DE69529405T2 - Pd-ecgf / thymidin phosphorylase spezifischer monoklonaler antikörper - Google Patents

Pd-ecgf / thymidin phosphorylase spezifischer monoklonaler antikörper

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Description

    Technisches Gebiet:
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf monoklonale Antikörper, die brauchbar sind zum Nachweis menschlicher Thymidin-Phosphorylase und den endothelialen Zellwachstums-Faktor von Thrombozyten (PD-ECGF), d. h., zum Überwachen einer Vielfalt von Tumoren, Erkrankungen mit abnormaler Angiogenese, wie Metastasen von Tumoren, rheumatischer Arthritis, diabetischer Retinitis, Cataracta immatura, seniler Maculadegeneration usw., durch Diagnose und Behandlung ebenso wie für den Einsatz in Arzneimittel-Abgabesystemen für Medizin usw.
    • Technischer Hintergrund:
  • Thymidin-Phosphorylase ist ein Enzym, das wesentlich ist für den Metabolismus von Thymidin und von dem berichtet wurde, dass es seine Aktivitäten in verschiedenen Geweben (Leber, Lungen, Dünndarm, Dickdarm, Placenta usw.) von Menschen und Tieren manifestiert [J. Natl. Cancer Inst., 58, 1587-1590 (1977)]. Es wurde auch berichtet, dass Thymidin-Phosphorylase einen höheren Grad der Aktivität in verschiedenen malignen Tumoren als in normalem Gewebe zeigt [Chem. Pharm. Bull., 34, 4225-4232 (1986)]. Wegen dieses Merkmals ist Thymidin-Phosphorylase ein Zielenzym für ein Antikrebsmittel.
  • Es wurde auch berichtet, dass die Aktivität von PD-ECGF erhöht wird, wenn eine abnormale Angiogenese auftritt, verglichen mit normalem Gewebe [Nature, 338, 557-562 (1989)], was PD-ECGF zu einer Markierung von Krankheiten macht, die eine abnormale Angiogenese begleiten.
  • Kürzlich wurde berichtet, dass menschliche Thymidin-Phosphorylase genetisch identisch PD-ECGF ist [Nature, 338, 557-562 (1989), Nature, 356, 668 (1992) und J. Biochem., 114, 9-14 (1993)]. Die Messung der Thymidin-Phosphorylase-Aktivität und der PD- ECGF-Aktivität ist brauchbar bei der Diagnose nicht nur maligner Tumoren sondern auch bei Erkrankungen mit abnormaler Angiogenese, wie rheumatischer Arthritis, diabetischer Retinitis, Cataracta immatura, seniler Maculadegeneration usw.
  • EP-0 377 855 A2 offenbart Antikörper gegen natürliche oder rekombinante PD- ECGF voller Länge, die zum Identifizieren von PD-ECGF durch Immunoblot-Analyse für wissenschaftliche Zwecke benutzt wird.
  • Konventionell wurden Aktivitäten menschlicher Thymidin-Phosphorylase und von PG-ECGF durch deren Messung in Gewebe bestimmt. Es müssen daher die Exzision erforderlicher Mengen von Gewebe und die Fraktionierung einer rohen enzymatischen Flüssigkeit ausgeführt werden, was mühsame Handhabungs-Techniken erfordert. Außerdem kann ein detaillierter Vergleich auf dem interzellularen Niveau nicht durch konventionelle Verfahren ausgeführt werden, was ein großes Problem bei sowohl den praktischen als auch Genauigkeits-Aspekten erzeugt.
    • Offenbarung der Erfindung:
  • Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein einfaches, weit anwendbares und praktisches Mittel bereitzustellen, das die spezifische Messung von Thymidin-Phosphorylase/PD-ECGF ermöglicht.
  • Die Erfinder haben sorgfältige Untersuchungen ausgeführt, erzeugten monoklonale Antikörper unter Einsatz gewisser Peptide in menschlicher Thymidin-Phosphorylase und PD-ECGF-Protein als Immunogene und stellten fest, dass sie spezifisch menschliche Thymidin-Phosphorylase und PD-ECGF erkennen und somit brauchbar sind für die Diagnose verschiedener Krankheiten, die eine erhöhte Aktivität der menschlichen Thymidin- Phosphorylase und des PD-ECGF begleiten. Die vorliegende Erfindung wurde auf dieser Feststellung gemacht.
