JPH09511139A - ワクチン組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 粘膜表面で免疫応答を誘発する生又は弱毒ワクチンとして使用できるように微生物を形質転換させることができる新規なＤＮＡ構築物を提供する。このようにして形質転換された微生物及び該微生物を含むワクチン組成物を更に提供する。本発明の好ましい構築物は、ヒト又は動物腸環境に自身を定着する能力を保持しながらＹ．ｐｅｓｔｉｓタンパク質又はその防御エピトープ断片を発現するように微生物を形質転換させ得る。Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ又はＳ．ｔｙｐｈｉのような腸内に生息する生物を形質転換させてＶタンパク質抗原を産生し得る数種の構築物が同定された。

Description

【発明の詳細な説明】 ワクチン組成物 本発明は、生物ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）への感染を予防 するための新規なワクチン及び該ワクチンを含む組成物に関する。特にヒト及び 他の動物で粘膜免疫を誘発することによって腺ペストや肺ペストを予防できる非 経口及び経口活性ワクチンを特に提供する。 Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓはヒトを含む広範な動物でペストを引き起こ す非常に有毒な生物である。上記生物への感染による死亡率は高い。このビルレ ンス（毒力）の高さは、染色体及び３種のプラスミドの両方によってコードされ る因子（例えばＬｃｒ遺伝子（Ｓｔｒａｌｅｙ，１９９１を参照されたい）、フ ィブリノリシン(Ｓｏｄｅｉｎｄｅ ＆ Ｇｏｇｕｅｎ，１９８８)及びカプセル ）が複雑に配列していることにあることが研究により判明している。 ヒトは疾病の自然のサイクル中に宿主となることがあり、感染したノミに食わ れると、局部リンパ節の腫脹を特徴とする腺ペストにかかることがある。腺ペス トの合併症の一つは二次性肺ペストであり、このような場合、疾病は空気によっ て運ばれる飛沫によってヒトの間で容易に伝播する。 ペストは北アメリカ、南アメリカ、アフリカ、中国及びアジアの地域では風土 病である(Ｂｕｔｌｅｒ(１９８３)「Ｐｌａｇｕｅ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｙｅｒ ｓｉｎｉａ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ」；Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙ ｏｒｋを参照されたい)。現在の大発生は第四の世界的汎流行病の一部であると 考えられ、明らかに風土病地域の居住者又は旅行者あるいは細菌を取扱う研究者 を防御する必要がある。 ペスト予防のために現在市販されている全細胞ワクチンは異種性が高いために 副作用があり、広範囲での使用には適さない（Ｒｅｉｓｍａｎ（１９７０）；Ｍ ｅｙｅｒ等（１９７４）；Ｍａｒｓｈａｌｌ等（１９７４））。 既存のペストワクチンのひとつは、ホルムアルデヒドで死滅させたペスト菌を 含んでいるＣｕｔｔｅｒワクチンであり、筋肉内注射によって体内に投与される 。しかしながら、非経口免疫感作は全身免疫を誘発するのには効果的であるが、 粘膜免疫の誘発には効果的ではない(ＭｃＧｈｅｅ等(１９９２)Ｖａｃｃｉｎｅ １０，７５−８８)。 今のところ、粘膜表面に防御免疫応答を生じ得るワクチンは報告されていない。 弱毒生ワクチン（Ｍｅｙｅｒ等、上掲）ＥＶ７６は、旧ソビエト連邦で１９３ ９年から徹底的に試験が行われて使用に供されているが、ヒトでの免疫応答誘発 に対する効果は疑問視されている（Ｍｅｙｅｒ等（１９７４）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ ．Ｄｉｓ．１２９ Ｓｕｐｐ：１３−１８）。ＥＶ７６のビルレンスは幾つかの 動物種で異なり、非ヒト霊長類は特にこの株に慢性感染しやすいことが判明して いる。西側世界では、このワクチンは副作用が極めて重篤であり、また株がまた 十分なビルレンスをもつように戻る可能性があるために、集団予防接種には適さ ないと考えられている。 数種の公知のＹ．