DE69527073T2

DE69527073T2 - Verfahren zur identifizierung von verbindungen, die zur behandlung von autoimmunkrankheiten verwendbar sind

Info

Publication number: DE69527073T2
Application number: DE69527073T
Authority: DE
Inventors: John Douhan Iii; H. Glimcher; Hong Zhou
Original assignee: Harvard College
Current assignee: Harvard College
Priority date: 1994-08-24
Filing date: 1995-08-22
Publication date: 2003-01-23
Anticipated expiration: 2015-08-23
Also published as: ATE219099T1; FI970735A0; PT777677E; NO970803L; WO1996006107A1; EP0777677B1; EP0777677A4; DE69527073D1; ES2178677T3; AU700235B2; NZ292369A; MX9701295A; KR970705573A; JPH10507908A; CA2197233A1; PL318812A1; NO970803D0; AU3412695A; US5672473A; CA2197233C

Description

Grundlagen der Erfindung

Diese Erfindung betrifft Autoimmunerkrankungen. Die Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse II Moleküle werden auf den Oberflächen antigenpräsentierender Zellen und B-Lymphozyten exprimiert. Durch Binden des Antigens und Präsentieren des Antigens an T-Zellen sind MHC Klasse II Moleküle am Auslösen einer Immunantwort beteiligt. Somit beeinflusst der Expressionsgehalt der MHC Klasse II Moleküle die Induktion einer Immunantwort.
Die Gene, die die α und β Polypeptide der MHC Klasse II Antigene codieren, sind in der HLA-D (Histokompatibilität Leukozyten Antigen-D) Region des Chromosoms lokalisiert. Isotypen der Klasse II Gene schließen solche ein, die HLA-DR, HLA-DQ und HLA-DP bezeichnet werden. Innerhalb dieser Gene gibt es einen wesentlichen allelen Polymorphismus; zum Beispiel schließen die HLA-DR Allele DR1, DR2, DR3 und DR4 ein. Zusätzlich gibt es Subtypen dieser Allele; zum Beispiel schließen Subtypen von DR4 Dw4, Dw10, Dw13, Dw14 und Dw15 ein.
Mehrere Autoimmunkrankheiten sind mit einer Expression bestimmter Allele der MHC Klasse II Gene assoziiert. Annährend 93% der von rheumatoider Arthritis betroffenen Patienten exprimierten HLA-DR1, HLA-DR4 oder beides (Mc- Dermott et al., Bulletin on the Rheumatic Diseases, 38: 1- 10; siehe Tabelle 1). Tabelle 1. Bevölkerungsstudien der Assoziationen von HLA mit rheumatoider Arthritis
Andere Autoimmunkrankheiten sind ebenfalls mit der Expression bestimmter Allele verknüpft. Zum Beispiel sind Felty Syndrom, Sjögren Syndrom, systemischer Lupus erythematodes und die Entwicklung von Toxizitäten gegen Gold und Penicillamin mit verschliedenen HLA-DR Allelen assoziiert (McDermott et al., Bulletin on the Rheumatic Diseases, 38: 1-10; siehe Tabelle 2). Tabelle 2. Assoziationen von HLA mit Syndromen, die mit RA, Toxizität gegen Penicillamin und Gold und Myasthenie gravis assoziiert sind
In einem anderen Beispiel ist pauciarticulare juvenile rheumatoide Arthritis mit HLA-DPB2.1 assoziiert (Begovich et al., 1989, PNAS 86: 9489-9493). Annährend 70% der Patienten mit Insulin-abhängiger Diabetes mellitus exprimieren HLA-DQ3.2B, DQA1 oder DQB1, und eine Anfälligkeit für die dermatologische Autoimmunkrankheit Pemphigus vulgaris ist mit einer Expression von HLA- DQB1.3 gekoppelt (Scharf et al., 1989, PNAS 86: 6215- 6219).
Eine Transkriptionsaktivierung der MHC Klasse II Gene hängt von dem Transaktivator CIITA ab (Steimle et al., 1993, Cell 75: 135-146).