  • Die vorliegende Erfindung schafft demgemäß ein Verfahren und eine Ausrüstung unter Einsatz eines monoklonalen Antikörpers, der erhältlich ist durch Immunisieren mit einem Fusionsprotein, bestehend aus SEQ ID Nr. 1 und Glutathion-S-Transferase (GST) oder bestehend aus SEQ ID Nr. 2 und GST, wobei der Antikörper selektiv mit menschlicher Thymidin-Phosphorylase (menschlichem PD-ECGF) reagiert.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnung
  • Fig. 1 ist eine Karte, die Profile der Reaktions-Spezifität monoklonaler Antikörper nach der vorliegenden Erfindung zeigt.
  • Fig. 2 ist eine Karte, die Resultate des Vergleichs in der Expression zwischen menschlichem Brustkrebsgewebe, das mit einem monoklonalen Antiköper nach der vorliegenden Erfindung reagiert, und seinem benachbarten normalen Gewebe (3 Fälle) zeigt.
  • Fig. 3 ist eine Fotographie, die das Resultat der immunhistochemischen Färbung eines Gewebeschnittes von einem gesunden menschlichen Dickdarmgewebe zeigt, mit dem ein monoklonaler Antiköper nach der vorliegenden Erfindung spezifisch reagiert.
  • Fig. 4 ist eine Fotographie, die das Resultat der immunhistochemischen Färbung eines Gewebeschnittes von menschlichem Dickdarm-Krebsgewebe zeigt, mit dem ein monoklonaler Antiköper nach der vorliegenden Erfindung spezifisch reagiert.
    • Beste Art der Ausführung der Erfindung
  • Das Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die in Sequenz Nr. 1 beschrieben ist, bildet einen Teil menschlicher Thymidin-Phosphorylase ebenso wie das Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die in Sequenz Nr. 2 beschrieben ist.
  • Die monoklonalen Antiköper der vorliegenden Erfindung können, z. B., hergestellt werden durch Züchten von Klonen, die Antiköper erzeugen, die menschliche Thymidin- Phosphorylase erkennen.
  • Solche Klone werden erhalten unter Einsatz eines konventionellen Zellfusions- Verfahrens, d. h., der Bildung von Fusionshybriden zwischen Antiköper produzierenden Zellen und Myelomzellen, Klonen der Hybride und Auswählen von Klonen, die Antiköper erzeugen, die menschliche Thymidin-Phosphorylase erkennen.
  • Beispiele der hier eingesetzten Antiköper erzeugenden Zellen schließen Milzzellen, Lymphknotenzellen und B-Lymphozyten ein, die alle von Tieren erhalten werden, die immunisiert wurden, indem man als Antigene Fusionsproteine benutzte, die aus der Aminosäuresequenz der Sequenz Nr. 1 oder 2 und GST bestehen.
  • Die Antiköper erzeugenden Zellen werden nach Routine-Verfahren hergestellt. So wird, z. B., ein Antigen zuerst in einem vollständigen oder unvollständigen Freunds Adjuvans emulgiert, um eine Antigen-Suspension zu erhalten. Unmittelbar danach wird die Suspension subcutan oder intraperitoneal alle 2 bis 3 Wochen mehrere Male (vorzugsweise dreimal) in ein Tier injiziert, wodurch das Tier immunisiert wird. Beispiele immunisierter Tiere schließen Mäuse, Ratten, Pferde, Ziegen, Kaninchen usw. ein. Drei bis fünf Tage nach der Endimmunisierung, ausgeführt durch intravenöse Verabreichung von Antigen, werden Antigen produzierende Zellen, wie Milzzellen, aus dem immunisierten Tier gewonnen.
  • Als die Myelom-Zellen werden solche benutzt, die von Mäusen, Ratten und Menschen gewonnen sind. Vorzugsweise werden Myelom-Zellen benutzt, die von dem gleichen Tier stammen, von dem die Antigen erzeugenden Zellen gewonnen sind. So können, z. B., als ein Fusions-Gegenstück murine Milzzellen, murine Myelomzellen, wie P3UI und SP-2/O-Ag14 IlNature, 277, 131-133 (1979)], benutzt werden.
  • Die Fusion der Zellen erfolgt nach einem Verfahren, das in Nature 256, 495-497 (1975) beschrieben ist, oder dem von Ueda et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 5122- 5126 (1981) beschriebenen Verfahren oder seinem äquivalenten Verfahren. Allgemein wird 30-50% Polyethylenglykol (mittleres Molekulargewicht: 1000-4000) in einer Fusions-Reaktion eingesetzt, und die Reaktion findet bei 30-40ºC für 1-3 Minuten statt. Bevorzugter werden 30-50% Polyethylenglykol (mittleres Molekulargewicht: 4000) in einer Fusions- Reaktion eingesetzt und die Reaktion findet bei 37ºC für 1-3 Minuten statt.
