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Die
vorliegende Erfindung betrifft neue Impfstoffe, die für einen
Schutz vor einer Infektion mit dem Organismus Yersinia pestis sorgen,
und Zusammensetzungen, die diese Impfstoffe enthalten. Insbesondere
werden oral wirksame Impfstoffe angegeben, die imstande sind, Schutz
vor Bubonenpest und Lungenpest zu bieten, insbesondere durch Herbeiführen einer
Schleimhautimmunität
sowohl beim Menschen als auch bei Tieren.
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Yersinia
pestis ist der hochgradig ansteckende Organismus, der in einer großen Vielzahl
von Tieren einschließlich
dem Menschen Pest hervorruft. Die Ansteckung mit diesen Organismen
hat eine hohe Sterberate zur Folge. Studien haben gezeigt, dass
die hochgradige Virulenz durch eine komplexe Reihe von Faktoren,
die durch das Chromosom und drei Plasmide einschließlich der
Lcr-Gene (siehe Straley, 1991) codiert werden, ein Fibrinolysin
(Sodeinde & Goguen,
1988) und eine Kapsel verursacht wird.
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Der
Mensch stellt einen gelegentlichen Wirt im natürlichen Zyklus der Krankheit
dar, und die Bubonenpest, die durch das Anschwellen lokaler Lymphknoten
gekennzeichnet ist, kann nach dem Biss eines infizierten Flohs ausbrechen.
Eine der Komplikationen der Bubonenpest ist eine sekundäre Lungenentzündung, in
derartigen Fällen
wird die Krankheit leicht durch Tröpfcheninfektion zwischen Menschen übertragen.
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Die
Pest ist endemisch in Regionen von Nord- und Südamerika, Afrika, China und
Asien (siehe Butler (1983) "Plague
and Other Yersinia Infections";
Plenum Press, New York). Von den derzeitigen Ausbrüchen wird angenommen,
dass sie Teil der Pandemie der Krankheit in der Vierten Welt sind,
und demnach gibt es eindeutig einen Bedarf am Schutz der Menschen,
die in endemischen Gebieten leben oder dort hin reisen, und der Labormitarbeiter,
die mit dem Bakterium in Berührung
kommen.
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Die
derzeitig bekannten Ganzkeimimpfstoffe, die für die Pestprophylaxe verfügbar sind,
sind höchst heterogen,
was zu Nebenwirkungen führt,
die sie ungeeignet machen für
die weit verbreitete Anwendung (Reisman, (1970); Meyer et al. (1974);
Marshall et al. (1974)).
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Ein
gegenwärtig
gegen Pest eingesetzter Impfstoff ist der Cutter-Impfstoff, der Pestbakterien enthält, die
mit Formaldehyd abgetötet
wurden, der dem Körper
durch intramuskuläre
Injektion verabreicht wird. Die parenterale Immunisierung führt jedoch,
obwohl sie wirksam für
das Auslösen
einer systemischen Immunität ist,
nicht zu einer wirksamen Schleimhautimmunität (McGhee et al., (1992) Vaccine
10, 75–88).
Bis heute ist über
keinen Impfstoff berichtet worden, der imstande ist, eine schützende Immunantwort
auf Schleimhautoberflächen
hervorzurufen.
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Der
abgeschwächte
Lebendimpfstoff (Meyer et al. ibd.) EV76 wurde umfassend untersucht
und ab 1939 in der ehemaligen Sowjetunion verwendet, obwohl seine
Wirksamkeit beim Hervorrufen einer Immunantwort im Menschen zweifelhaft
ist (Meyer et al. (1974) J. Infect. Dis. 129 Supp: 18-18). Es ist
gezeigt worden, dass die Virulenz von EV76 in verschiedenen Tierarten
unterschiedlich ausgeprägt
ist, und nicht-menschliche Primaten sind besonders anfällig für eine chronische
Infektion mit diesem Stamm. In der westlichen Welt wird dieser Impfstoff
wegen seiner enormen Heftigkeit und der Möglichkeit, dass der Stamm wieder
seine volle Virulenz erlangt, als ungeeignet für Massenimpfungen angesehen.
