt; lediglich das d-Isomer der Droge ist pharmakologisch aktiv. Schon orale Dosen von lediglich 25 ug können zu Störungen des zentralen Nervensystems wie Halluzinationen, verzerrten Sinneswahrnehmungen, Stimmungsschwankungen und traumähnlichen Denkvorgängen als auch psychotischen Reaktionen bei offensichtlich prädisponierten Personen führen. Daher sind die mit einiger Wahrscheinlichkeit in Blut und Urin anzutreffenden Konzentrationen von LSD und LSD-Metaboliten sehr gering. Der Nachweis von LSD in den Körperflüssigkeiten der Konsumenten ist besonders schwierig, weil die üblicherweise eingenommenen Mengen sehr gering sind und weil die Droge schnell und umfassend zu Stoffwechselprodukten abgebaut wird. Darüber hinaus tragen die geringe Flüchtigkeit der Droge, ihre Wärmeunbeständigkeit und ihre Neigung, während der gaschromatographischen Analyse adsorptiv verloren zu gehen, sämtlich zu Schwierigkeit bei, eine Methode zur Bestimmung von LSD in Körperflüssigkeiten zu entwickeln.
Bei LSD handelt es sich um ein natürliches Produkt des Roggenpilzes Claviceps, das erstmals im Jahre 1938 synthetisch hergestellt wurde. Seine psychologischen Wirkungen wurden auf einen versehentlichen Konsum hin entdeckt. Chemisch gesehen handelt es sich bei LSD um ein Ergot-Alkaloid, das, ebenso wie die anderen Verbindungen dieser Klasse, Lysergsäure als Basis seiner Struktur enthält. Strukturell dem Serotonin-(5-hydroxytryptamin) ähnlich, wird angenommen, dass LSD seine psychomimetischen Wirkungen durch den Antagonismus der Serotonin- Aktivität im Hirnstamm ausübt. Über die Gewebeverteilung, den Metabolismus und die Ausscheidung von LSD beim Menschen ist wenig bekannt. LSD wird durch den Magen-Darmtrakt recht schnell absorbiert, wobei seine Plasma-Halbwertszeit beim Menschen mit etwa drei Stunden berechnet wurde. Untersuchungen an Tieren weisen darauf hin, dass LSD über eine hepatische Oxidation inaktiviert wird. Es wird umfassend verdaut, wobei lediglich vernachlässigbare Mengen an unveränderter Droge in Urin und Stuhl auftauchen, wobei der Großteil der Metaboliten im Urin ausgeschieden wird. Mögliche metabolische Umwandlungen können in der Hydrolyse zu Lysergsäure bestehen, der N-Demethylation zu nor-LSD und der Oxidation zu 2-oxo-LSD. Untersuchungen mit Urinproben von freiwilligen Versuchspersonen, die LSD erhielten, ergaben, dass die Droge oder ihre eng verwandten Metaboliten im Urin mittels Radioimmunoassay (RlA) noch mehrere Tage nach Verabreichung nachgewiesen werden können.
Obschon der fortgesetzte verbotene Konsum von LSD Bemühungen hervorgerufen hat, wirksame analytische Methoden zum Nachweis der Droge und ihrer Metaboliten in Körperflüssigkeiten verdächtigter LSD-Konsumenten zu entwickeln, sind die derzeit verfügbaren Methoden kompliziert, zeitaufwendig, in der Durchführung kostspielig und durch weitere Probleme belastet. Zu diesen Methoden zählen die Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC), Gaschromatographie/Massenspektrometrie (GC/MS) und der Radioimmunoassay. Ein Problem, mit dem sich die mit der Bestimmung von LSD befassten Laboratorien konfrontiert sehen, ist die ausgeprägte Tendenz von LSD und derivatisiertem LSD, bei der Gaschromatographie adsorptiv verloren zu gehen. Dieses Verhalten verhindert oftmals den Nachweis der Droge bei den normalerweise in Körperflüssigkeiten von LSD- Konsumenten vorzufindenden Sub-Nanogramm/Milliliter-Konzentrationen.
Handelsübliche RIAs für LSD sind von verschiedenen Quellen beziehbar, einschließlich ABUSCREEN LSD-Assay (® Roche Diagnostics Systems, Nutley, NJ) und COAT-A-COUNT LSD-Assay (® Diagnostic Products Corp.; Los Angeles, CA); diese Produkte sind als nützliches und relativ preiswertes Verfahren zum Screening auf das Vorhandensein der Droge zweckdienlich. Die RIAs sind allerdings nicht völlig spezifisch für LSD, so dass eine RIA-positive Probe noch durch einen zweiten und spezifischeren Assay bestätigt werden muss, wenn die Ergebnisse der Analyse strafrechtliche Konsequenzen haben könnten. Die von den Herstellern empfohlene Grenzkonzentration, um eine Probe als LSD-positiv zu bezeichnen, beträgt 0,5 ng/ml, obschon geringere Grenzwerte bei Untersuchungen angesetzt wurden, bei denen keine rechtlichen Konsequenzen eine Rolle spielten. Die tatsächliche Konzentration des LSD in RIA-positiven Urinproben ist allgemein geringer als vom RIA angegeben, und oftmals beträchtlich geringer. Vermutlich sind die durch den RIA angegebenen höheren Konzentrationen auf die Kreuzreaktivität der LSD- Metaboliten mit den RIA-Antiseren zurückzuführen, doch kann diese Schlussfolgerung nicht erhärtet werden, bis die wichtigsten LSD-Metaboliten im Urin identifiziert und deren Kreuzreaktivitäten bestimmt wurden.
Beim Test auf andere missbräuchlich verwendete Drogen haben sich Immunoassays, besonders kompetitiv bindende Immunoassays, als besonders vorteilhaft erwiesen. Bei kompetitiv bindenden Immunoassays konkurriert ein Analyt in einer biologischen Probe mit einem markierten Reagenz oder Analyt-Analogon oder Tracer um eine begrenzte Anzahl von Rezeptor-Bindungsstellen auf für das Analyt und Analyt-Analogon spezifischen Antikörpern. Enzyme wie β-Galactosidase und Peroxidase, fluoreszierende Moleküle wie Fluorescein-Verbindungen, und radioaktive Verbindungen wie ¹²&sup5;I, sind gebräuchliche, als Tracer verwendete Markierungssubstanzen. Die Konzentration des Analyts in der Probe bestimmt die Menge an Analyt-Analogon, die an den Antikörper binden wird. Die-Menge an bindendem Analyt-Analogon ist umgekehrt proportional zur Konzentration des Analyts in der Probe, da das Analyt und das Analyt-Analogon jeweils an den Antikörper im Verhältnis zu ihren jeweiligen Konzentrationen binden. Die Menge an freiem oder gebundenem Analyt-Analogon kann dann mittels Methoden bestimmt werden, die für die speziell verwendete Markierung geeignet sind.