  • Die durch Zellfusion erhaltenen Hybridome werden einer Züchtung in, z. B., einer Mikroplatte unter Einsatz eines HAT-Mediums (Basalmedium, enthaltend Hypoxanthin 100 uM, Aminopterin 0,4 uM, Thymidin 16 uM) oder einem ähnlichen Medium unterworfen, woraufhin die gezüchteten Zellen ausgewählt werden. Die ausgewählten Hybridome werden einem Antigen-Bindeassay und dann einem Klonen unterworfen.
  • Kurz gesagt, wird der Antigen-Titer des Überstehenden der Bohrungen, in denen das Wachstum der Zellen beobachtet wurde, nach einer Enzym-Antiköper-Technik, wie ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay, M. E. Miller, Lancet, 1, 665 (1971)), unter Einsatz eines Antigen-Peptids als Antigen zum Screenen bestimmt. Danach wird das Klonen unter Benutzung eines beschränkten Verdünnungs-Verfahrens ausgeführt, wobei Klone erhalten werden.
  • Werden die so erhaltenen Klone wie gewöhnliche Tierzellen gezüchtet, dann werden die monoklonalen Antiköper der vorliegenden Erfindung im Medium erzeugt. Da diese Klone, wenn sie intraperitoneal in eine Balb/c Maus implantiert werden, der vorher 0,5 ml Pristan verabreicht worden sind, Aszites erzeugen, die hohe Niveaus monoklonaler Antiköper am Tage 7-14 enthält, können die monoklonalen Antiköper auch aus Aszites gewonnen werden.
  • Die monoklonalen Antiköper können aus der Kulturmischung oder Ascites, die die Klone enthält, durch die Anwendung eines bekannten Verfahrens zur Reinigung von IgG, einschließlich einer Variante der Chromatographie-Verfahren unter Einsatz von Anionenaustauschern, Hydroxyapatit oder immobilisierten Protein A- oder G-Säulen, dem Ammoniumsulfat-Fraktionierungs-Verfahren, dem PEG-Fraktionierungs-Verfahren, dem Ethanol-Fraktionierungs-Verfahren oder einem hypotonischen Puffer-Ausfällungsverfahren, gewonnen werden.
  • Van den so erzeugten monoklonalen Antiköpern sind die zur Klasse IgG gehörenden bevorzugt.
  • Die durch Einsatz menschlicher Thymidin-Phosphorylase-Fragmente als Antigen erhaltenen monoklonalen Antiköper zeigen geringere Kreuz-Reaktivität gegenüber exogenen Proteinen als Antiköper gegen die Gesamtheit menschlicher Thymidin-Phosphorylase. Werden daher Antiköper gegen menschliche Thymidin-Phosphorylase-Fragmente bei der Diagnose von Krebs eingesetzt, dann kann eine höhere Empfindlichkeit als in dem Falle erhalten werden, bei dem Antiköper gegen die Gesamtheit menschlicher Thymidin-Phosphorylase benutzt werden. Antiköper, die erhalten sind unter Einsatz solcher menschlicher Thymidin-Phosphorylase-Fragmente als Antigen, sind immunologisch reaktiv mit der gesamten menschlichen Thymidin-Phosphorylase.
  • Es ist bekannt, dass jedes der Fv-, Fab- und F(ab')2-Fragmente jedes monoklonalen Antiköpers der vorliegenden Erfindung eine Bindestelle für den Antiköper hat, und dass diese Fragmente die Fähigkeit haben, Antigene wie vollständige Antiköper zu binden. Die Fragmente können leicht durch Fragmentieren von Antiköpern unter Einsatz einer Protease erhalten werden.