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Eines
von mehreren bekannten Y. pestis-Antigenen ist das Y. pestis-LcrV-Antigen (V-Antigen),
ein instabiles monomeres Peptid von 37,3 kDa, das auf dem etwa 70
kb großen
Lcr-Plasmid von Y. pestis, Y. pseudotuberculosis und Y. enterocolitica
codiert ist. Dieses Plasmid bewirkt die Wachstumshemmung des Organismus
bei 37 °C
in Gegenwart von weniger als 2,5 mM Ca2+.
Unter derartigen Bedingungen sind die Zellen außerstande, bulk vegetative
proteins zu erzeugen, obwohl mehrere Stress-Proteine und Virulenzfaktoren
exprimiert werden; Diese Antwort ist als "low calcium response" bekannt. Für eine unpolare Mutation des
lcrV-Gens ist gezeigt worden, dass sie den Verlust der Notwendigkeit
von Ca2+ verursacht und zu Avirulenz führt (Price et
al. (1991) J. Bacteriol 173, S. 2649–2657), es wird daher postuliert,
dass das V-Antigen die Wirkung eines Virulenzfaktors hat.
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Es
konnte gezeigt werden, dass Kaninchen-Antiserum, das gegen teilweise
gereinigtes V-Antigen produziert wurde, für einen passiven Schutz in
Mäusen
sorgt, die später
intraperitoneal einer Belastungsinfektion mit 100 LD50 Y.
pestis ausgesetzt wurden (siehe Lawton et al. (1963) J. Immunol
91, S. 179–184).
Dass es sich hierbei um einen Virulenzfaktor handeln könnte, wurde
bestätigt,
als für
monospezifische Antisera, die gegen das V-Antigen von Y. pestis
entwickelt wurden, gezeigt wurde, dass sie passiv gegen eine parenterale
Belastungsinfektion mit dem Bakterium schützen (siehe Une und Brubaker
(1984 J. Immunol. 133, S. 2226–2230) und
dass Antikörper,
die gegen ein Fusionsprotein aus einem V-Fragment und Protein A
erzeugt wurden, zu einer passiven Immunisierung führen (Une
et al. (1987) Contrib. Microbiol. Immunol. 9, 179–185).
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Vor
kurzem wurde nachgewiesen, dass polyklonale Antisera, die gegen
rekombinantes V-Antigen oder eine Fusion von Protein A und V-Antigen (PAV) erzeugt
wurden, ebenfalls partiell schützend
gegen Y. pestis KIM wirken (siehe Motin et al. (1994) Infect. Immun.
62. S. 4192–4201).
Durch Absorbieren der Antisera mit Bruchstücken von PAV wurde gefolgert,
dass mindestens ein schützendes
Epitop zwischen den Aminosäuren 168
und 275 des V-Antigens liegt.
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Die
Bedeutung des V-Antigens für
die Virulenz ist unbekannt, Nakajima und Brubaker ((1993) Infect. Immun.
61, S. 23–31)
haben aber vorgeschlagen, dass es immunsuppressiv wirken kann, möglicherweise durch
Hemmung der Synthese von Cytokinen, wodurch das Einwandern von Entzündungszellen
des Wirts in infizierte Organe verhindert wird (Une et al. (1987)
Contrib. Microbiol. Immunol. 9, S. 179–185; Straley und Cibull (1989)
Infect. Immun. 57, S. 1200–1210).
Der passive Schutz, der durch ein Antiserum gegen V-Antigen verliehen
wird, kann daher möglicherweise
der Neutralisierung dieser immunsuppressiven Wirkung zugeschrieben
werden (Nakajima und Brubaker (1993) s.o.).