Eine Art von kompetitiv bindendem Immunoassay basiert auf der Reassoziation enzymatisch inaktiver Polypeptid-Fragmente zum Erhalt von aktivem Enzym als einem Schritt der Erzeugung eines nachweisbaren Signals, das zur Bestimmung der Menge an in einer Probe vorhandenem Analyt dient. Diese Art von Assay, bekannt als klonierter Enzym-Donator-Immunoassay (CEDIA), ist beschrieben in US- Patentschrift Nr. 4.708.929. Genauer gesagt verbindet sich ein β-Galactosidase- Enzym-Donator-Polypeptid mit einem β-Galactosidase-Enzym-Akzeptor-Polypeptid und ergibt ein aktives β-Galactosidase-Enzym. Die Konjugation eines Haptens oder eines kleinen Analyts oder eines Analyt-Analogon an das Enzym-Donator-Polypeptid an bestimmten Stellen beeinträchtigt die Fähigkeit zur Bildung der aktiven β-Galactosidase durch eine Komplementationsreaktion nicht und beeinträchtigt folglich auch nicht die Rate der β-Galactosidase-Aktivität in Gegenwart eines Substrats für die β-Galactosidase. Wird das Enzym-Donator-Hapten-Konjugat jedoch durch einen Anti-Analyt-Antikörper gebunden, so wird die Komplementationsrate behindert und dadurch die Enzym-katalysierte Reaktionsrate während der Anfangsphase der Reaktion herabgesetzt. Diese Herabsetzung der Enzym-katalysierten Reaktionsrate kann überwacht werden und wurde zur Bestimmung einer Vielzahl von Analyten erfolgreich eingesetzt, wobei das Prinzip der kompetitiven Hemmung angewandt wird, bei dem in einem Reaktionsgemisch vorhandenes Enzym-Donator-Analyt- Konjugat und in einer Probe vorhandenes Analyt um den Anti-Analyt-Antikörper vor Zugabe des Enzym-Akzeptors konkurrieren. Die Komplementationsrate der β-Galactosidase-Bildung, und folglich die Enzym-katalysierte Reaktionsrate, nimmt mit steigender Menge an in der Probe vorhandenem Analyt ebenfalls zu.
Für die Entwicklung nicht-isotoper Immunoassays, die LSD und LSD-Metaboliten nachweisen, sind definierte Hapten-Derivate für die Präparation von Immunogenen und markierten Konjugaten erforderlich. Insbesondere sind Hapten-Derivate an der 1-Position der Lysergamid-Komponente erwünscht, da eine allgemein akzeptierte Strategie zur Herstellung von Immunogenen die Bindung eines Haptens an die Trägersubstanz an einer Position einbezieht, die von der Stelle im Molekül, an der Immunspezifität gewünscht wird, entfernt liegt, d. h. eine Stelle auf der anderen Seite des Moleküls von den Ethyl-Seitenketten an der 8-Position aus.
Dile Präparation von Antikörpern zu LSD zur Verwendung in Immunoassays für die Bestimmung der Droge wird gemäß dem Stand der Technik mittels mehrerer verschiedener Ansätze erreicht. Ein Ansatz bestand in der Kopplung der Carboxylgruppe der Lysergsäure direkt an ein immunogenes Trägerprotein, d. h. Poly(L-Lysin) oder humanes Serumalbumin unter Verwendung von Carbodiimiden.
Siehe Van Vunakis, Proc. Nat. Acad. Sci., 68: 1483-87 (1971); Loeffler, J. Pharm. Sci. 62: 1817-20 (1973); und Voss, Psychopharma-cologia 26: 140-45 (1972). Dieser Ansatz wurde bei der Entwicklung früher RIA-Methoden für die LSD-Bestimmung verwendet, doch waren die erzeugten Antikörper durch eine geringe Spezifität für LSD und hohe Kreuzreaktivitäten mit anderen Ergot-Alkaloiden gekennzeichnet.
Ein zweiter Ansatz bestand in der Kopplung von LSD an ein immunogenes Trägerprotein über eine der Ethyl-Seitenketten an der 8-Position. Siehe Ratcliffe, Clin. Chem. 23: 169 : 74 (1977). Bei einem weiteren Ansatz wurde Bisdiazobenzidin zur Kopplung der Trägerproteine über eine aromatische Substitution verwendet. Siehe Luderer, Bull. New Jersey Acad. Sci. 19: 8-10 (1974).
Schließlich wurde LSD an ein immunogenes Trägerprotein über einen Linkerarm unter Ausnutzung einer Reaktion zwischen LSD, Formaldehyd und Rinderserumalbumin gekoppelt. Siehe Castro, Res. Commun. Chem, Pathol. Pharmacol. 6: 879- 86 (1973); Taunton-Rigby, Science 181: 165-6 (1973); und Ratcliffe, Clin, Chem. 23: 169-74 (1977). Diese Autoren berichteten, dass die Reaktion eine Mannich- Aminoalkylierungsreaktion sei, von deren Produkt sie voraussetzten, dass es an der N-1-, oder Indol-Stickstoff-Position, substituiert sei. Eine jüngere Untersuchung jedoch, die auf bekanntem Kondensationsreaktionen von Indolgruppen mit einem Aldehyd basierte, lässt annehmen, dass die 2-Position mit größerer Wahrscheinlichkeit: die tatsächliche Reaktionsstelle ist. In mehreren Literaturstellen ist die Mannich- Reaktion mit Indol beschrieben wobei diese Literaturstellen lehren, dass keine Bindung an der N-1 Position entsteht, wenn eine Möglichkeit zur Reaktion an einer anderen Position auf dem lndol-Molekül besteht. Ist sowohl die 3-Position als auch die 2-Position verfügbar, so findet die Reaktion an der 3-Position statt, wobei der Indol-Stickstoff träge bleibt. Dies ist beschrieben bei Orchin, The Vocabulary of Orqanic Chemistry, John Wiley & Sons, NY, S. 385; Furniss, Vogel's Textbook of Practical Organic Chemistry, 4. Ausgabe, Longman Scientific & Technical and John Wiley & Sons, NY, S. 813 (1978); und Mundy, Name Reactions and Reagents in Orclanic Synthesis, John Wiley & Sons, NY, S. 137 (1988). Ist jedoch die 3-Position des Indolrings blockiert, wie dies beim LSD-Molekül der Fall ist, so ist die reaktive Stelle die 2-Position, wobei keine Bindung am Indol-Stickstoff N-1 entsteht. Dies ist beschrieben bei Orchin, The Vocabulary of Organic Chemistry, John Wiley & Sons, NY, S. 501, Abb. 13.790. Orchin beschreibt, dass das Indol-Alkaloid Tryptamin eine Mannich-Kondensationsreaktion mit einem Aldehyd (Secologanin) vollzieht, wobei die resultierende Substitution an der 2-Position an der Indolgruppe erfolgt.
Bei den LSD-Derivaten der vorliegenden Erfindung handelt es sich um Carboxyalkyl- Derivate, die, im Gegensatz zu den Derivaten nach dem Stand der Technik, in definierten Substanz-Zusammensetzungen bestehen. Die Derivate nach dem Stand der Technik werden als Aminoalkyl-, speziell Aminomethyl-Derivate ausgewiesen, sind aber nicht durch irgendeine analytische Bestimmung, wie etwa der Stelle der Substitution oder der Linker-Zusammensetzung, definiert. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung gehen davon aus, dass dies die erste Beschreibung einzelner, an der N-1-Position substituierter Hapten-Carboxyl-Derivate von LSD ist.