  • Diagnostische Ausrüstungen, die Gebrauch von den monoklonalen Antiköpern machen, können mit einer Vielfalt von Nachweisverfahren kombiniert werden, bei denen versucht wird, die Empfindlichkeit der Messung zu vergrößern, z. B. mit dem Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC)-Verfahren in ELISA, dem Streptoavidin-Biotin-Komplex (SBC)-Verfahren oder dem Peroxidase-Antiperoxidase (PAP)-Verfahren usw. Die diagnostische Ausrüstung kann einzeln oder in Kombination mit irgendeinem anderen Diagnostikum eingesetzt werden.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung erkennt spezifisch menschliche Thymidin-Phosphorylase und PD-ECGF und ist somit brauchbar bei der immunochemischen und immunohistologischen Diagnose von Krankheiten, die verstärkte Thymidin-Phosphorylase- und PD-ECGF-Aktivitäten einschließen. Beispiele solcher Krankheiten schlie¬ Ben maligne Tumoren und daraus resultierende Metastasen-Krebserkrankungen, rheumatische Arthritis, diabetische Retinitis, Cataract immatura, senile Maculadegeneration usw. ein. Die Diagnose kann auch unter Einsatz von Körperflüssigkeiten ausgeführt werden, weil die vorliegenden Antigene bei Eintreten des Zelltodes in Körperflüssigkeiten überführt werden. Diagnostische Ausrüstungen, die Verwendung von den monoklonalen Antiköpern machen, können mit einer Vielfalt von Nachweisverfahren kombiniert werden, bei denen versucht wird, die Messempfindlichkeit zu erhöhen, einschließlich dem ABC- Verfahren in ELISA, dem SBC-Verfahren oder dem PAP-Verfahren. Die Diagnose-Ausrüstungen können einzeln oder in Kombination mit irgendwelchen anderen diagnostischen Ausrüstungen benutzt werden.
  • Die monoklonalen Antiköper können auch zum Abbilden von Geweben angewendet werden, z. B. bei Bild gebenden Diagnosen unter Einsatz von mit Indium-III markierten Antiköpern.
  • Gegen maligne Tumore können die monoklonalen Antiköper bei der zielgerichteten Behandlung unter Einsatz von Immunotoxin oder Ähnlichem benutzt werden, beidem Antiköper an die aktive Stelle von Lysin oder Abrin gebunden ist, wie in Cancer Res., 42, 457-464 (1982) berichtet.
  • Die vorliegende Erfindung wird als Nächstes mittels Beispielen beschrieben. Die vorliegende Erfindung ist jedoch auf diese Beispiele nicht beschränkt.
    • Beispiel 1:
  • Herstellung eines bindenden Proteins zwischen der N-endständigen Region und der C-endständigen Region eines Antigens menschlicher Thymidin-Phosphorylase oder von PD-ECGF und Glutathion-Transferase:
  • Ein Fusionsprotein mit GST wurde hergestellt unter Einsatz einer kommerziell erhältlichen Ausrüstung, des GST-Genfusionssystems (Pharmacia). Kurz gesagt erfolgte die Integration in einen Expressionsvektor von E. coli, um ein Fusionsprotein zwischen einem Polypeptid, das sich vom 7. Rest bis zum 250. Rest im N-Ende von menschlicher Thymidin- Phosphorylase/PD-ECGF erstreckte, und GST oder ein Fusionsprotein zwischen einem Polypeptid, das sich vom 353. Rest bis 483. Rest im C-Ende menschlicher Thymidin-Phosphorylase/PD-ECGF erstreckte, und GST zu erhalten.
  • Das resultierende Plasmid wurde in E. coli DH5α eingeführt und in 200 ml einer LB-Mediums-Flüssigkeit gezüchtet, die 100 ug/ml Ampicillin enthielt, bis die Extinktion bei der Wellenlänge von 660 nm 0,6 erreichte. Nach Erreichen der Extinktion von 0,6 wurde Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranosid (IPTG) hinzugegeben. Das Züchten wurde für weitere 3 Stunden fortgesetzt, woraufhin nur E. coli-Zellen durch Zentrifugentrennung gesammelt wurden. Die gesammelten Zellen wurden in einem SDS-Polyacrylsäureamid- Probenpuffer lysiert und die Lösung einer fraktionellen SDS-Polyacrylsäureamid-Elektrophorese unter Einsatz einer Vorrichtung unterworfen, die von Nippon Eido K. K. herge¬ stellt war, um fraktionell ein entsprechendes Protein zu erhalten. Die Ausbeuten betrugen 6,4 mg Antigen für die N-endständige Seite und 5,7 mg Antigen für die C-endständige Seite.
    • Beispiel 2:
  • Klonen von Zellen, die monoklonale Antiköper gegen menschliche Thymidin- Phosphorylase oder PD-ECGF produzieren:
  • Drei 8 Wochen alte weibliche Balb/c-Mäuse (geliefert von Japan CLER K. K.) wurden zuerst mit einem in Beispiel 1 hergestellten bindenden Protein immunisiert, d. h., einem Protein, hergestellt durch Binden der N-endständigen Region oder der C-endständigen Region von Thymidin-Phosphorylase oder PD-ECGF an GST, wobei das bindende Protein in Freunds komplettem Adjuvans suspendiert war. Danach wurden 0,4 m² Lösung, enthaltend 100 ug eines Fusionsproteins, jeder Maus intraperitoneal verabreicht. Am Tage 14 nach der ersten Immunisierung wurde ein in Freunds komplettem Adjuvans gelöstes Fusionsprotein gegeben. Als eine Endimmunisierung wurde am Tage 10 nach der zweiten Immunisierung eine Hilfsimmunisierung intraperitoneal ausgeführt. Vier Tage später wurde die Milz der Maus entfernt. Nach dem graduellen Homogenisieren unter Einsatz von 3 ml eines Wachstumsmediums, wurde die Milz bei 200 g zentrifugiert, um Milzzellen zu sammeln.