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Obwohl
ca. 30 Jahre seit dem ersten Hinweis auf seine mögliche Bedeutung für die Virulenz
von Y. pestis vergangen sind, ist bislang nicht über die Verwendung eines Impfstoffs
auf der Basis des V-Antigens berichtet
worden, weder über
eine Eignung für
die orale oder parenterale Verabreichung noch für das Ziel der Erzeugung einer
Schleimhautimmunität.
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Die
Erfinder haben nunmehr rekombinante DNA-Konstrukte bereitgestellt,
die, wenn sie in die DNA von Mikroorganismen eingebaut werden, insbesondere
von Organismen, die den Darm von Mensch oder Tier besiedeln, imstande
sind, diese so zu transformieren, dass sie befähigt sind, ein Peptid, das
sich vom V-Antigen ableitet, oder das V-Antigen selbst zu exprimieren,
das eine schützende
Immunantwort gegen Yersinia pestis im menschlichen Körper oder
im Tierkörper
hervorruft, wenn der Mikroorganismus auf oralen Wegen ver abreicht
wird. Die vorliegende Erfindung gibt vorzugsweise solche DNA-Konstrukte
an, die derartige Mikroorganismen transformieren und ihnen dabei
ermöglichen,
ihre Fähigkeit
zu behalten, den Darm des Menschen oder von Tieren zu besiedeln
und systemisch in den Körper
einzuwandern.
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Weiterhin
werden Plasmide bereitgestellt, die diese Konstrukte enthalten und
die imstande sind, einen Mikroorganismus, der den Darm des Menschen
oder von Tieren besiedelt, so zu transformieren, dass er befähigt ist,
ein Protein zu exprimieren, das eine schützende Immunantwort gegen Yersinia
pestis in einem menschlichen Körper
oder einem Tierkörper
hervorruft, wenn der Mikroorganismus auf oralen Wegen verabreicht
wird, und wiederum ermöglichen
es diese Plasmide vorzugsweise, dass die Mikroorganismen ihre Fähigkeit
behalten, den Darm des Menschen oder von Tieren zu besiedeln und
systemisch in den Körper
einzuwandern.
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Weiterhin
werden den Darm von Menschen oder Tieren besiedelnde Mikroorganismen
bereitgestellt, die so mit erfindungsgemäßer rekombinanter DNA oder
einem erfindungsgemäßen Plasmid,
das diese rekombinante DNA enthält,
transformiert sind, dass sie befähigt
sind, ein Protein zu exprimieren, das eine schützende Immunantwort gegen Yersinia
pestis in einem menschlichen Körper
oder einem Tierkörper
hervorruft, wenn die Mikroorganismen auf oralen Wegen verabreicht
werden, und die vorzugsweise imstande sind, ihre Fähigkeit
zu behalten, den Darm des Menschen oder von Tieren zu besiedeln.
Die schützende
Antwort schließt
vorzugsweise eine schützende
Antwort auf den Oberflächen
der Schleimhäute
ein.
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Eine
besonders bevorzugte rekombinante DNA, ein besonders bevorzugtes
Plasmid oder ein besonders bevorzugter Organismus, der den Darm
des Menschen oder von Tieren besiedelt, codiert oder expri miert das
gesamte reife V-Protein von Yersinia pestis oder einen schützenden
Epitopbereich dieses reifen V-Proteins. Eine besonders bevorzugte
rekombinante DNA umfasst eine DNA-Sequenz wie sie in SEQ ID NO 1
oder SEQ ID NO 3 beschrieben wird, noch bevorzugter positioniert
in einem Rahmen mit einem Promotor, wie lacz oder nirβ, und vorzugsweise
in einem Vektor, der zur Expression und Replikation in einer Salmonella
imstande ist.
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Die
bevorzugten erfindungsgemäßen Konstrukte
erlauben die Erzeugung von Mikroorganismen, die, wenn sie oral verabreicht
werden, eine lokale Stimulierung des darmassoziierten lymphatischen
Gewebes (GALT) hervorrufen, und durch Wanderung von Lymphocyten
durch das allgemeine Schleimhautimmunsystem wird eine sekundäre Stimulation
des bronchienassoziierten lymphatischen Gewebes (BALT) hervorgerufen, wodurch
für eine
sekretorische IgA-Antwort auf den Schleimhautoberflächen des
Atmungssystems gesorgt wird.