ｐｅｓｔｉｓ抗原の１種は、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ、Ｙ．ｐｓｅ ｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ及びＹ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａの約７ ０ｋｂＬｃｒプラスミド上でコードされる不安定な３７．３ｋＤａモノマーペプ チドのＹ．ｐｅｓｔｉｓ ＬｃｒＶ（Ｖ抗原）である。上記プラスミドは、２． ５ｍＭ未満のＣａ²⁺の存在下、３７℃で生物の増殖制限を媒介する。このような 状況では、細胞は嵩高な植物性タンパク質を合成できないが、一連のストレスタ ンパク質及びビルレンス因子は 発現される。この応答は「低カルシウム応答」として公知である。ｌｃｒＶ遺伝 子が非極性突然変異すると、Ｃａ²⁺の要求が低下することが判明しており、その 結果無毒になり（Ｐｒｉｃｅ等（１９９１）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７３， ｐｐ２６４９−２６５７）、従ってＶ抗原はビルレンス因子として作用すると仮 定される。 部分精製Ｖ抗原に対して産生されたウサギ抗血清を用いれば、後で１００ Ｌ Ｄ₅₀ Ｙ．ｐｅｓｔｉｓを腹腔内にチャレンジしたマウスで受動的防御が働くこ とが判明した（Ｌａｗｔｏｎ等（１９６３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９１，ｐｐ１ ７９−１８４を参照されたい）。Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ Ｖ抗原に対して産生された 単一特異性抗血清が細菌の非経口チャレンジを受動的に防御することが判明した ときにそれがビルレンス因子であり得る（Ｕｎｅ及びＢｒｕｂａｋｅｒ（１９８ ４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３ｐｐ ２２２６−２２３０）ことが、またＶ断 片とプロテインＡとの融合タンパク質に対して産生された抗体で受動免疫が得ら れる（Ｕｎｅ等（１９８７）Ｃｏｎｔｒｉｂ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎ ｏｌ．９，１７９−１８５）ことが確定された。 最近、組換えＶ抗原又はプロテインＡ／Ｖ又は抗原融合物（ＰＡＶ）に対して 産生されたポリクローナル抗血清もＹ．ｐｅｓｔｉｓ ＫＩＭを部分的に防御す ることが実証された（Ｍｏｔｉｎ等（１９９４）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６ ２．ｐｐ４１９２−４２０１を参照されたい）。抗血清を切頭型ＰＡＶで吸収す ることによって、少なくとも１個の防御エピトープがＶ抗原のアミノ酸１６８〜 ２７５の間に位置することが推定された。 ビルレンスでのＶ抗原の役割は不明であるが、Ｎａｋａｊｉｍａ及びＢｒｕｂ ａｋｅｒ（（１９９３）Ｔｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１，ｐ２３−３１）は、 Ｖ抗原が恐らくはサイトカイン合成を阻害することによって免疫抑制的に働いて 、感染器官内への宿主炎症性細胞の浸潤を阻止し得ると示唆していた（Ｕｎｅ等 （１９８７）Ｃｏｎｔｒｉｂ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９，ｐ１ ７９−１８５；Ｓｔｒａｌｅｙ及びＣｉｂｕｌｌ（１９８９）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉ ｍｍｕｎ．５７，ｐ１２００−１２１０）。従って、抗Ｖ抗原血清によって付与 される受動防御は、上記免疫抑制活性を相殺したことによるものであろう(Ｎａ ｋａｊｉｍａ及びＢｒｕｂａｋｅｒ(１ ９９３)上掲)。 Ｖ抗原がＹ．ｐｅｓｔｉｓのビルレンスに関与し得ることが最初に証明されて から約３０年が経過したが、Ｖ抗原を主成分とするワタチンが経口又は非経口投 与に適していようとも又は粘膜免疫を付与する目的に適していようとも使用され たという報告はない。 