Zusammenfassung der Erfindung

Wir haben entdeckt, dass ein Teil von CIITA ausreicht, um bei Nichtvorhandensein des restlichen Proteins und bei Vorhandensein eines ansonsten vollständigen Transkriptionssystems Transkription zu aktivieren. Wir bezeichnen diese Domäne als die CIITA-Transkriptionsaktivierungsdomäne, und wir haben etabliert, dass sie nützliche Information zur Identifizierung von Verbindungen bereitstellt, die eine CIITA-abhängige Transkription hemmen. Solche Verbindungen sind aufgrund ihrer Fähigkeit, eine Transkription von MHC Klasse II Genen zu hemmen, potentielle Autoimmunkrankheits-Therapeutika. Wir haben ebenfalls entdeckt, dass ein zweiter Teil von CIITA ausreicht, um bei Nichtvorhandensein des restlichen Proteins und bei Vorhandensein eines ansonsten vollständigen Transkriptionssystems die Interaktion zwischen CIITA und dessen Zielprotein in der zellulären Transkriptionsmaschinerie zu vermitteln und alle MHC Klasse II Promotoren zu aktivieren. Wir bezeichnen diese Domäne als die CIITA -Interaktionsdomäne, und Verbindungen, die ein Binden dieser Domäne an ihr Zielprotein hemmen, können eine CIITA abhängige Transkription hemmen und sind somit potentielle Autoimmunkrankheits-Therapeutika. Wir haben ebenfalls entdeckt, dass eine Mutante von CIITA (hierin als Klon 13 CIITA bezeichnet) die Transkription einer Untergruppe der MHC Klasse II Gene aktiviert. Wir bezeichnen diese Mutante als Isotyp-spezifisch; die Transkriptionsaktivierungs- und Interaktionsdomänen der Isotypspezifischen CIITA Proteine sind zur Identifizierung von Verbindungen, die Isotyp-spezifische Transkriptionsinhibitoren sind, nützlich.
Demgemäss kennzeichnet die Erfindung Verfahren, die die CIITA-Aktivierungsdomäne oder Interaktionsdomäne zur Bestimmung, ob eine Verbindung ein potentielles Autoimmunkrankheits-Therapeutikum ist, verwendet. Das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein einer funktionellen CIITA -Aktivierungsdomäne oder einer funktionellen CIITA-Interaktionsdomäne kann unter Verwendung der unten beschriebenen Transkriptionsmesstechniken bestimmt werden. In einem Verfahren wird die Fähigkeit einer Verbindung Transkription eines Reportergens zu hemmen, gemessen, wobei eine Transkriptionshemmung anzeigt, dass die Verbindung ein potentielles Autoimmunkrankheits-Therapeutikum ist. In einem anderen Verfahren wird die Fähigkeit einer Verbindung ein Binden der CIITA-Interaktionsdomäne an ihr Zielprotein zu hemmen, gemessen, wobei eine Bindungshemmung anzeigt, dass die Verbindung ein potentieLles Autoimmunkrankheits-Therapeutikum ist. In noch einem anderen Verfahren wird die Fähigkeit der CIITA-Interaktionsdomäne gemessen, Transkription bei Nichtvorhandensein einer CIITA-Transkriptionsaktivierungsdomäne und bei Vorhandensein der Transkriptionsaktivierungsdomäne eines anderen Proteins zu vermitteln. Verbindungen, die die Funktion der Interaktionsdomäne hemmen, sind potentielle Autoimmunkrankheits-Therapeutika. Durch Messen der Fähigkeit der Wildtyp CIITA-Interaktionsdomäne Transkription bei Vorhandensein der zu testenden Verbindungen zu vermitteln und durch Überwachen der Expression eines jeden Isotyps, ermöglicht dieses Verfahren die Identifizierung von Verbindungen, die Isotyp-spezifische Transkriptionsinhibitoren sind. Bei Vorhandensein eines Isotypspezifischen Inhibitors vermittelt die Wildtyp- spezifische CIITA-Interaktionsdomäne die Transkription von nur einer MHC Klasse II Genuntergruppe.