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Die
Mikroorganismen, die durch die Transformation unter Verwendung der
erfindungsgemäßen DNA, im
Vektorformat oder in direkt insertiertem Format, erzeugt werden,
sind bevorzugt abgeschwächte
Mikroorganismen und noch bevorzugter abgeschwächte Salmonella. Abgeschwächte Mikroorganismen,
wie S. typhimurium, sind als Träger
für verschiedene
heterologe Antigene gut charakterisiert worden (Curtiss, (1990);
Cardenas und Clements (1992)). Die Abschwächung kann auf mehreren verschiedenen
Wegen durchgeführt
werden, z.B. durch Anwendung des aro-A- und/oder aro-C-Mutationsweges
(siehe Hosieth et al. (1981) Nature 291, 238–239; Dougan et al. (1986)
Parasite Immunol 9, 151–160;
Chatfield et al. (1989) Vaccine 7, 495–498); mehrfache Mutationen,
wie aro-A- und aro-C-Mutanten, wie von Hone et al. beschrieben (1991;
Vaccine 9, S. 810–816),
können
auch verwendet werden. Es kann jedoch jeder geeignete Defektorganismus, der
für die
beabsichtigte Verwendung ungefährlich
ist, eingesetzt werden.
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Viele
weitere derartige abgeschwächte
Deletionen und Mutationen werden für diese und andere Mikroorganismen
bekannt sein, die sie geeignet machen für die Transformation mit erfindungsgemäßen Konstrukten
mit dem Ziel der Expression von Impfstoffproteinen im Darm und/oder
der Besiedelung des Darms von Tieren, die gegen Y. pestis behandelt
werden sollen. Für
die Impfung des Menschen werden Vektoren, die die erfindungsgemäßen Konstrukte
enthalten, in abgeschwächten
S. typhi eingebracht, und dieser transformierte Organismus wird
als Wirkstoff für
die orale Lebendimpfung verwendet.
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Wenn
die erfindungsgemäße DNA für die Transformation
des abgeschwächten
Mikroorganismus durch direkte Insertion in dessen DNA verwendet
wird, kann dies durch direkte Integration in ein Gen geschehen.
Wenn sie in Form eines Plasmids eingebaut wird, das V-Protein oder ein
Epitop-Fragment davon exprimiert, kann dies alternativ so erfolgen,
dass nur das V-Protein oder ein Fragment exprimiert wird oder dass
es als Fusionspeptid mit einem weiteren Protein oder Peptidfragment
exprimiert wird. Ein derartiges weiteres Protein oder Peptidfragment
kann so aufgebaut sein, dass es den Export des reifen Proteins oder
Peptids durch die Zellmembran fördert,
oder es kann sich um ein weiteres Y. pestis-Antigen handeln.
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Das
lcr-Gen wurde von Price et al. aus dem Y. pestis-Stamm KIM kloniert,
und seine Nucleotidsequenz wurde in J. Bacteriol. (1989) 171, S.
5646–5653,
veröffentlicht.
In den Beispielen weiter unten wurde diese Information verwendet,
um Oligonucleotid-Primer zu konstruieren, mit denen das Gen von
Y. pestis (Stamm GB) unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) amplifiziert werden könnte.
Die PCR-Primer wurden so konstruiert, dass sie komplemen tär zu den
beiden Sequenzen sind, die das 5'-Ende
und das 3'-Ende
des lcrV-Gens flankieren, aber auch 5'-Endbereiches aufweisen, die eine Restriktionsenzym-Erkennungsstelle
einschließen,
um es zu ermöglichen,
das amplifizierte lcrV-Gen gerichtet in einen Plasmidvektor zu klonieren
(der 5'-Primer weist
eine EcoRI-Stelle auf, und der 3'-Primer enthält eine
SacI-Stelle).