今回、本発明者らは、微生物を経口又は非経口経路で投与したときにヒト又は 動物体内でＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓに対する防御免疫応答を生ずるＶ抗 原由来のペプチド又はＶ抗原自体を発現できるように、微生物（特にヒト又は動 物腸内にコロニーを形成する微生物）のＤＮＡ内に組み込まれたときに該微生物 を形質転換させ得る組換えＤＮＡ構築物を提供する。本発明では好ましくは、微 生物がヒト又は動物腸内にコロニーを形成して全身を冒す能力を維持しつつ該微 生物を形質転換させる上記ＤＮＡ構築物を提供する。 更には、微生物を経口又は非経口経路で投与したときにヒト又は動物体内でＹ ｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓに対する防御免疫応答を生ずるタンパク質を発現 できるようにヒト又は動物腸内にコロニーを形成する微生物を形質転換 させ得る上記構築物を含んでいるプラスミドを提供する。該プラスミドも好まし くは微生物がヒト又は動物腸内にコロニーを形成して全身を冒す能力を維持させ 得る。 更には、微生物を経口又は非経口経路で投与したときにヒト又は動物体内でＹ ｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓに対する防御免疫応答を生ずるタンパク質を発現 できるように本発明の組換えＤＮＡ又は該組換えＤＮＡを含むプラスミドで形質 転換され、好ましくはヒト又は動物腸内でのコロニー形成能力を維持し得るヒト 又は動物腸内にコロニーを形成する微生物を提供する。 特に好ましい組換えＤＮＡ、プラスミド、又はヒトもしくは動物腸内にコロニ ーを形成する微生物は、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓの成熟Ｖタンパク質の 全てを又は防御エピトープ部分をコードするか又は発現する。特に好ましい組換 えＤＮＡは、好ましくはＳａｌｍｏｎｅｌｌａで発現及び複製を行い得るベクタ ー内に、更に好ましくはｌａｃｚ又はｎｉｒβのようなプロモーターと共にフレ ーム内に位置する配列番号１又は配列番号３に記載のＤＮＡ配列を含んでいる。 本発明の好ましい構築物では、経口投与したときに腸関 連リンパ様組織（ＧＡＬＴ）の局部刺激を誘発し、またリンパ球を共通の粘膜免 疫系内に通過させることによって気管支関連リンパ様組織（ＢＡＬＴ）を二次刺 激して、呼吸器粘膜表面で分泌性ＩｇＡ応答を生ずる微生物を作出することがで きる。 本発明のＤＮＡをベクター方式又は直接挿入方式で用いた形質転換によって得 られる微生物は弱毒化されていることが好ましく、弱毒サルモネラ菌であれば更 に好ましい。Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのような弱毒微生物は種々の異種抗原 用キャリヤーとして十分に特徴付けられている（Ｃｕｒｔｉｓｓ（１９９０）； Ｃａｒｄｅｎａｓ及びＣｌｅｍｅｎｔｓ（１９９２））。弱毒化は幾つかの方法 で、例えばａｒｏ Ａ及び／又はａｒｏ Ｃ突然変異法を用いて行われ得る（Ｈ ｏｓｉｅｔｈ等（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９１，２３８−２３９；Ｄｏｕｇ ａｎ等（１９８６）Ｐａｒａｓｉｔｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９，１５１−１６０； Ｃｈａｔｆｉｅｌｄ等（１９８９）Ｖａｃｃｉｎｅ ７，４９５−４９８を参照 されたい）。Ｈｏｎｅ等（１９９１）Ｖａｃｃｉｎｅ ９，ｐｐ８１０−８１６ に記載のａｒｏ Ａ及びａｒｏ Ｃ突然変異体のような多 重突然変異を使用してもよい。しかしながら、適当に欠陥はあるが、意図する用 途には安全な生物を使用してもよい。 上記微生物や他の微生物については、該微生物を、腸内でのワクチンタンパク 質の発現及び／又はＹ．ｐｅｓｔｉｓについて処置すべき動物の腸内コロニー形 成のための本発明の構築物による形質転換に適したものとする他の多くの弱毒欠 失や突然変異が知られている。ヒトへのワクチン接種のために、本発明の構築物 を含んでいるベクターが弱毒Ｓ．ｔｙｐｈｉ内に置かれ、該形質転換生物が経口 生ワクチン用の活性剤として使用される。 本発明のＤＮＡを使用して弱毒微生物を微生物ＤＮＡ内への直接挿入によって 形質転換するときは、遺伝子内への直接の組み込みによって行われ得る。