Bei "Haptenen" handelt es sich um teilweise oder unvollständige Antigene. Sie bestehen in proteinfreien Substanzen von meist niederem Molekulargewicht, die nicht zur Stimulierung der Antikörperbildung fähig sind, doch mit Antikörpern reagieren. Letztere werden durch Kopplung des Haptens an einen Träger von hohem Molekulargewicht und durch Injizieren dieses gekoppelten Produkts in Menschen oder Tiere gebildet. Zu Beispielen der Haptene zählen therapeutische Wirkstoffe wie Digoxin und Theophyllin, missbräuchlich verwendete Drogen wie Morphin und LSD, Antibiotika wie Gentamycin und Vancomycin, Hormone wie Östrogen und Progesteron, Vitamine wie Vitamin B12 und Folsäure, Thyroxin, Histamin, Serotonin, Adrenalin und andere.
Bei einem "Träger", wie hierin verwendet, handelt es sich um eine immunogene Substanz, üblicherweise ein Protein, das an ein Hapten binden kann, wodurch das Hapten zur Stimulierung einer Immunantwort befähigt wird. Zu Trägersubstanzen zählen Proteine, Glycoproteine, Komplex-Polysaccharide und Nukleinsäuren, die als fremd erkannt werden und dadurch eine immunologische Reaktion beim Wirt auslösen.
Bei einem "Enzym-Akzeptor" (EA) handelt es sich um ein enzymatisch inaktives Polypeptid-Fragment von β-Galactosidase, das durch eine Deletionsmutante des β-Galactosidase-Gens erzeugt wird und das in Kombination mit oder Bindung an einen Enzym-Donator zur Bildung eines aktiven β-Galactosidase-Enzyms durch den Prozess der Komplementation fähig ist.
Bei einem "Enzym-Donator" (ED) handelt es sich um ein enzymatisch inaktives Polypeptid-Fragment von β-Galactosidase, das eine Peptid-Sequenz umfaßt, die zur Kombination mit oder Bindung an einen Enzym-Akzeptor zum Erhalt eines aktiven β-Galactosidase-Enzyms fähig ist.
Der Begriff "immunogen" bezieht sich, wie hierin verwendet, auf Substanzen, die zum Produzieren oder Erzeugen einer Immunantwort in einem Organismus fähig sind.
Der Begriff "Derivat" bezieht sich auf eine chemische Verbindung oder ein Molekül, die aus einer Stammverbindung oder einem Molekül wie LSD durch eine oder mehrere chemische Reaktionen gewinnbar ist.
Wie hierin verwendet, handelt es sich bei einer "Markierung" oder einem "Tracer" um eine identifizierende Kennzeichnung, die bei Bindung an eine Trägersubstanz oder ein Molekül zum Nachweis eines Analyts dienen kann. Die Markierung kann an ihre Trägersubstanz direkt oder indirekt durch eine Verknüpfung oder eine brückenbildende Komponente gebunden werden. Zu Beispielen für Markierungen zählen Enzyme wie β-Galactosidase und Peroxidase, fluoreszierende Verbindungen wie Rhodamin und Fluoresceinisothiocyanat (FITC), lumineszierende Verbindungen wie Dioxetane und Luciferin, und radioaktive Isotope wie ¹²&sup5;I.
Bei einem "Peptid" handelt es sich um eine beliebige Verbindung, die durch Verknüpfung von zwei oder mehr Aminosäuren durch Amid- oder Peptid-Bindungen gebildet wird, und ist gewöhnlich ein Polymer von α-Aminosäuren, worin die α-Aminogruppe jedes Aminosäure-Rests (außer der NH&sub2;-Endigung) an die α-Carboxylgruppe des nächsten Rests in einer linearen Kette geknüpft ist. Die Begriffe Peptid, Polypeptid und Polyaminosäure werden hierin zur Bezeichnung dieser Klasse von Verbindungen ohne Größeneinschränkung synonym verwendet. Die größten Mitglieder dieser Klasse werden als Proteine bezeichnet.
Bei einem "Komplex" handelt es sich um einen reversiblen Zusammenschluss chemischer Verbindungen oder Komponenten, die durch schwache Bindungen oder andere Kräfte zusammengehalten werden, wie z. B. ein Enzym-Substrat-Komplex (ein Zusammenschluss eines Enzyms und einer oder mehrerer Substrate, das die reagierende Komponente in einer Enzym-katalysierten Reaktion darstellt), ein Antigen-Antikörper-Komplex, ein Hapten-Antikörper-Komplex oder ein durch Komplementation eines Enzym-Donators und eines Enzym-Akzeptors gebildeter aktiver Enzym-Komplex von β-Galactosidase.
Mit der vorliegenden Erfindung werden Reagenzien zur Bestimmung des Vorhandenseins von LSD oder seiner Metaboliten in einer Urinprobe mittels Enzym- Immunoassay bereitgestellt, umfassend:
ein erstes Reagenz, enthaltend ein Konjugat zwischen LSD und einem Enzym oder Enzym-Donator-Polypeptid; und
ein zweites Reagenz, enthaltend einen Antikörper, der zur Bindung an das Konjugat des ersten Reagenz in einer Weise fähig ist, die durch LSD hemmbar ist.
Das Konjugat ist von folgender Form:
worin R&sub1; eine Alkyl-, Cycloalkyl- oder Arylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, worin
R&sub2; eine Bindung oder
ist, worin
R&sub3; eine Alkyl-, Cycloalkyl- oder Arylgruppe mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise eine Alkylgruppe mit 2 oder 5 Kohlenstoffatomen ist, Z eine immunogene Trägersubstanz, ein Enzym-Donator-Polypeptid oder eine Markierung ist, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Enzym, einer Substanz mit fluoreszierenden Eigenschaften und einer radioaktiven Substanz, und n 1 bis p ist, wobei p das Molekulargewicht (MG) von Zu 000 ist.
Mit der vorliegenden Erfindung werden in einzigartiger Weise Reagenzien zur Verwendung in LSD-Immunoassays bereitgestellt, die das Koppeln an oder Derivatisieren der Maleimid-modifizierten aktivierten Hapten-Vorläufer-Verbindung über Sulfhydryl-Gruppen an eine immunogene Trägersubstanz umfassen. Die Immunogene, die die haptene Droge in kovalenter Bindung über ihre Maleimid-Komponente und eine Sulfhydryl-Brücke an ein immunogenes Trägermaterial enthalten, werden zur Stimulierung der Produktion von Antikörpern zu LSD verwendet.
Mit der vorliegenden Erfindung werden außerdem in einzigartiger Weise Reagenzien zur Verwendung in LSD-Immunoassays bereitgestellt, die das Koppeln an oder Deriyatisieren der N-1-Carboxyalkyl-Hapten-Vorläufer-Verbindung über Amidverknüpfungen an eine immunogene Trägersubstanz umfassen. Diese Immunogene, die die haptene Droge in kovalenter Bindung über eine Kondensation direkt mit Amingruppen an ein immunogenes Trägermaterial umfassen, werden zur Stimulierung der Produktion von Antikörpern zu LSD verwendet.
Bei einer anderen Ausführungsform werden mit der vorliegenden Erfindung Immunoassay-Methoden und -Reagenzien zur Bestimmung von LSD unter Verwendung der obengenannten Antikörper bereitgestellt. Die obigen Konjugate werden entweder aus dem aktivierten N-1-Carboxyalkyl-LSD-Analogon oder aus dem Maleimid-Addukt des N-1-Carboxyalkyl-LSD-Analogon hergestellt.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die nachfolgende ausführliche Beschreibung der Erfindung in Verbindung mit den Zeichnungen, die Teil der Beschreibung darstellen, verständlicher werden, worin:
Abb. 1 ein spezielles Syntheseschema zur Herstellung von N-1-Carboxymethyl-LSD darstellt.
Abb. 2 ein spezielles Syntheseschema zur Herstellung des N-Hydroxysuccinimidesters von N-1-Carboxymethyl-LSD darstellt.
Abb. 3 ein spezielles Syntheseschema zur Herstellung von N-1-(Maleimidoethylaminocarbonylmethyl)-LSD darstellt.
Abbn. 4(a) und 4(b) Schaubilder darstellen, die die Dosis-Wirkungs-Kurven bei verschiedenen Mengen von LSD unter Verwendung von Enzym-Donator-Konjugaten und Antikörpern der vorliegenden Erfindung zeigen.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die vorliegende Erfindung richtet sich mit all ihren aufeinander bezogenen Ausführungsformen auf die Herstellung von N-1-Carboxyalkyl-Derivat-Analoga von LSD, die dann zur Bildung von immunogenen durch Kopplung der Derivate an herkömmliche immunogene Polyaminosäuren oder andere antigene Trägersubstanzen, und anschließend zum Erhalt von Antikörpern verwendet werden können; alternativ können die Derivate zur Bildung von Enzym-, Enzym-Donator- oder markierten Konjugaten verwendet werden, die als Nachweis-Reagenzien in Immunoassays für die Drogen nützlich sind.
Die chemische Struktur des LSD ist dargestellt durch die folgende Formel:
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden zunächst N-1-Carboxyalkyl-Derivate von LSD durch ein neuartiges Verfahren hergestellt, bei dem die N-1-Alkylierung gegenüber der N-6-Alkylierung, d. h. die Quaternisierung, begünstigt wird. Diese Methode umfasst die Behandlung von LSD mit einem molaren Überschuss einer starken Base, z. B. Natriumhydrid, gefolgt durch Zugabe von Alkylhaloalkylcarboxylat. Die Hydrolyse des Esters ergibt ein N-1- Carboxyalkyl-LSD. Letzteres Derivat kann an Aminogruppen oder immunogene Trägerproteine zum direkten Erhalt von Immunogenen konjugiert werden oder kann an Aminogruppen an Linkem, d. h. Maleimidoalkylaminen, zum Erhalt von Addukten konjugiert werden, die zur Konjugation an Thiolgruppen von Enzym-Donator- Polypeptiden, immunogenen Trägerproteinen oder Markierungsgruppen geeignet sind.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird bei der Herstellung von Immunogen-, Enzym- oder Enzym-Donator-Konjugaten der Analoga zunächst ein Maleimid-Addukt mit einem Aminoalkylmaleimid-Derivat gebildet. Diese Aminoalkylmaleimid-Derivate werden mittels der Methoden von Huber synthetisiert, wie beschrieben in der PCT-Veröffentlichung WO 90/15798 (27. Dez. 1990). Die Maleimid-Addukte werden mit Thiolgruppen am Immunogen, Enzym oder Enzym- Donator zum Erhalt Thioether-verknüpfter Konjugate umgesetzt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird bei der Herstellung der Immunogene der Erfindung eine Thiol-haltige Träger-Polyaminosäure oder andere Substanz mit immunogenen Eigenschaften an das Maleimid-Hapten gekoppelt. Obschon thioliertes Napfschnecken-Hämocyanin (KLH) eine besonders bevorzugte antigene Polyaminosäure oder Trägerprotein ist, sollte klar sein, dass verschiedene Proteinträger verwendet werden können, einschließlich von Albuminen, Serumproteinen, z. B. Globulinen, Augenlinsenproteinen, Lipoproteinen und ähnlichem. Zu anschaulichen Proteinträgern zählen Rinderserumalbumin, Eieralbumin, Rindergammaglobulin, Thyroxin-bindendes Globulin etc. Alternativ dazu können synthetische Polyaminosäuren mit einer ausreichenden Zahl verfügbarer Sulfhydrylgruppen wie Cystein verwendet werden, ebenso wie andere synthetische oder natürliche polymere Materialien, die reaktive funktionelle Gruppen tragen. Besonders können Kohlenhydrate, Hefen oder Polysaccharide an das Hapten zum Erhalt eines Immunogens konjugiert werden.
Konjugate des aktivierten Haptens und einer Markierungsgruppe, wie etwa ein Enzym, eine Substanz mit fluoreszierenden Eigenschaften oder eine radioaktive Markierung, können ebenfalls hergestellt und als Reagenzien in Immunoassays verwendet werden. Wie bei den Immunogen- und Enzym-Donator-Konjugaten, muss die verwendete Markierung verfügbare Thiol-haltige Gruppen aufweisen, um zur Konjugation über die Ausführungsform der vorliegenden Erfindung mit dem Maleimid-Linker geeignet zu sein. Die Thiolgruppen können natürlich vorkommende sein oder können über die Verwendung eines Thiolierungsmittels, wie etwa N- Succinimidyl-3-(acetylthio)-propionat (SATP) oder 2-Iminothiolan, künstlich eingeführt werden.
Um Antikörper zu erzeugen, wird das Immunogen bequemerweise zur Injektion in ein Wirtstier hergestellt, indem ein lyophilisiertes Immunogen zum Erhalt einer Lösung oder Suspension des Immunogens rehydriert wird. Die Immunogenlösung wird dann mit einem Adjuvans, wie z. B. Freund-Adjuvans, kombiniert. Das Immunogen kann in eine Vielzahl von Stellen in verschiedenen Dosierungen, bei einmaliger oder mehrmaliger Gabe, über viele Wochen hinweg verabreicht werden.
Die Herstellung der polyklonalen Antikörper unter Verwendung des Immunogens kann einer beliebigen der herkömmlichen, den Fachleuten des Bereichs bekannten Methoden folgen. Üblicherweise wird einem Wirtstier wie Kaninchen, Ziege, Maus, Meerschweinchen oder Pferd das Immunogengemisch injiziert. Es werden weitere Injektionen vorgenommen, wobei das Serum auf den Antikörper-Titer ausgewertet wird, bis das Erreichen des optimalen Titers feststellbar ist. Das Wirtstier wird dann bluten gelassen, um ein geeignetes Volumen an spezifischem Antiserum zu erhalten. Wo erwünscht, können Reinigungsschritte vorgenommen werden, um unerwünschtes Material wie nicht-spezifische Antikörper zu entfernen, bevor das Antiserum als zur Verwendung bei der Durchführung von Assays geeignet erachtet wird.
Monoklonale Antikörper können durch Hybridisieren von Mäuse-Lymphozyten, die wie oben beschrieben immunisiert wurden, und Myelomzellen unter Verwendung einer Polyethylenglycol-Methode erhalten werden, wie etwa der in Methods in Enzymology 73 (Part B), S. 3-46 (1981) beschriebenen Methode.