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In
den folgenden Beispielen enthalten die erfindungsgemäßen Konstrukte
einen lac-Promotor, andere Promotoren wie der Makrophagen-Promotor
(nirβ) können aber
verwendet werden.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren,
die erfindungsgemäßen Konstrukte,
Mikroorganismen und Impfstoffe werden nun durch Veranschaulichung
nur unter Bezugaufnahme auf das folgende Sequenzprotokoll, die folgende
Figur und die folgenden Beispiele beispielhaft dargestellt. Weitere
Ausführungsformen
sind dem Fachmann im Lichte dieser Beispiele unmittelbar ersichtlich.
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SEQUENZPROTOKOLL:
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SEQ
ID NO 1: zeigt die Nucleotidsequenz und die sich davon ableitende
Aminosäuresequenz
einer erfindungsgemäßen DNA
mit den letzten 6 Basen des Vektors pMAL-p2 oder pMAL-c2, in den
sie kloniert ist, am 5'-Ende
unter Verwendung der EcoRI-Stelle in der Sequenz GAATTC (stammt
vom 5'-Ende-PCR-Primer) und
am 3'-Ende bei der
SaII-Stelle in der Sequenz GTCGAC (stammt vom 3'-Ende-PCR-Primer). Die Base in der Position
1006 wurde mit SDM gegen ein T ausgetauscht, um ein zweites in-frame-Stopcodon
zu erzeugen. Der Start der Sequenz ist eine Faktor-Xa-Spaltstelle.
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SEQ
ID NO 2: zeigt die Aminosäuresequenz
des Peptids, das von der erfindungsgemäßen DNA exprimiert wird, mit
zwei Aminosäuren
am N-terminalen Ende (I und S), die von dem Vektor codiert werden.
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SEQ
ID NO 3: zeigt die Nucleotidsequenz und die sich davon ableitende
Aminosäuresequenz
einer zweiten erfindungsgemäßen DNA
mit den letzten 10 Basen eines Vektors pGEX-5X-2, in den sie kloniert
ist, die am 5'-Ende
gezeigt werden, unter Verwendung der EcoRI-Stelle in der Sequenz GAATTC (GA stammt
vom 5'-Ende-PCR-Primer)
und der SaII-Stelle in der Sequenz GTCGAC (GTCGAC stammt vom 3'-Ende-PCR-Primer).
Die Base in der Position 1006 wurde durch SDM verändert, um
ein zweites in-frame-Stopcodon zu erzeugen; die Base A in der Position
16 wurde durch ein C ersetzt, um die EcoRI-Stelle zu erzeugen. Der Start der Sequenz
ist eine Faktor-Xa-Spaltstelle.
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SEQ
ID NO 4: zeigt die Aminosäuresequenz
des Peptids, das durch die zweite erfindungsgemäße DNA exprimiert wird, mit
vier Aminosäuren,
die am N-terminalen Ende durch den Vektor (G, I, P und G) codiert werden.
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BEISPIELE
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Manipulation
der DNA. Chromosomale DNA wurde nach der Methode von Marmur aus
Y. pestis isoliert. Das Gen, das das V-Antigen codiert (lcrV), wurde aus Y.
pestis-DNA unter Anwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) mit
125 pmol Primern amplifiziert, die homolog zu Sequenzen am 5'-Ende bzw. 3'-Ende des Gens sind
(siehe Price et al. (1989), J. Bacteriol 171 S. 5646–5653).
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Die
Sequenz des 5'-Primers
(V/5'E: GATCGAATTCATTAGAGCCTACGAACAA)
und des 3'-Primers (GGATCGTCGACTTACATAATTACCTCGTGTCA)
enthielten auch 5'-Regionen,
die die Restriktionsstellen EcoRI bzw. Sall codieren. Zusätzlich wurde
ein Nucleotid (*) in der veröffentlichten
Sequenz von lcrV verändert (Price
et al., 1989), damit das amplifizierte Gen ein zusätzliches
Terminationscodon (TAA) codiert. Die PCR-Primer wurden mit einem
DNA-Synthesizer (392 Applied Biosystems) hergestellt. Ein DNA-Fragment wurde
nach 30 Amplifikationszyklen erhalten (95 °C, 20 s, 45 °C, 20 s, 72 °C, 30 s; Perkin 9600 GeneAmp
PCR System). Das Fragment wurde gereinigt, mit EcoRI und SalI gespalten,
mit geeignet gespaltenem Plasmid pGEX-5x-2 verknüpft.