  • Die gesammelten Zellen wurden langsam in einem RPMI 1640-Medium (PEG 400- Lösung), enthaltend 50% (Vol./Vol.) Polyethylenglykol (PEG), suspendiert und graduell mit einem RPMI 1640-Medium verdünnt, um die Kozentration von PEG auf 5% (Vol./Vol.) zu bringen. Zellen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt. Ein Wachstumsmedium wurde graduell dispergiert. Zellen wurden in Bohrungen einer Mikrotiterplatte in einer Menge von 10&sup6; Zellen/0,1 ml pro Bohrung ausgesät. Zellen wurden in 5% CO&sub2; bei 37ºC für 2 Minuten inkubiert.
  • In dieser Weise wurden Mäuse-Milzzellen und Myelom-Zellen P3U1 (P3X63Ag8U.1) unter Einsatz einer elektrischen Fusions-Vorrichtung fusioniert.
  • Am ersten Tag nach der Zellfusion wurde 0,1 ml eines HAT-Mediums hinzugegeben. Danach wurde eine Hälfte des HAT-Mediums alle 3 Tage gegen ein frisches HAT- Medium ausgetauscht. Nach 8 Tagen traten Klone auf. Vor dem Ablauf von 10 Tagen wurde das Überstehende einem Festphasen-Antiköper-Bindetest (ELISA) zum Screenen und Prüfen der Produktion von IgG unterworfen.
  • Die positiven Gruppen hinsichtlich der Antikörper-Produktion wurden in einer Platte mit 24 Bohrungen ausgebreitet. Wurde die Zelldichte hoch, dann wurden die Zellen auf eine 25 cm²-Kultur überführt. Während man Hybridome in einem HT-Medium (einem HAT-Medium ohne Aminopterin) hielt, wurde die Antiköper-Produktion überprüft.
  • Um Klone zu erhalten, die mit entweder dem N-Ende oder C-Ende von Thymidin- Phosphorylase oder PD-ECGF spezifisch reagieren, wurde ein Screening unter Anwendung einer ELISA-Technik ausgeführt. Kurz gesagt wurden 50 ul eines unter Einsatz von GST als Antigen hergestellten Fusions-Polypeptids zu jeder Bohrung einer Mikrotiter¬ platte mit 96 Bohrungen für ELISA in einer Konzentration von 10 ug/ml hinzugegeben, woraufhin man die Bohrungen über Nacht bei 4ºC beließ. Danach wurden 200 ul einer kommerziell erhältlichen Blockier-Flüssigkeit (Produkt von Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) zu jeder Bohrung hinzugegeben, und man beließ für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Ein Kultur-Überstehendes der geklonten Hybridom-Zellen wurde hinzugegeben und für 1 Stunde bei 37ºC inkubiert.
  • Mit Peroxidase markierter Anti-Mäuse-IgG-Antiköper (Produkt der Organon Technica) wurde so hinzugegeben, um eine Endkonzentration von 1,0 ug/ml zu erhalten, gefolgt von einer Inkubation bei 37ºC für 1 Stunde. Danach gab man 100 ul einer OPDA/¬ wässerige Wasserstoffperoxid-Lösung hinzu und gestattete den Ablauf einer Reaktion für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Nach Abschluss der Reaktion wurde diese durch die Zugabe von 100 ul 2 N-Schwefelsäure gestoppt. Extinktionen bei 490 nm und 595 nm wurden unter Einsatz eines Mikrotiter-Lesegerätes gemessen. Das Screening wurde auf der Grundlage des Unterschiedes zwischen den beiden erhaltenen Extinktions-Daten ausgeführt. Die Resultate sind in den Tabellen 1 und 2 gezeigt. Tabelle 1 Vom N-endständigen Peptid resultierende Klone
  • Bindeassay unter Einsatz entsprechender Klone, Antigen und PD-ECGF oder Thymidin- Phosphorylase Tabelle 2 Vom C-endständigen Peptid resultierende Klone
  • Als ein Ergebnis wurden 6 Stämme erhalten, die positiv waren für das N-endständige Antigen und 6 Stämme wurden erhalten, die positiv waren für das C-endständige Antigen.