あるい は、Ｖタンパク質又はそのエピトープ断片を発現するプラスミドの形態で組み込 むときは、Ｖタンパク質もしくは断片のみが発現されるか又はこれが別のタンパ ク質もしくはペプチド断片との融合ペプチドとして発現されるように行われ得る 。このような別のタンパク質又はペプチド断片は細胞膜を通じて成熟タンパク質 又はペプチドの輸送（ｅｘｐｏｒｔ）を促進するようなものであってもよいし、 別のＹ．ｐｅｓ ｔｉｓ抗原であってもよい。 ｌｃｒ遺伝子はＰｒｉｃｅ等によってＹ．ｐｅｓｔｉｓ株ＫＩＭからクローニ ングされ、そのヌクレオチド配列はＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ（１９８９）１７１ ，ｐｐ５６４６−５６５３に発表されている。以下の実施例では、この情報を使 用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてＹ．ｐｅｓｔｉｓ（ＧＢ株） 由来の遺伝子を増幅させることのできるオリゴヌクレオチドプライマーを設計し た。ＰＣＲプライマーは、ｌｃｒＶ遺伝子の５’及び３’末端に隣接するだけで なく、増幅ｌｃｒＶ遺伝子のプラスミドベクター内への指向的クローニングを可 能にする制限酵素認識部位を含んだ５’末端尾を有する各配列に相補的になるよ うに設計された（ＥｃｏＲＩ部位を含む５’プライマー及びＳａｃＩ部位を含む ３’プライマー）。 以下の実施例では、本発明の構築物はｌａｃプロモーターを含んでいるが、マ クロファージプロモーター（ｎｉｒβ）のような他のプロモーターを使用しても よい。 以下の配列表、図面及び実施例を参照して、本発明の方法、構築物、微生物及 びワクチンを例示的に説明する。以下の内容により、当業者には別の実施態様が 自明であろう。 配列表： 配列番号１：本発明のＤＮＡのヌクレオチド及び誘導アミノ酸配列を、遺伝子が ５’末端では（５’末端ＰＣＲプライマーに由来する）配列ＧＡＡＴＴＣのＥｃ ｏＲＩ部位を用いて、３’末端では（３’末端ＰＣＲプライマーに由来する）配 列ＧＴＣＧＡＣのＳａｌＩ部位を用いてクローニングされるベクターｐＭＡＬ− ｐ２又はｐＭＡＬ−ｃ２の最後の６塩基と共に示す。１００６位の塩基はＳＤＭ で改変してＴとし、第２のインフレーム終結コドンを設けた。配列開始は因子Ｘ ａ開裂部位である。 配列番号２：本発明のＤＮＡによって発現されるペプチドのアミノ酸配列を、Ｎ 末端でベクター（Ｉ及びＳ）によってコードされる２個のアミノ酸と共に示す。 配列番号３：本発明の第２のＤＮＡのヌクレオチド及び誘導アミノ酸配列を、遺 伝子が５’末端では配列ＧＡＡＴＴＣ（５’末端ＰＣＲプライマーに由来するＧ Ａ）のＥｃｏＲＩ部位を用いて、３’末端では配列ＧＴＣＧＡＣ（３’末端ＰＣ Ｒプライマーに由来するＧＴＣＧＡＣ）のＳａｌＩ部位を用いてクローニングさ れるベクターｐＧＥＸ−５Ｘ−２の最後の１０塩基と共に示す。１００６位の塩 基は ＳＤＭで改変して、第２のインフレーム終結コドンを設けた。１６位の塩基はＡ からＣに改変して、ＥｃｏＲＩ部位を設けた。配列開始は因子Ｘａ開裂部位であ る。 配列番号４：本発明の第２のＤＮＡによって発現されるペプチドのアミノ酸配列 を、Ｎ末端でベクター（Ｇ、Ｉ、Ｐ及びＧ）によってコードされる４個のアミノ 酸と共に示す。実施例 ＤＮＡ操作。Ｍａｒｍｕｒの方法により染色体ＤＮＡをＹ．ｐｅｓｔｉ ｓから単離した。遺伝子の５’及び３’末端に由来する配列と相同な１２５ｐｍ ｏｌのプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、Ｖ抗原（ｌ ｃｒＶ）をコードする遺伝子をＹ．ｐｅｓｔｉｓ ＤＮＡから増幅させた（Ｐｒ ｉｃｅ等（１９８９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７１ ｐ５６４６−５６５３ を参照されたい）。 ５’プライマー（Ｖ／５’Ｅ：ＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣＡＴＴＡＧＡＧＣＣＴＡ ＣＧＡＡＣＡＡ）及び３’プライマー（ＧＧＡＴＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＡＴＡ ＡＴＴＡＣＣＴＣＧＴＧＴＣＡ）の配列は更に、それぞれ制限部位ＥｃｏＲＩ及 びＳａｌＩをコードする５’領域を含んでいた。更には、増幅遺伝子が余分の終 結コドン（ＴＡＡ）をコー ドするように、発表されたＩｃｒＶ配列（Ｐｒｉｃｅ等，１９８９）から１個の ヌクレオチド（＊）を改変させた。