Beispiel 1. Thiolierung von KLH

Eine Lösung von Napfschnecken-Hämocyanin (KLH) (12,3 mg, 12,3 nMol) wurde in 50 mM Phosphat-Puffer (2,5 ml), pH 7,6, wiederhergestellt. Dem wurde 2-Iminothiolan-Hydrochlorid (2-IT) (3,4 mg, 24,6 nMol) zugegeben. Die Lösung wurde verwirbelt und bei Raumtemperatur 60 Minuten lang stehen gelassen. Das thiolierte KLH (KLH-SH) wurde mit 50 mM Phosphat-Puffer (3,5 ml), pH 7,0, über einer mit PD-10 vorbepackten SEPHADEX G-25-Ionenaustauscher-Säule (® Pharmacia, Inc.), voräquilibriert mit 50 mM Phosphat-Puffer, pH 7,6, zur Entfernung überschüssigen, nicht umgesetzten 2-IT entsalzt.

Beispiel 2. Herstellung von N-1-Carboxymethyl-LSD

N-1-(Ethylcarboxymethyl)-LSD (Formel II) wurde als ein Ausgangsmaterial hergestellt, indem LSD (Formel I) mit einer molaren Überschussmenge an Natriumhydrid, gefolgt von der Zugabe von Ethylbromacetat, behandelt wurde. Der entstandene Ester wurde zum Erhalt von N-1-Carboxymethyl-LSD (N-1-CM-LSD, Formel III) hydrolisiert. Das nachstehend ausführlich beschriebene Syntheseschema ist in Abb. 1 veranschaulicht.
Da man LSD aufgrund statischer Ladung als schwierig und gefährlich mittels Transfer abzuwiegen befand, wurde eine Methode übernommen, bei der eine gesamte Phiole wiederhergestellt und das Wiegen durch Entnehmen erfolgte. Unter Arbeiten in einer Handschuh-Schutzkammer, die mit Stickstoffgas gespült worden war, wurden 7,4 mg (308 uMol) Natriumhydrid direkt in eine geteerte konische 2,5- ml-Reaktionsphiole abgewogen. 400 ul Dimethylformamid (DMF) wurden der Reaktionsphiole zugegeben und außerdem ein magnetischer Rührstab, Öffnungsdeckel und eine Membran mit TEFLON- (synthetisches Harzpolymer)-beschichteter Oberfläche. Die Phiole wurde über etwa 10 Min, hinweg in einen Becher eingebracht, der zerstoßenes Trockeneis enthielt. 300 ul DMF wurden einer geteerten 50-mg- Phiole von LSD zugegeben und die Phiole verdeckelt und mehrfach umgedreht, bis eine vollständige Lösung erhalten war. Die LSD-Lösung wurde in ein kleines Kulturröhrchen (12 · 75 mm) umgefüllt, verdeckelt und etwa 10 Min. lang in Trockeneis plaziert. Die leere LSD-Phiole wurde dann mit Aceton gespült, getrocknet und gewogen, um das Nettogewicht des durch Entnahme entfernten LSD zu erhalten, nämlich 50 mg (154 uMol). Nach Herausnahme der Reaktionsphiole aus dem Trockeneis und Plazieren auf einer magnetischen Rührplatte wurde die LSD-Lösung unter kräftigem Rühren der Natriumhydrid-Suspension in der Phiole eingespritzt. Die Entwicklung von Wasserstoffgas und eine hellgelbe Verfärbung waren feststellbar. Die Suspension durfte sich unter Rühren etwa 5 Min. lang erwärmen, zu welchem Zeitpunkt die Gasentwicklung aufgehört hatte. Dann wurde Ethylbromacetat, 17 ul (164 uMol) eingespritzt und etwa 2 Min. lang gerührt. Nach Entnahme der Phiole aus der Handschuh-Schutzkammer wurde eine Teilmenge von 1-2 ul für die HPLC- Analyse entnommen und die Phiole dann in einen Gefrierschrank bei -70ºC gestellt, während die HPLC vorgenommen wurde. Die HPLC-Teilmenge wurde in einem 12 · 75 mm-Kulturröhrchen mit 20 ul Acetonitril und 20 ul an 0,1 M Triethylaminacetat (TEA-Ac) verdünnt. Die Probe wurde auf eine analytische C&sub4;-Säule (Vydac) injiziert und das folgende Programm ablaufen gelassen: 0-5 Min., 100% 0,1 M TEA-Ac (pH 7); 5-55 Min., 0-50% Acetonitril/0,1 M TEA-Ac; 55-60 Min., 100% Acetonitril; 60-70 Min., 100% 0,1 M TEA-Ac. Die Fließgeschwindigkeit betrug 1 ml/Min. bei einer UV- Detektion bei 320 und 280 nm. Die HPLC ergab eine nahezu vollständige Umwandlung von LSD, das um 30-32% Acetonitril eluierte, zu einem Hauptprodukt, das um 40-42% Acetonitril eluierte, das eine leichte rückwärts gerichtete Schulter zeigte. Das N-6-quaternierte Nebenprodukt eluierte direkt nach LSD, d. h. bei 32-33% Acetonitril.
Das Produkt wurde mittels präparativer HPLC auf einer 2,2 · 25 CM-C4-Säule unter Anlegen des folgenden Programms isoliert: 0-10 Min., 10% Acetonitril/0,1 M TEA-Ac; 10-60 Min., 10-60% Acetonitril/0,1 M TEA-Ac; 60-65 Min., 65% Acetonitril/0,1 M TEA-Ac; 65-75 Min., 10% Acetonitril/0,1 M TEA-Ac. Die Fließgeschwindigkeit betrug 8 ml/Min. Die Beladungs-Lösung wurde durch Verdünnen des kalten Reaktionsgemischs mit 1 ml 0,1 M TEA-Ac, Filtern der resultierenden, leicht trüben Lösung durch ein 1 um-Spritzenfilter und Injizieren des klaren Filtrats, 1,8 ml, auf einen 2-ml- Bauch hergestellt. Das gewünschte Produkte eluierte gegen Ende des Gradienten mit einer Rückschulter. Die Fraktionen wurden über dem Hauptpeak manuell eingesammelt, wobei darauf geachtet wurde, die Fraktionen an der Rückschulter zu wechseln. Diese Rückschulter entspricht dem teilweise gelösten N-1-(Ethylcarboxymethyl)-iso-LSD, d. h. ist an der 8-Position epimerisiert. Eine analytische HPLC wurde an den Hauptfraktionen vorgenommen, wobei jene, die frei von der Iso-LSD- Schulter waren, gepoolt und lyophilisiert wurden. Die Fraktion wurde mittels 1H-NMR in Acetonitril-d&sub3; analysiert und ihre Identität mittes Massenspektrometrie (MS) bestätigt. Das NMR-Spektrum des N-1 (Ethylcarboxymethyl)-LSD ergab die Abwesenheit des LSD in 1-Position-NH bei 9,0 ppm. Alle anderen LSD-Resonanzen waren aber bei etwa derselben Position wie bei der Stammdroge sichtbar. Dies wies stark darauf hin, dass die 1-Position substituiert war. Außerdem wurden neue Resonanzen für das Carboxymethyl-CH&sub2; (4,9 ppm, 2 Protonen-Singlet) und den Ethytester (CH&sub2; bei 4,2 ppm, 2 Protonen-Quartet, und CH&sub3; bei 1,3 ppm, Triplet überlappt mit Diethylamid-Resonanzen). Die rückgewonnene Ausbeute wurde durch Vergleich von UV/sichtbar in Acetonitril/Wasser (50 : 50) unter Anwendung von MG = 409,5 und Emax = 5895 für den Peak um 320 nm berechnet und als 30 mg festgestellt.
Das N-1-(Ethylcarboxymethyl)-LSD-Ausgangsmaterial (28,5 mg, 70 uMol) wurde in 3,5 ml Ethanol gelöst und in eine kleine Phiole eingebracht, die mit einer Membran/Nadel, gekoppelt an eine Erdgasleitung, und einem kleinen Rührstab ausgestattet war. Die Reaktionsphiole wurde mit Argongas gespült. Dann wurde Natriumhydroxid, 75 ul einer 1 N Lösung, unter Rühren eingespritzt. Die Reaktion wurde unter Verwendung des oben für die Herstellung des Ausgangsmaterials beschriebenen analytischen Systems überwacht. Das Produkt eluierte bei etwa 24-25% Acetonitril als ein scharfer Peak. Es wurde eine geringe Menge an Iso-LSD-Derivat-Nebenprodukt festgestellt, die als eine Rückschulter am Hauptpeak auftrat. Die Reaktion war in etwa 2 Std. abgeschlossen. Das Reaktionsgemisch wurde dann durch Zugabe eines Äquivalent Essigsäure und von 1 ml Wasser neutralisiert, wobei die resultierende Lösung klar war. Das Produkt wurde isoliert und mittels HPLC auf einer präperativen C4-Säule unter Verwendung von 20 mM TEA-Ac, pH 7, und Acetonitril gemäß dem folgenden Programm entsalzt: 0-5 Min., 0% Acetonitril/20 mM TEA-Ac; 5-55 Min., 0-50% Acetonitril/20 mM TEA-Ac; 55-60 Min., 100% Acetonitril. Die Fließgeschwindigkeit betrug 8 ml/Min. Der Hauptpeak, der um 28-29% Acetonitril eluierte, wurde abgesammelt und die Fraktionen auf der Rückseite des Peaks gewechselt, um jegliche Schulter für ein Iso-LSD-Derivat zu vermeiden. Die gepoolten Fraktionen wurden lyophilisiert und noch weitere zweimal aus Wasser/Acetonitril, 4 : 1, zur Beseitigung des TEA-Ac und Umwandlung des Produkts zu einem Zwitterion lyophilisiert. Das Produkt wurde durch 1H NMR in einem Gemisch von Acetonitril-d&sub3; und Deuteriumoxid analysiert. Es wurde bestätigt dass die oben festgestellten Ethylester-Resonanzen bei der NMR verschwanden, wohingegen die anderen oben festgestellten Resonanzen intakt waren. Das Produkt wurde auch mittels MS analysiert und ein Ionen-Peak entsprechend dem theoretischen Molekulargewicht (MG) von 381 bestätigt. Die rückgewonnene Ausbeute wurde mittels UV in Acetonitril-H&sub2;O, wie oben für das Ausgangsmaterial beschrieben, unter Verwendung von MG = 381 und Emax = 5895 errechnet. Die Ausbeute an N-1-CM- LSD wurde als 20 mg befunden.