  • Um die bindende Fähigkeit jedes Klons an Thymidin-Phosphorylase/PD-ECGF zu untersuchen, wurde über ELISA ein Screening ausgeführt, wobei nur 1 ug/ml Thymidin- Phosphorylase/PD-ECGF hinzugegeben wurde.
  • Es wurden Klone ausgewählt, die sich selbst an ein Fusionsprotein zwischen GST und der/m N-endständigen Thymidin-Phosphorylase/PD-ECGF banden und die sich auch an Thymidin-Phosphorylase/PD-ECGF banden, um Klone zu erhalten, die sich sowohl an N- oder C-endständiges Peptid als auch Thymidin-Phosphorylase/PD-ECGF sehr gut banden (N-endständiges Klon: 2A4, C-endständiges Klon: 2D9).
    • Beispiel 3:
  • Herstellung von monoklonalem Antiköper gegen Thymidin-Phosphorylase/PD- ECGF durch Zellzüchtung:
  • Antiköper gegen Thymidin-Phosphorylase produzierende Hybridome wurden in einem 75 cm²-Kolben zur Gewebezüchtung unter Einsatz eines RPMI 1640-Mediums, enthaltend 10% (Vol/Vol.) fötales Kalbsserum, 100 mM Pyruvinsäure und 2-Mercaptoethanol, gezüchtet.
  • Nach dem Reinigen der Antiköper wurde ein serumfreies Medium, PUF-1 (Produkt von Gibco), zum Züchten benutzt.
  • In diesem Medium wurden Hybridom-Zellen, die sich bis auf 8 · 10&sup5; Zellen/ml ausgebreitet hatten, durch Zentrifugentrennung bei 200 g für 5 Minuten gewonnen.
  • Das gesammelte Überstehende der Kultur wurde bis zu einem Volumen von nicht mehr als 2 nie unter Benutzung einer PM10-Ultrafiltrationsmembran (Produkt von Amicon) konzentriert, gefolgt vom Filtrieren durch einen Membranfiter von 0,45 um.
  • Die so erhaltene Rohfraktion wurde mit einer gleichen Menge eines Bindepuffers kombiniert, gut vermischt und durch eine Protein A-Säule geschickt, die vorher mit einem Bindepuffer äquilibriert worden war, wodurch IgG an Protein A gebunden wurde. Das gebundene Produkt wurde unter Einsatz von 10 ml eines Bindepuffer gewaschen und daraufhin eine IgG-Fraktion durch Elution des IgG in 3 ml eines Elutions-Puffers gewonnen.
  • Zu 3 ml der resultierenden Fraktion gab man unmittelbar 1 ml 1M Tris-HCl-Puffer (pH 9,0) hinzu, um den pH in die Nähe der Neutralität zurückzuführen. Danach wurde eine Dialyse gegen Phosphat-gepufferte Salzlauge (PBS) über Nacht ausgeführt, und dabei monoklonaler Antiköper-IgG in hoher Reinheit erhalten.
  • Die Unterklassen der erhaltenen Anti-Thymidin-Phosphorylase-Antiköper wurden mittels Enzym-Immunoassay unter Einsatz einer kommerziell erhältlichen Mäuse-monoklonaler Antiköper-Isotyping-Ausrüstung (Produkt von Amersham) bestimmt.
  • Die Unterklassen der Klone sind in Tabellen 3 und 4 gezeigt.
    • Tabelle 3 N-endständige monoklonale Antiköper produzierende Klone
  • Nr. der Klone Unterklassen
  • 1D10 IgG1
  • 1F4 IgG2a
  • 2A4 IgG2b
  • 2A11 IgG2b
  • 2E6 IgG1
  • 3C9 IgG2a
  • Immunoglobulin-Unterklassen der Klone
    • Tabelle 4 C-endständige monoklonale Antiköper produzierende Klone
  • Nr. der Klone Unterklassen
  • 1F3 IgG2a
  • 1F9 IgG1
  • 1H10 IgG2b
  • 2C9 IgG2b
  • 2D9 IgG2b
  • 2H8 IgG3
    • Beispiel 4:
  • Herstellung von monoklonalem Antiköper gegen Thymidin-Phosphorylase/PD- ECGF unter Einsatz von Mäuse-Aszites:
  • Hybridom-Zellen wurden einmal unter Einsatz eines serumfreien RPMI 1640-Mediums gewaschen und dann in einer Konzentration von 1 · 10&sup7; Zellen/ml in RPMI 1640- Medium resuspendiert.