Die Erfindung kennzeichnet ferner Verfahren, die Isotyp-spezifische CIITA-Interaktions- und Transkriptonsaktivierungsdomänen zur Identifizierung von Verbindungen, die Isotyp-spezifische Transkriptionsinhibitoren sind, verwenden. In diesen Verfahren werden Verbindungen bezüglich ihrer Fähigkeit getestet, durch Wildtyp- und Isotypspezifische CIITA-Interaktions- und Transkriptionsaktivierungsdomänen vermittelte Transkription differentiell zu beeinflussen. Solche Isotyp-spezifischen Inhibitoren sind zur selektiven Beeinflussung des Immunsystems nützlich.
Eine Transkriptionshemmung kann in vivo, in vitro oder in auf Zellen basierenden Tests gemessen werden. Eine Vielzahl an Techniken zur Aktivitätsmessung einer Transkriptionsaktivierungsdomäne sind im Fachgebiet bekannt (siehe z. B. Keegan et al., 1986, Science 23: 699; Ma et al., 1987, Cell 48: 847; Lin et al., 1988, Cell 54: 659; Sadowski et al., 1988, Nature 335: 563; Roberts et al., 1993, Nature 363: 741; und Ma et al., 1988, Cell 55: 443). Diese und andere Transkriptionstests können zur Identifizierung von Verbindungen, die CIITA-Transkriptionsaktivierung hemmen, modifiziert werden. Dies kann durch Ersetzen der neuidentifizierten CIITA-Transkriptionsaktivierungsdomäne durch die in einem kürzlich beschriebenen Test verwendete Aktivierungsdomäne erzielt werden. Verbindungen, die eine CIITA-Aktivierung hemmen, können durch einfache Zugabe der Verbindungen zur Transkriptionsreaktion und Bestimmung, ob die Verbindung Transkription hemmt, identifiziert werden. Solche Verbindungen sind potentielle Autoimmunkrankheits-Therapeutika.
In bevorzugten Anwendungsfällen werden potentielle Autoimmunkrankheits-Therapeutika identifiziert durch:
a) Bereitstellen eines fusionierten Proteins, das eine an ein DNA-Bindeprotein (z. B. die DNA Binde/Dimerisierungsdomäne von LexA oder die DNA Bindedomäne von GAL4) fusionierte CIITA-Transkriptionsaktivierungsdomäne (ohne eine funktionelle CIITA-Interaktionsdomäne) einschließt;
b) Bereitstellen des fusionierten Proteins in einem Transkriptionssystem (z. B. in vitro oder in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle, wie eine bakterielle Zelle, eine Hefezelle, eine Pflanzenzelle oder eine Säugerzelle), wobei das Transkriptionssystem DNA mit einer regulatorischen Sequenz (z. B. auf einem Plasmid oder auf einem Chromosom) aufweist, an die das fusionierte Protein bindet, und die regulatorische Sequenz an ein Reportergen (z. B. ein Gen, das β-Galactosidase, CAT, GUS, Luciferase, menschliches Wachstumshormon oder alkalische Phosphatase) zweckorientiert verknüpft ist;
c) Messen des Transkriptionsgehaltes des Reportergens (z. B. unter Verwendung von Standardtechniken zum Messen des Aktivitätsgehaltes einer RNA oder eines Proteinproduktes des Reportergens. Zum Beispiel kann Transkription des lacZ Gens durch Kultivieren der Zellen in oder auf X-gal haltigen Medien und durch Messen des Gehaltes des produzierten blauen Chromophors) gemessen werden; und
d) Durchführen der Schritte a-c, oben, bei Vorhandensein der zu testenden Verbindung, wobei eine Abnahme des Transkriptionsgehaltes (im Verhältnis zu den bei Nichtvorhandensein der Verbindung ersichtlichen Gehalten) anzeigt, dass die Verbindung eine CIITA-Transkriptionsaktivierung hemmt und deshalb ein potentielles Autoimmunkrankheits-Therapeutikum ist.