Beispiel 3. Herstellung von N-1-(Carboxymethyl)-LSD-N-hydroxysuccinimidester

Wie in Abb. 2 veranschaulicht, wurde N-1-(Carboxymethyl)-LSD-N- hydroxysuccinimidester (N-1-CM-LSD-NHS, Formel V) durch Auflösen einer Probe von N-1- Carboxymethyl-LSD (6,6 mg, 17,3 uMol, Formel IV) in 1,0 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) hergestellt. Dieser Lösung wurde N-Hydroxysuccinimid (NHS) (14 mg, 121 uMol) und 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-Hydrochlorid (EDC) (23,2 mg, 121 uMol) zugegeben. Die Lösung wurde verwirbelt und bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert. Das aktivierte N-1-CM-LSD-NHS (Formel V) wurde in Beispielen 4 und 5 ohne weitere Reinigung verwendet.

Beispiel 4. Konjugation von N-1-(Carboxvmethyl)-LSD-N-hydroxysuccinimidester an KLH

Einer Lösung von KLH (15,0 mg, 15 nMol) in 4,0 ml Phosphat-Puffer wurde eine Lösung von N-1-CM-LSD-NHS (5,7 mg, 15,0 uMol) in 1,0 ml DMSO, hergestellt wie in Beispiel 3, zugegeben. Die resultierende Lösung wurde zwei Minuten lang leicht verwirbelt und bei Raumtemperatur 8 Stunden lang stehen gelassen. Das Immunogen [N-1-CM-LSD]n-KLH wurde gegen Wasser/MeOH (80 : 20 Vol/Vol) drei Tage lang dialysiert. Das Immunogen wurde dann zum Erhalt eines lyophyilisierten Pulvermaterials gefriergetrocknet. Die Beladung des Immunogens, errechnet wie unten im Beispiel 7 beschrieben, wurde als etwa 199 unter Anwendung eines Extinktionskoeffizienten von 17,060 M&supmin;¹ cm&supmin;¹ bei 250 nm für N-1-CM-LSD bestimmt.

Beispiel 5. Herstellung von N-1-(Maleimidoethylaminocarbonylmethyl)-LSD

Wie in Abb. 3 veranschaulicht, wurde ein zweifacher Überschuss an Maleimidoethylamin-Hydrochlorid (MEA HCl, Formel V, 6,1 mg, 34,6 uMol) in 1,5 ml Phosphat- Puffer dem aktivierten N-1-CM-LSD-NHS aus Beispiel 3 (6,6 mg, 17,3 uMol) zugegeben. Das MEA HCl wurde mittels der Methode von Huber synthetisiert, wie beschrieben in PCT-Veröffentlichung WO 90/15798 (27. Dez. 1990). Der Verlauf der Reaktion wurde mittels HPLC überwacht. Das N-1-(Maleimidoethylamino-carbonylmethyl)-LSD (N-1-MEA-CM-LSD, Formel VI) wurde dann mittels HPLC gereinigt.

Beispiel 6. Konjugation von N-1-(Maleimidoethylaminocarbonylmethyl)-LSD an KLH

Die KLH-SH-Lösung (7,0 mg, 7,0 uMol) in 2,1 ml Phosphat-Puffer aus Beispiel 1 wurde einer Lösung von N-1-MEA-CM-LSD (3,5 mg, 7,0 mMol) in DMSO (0,60 ml) zugegeben. Die resultierende Lösung wurde zwei Minuten lang leicht verwirbelt und bei Raumtemperatur 5 Stunden lang stehen gelassen. Das Protein-Konjugat [N-1- MEA-CM-LSD]n-KLH wurde gegen H&sub2;O : MeOH (80 : 20 Vo/Vol) über drei Tage hinweg dialysiert und dann zum Erhalt eines lyophilisierten Pulvermaterials gefriergetrocknet.
Die Anzahl der in das Protein-Träger-KLH (Beladung des Immunogens) eingebauten N-1-MEA-CM-LSD-Addukte wurde wie folgt bestimmt: Ein Milligramm [N-1-MEA-CM- LSID]n-KLH wurde in 1,0 ml 1,0 N NaOH gelöst. Das Spektrum der Lösung wurde zwüschen 200 und 400 nm gegen dasselbe Lösungsmittel wie bei der Referenz aufgezeichnet. Unter Anwendung des Extinktionskoeffizienten von 5,899 M&supmin;¹ cm&supmin;¹ bei 320 nm für N-1-MEA-CM-LSD, wobei keine Absorption für KLH vorliegt, wurde das Molverhältnis mit 226 : 1 berechnet.