  • Hybridom-Zellen in einer Zahl von 5 · 10&sup6; wurden intraperitoneal jeder nackten Maus, Balbc/nu-nu, verabreicht, und zwei Wochen später wurden aus dem Abdominalhohlraum der Maus monoklonale Antiköper gewonnen.
  • Das gesammelte Aszites wurden einer Zentrifugaltrennung bei 1500 g für 15 Minuten unterworfen und dann durch einen Membranfilter von 0,45 um filtriert.
  • Die so erhaltene Rohfraktion wurde mit einer gleichen Menge eines Bindepuffers kombiniert, gut vermischt und durch eine Protein A-Säule geschickt, die vorher unter Einsatz eines Bindepuffers äquilibriert worden war, wodurch IgG an Protein A gebunden wurde. Das gebundene Produkt wurde unter Einsatz von 10 ml eines Bindepuffers gewaschen und daraufhin eine IgG-Fraktion durch Eluieren des IgG in 3 ml eines Elutions-Puffere gewonnen.
  • Zu 3 ml der resultierenden Fraktion gab man unmittelbar 1 ml 1M Tris-HCl-Puffer (pH 9,0), um den pH in die Nähe der Neutralität zurückzuführen. Danach wurde Dialyse gegen Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) über Nacht ausgeführt und dabei monoklonales Antiköper-IgG in hoher Reinheit erhalten.
  • Die Unterklassen der erhaltenen Anti-Thymidin-Phosphorylase-Antiköper wurden mittels Enzym-Immunoassay bestimmt, wobei eine kommerziell erhältliche Mäuse-monoklonale Antiköper-Isotyping-Ausrüstung (Produkt von Amersham) benutzt wurde. Die Unterklassen der Klone waren identisch den in Beispiel 3 bestimmten.
    • Beispiel 5:
  • Nachweis von Thymidin-Phosphorylase/PD-ECGF durch Immunoblotting:
  • 200 ug eines Rohprotein-Extraktes wurden unter Einsatz von Zellen, normalem Gewebe oder Tumorgewebe zubereitet. Der Extrakt wurde durch SDS-Polyacrylamidgel- Elektrophorese unter Benutzung eines Gradientengels analysiert, das 4%-20% (Gew./Vol.) Acrylamid enthielt. Danach wurde das Protein auf einer kommerziell erhältlichen PYDF- Membran (Produkt von Millipore) transcribiert.
  • Nach dem Blockieren nicht spezifischer Adsorption unter Einsatz von entrahmter Milch wurde der in Beispiel 4 gereinigte Anti-Thymidin-Phosphorylase/PD-ECGF-Antiköper (Klon 2A4) in einer Konzentration von 0,5 ug/ml hinzugegeben. Man ließ die Mischung 1 Stunde lang bei Raumtemperatur und dann über Nacht bei 4ºC stehen.
  • Das eingesetzte Peroxidase-markierte Anti-Mäuse-Immunoglobulin war ein kommerziell erhältliches. Eine Farbentwicklung von Peroxidase wurde unter Benutzung eines ECL-Systems (Amersham) ausgeführt. Die Resultate sind in den Fig. 1 und 2 gezeigt.
  • Fig. 1 zeigt die Resultate des Färbens von N-endständigem Antiköper 2A4 und C- endständigem Antiköper 2D9, die beide in Beispiel 4 hergestellt wurden. Das Fusionsprotein zwischen GST und dem N-endständigen Polypeptid reagierte mit 2A4 spezifisch und das Fusionsprotein zwischen GST und dem C-endständigen Polypeptid reagierte mit 2D9 spezifisch. Beide Antiköper waren reaktionsfähig mit überexprimierten KB-Zellen, erhalten durch Einführen von cDNA von Thymidin-Phosphorylase/PD-ECGF, was klar eine Bande in der Position zeigt, die einer Molekülmasse von 55 kD entspricht.
  • Fig. 2 zeigt die Resultate des Vergleichs zwischen menschlichem Brustkrebs- Gewebe und seinem benachbarten normalen Gewebe (3 Fälle). Aus den Banden bei Positionen, die einer Molekülmasse von 55 kD entsprechen, wird klar, dass die stärkere Expression von Thymidin-Phosphorylase/PD-ECGF in jedem Krebsgewebe statt im Normalgewebe, das rechts angegeben ist, beobachtet wurde.