In anderen bevorzugten Anwendungsfällen wird die CIITA-Interaktionsdomäne zur Identifizierung potentieller Autoimmunkrankheits-Therapeutika verwendet. Diese Verfahren beinhalten:
a) Bereitstellen eines fusionierten Proteins, das eine an eine andere Transkriptionsaktivierungsdomäne als CIITA (z. B. die Transkriptionsaktivierungsdomäne des Herpes Simplex Virus α-transduzierenden Faktors (α-TDF)) fusionierte CIITA-Interaktionsdomäne umfasst;
b) Bereitstellen eines CIITA-interagierenden Zielproteins (z. B. das CIITA-interagierende Zielprotein einer menschlichen B-Zelle);
c) Bereitstellen des fusionierten Proteins und des Zielproteins in einem Transkriptionssystem (z. B. in vitro oder in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen, wie eine bakterielle Zelle, eine Hefezelle, eine Pflanzenzelle oder eine Säugerzelle wie eine menschliche B- Zelle (z. B. Klon 13, Raji oder RM3 Zellen)), wobei das Transkriptionssystem DNA mit einer regulatorischen Sequenz aufweist, die eine MHC Klasse II Promotorsequenz (z. B. auf einem Plasmid oder auf einem Chromosom) umfasst, und die regulatorische Sequenz an ein Reportergen (z. B. ein MHC Klasse II Gen, ein β-Galactosidase, CAT, GUS, Luciferase, menschliches Wachstumshormon oder alkalische Phosphatase codierendes Gen) zweckorientiert verknüpft ist; und
d) Messen des Transkriptionsgehaltes des Reportergens (z. B. unter Verwendung von Standardtechniken zum Messen des Aktivitätsgehaltes einer RNA oder eines Proteinproduktes des Reportergens. Zum Beispiel kann Transkription der MHC Klasse II Gene in einer menschlichen B-Zelllinie unter Verwendung von FACS zum Testen einer Expressionssteigerung der MHC Klasse II Moleküle auf der Zelloberfläche gemessen werden); und
e) Durchführen der Schritte a-d, oben, bei Vorhandensein der zu testenden Verbindung, wobei eine Abnahme des Transkriptionsgehaltes (im Verhältnis zu den bei Nichtvorhandensein der Verbindung ersichtlichen Gehalten) anzeigt, dass die Verbindung die Fähigkeit der CIITA- Interaktionsdomäne Transkription zu vermitteln hemmt und deshalb ein potentielles Autoimmunkrankheits-Therapeutikum ist. Verbindungen, die Isotyp-spezifische Inhibitoren der Transkription sind, können aufgrund ihrer Fähigkeit, eine Expression der MHC Klasse II Gene differentiell zu hemmen, identifiziert werden. Zum Beispiel stellt eine Expression der Wildtyp CIITA-Interaktionsdomäne in Klon 13 Zellen eine Transkription der HLA-DR, -DQ, und -DP Isotypen wieder her. Eine Verbindung, die Transkription hemmt, jedoch nicht auf eine Isotyp-spezifische Weise, wird eine Wiederherstellung der Expression von allen 3 Genen verhindern.
Im Gegensatz dazu wird ein Isotyp-spezifischer Transkriptionsinhibitor eine Wiederherstellung der Expression von nur einer Genuntergruppe stören.