Beispiel 7. Herstellung von N-1-(Maleimidopentylaminocarbonylmethyl)-LSD:ED- Konjugat

Zunächst wurde N-1-(Maleimidopentylaminocarbonylmethyl)-LSD (N-1-MEA-CM- LSD) hergestellt. Einer Lösung von N-1-CM-LSD-NHS (50,11 mg, 131,4 uMol), die wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt worden war, wurde eine annähernd äquivalente Molzahl an Maleimidopentylamin-Hydrochlorid (MPA) (28,78 mg, 131,6 uMol) in Dimethylformamid (DMF) zugegeben. Um das Reaktionsgemisch auf einem neutralen pH-Wert zu halten, wurden 300 ul Triethylamin (TEA) zugegeben und der pH-Wert geprüft. Der Verlauf der Reaktion wurde mittels HPLC überwacht. Das N-1- MIPA-CM-LSD wurde dann durch HPLC gereinigt und bei der Herstellung des ED- Konjugats verwendet.
Einer Lösung von thioliertem ED28 (5,0 mg, 0,5 uMol) wurde hergestellt und in 3,5 ml Phosphat-Puffer entsalzt. Diese Lösung wurde dann einer Lösung von N-1-MPA- CIM-LSD (1,67 mg/l,5 ml DMF) zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde 2 Minuten lang leicht verwirbelt und 55 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Protein-Konjugat N-1-MPA-CM-LSD : ED wurde unter Verwendung einer semipräparativen Vydac-C4-Säule mittels HPLC gereinigt.

Beispiel 8. Herstellung monoklonaler Antikörper

Die Herstellung des Immunogens und die Immunisierung des Wirtstiers wurde unter Anwendung von Methoden erzielt, wie sie den Fachleuten des Bereichs wohl bekannt sein werden. Jedes der in Beispielen 4 und 6 hergestellten Immunogene wurde an Mäuse durch Reiheninjektionen verabreicht. Die Hybridoma-Zelllinien wurden dann aus Fusionen unter Verwendung immunisierter Milzen entwickelt. Der Antikörper-Überstand wurde dann wie nachfolgend beschrieben ausgewertet, und aus nützlichem Klonen wurden Aszites erzeugt. Die Aszites wurden dann gereinigt, was monoklonalen Antikörper ergab. Die gesamten biologischen und Reinigungs- Verfahren wurden in einer den Fachleuten des Bereichs wohlbekannten Weise vorgenommen.
In diesem Beispiel wurden die überstehenden Antikörper gewählt aus 96-well-Kulturplatten unter Verwendung eines homogenen CEDIA-Assays. Wie zuvor beschrieben, verwendet der CEDIA-Assay zwei gentechnisch hergestellte, enzymatisch inaktive Fragmente von β-Galactosidase. Das kleinere Polypeptid, der Enzym-Donator, kann mit dem größeren Fragment, dem Enzym-Akzeptor, spontan rekombinieren, und bildet dabei in einem Prozess, genannt Komplementation, aktive β-Galactosidase. Bindet ein spezifischer Antikörper zum Ligand oder Analyt an das Enzym-Donator- Konjugat, so hemmt dies die Komplementation. Die Zugabe des freien Liganden zu diesem System moduliert die Hemmung der Komplementation. Dieses Assay-Prinzip wurde zum Screening der Fusionsprodukte im 96-weil-Format verwendet.
Zunächst wurde ein Primär-Screening der Fusionsprodukte zur Auswertung der Fähigkeit der Antikörper vorgenommen, an das in Beispiel 8 hergestellte Enzym- Donator-Konjugat zu binden und die Komplementation zu hemmen. Die Anzahl der Inhibitions-positiven Klone wurde dann durch Vornahme eines Sekundär-Screening- Assays weiter angenähert, um zu bestimmen, ob die freie Droge mit dem Enzym- Donator-Konjugat für den Antikörper modulieren oder konkurrieren würde. Der Modulations-Assay identifiziert auch spezifische Klone, wenn gegen kreuzreagierende Analyte gescreent. Die Klone, die mit dem spezifischen Analyt der Wahl modulierten, wurden dann zur weiteren Untersuchung gezüchtet. Die Kulturüberstände, die die monoklonalen Antikörper enthielten, wurden abgesammelt und auf dem HITACHI 717-Analysegerät (®Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN) ausgewertet, wie in nachstehendem Beispiel 9 beschrieben.

Beispiel 9. Assay für LSD

Ein CEDIA-Assay für LSD wurde unter Verwendung des in Beispiel 7 hergestellten Enzym-Donator-Konjugats und des gemäß Beispiel 4 hergestellten Antikörpers durchgeführt. Es wurden die folgenden Reagenzien hergestellt:

Antikörper-Reagenz:

Antikörper 57 ng/ml
PIPES (Piperazin-N,N-bis-[2-ethansulfonsäure]) 100 mM
NaCl 500 mM
Fötales Rinderserum 0,5%
EGTA 10 mM
Magnesiumacetat 10 mM
Natriumazid 20 mM
pH 6,90

Donator-Reagenz:

Enzym-Donator-Konjugat 0,487 nM
CPRG (Chlorphenylrot-(3-D-galactopyranosid) 3 mg/ml
PIPES 100 mM
NaCl 400 mM
EGTA 10 mM
Fragmentiertes BSA 2 mg/ml
Natriumazid 20 mM
pH 6,90

Akzeptor-Reagenz:

Enzym-Akzeptor 880 E/ml
Magnesiumacetat 10 mM
NaCl 400 mM
PIPES 100 mM
EGTA 10 mM
Natriumazid 20 mM
pH 6,90
Die Assays wurden unter Verwendung eines HITACHI 911-Analysegeräts vorgenommen. Das Instrument entnahm eine Probe, enthaltend 12 ul LSD, denen 100 ul des Antikörper-Reagenz zugegeben wurden. Das Gemisch wurde bei 37ºC über 60 Sekunden hinweg inkubiert, dann 100 ul des Donator-Reagenz zugegeben und dieses Gemisch weitere 530 Sekunden lang inkubiert. Schließlich wurden 140 ul des Akzeptor-Reagenz zugegeben. Die Extinktionsrate wurde über einen Zeitraum von 295 Sek. bis 375 Sek. nach Zugabe des Akzeptor-Reagenz gemessen. Die angewendete Primär-Wellenlänge betrug 570 nm, die angewendete Sekundär- Wellenlänge 660 nm. Die Extinktionsrate bei 570 nm wurde gegen die LSD- Konzentration aufgetragen, um die in Abb. 4 (a) gezeigte Dosis-Wirkungs-Kurve zu konstruieren. Die Ergebnisse, die mit einem LSD spezifischen, gegen das Immunogen aus Beispiel 4 gezüchteten monoklonalen Antikörper erhalten wurden, sind die folgenden:

Dosis, ng/ml Rate, mAU/Min.

0,0 112,4
0,3 132,2
0,5 145,0
0,7 155,3
2,0 207,0
4,0 224,8
100 228,7

Beispiel 10. Assay für LSD

In ähnlicher Weise wie in Beispiel 9 beschrieben, wurde ein CEDIA-Assay für LSD unter Verwendung des in Beispiel 7 hergestellen Enzym-Donator-Konjugats und eines LSD spezifischen monoklonalen Antikörpers, wie gegen das Immunogen aus Beispiel 6 gezüchtet, vorgenommen. Die erhaltenen Ergebnisse sind die folgenden:

Dosis, ng/ml Rate, mAU/Min.