ＤＮＡシンセサイザー（３９２ Ａｐｐｌｉ ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でＰＣＲプライマーを調製した。３０サイクルの 増幅（９５℃で２０秒、４５℃で２０秒、７２℃で３０秒：Ｐｅｒｋｉｎ ９６ ００ ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ）の後にＤＮＡ断片を得た。断片 を精製し、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで消化し、適切に消化されたプラスミドｐＧ ＥＸ−５Ｘ−２と連結させた。 増幅ｌｃｒＶ遺伝子を３個の異なるプラスミドベクター内にクローニングした 。実施例１： ｐＭＡＬ−ｐ２：マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）との融合産物としてク ローン化遺伝子を発現するように設計されたベクター。ＭＢＰのＣ末端をＶ抗原 のＮ末端に融合する。このように発現によって産生された融合タンパク質をペリ プラスムに輸送する。Ｖ抗原ＤＮＡ配列を含んでいるベクターをｐＶＭＰ１００ と名付けた。実施例２： ｐＭＡＬ−ｃ２：ＭＢＰ−Ｖ抗原融合タンパク質が細胞 質で発現されることを除いてｐＭＡＬ−ｐ２と同様のベクター。組換えプラスミ ドはｐＶＭＣ１００と名付けた。実施例３： ｐＧＥＸ−５Ｘ−２：グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との 融合タンパク質としてクローン化遺伝子を発現するように設計されたベクター。 ＧＳＴのＣ末端をＶ抗原のＮ末端と融合し、この融合タンパク質を細胞質で発現 させる。組換えプラスミドはｐＶＧ１００と名付けた。 全てのベクターはＰ_tacプロモーター及びｌａｃＩ^Q遺伝子を含んでいる。後者 は、ＩＰＴＧが付加されるまでＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内でのＰ_tac からの転写を停止させるｌａｃレプレッサーをコードする。プラスミドはｐＢＲ ３２２由来の複製源を含んでおり、結果として細菌細胞内に少ないコピー数で複 製する。外来抗原の発現用生ワクチンベクターとして広く使用されてきた弱毒株 であるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株ＳＬ３２６１内に各組 換えプラスミドをエレクトロポレートした。これは、ａｒｏＡ遺伝子内に特異欠 失突然変異を含んでいるため、突然変異体は増殖用のある種の芳香族に 依存する（Ｈｏｓｉｅｔｈ等を参照されたい）。ヒトワクチン接種用途に適した 微生物を作出するために、弱毒Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ内にエレクト ロポレートする。 Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ培養物のウエスタンブロッティング及びＲ Ｂｒ ｕｂａｋｅｒ，Ｄｅｐｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｓｔ ａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｅａｓｔ Ｌａｎｓｉｎｇ，ＭＩ ４８８２４ −１１０１，ＵＳＡから入手した単一特異性抗Ｖ抗原ポリクローナル抗血清によ るプロービングによって分かるように、組換えプラスミドは全てＶ抗原を発現し た。組換えＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを５×１０⁷ｃｆｕ／用量でマウスの静 脈内に接種すると、肝臓及び脾臓において高レベルでコロニーが形成されること が判明した。器官当たり８×１０⁶〜５×１０⁸ｃｆｕが回収された。回収した細 菌細胞の大半は更にアンピシリン耐性であり、このことは組換えプラスミドが保 持されていることを示していた。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年４月２２日 【補正内容】３４条補正 請求の範囲 １．