In anderen bevorzugten Anwendungsfällen werden Verbindungen, die potentielle Autoimmunkrankheits-Therapeutika sind, identifiziert durch:
a) Bereitstellen eines ersten fusionierten Proteins, das eine an ein DNA Bindeprotein (z. B. die DNA Binde/Dimerisierungsdomäne von LexA oder die DNA Bindedomäne von GAL4) fusionierte CIITA-Interaktionsdomäne (ohne eine funktionelle CIITA-Aktivierungsdomäne) umfasst;
b) Bereitstellen des fusionierten Proteins in einem Transkriptionssystem (z. B. in vitro oder in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen, wie eine bakterielle Zelle, eine Hefezelle, eine Pflanzenzelle oder eine Säugerzelle), wobei das Transkriptionssystem DNA mit einer regulatorischen Sequenz (z. B. auf einem Plasmid oder auf einem Chromosom) aufweist, an die das erste fusionierte Protein bindet, und wobei die regulatorische Sequenz an ein Reportergen (z. B. ein β-Galactosidase, CAT, GUS, Luciferase, menschliches Wachstumshormon oder alkalische Phosphatase codierendes Gen) zweckorientiert verknüpft ist;
c) Bereitstellen eines zweiten fusionierten Proteins, wobei das zweite fusionierte Protein dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine an ein wie hierin definiertes CIITA-interagierendes Zielprotein fusionierte Transkriptionsaktivierungsdomäne (z. B. die Transkriptionsaktivierungsdomäne von B42) umfasst;
d) Messen des Transkriptionsgehaltes des Reportergens (z. B. unter Verwendung von Standardtechniken zum Messen des Aktivitätsgehaltes einer RNA oder eines Proteinproduktes des Reportergens. Zum Beispiel kann Transkription des lacZ Gens durch Kultivieren der Zellen in oder auf X-gal haltigen Medien und durch Messen der Menge des produzierten blauen Chromophors) gemessen werden; und
e) Durchführen der Schritte a-d, oben, bei Vorhandensein der zu testenden Verbindung, wobei eine Abnahme des Transkriptionsgehaltes (im Verhältnis zu den bei Nichtvorhandensein der Verbindung ersichtlichen Gehalten) anzeigt, dass die Verbindung die Fähigkeit der CIITA- Interaktionsdomäne an ihr Zielprotein zu binden hemmt und deshalb ein potentielles Autoimmunkrankheits-Therapeutikum ist. Die Verbindung, die ein Binden hemmt, kann durch eine Vielzahl an Verfahren wirken, einschließlich sterisches Stören des Bindens oder Verändern der Struktur von CIITA oder dessen Zielproteins. Obwohl der genaue Mechanismus, durch den die Verbindung eine Transkription verhindert, unbekannt ist, ist die Verbindung trotz allem als ein Therapeutikum wertvoll. Andere Messverfahren von Protein-Protein Interaktionen können ebenfalls zur Identifizierung von Verbindungen, die ein Binden der CIITA- Interaktionsdomäne an ihr Zielprotein verhindern, verwendet werden. Unter Verwendung von molekularbiologischen Standardtechniken kann ein Fachmann ELlSAs, Southwestern- Blotten, Filter- und Membran-gebundene Proteine oder immobilisierte Proteine zur Identifizierung von Verbindungen verwenden, die ein Binden der CIITA-Interaktionsdomäne an ihr Zielprotein hemmen.
Die Erfindung kennzeichnet ebenfalls ein im wesentlichen gereinigtes Polypeptid, das eine CIITA-Transkriptionsaktivierungsdomäne ohne eine funktionelle CIITA-Interaktionsdomäne einschließt. Vorzugsweise schließt das Polypeptid eine Sequenz von mehr als 50 Aminosäuren, die zu einer Sequenz von mehr als 50 Aminosäuren der Aminosäuren 26-352 der in Fig. 1 gezeigten Sequenz im wesentlichen identisch ist, ein.
In einem verwandten Aspekt kennzeichnet die Erfindung eine im wesentlichen reine DNA (z. B. genomische DNA, cDNA oder synthetische DNA), die eine CIITA-Transkriptionsaktivierungsdomäne ohne Codierung einer funktionellen CIITA -Interaktionsdomäne codiert.
Die Erfindung kennzeichnet ferner ein im wesentlichen gereinigtes Polypeptid, das eine CIITA-Interaktionsdomäne ohne Einschließen einer funktionellen CIITA- Transkriptionsaktivierungsdomäne einschließt. Vorzugsweise schließt das Polypeptid eine Sequenz von mehr als 50 Aminosäuren, die zu mehr als 50 Aminosäuren von 301-1130 der in Fig. 1 gezeigten Sequenz im wesentlichen identisch ist, ein.
In einem verwandten Aspekt kennzeichnet die Erfindung eine im wesentlichen reine DNA (z. B. genomische DNA, cDNA oder synthetische DNA), die eine CIITA-Interaktionsdomäne ohne Codieren einer funktionellen CIITA-Transkriptionsaktivierungsdomäne codiert.