0,0 63,6
0,3 67,6
0,5 69,9
0,8 72,6
1,6 80,8
4,0 107,4
Die durch Auftrag der LSD-Dosis gegen die Rate erhaltene Wirkungs-Kurve ist in Abb. 4(b) gezeigt.

Claims

1. Reagenzien zur Bestimmung des Vorhandenseins von LSD oder seiner Metaboliten in einer Urinprobe mittels Enzym-Immunoassay, umfassend:

ein erstes Reagenz, enthaltend ein Konjugat zwischen LSD und einem Enzym oder Enzym-Donator-Polypeptid; und

ein zweites Reagenz, enthaltend einen Antikörper, der zur Bindung an das Konjugat des ersten Reagenz in einer Weise fähig ist, die durch LSD hemmbar ist.

2. Reagenzien nach Anspruch 1, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

3. Reagenzien nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Konjugat ein Konjugat zwischen LSD und einem β-Galactosidase-Enzym-Donator ist.

4. Reagenzien nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Enzym oder Enzym-Donator-Polypeptid an die N-1-Position des LSD konjugiert ist.

5. Reagenzien nach Anspruch 4, wobei das Konjugat von folgender Form ist:

worin Z das Enzym oder Enzym-Donator-Polypeptid ist;

R&sub1; = eine Alkyl-, Cycloalkyl- oder Arylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen;

R&sub2; = eine Bindung oder

worin R&sub3; = eine Alkyl-, Cycloalkyl- oder Arylgruppe mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen; und

n = 1 bis p, wobei p = MG von Z/1000.

Ei. Reagenzien nach Anspruch 5, wobei R&sub2; ist

wobei R&sub3; = eine Alkylgruppe mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen.

7. Reagenzien nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Antikörper des zweiten Reagenz zur Bindung an das Konjugat des ersten Reagenz in einer Weise fähig ist, die durch das LSD bei einer Konzentration von unter 0,1 nM hemmbar ist:

8. Reagenzien nach Anspruch 7, wobei der Antikörper des zweiten Reagenz zur Bindung an das Konjugat des ersten Reagenz in einer Weise fähig ist, die durch das LSD hemmbar ist, wobei 50% der maximalen Inhibition bei einer LSD- Konzentration von unter 0,2 nM eintritt.

9. Reagenzien nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Antikörper des zweiten Reagenz zur Bindung an das Konjugat des ersten Reagenz in einer Weise fähig ist, die durch unkonjugiertes LSD hemmbar ist, wenn in einem homogenen Immunoassay verwendet.

10. Reagenzien nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Immunoassay ein homogener Assay ist.

11. Reagenzien nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Immunoassay ein Enzym-Komplementations-Assay ist.

12. Enzym-Immunoassay-Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins von LSD oder LSD-Metaboliten in einer Probe, umfassend

a) Zusammenbringen eines Antikörpers mit jeglichem LSD oder LSD- Metaboliten in der Probe;

b) Zusammenbringen des Antikörpers mit einem Konjugat zwischen LSD und einem Enzym oder Enzym-Donator-Polypeptid; und

c) Messen jeglichen Komplexes, der zwischen dem Konjugat und dem Antikörper in einer Weise gebildet wurde, die durch LSD hemmbar ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, wobei das Konjugat ein Konjugat zwischen LSD und einem β-Galactosidase-Enzym-Donator ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 12-14, wobei das Enzym oder Enzym- Donator-Polypeptid an die N-1-Position des LSD konjugiert ist.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 12-15, wobei das LSD oder die LSD- Metaboliten in der Probe ausgeschieden wird, die eine Urinprobe ist.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 12-16, welches ein homogenes Assay- Verfahren ist.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 12-17, welches ein kompetitiv bindendes Assay-Verfahren ist.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 12-18, welches eine Enzym- Komplementations-Assaymethode ist.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 12-19, welches ein automatisiertes Assay- Verfahren ist.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 12-20, welches ein CEDIA-Assay- Verfahren ist.

22. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das LSD-Protein-Konjugat ein LSD-Enzym- Donator-Konjugat ist, und die Messung in Schritt c) das Zusammenbringen jeglichen verbliebenen Konjugats mit einem Enzym-Akzeptor zum Erhalt eines Enzym-Komplexes; das Zusammenbringen jeglichen Enzym-Komplexes mit einem Substrat dafür; und das Messen der Umwandlungsrate des Substrats zu einem Produkt umfaßt.

23. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Zusammenbringen aus Schritt a) vor dem Zusammenbringen aus Schritt b) vorgenommen wird.

24. . Verfahren nach Anspruch 12, umfassend das Herstellen eines Reaktionsgemischs, enthaltend den Antikörper, die Probe und das Konjugat.

25. Verfahren zur Bestimmung von LSD in einer Probe, umfassend:

(a) Zusammenbringen der Probe mit

(i) einem Enzym-Donator-Polypeptid-Konjugat der folgenden Form:

worin Z ein Enzym-Donator-Polypeptid von β-Galactosidase ist;

R&sub2; = eine Bindung oder

n = 1 bis p, wobei p = MG von Z/1000.

(ii) einem Enzym-Akzeptor-Polypeptid, wobei das Enzym-Akzeptor- Polypeptid dadurch gekennzeichnet ist, dass es mit dem Enzym-Donator- Polypeptid-Konjugat einen aktiven Enzym-Komplex mit β-Galactosidase- Aktivität in Abwesenheit eines Antikörpers zu LSD bildet;

(iii) einem für LSD spezifischen Antikörper, wobei das Enzym-Donator- Konjugat zur kompetitiven Bindung an diesen Antikörper fähig ist und dabei die Bildung von aktivem Enzym-Komplex hemmt; und

(iv) einem Substrat, das zum Reagieren mit dem aktiven Enzym-Komplex fähig ist, so dass die Umwandlungsrate des Substrats durch den aktiven Enzymkomplex überwacht werden kann; und

(b) Messen der Umwandlungsrate des Substrats durch den aktiven Enzymkomplex als ein Maß der Menge des LSD in der Probe.

26. Verfahren zur Bestimmung von LSD in einer Probe, umfassend:

(a) das Zusammenbringen der Probe mit

(i) einem Enzym-Donator-Polypeptid-Konjugat von β-Galactosidase;

(iii) einem Antikörper zu einer Verbindung der folgenden Form:

worin Z eine immunogene Trägersubstanz ist;

R&sub2; = eine Bindung oder

n = 1 bis p, wobei p = MG von Z/1000.

wobei das Enzym-Donator-Konjugat zur kompetitiven Bindung an den Antikörper fähig ist und dabei die Bildung eines aktiven Enzym-Komplexes hemmt; und

(iv) einem Substrat, das zum Reagieren mit dem aktiven Enzym-Komplex fähig ist, so dass die Umwandlungsrate des Substrats durch den aktiven Enzym- Komplex überwacht werden kann; und

(b) Messen der Umwandlungsrate des Substrats durch den aktiven Enzym- Komplex als ein Maß der Menge des LSD in der Probe.