細胞膜を通じて成熟タンパク質もしくはペプチドの輸送を促進し得るか又は 別のペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）抗原であるペプチド又はタン パク質に融合し、ヒト又は動物体内でペスト菌(Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉ ｓ)に対する防御免疫応答を生じ得るペスト菌(Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ )のＶ抗原又はその免疫原性断片もしくは誘導体を含んでいるペプチドをコード する組換え核酸。 ２．マルトース結合タンパク質又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに融 合したペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）のＶ抗原又はその免疫原性 断片をコードする請求項１に記載の組換え核酸。 ３．経口ワクチンの製造に使用される、ヒト又は動物体内でペスト菌（Ｙｅｒｓ ｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）に対する防御免疫応答を生じ得るペスト菌（Ｙｅｒｓ ｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）のＶ抗原又はその免疫原性断片もしくは誘導体をコー ドする核酸。 ４．配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列をコー ドする請求項１から３のいずれか一項に記載の核酸。 ５．請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸を組み込んでいるプラスミド。 ６．配列番号１又は配列番号３に記載したＤＮＡ配列を含んでいる請求項５に記 載のプラスミド。 ７．Ｖ抗原の全て又は一部分をコードする配列と共にフレーム内にｌａｃプロモ ーター又はｎｉｒβプロモーターを含んでいる請求項５又は６に記載のプラスミ ド。 ８．ｐＭＡＬ−２、ｐＭＡＬ−ｃ２又はｐＧＥＸ−５Ｘ−２ベクターを含んでい る請求項７に記載のプラスミド。 ９．ワクチンとして使用するための、ヒト又は動物体内でペスト菌（Ｙｅｒｓｉ ｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）に対する防御免疫応答を生じ得るペスト菌（Ｙｅｒｓｉ ｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）のＶ抗原又はその免疫原性断片もしくは誘導体をコード する核酸配列を含んでいる組換え微生物。 １０．請求項５から８のいずれか一項に記載のプラスミドで形質転換された微生 物。 １１．ヒト又は動物腸内にコロニーを形成し得る請求項９又は１０に記載の微生 物。 １２．ヒト全身を冒し得る請求項９から１１のいずれか一 項に記載の微生物。 １３．ヒト又は動物に発病させることができない弱毒微生物からなる請求項９か ら１２のいずれか一項に記載の微生物。 １４．Ａｒｏ Ａ又はＡｒｏ Ｃ突然変異体である請求項９から１３のいずれか 一項に記載の微生物。 １５．サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）からなる請求項９から１４のいずれ か一項に記載の微生物。 １６．ネズミチフス菌(Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ)又はチ フス菌(Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ)からなる請求項１５に記載の微生物 。 １７．請求項９から１６のいずれか一項に記載の微生物と医薬的に許容可能なキ ャリヤーとを含んでなるワクチン。 １８．経口投与に適している請求項１５に記載のワクチン。 １９．ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）予防ワクチンの製造での請 求項９から１６のいずれか一項に記載の微生物の使用。 ２０．