Zusätzlich kennzeichnet die Erfindung ein im wesentlichen gereinigtes Polypeptid, das die Interaktionsdomäne des CIITA Polypeptides, aber nicht die Transkriptionsaktivierungsdomäne der Klon 13 Zelllinie umfasst (zur Beschreibung der Zelllinie, siehe Ono et al., 1991, J. Exp. Med. 173: 629-637). Der Klon 13 CIITA aktiviert eine Transkription der MHC Klasse II DR und DP Gene. Vorzugsweise schließt das Polypeptid eine Sequenz von mehr als 50 Aminosäuren, die im wesentlichen zu mehr als 50 Aminosäuren von 301-1077 der in Fig. 1 gezeigten Sequenz im wesentlichen identisch ist, während die Aminosäuren 1-300 und 1078-1130 der in Fig. 1 gezeigten Sequenz fehlen. In einem verwandten Aspekt schließt die Erfindung eine im wesentlichen reine DNA ein (z. B. genomische DNA, cDNA oder synthetische DNA), die die Interaktionsdomäne aber nicht die Transkriptionsaktivierungsdomäne des Klon 13 CIITA codiert.
Andere Isotyp-spezifische CIITA Mutanten sind ebenfalls in der Erfindung eingeschlossen, und die Erfindung kennzeichnet ferner Verfahren, die die Aktivierungs- und Interaktionsdomänen von Isotyp-spezifischen Mutanten von CIITA zur Bestimmung, ob eine Verbindung ein Isotyp-spezifischer Transkriptionsinhibitor ist, verwenden. Eine Verbindung, die ein Isotyp-spezifischer Inhibitor ist, ist ebenfalls ein potentielles Autoimmunkrankheits-Therapeutikum. Solch eine Verbindung ist insbesondere nützlich, da sie die Transkription bestimmter Gene, die bekannterweise an Autoimmunkrankheiten beteiligt sind, hemmen kann, während eine Expression anderer MHC Klasse II Gene ermöglicht wird. Somit kann eine Isotyp-spezifische Verbindung bei Verwendung als ein Autoimmunkrankheits- Therapeutikum ein Verursachen von allgemeiner Immunsuppression verhindern.
Eine Verbindung, die Isotyp-spezifisch ist, kann durch Verwendung eines Isotyp-spezifischen CIITA in einem der hierin beschriebenen Hemmtests und durch Vergleich der unter Verwendung von Wildtyp CIITA oder einer CIITA Mutante von unterschiedlicher Isotyp-Spezifität erzielten Ergebnisse identifiziert werden. Zum Beispiel ist eine Verbindung, die eine von Wildtyp CIITA aber nicht von Klon 13 CIITA abhängige Transkription hemmt, nützlich bei einer Transkriptionshemmung von MHC Klasse II DR und DP Genen. Da eine Expression von DR1 und/oder DR4 mit 93% der Fälle von rheumatoider Arthritis assoziiert ist, ist eine Verbindung, die eine Transkription der DR Gene spezifisch hemmt, ein ernster Kandidat für ein Therapeutikum gegen rheumatoide Arthritis.
Ähnlicherweise können zwei Isotyp-spezifische Mutanten von CIITA zur Bestimmung, ob eine Verbindung ein Isotyp-spezifischer Transkriptionsinhibitor ist, verwendet werden. Zum Beispiel kann ein vergleichendes Verfahren eine erste CIITA Mutante, die Transkription von DR und DP aktiviert, und eine zweite CIITA Mutante, die Transkription von nur DP aktiviert, einbeziehen. Eine Verbindung, die die Fähigkeit der ersten Mutante, aber nicht der zweiten Mutante hemmt, ist nützlich zur selektiven Hemmung der Expression von DR.
"Klasse II Transaktivatorgen" (CIITA Gen) bezeichnet ein Gen, dass einen Transkriptionsaktivator codiert, wobei das Gen eine Sequenzidentität von etwa 80% oder mehr zu der CIITA Sequenz von Fig. 1 (SEQ ID NR. 1) aufweist.