  • Die Bahnen in Fig. 1 sind Folgende:
  • GST-N; ein Polypeptid, bei dem GST an das N-endständige Peptid von menschlicher Thymidin-Phosphorylase gebunden war,
  • GST-C; ein Polypeptid, bei dem GST an das C-endständige Peptid von menschlicher Thymidin-Phosphorylase gebunden war,
  • KB; ein Zellextrakt von von KB-Zellen und
  • KB-TP; ein Zellextrakt von Zellen, erhalten durch Transfection von KB-Zellen mit cDNA von menschlicher Thymidin-Phosphorylase/PD-ECGF.
    • Beispiel 6:
  • Immunhistologisches Färben von Thymidin-Phosphorylase/PD-ECGF in klinisch erhaltenen menschlichen Gewebeschnitten:
  • Menschliches malignes Tumorgewebe und sein benachbartes normales Gewebe wurden herausgeschnitten und unmittelbar unter Benutzung eines 10%-igen (Vol./Vol.) Formalin-PBS fixiert. Nach dem Belassen bei Raumtemperatur für 24 Stunden wurden die fixierten Gewebe in Paraffin eingebettet und Schnitte mit jeweils einer Dicke von 3 um hergestellt.
  • Nach dem Entparaffinieren der Schnitte wurde ein reiner Thymidin-Phosphorylase-Antiköper (Klon 2A4), gereinigt in Beispiel 4, in einer Konzentration von 1 ug/ml hinzugegeben, gefolgt vom Stehenlassen bei Raumtemperatur für 1 Stunde und dann über Nacht bei 4ºC. Die Schnitte wurden unter Benutzung einer kommerziell erhältlichen Ausrüstung, Funakoshi ABC Elite-Ausrüstung (Produkt von Vektor) gefärbt. Die Resultate sind in den Fig. 3 und 4 gezeigt.
  • Fig. 3 zeigt das negative Resultat des Färbens eines Schnittes von Normalgewebe.
  • Fig. 4 zeigt das gefärbte Resultat von Krebsgewebe des Dickdarms. Wie aus diesen Figuren klar erkennbar, wurde Zytoplasma des Tumorgewebes positiv gefärbt. Es wurde so festgestellt, dass der Antiköper sehr brauchbar ist, einfach zu verwenden und geeignet für klinische Anwendungen, weil seine Reaktivität selbst nach der Beeinträchtigung der Antigenität aufgrund des Paraffinifixierens oder selbst nach beträchtlicher Zeit nach dem Herausschneiden des Gewebes nicht verloren gegangen ist.
    • Sequenzliste
  • Sequenz Nr. 1
  • Länge der Sequenz: 244
  • Typ der Sequenz: Aminosäure
  • Topologie: linear
  • Art der Sequenz: Peptid Sequenz
  • Sequenz Nr. 2
  • Länge der Sequenz: 130
  • Typ der Sequenz: Aminosäure
  • Topologie: linear
  • Art der Sequenz: Peptid Sequenz
    • Industrielle Brauchbarkeit
  • Da die monoklonalen Antiköper eine spezifische Messung von Thymidin-Phosphorylase/PD-ECGF ermöglichen und ein praktisches Mittel liefern, das einfach und weit anwendbar ist, sind die monoklonalen Antiköper brauchbar für die Diagnose einer Vielfalt von Erkrankungen, die mit einer Erhöhung der menschlichen Thymidin-Phosphorylase- oder PD-ECGF-Aktivität einhergehen.

Claims (4)

1. Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit menschlicher Thymidin Phosphorylase/menschlichen endothelialen Zellwachstumsfaktors aus Thrombozyten in einer Gewebeprobe, umfassend den Einsatz eines monoclonalen Antikörpers, erhältlich durch Immu¬ nisierung mit einem Fusionsprotein eines Polypeptids, bestehend aus Aminosäure-Sequenz Nr. 1 oder Aminosäure-Sequenz Nr. 2 und Glutathion-S-Transferase, wodurch der Antikörper selektiv mit in der Gewebeprobe vorhandener(m) menschlicher Thymidin-Phosphorylase/menschlichem endothelialem Zellwachstumsfaktor aus Thrombozyten reagiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, das ein immunhistochemischer Färbeassay ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem der monoclonale Antikörper zur Klasse IgG gehört.
4. Ausstattungsteile zum Ausführen des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend einen monoclonalen Antikörper, erhältlich durch Immunisieren mit einem Fusions¬ protein eines Polypeptids, bestehend aus Aminosäure-Sequenz Nr. 1 oder Aminosäure-Sequenz Nr. 2 und Glutathion-S-Tranferase.
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