ヒト又は動物に免疫有効量の請求項１７に記載のワクチンを投与すること からなるペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）に対する予防効果を発生 させる方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:42） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ウイリアムソン，エテル・ダイアン イギリス国、ウイルトシヤー・エス・ピ イ・４・０・ジエイ・キユー、サリスベリ ー、デイー・エム・デイー シー・ビイ・ デイー・イー ポートン・ダウン （番地 なし) (72)発明者 リアリー，ソフイー・エマ・クレアー イギリス国、ウイルトシヤー・エス・ピ イ・４・０・ジエイ・キユー、サリスベリ ー、デイー・エム・デイー シー・ビイ・ デイー・イー ポートン・ダウン （番地 なし)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．微生物を経口経路で投与したときにヒト又は動物体内でＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓに対する防御免疫応答を生ずるペプチド又はタンパク質を発現でき るように、微生物のＤＮＡ内に組み込まれたときに該微生物を形質転換させるこ とができ、ペプチド又はタンパク質が、防御免疫応答を誘発し得るエピトープを 有するＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ Ｖ抗原又はその断片を含んでいること を特徴とする組換えＤＮＡ。 ２．微生物を経口経路で投与したときにヒト又は動物体内でＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓに対する防御免疫応答を生ずるペプチド又はタンパク質を発現でき るように微生物を形質転換させることができ、請求項１に記載のＤＮＡを含んで いることを特徴とするプラスミド。 ３．経口経路で投与したときにヒト又は動物体内でＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔ ｉｓに対する防御免疫応答を生ずるペプチド又はタンパク質を発現できるように 組換えＤＮＡ又は該組換えＤＮＡを含むプラスミドで形質転換され、組換えＤＮ Ａ又はプラスミドが請求項１又は２に記載した通りであることを特徴とする微生 物。 ４．ヒト又は動物腸内にコロニーを形成する微生物であることを特徴とする請求 項３に記載の微生物。 ５．形質転換微生物がヒト又は動物腸内にコロニーを形成して全身を冒す能力を 維持している請求項１から４のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡ、プラスミド 又は微生物。 ６．配列番号１又は配列番号３に記載したＤＮＡ配列を含んでいる組換えＤＮＡ 。 ７．配列番号１又は配列番号３に記載したＤＮＡ配列を含んでいることを特徴と する請求項１から６のいずれか一項に記載のプラスミド。 ８．Ｖ抗原の全て又は一部分をコードする配列と共にフレーム内にｌａｃプロモ ーター又はｎｉｒβプロモーターを含んでいることを特徴とする請求項２又は８ に記載のプラスミド。 ９．防御免疫応答を誘発し得るエピトープを有するＶ抗原又はその断片をコード するＤＮＡ配列が挿入されたｐＭＡＬ−ｐ２、ｐＭＡＬ−ｃ２又はｐＧＥＸ−５ Ｘ−２ベクターを含んでいることを特徴とする請求項９に記載のプラスミド。 １０．配列番号１又は配列番号３に記載したＤＮＡ配列を 含む組換えＤＮＡを含んでいる請求項３又は４に記載の微生物。 １１．請求項７から９のいずれか一項に記載のプラスミドを含んでいる請求項３ 又は４に記載の微生物。 １２．ヒト又は動物に発病させることができない弱毒微生物である請求項３、４ 、１０又は１１に記載の微生物。 １３．Ａｒｏ Ａ又はＡｒｏ Ｃ突然変異体である請求項３、４、１０又は１１ に記載の微生物。 １４．Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａである請求項１２又は１３に記載の微生物。 １５．Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ又はＳａｌｍｏｎｅｌｌ ａ ｔｙｐｈｉである請求項１４に記載の微生物。 １６．請求項３、４、１１から１５のいずれか一項に記載の微生物と医薬的に許 容可能なキャリヤーとを含んでなるワクチン。 １７．請求項１から１６のいずれか一項に記載し、実施例１に記載する組換えＤ ＮＡ、プラスミド、微生物又はワクチン。