"CIITA Transkriptionsaktivierungsdomäne" bezeichnet ein Polypeptid, das eine Sequenzidentität von etwa 80% oder mehr mit den Aminosäuren 26-352 des in Fig. 1 gezeigten CIITA Polypeptides aufweist, ohne eine funktionelle CIITA-Interaktionsdomäne zu haben.
"CIITA-Interaktionsdomäne" bezeichnet ein Polypeptid, das eine Sequenzidentität von etwa 80% oder mehr mit den Aminosäuren 301-1130 des in Fig. 1 gezeigten CIITA Polypeptides aufweist, ohne eine funktionelle CIITA Transkriptionsaktivierungsdomäne zu haben. Ein Beispiel einer mutierten CIITA-Interaktionsdomäne ist die Interaktionsdomäne des Klon 13 CIITA, dessen DNA Sequenz zumindest teilweise durch eine Deletion der Nucleotide 3211-3214 der in Fig. 1 gezeigten Wildtyp CIITA Sequenz (diese entspricht den Nucleotiden 3326-3329 der kürzlich beschriebenen cDNA Sequenz (Steimle et al., infra)) gekennzeichnet ist, wodurch ein Protein resultiert, das um 53 Aminosäuren im Verhältnis zum Wildtyp verkürzt ist.
Es versteht sicht, dass die hierin definierten CIITA -Transkriptionsaktivierungs- und Interaktionsdomänen etwa 51 Aminosäuren überlappen. Dennoch ist der Überlappungsbereich nicht ausreichend, um eine funktionelle Transkriptionsaktivierungs- oder Interaktionsdomäne zu konstituieren. Somit hat ein Polypeptid, das die Aminosäuren 26-352 aufweist und dem die Aminosäuren 353-1130 der in Fig. 1 gezeigten Sequenz fehlen, eine funktionelle Transkriptionsaktivierungsdomäne, aber keine funktionelle Interaktionsdomäne. Ähnlicherweise hat ein Polypeptid, das die Aminosäuren 301-1130 aufweist und dem die Aminosäuren 1-300 der in Fig. 1 gezeigten Sequenz fehlen, eine funktionelle Interaktionsdomäne, aber keine funktionelle Trankriptionsaktivierungsdomäne.
"Polypeptid" bezeichnet eine beliebige Aminosäurekette, ungeachtet ihrer Länge oder posttranslationaler Modifikation (z. B. Glycosylierung oder Phosphorylierung).
"Zweckorientiert verknüpft" bezeichnet, dass ein Gen und (eine) regulatorische Sequenz(en) auf eine Weise verbunden sind, dass Genexpression ermöglicht wird, wenn die geeigneten Moleküle (z. B. transkriptionelle Aktivatorproteine) an die regulatorische(n) Sequenz(en) gebunden sind.
"Reportergen" bezeichnet ein Gen, dessen Expression getestet werden kann; solche Gene schließen, ohne einzuschränken, die lacZ, Chloramphenicoltransferase (CAT), β- Glucoronidase (GUS) und Luciferase -Gene ein.
"Im wesentlichen identisch" bezeichnet ein Polypeptid oder eine Nucleinsäure, das/die eine Homologie von mindestens 50%, vorzugsweise 85%, bevorzugter 90% und am Bevorzugtesten 95% zu einer Referenzaminosäuresequenz- oder nucleinsäuresequenz aufweist. Bei. Polypeptiden ist die Länge der Vergleichssequenzen im allgemeinen mindestens 16 Aminosäuren, vorzugsweise mindestens 20 Aminosäuren, bevorzugter mindestens 25 Aminosäuren und am Bevorzugtesten mindestens 35 Aminosäuren. Bei Nucleinsäuren ist die Länge der Vergleichssequenzen im allgemeinen mindestens 50 Nucleotide, vorzugsweise mindestens 60 Nucleotide, bevorzugter mindestens 75 Nucleotide und am Bevorzugtesten 110 Nucleotide.
Sequenzidentität wird typischerweise unter Verwendung von Sequenzanalysensoftware (z. B. Sequence Analysis Software Package der Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705) gemessen. Eine solche Software vergleicht ähnliche Sequenzen durch Bewertung des Homologiegrades mit verschiedenen Substitutionen, Deletionen und anderen Modifikationen. Konservative Substitutionen umfassen typischerweise Substitutionen innerhalb der folgenden Gruppen: Glycin, Alanin; Valin, Isoleucin, Leucin; Asparaginsäure, Glutaminsäure, Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Lysin, Arginin; und Phenylalanin, Tyrosin.