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Das
amplifizierte lcrV-Gen wurde in drei verschiedene Plasmidvektoren
kloniert:
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BEISPIEL 1:
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PMAL-p2:
ein Vektor, der so konstruiert ist, dass er das klonierte Gen als
Fusionsprodukt mit einem Maltose-bindenden Protein (MBP) exprimiert.
Der C-Terminus des MBP ist mit dem N-Terminus des V-Antigens verknüpft. Das
so bei der Expression erzeugte Fusionsprotein wird in das Periplasma
exportiert. Der Vektor, der die DNA-Sequenz für das V-Antigen enthält, erhielt
die Bezeichnung pVMP100.
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BEISPIEL 2:
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PMAL-c2:
ein Vektor, der pMAL-p2 ähnelt
mit dem Unterschied, dass das MBP-V-Antigen-Fusionsprotein ins Cytoplasma
exprimiert wird. Das rekombinante Plasmid erhielt die Bezeichnung
pVMC 100.
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BEISPIEL 3:
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pGEX-5X-2:
ein Vektor, der so konstruiert wurde, dass er das klonierte Gen
als Fusionsprotein mit Glutathion-S-Transferase (GST) exprimiert.
Der C-Terminus von GST ist mit dem N-Terminus des V-Antigens verknüpft, und
das Fusionsprotein wird ins Cytoplasma exprimiert. Das rekombinante
Plasmid erhielt die Bezeichnung pVG100.
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All
diese Vektoren enthalten den Ptac-Promotor
und das lacIQ-Gen; letzteres codiert den
lac-Repressor, der die Transkription von Ptac in
Escherichia coli ausschaltet, bis IPTG zugegeben wird. Die Plasmide
enthalten den Replikationsursprung von pBR322, und replizieren im
Ergebnis in einer geringen Kopienzahl in der Bakterienzelle. Alle
rekombinanten Plasmide wurde durch Elektroporation in den Salmonella
typhimurium-Stamm SL3261 eingebracht, einen abgeschwächten Stamm,
der umfangreich als Lebendimpfstoff-Vektor für die Expression von Fremdantigenen
verwendet worden ist. Er enthält
eine spezifische Deletionsmutation im aroA-Gen, die dazu führt, dass
das Wachstum der Mutante von bestimmten aromatischen Verbindungen
abhängt
(siehe Hosieth et al.). Für
die Erzeugung von Mikroorganismen, die für die Impfung von Menschen
geeignet sind, wird die Elektroporation in abgeschwächte Salmonella
typhi durchgeführt.
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Alle
rekombinanten Plasmide exprimierten V-Antigen, was durch den Western
Blot von S. typhimurium-Kulturen und die Behandlung mit einem monospezifischen,
polyklonalen Antiserum gegen V-Antigen als Sonde gezeigt wurde,
das von R. Brubaker, Dept. Microbiology, Michigan State University,
East Lansing, MI 48824–1101,
USA, geliefert wurde. Rekombinantes S. typhimurium wurde intravenös in Mäuse in einer
Menge von 5 × 107 cfu/Dosis geimpft, und es konnte gezeigt
werden, dass es die Leber und die Milz in hohen Konzentrationen
besiedelt; 8 × 106 bis 5 × 108 cfu pro Organ wurden wiedergewonnen. Die
Mehrzahl der wiedergewonnenen Bakterienzellen waren außerdem Ampicillin-resistent,
was auf die Beibehaltung von rekombinanten Plasmiden hinweist.
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