"Im wesentlichen reines Polypeptid" bezeichnet ein Polypeptid, das von Bestandteilen, die es natürlicherweise umgeben, abgetrennt worden ist. Tyischerweise ist das Polypeptid im wesentlichen rein, wenn es mindestens zu 60% nach Gewicht frei von den Proteinen und natürlicherweise-vorkommenden organischen Molekülen ist, mit denen es natürlicherweise assoziiert ist. Vorzugsweise ist die Präparation mindestens zu 75%, bevorzugter mindestens zu 90% und am Bevorzugtesten mindestens zu 99% nach Gewicht das gewünschte Protein. Eine im wesentlichen reine CIITA-Transkriptionsaktivierungsdomäne oder CIITA- Interaktionsdomäne kann zum Beispiel durch Extraktion aus einer natürlichen Quelle (z. B. eine menschliche Zelle); durch Expression einer rekombinanten Nucleinsäure, die eine CIITA-Transkriptionsaktivierungsdomäne oder CIITA- Interaktionsdomäne codiert; oder durch chemisches Synthetisieren des Polypeptides erhalten werden. Die Reinheit kann durch jedes geeignete Verfahren (z. B. Säulenchromatographie, Polyacrylamid-Gelelektrophorese und HPLC Analyse) gemessen werden.
Ein Protein ist im wesentlichen frei von natürlicherweise assoziierten Bestandteilen, wenn es von diesen Verunreinigungen, die es in seinem natürlichen Zustand begleiten, abgetrennt ist. Somit ist ein Protein, das chemisch synthetisiert, in vitro synthetisiert oder in einem anderen zellulären System als die Zelle, aus der es natürlicherweise stammt, hergestellt ist, im wesentlichen frei von seinen natürlicherweise assoziierten Bestandteilen. Demgemäss schließen im wesentlichen reine Polypeptide solche ein, die von eukaryotischen Organismen stammen, aber in E. coli oder anderen Prokaryoten synthetisiert werden.
"Im wesentlichen reine DNA" bezeichnet DNA, die frei von den Genen ist, die in dem natürlicherweise vorkommenden Genom des Organismus, aus dem die DNA der Erfindung stammt, das Gen flankieren. Der Ausdruck schließt deshalb zum Beispiel eine rekombinante DNA ein, die inkorporiert ist in einen Vektor; in ein autonom replizierendes Plasmid oder Virus oder in die genomische DNA eines Prokaryoten oder Eukaryoten (z. B. eine Hefezelle); oder die als ein separates Molekül (z. B. eine cDNA oder ein genomisches oder cDNA Fragment, welches durch PCR oder Restriktionendonucleaseverdau hergestellt ist) unabhängig von anderen Sequenzen, existiert. Er schließt ebenfalls eine rekombinante DNA ein, die Teil eines Hybridgens ist, das eine zusätzliche Polypeptidsequenz codiert.

Detaillierte Beschreibung

Die Zeichnungen werden zunächst beschrieben.
Fig. 1 ist eine Auflistung der Nucleotide und der vorhergesagten Aminosäuresequenzen von CIITA vollständiger Länge (SEQ ID NR. 1).
Fig. 2 ist eine schematische Darstellung der CIITA Deletionsmutanten und des zur Identifizierung der CIITA Transkriptionsaktivierungs- und Interaktionsdomänen verwendeten in vivo Tests. Die Ergebnisse der Transkriptionstests sind ebenfalls in dieser Figur zusammengefasst.
Fig. 3 ist eine Photographie der in den Transkriptionstests zur Identifizierung der CITTA Transkriptionsaktivierungs- und Interaktionsdomänen verwendeten Hefezellen.
Fig. 4 ist ein Histogramm, dass Daten zeigt, die aus einem kolorimetrischen Test erhalten wurden, der zur Transkriptionsmessung des lacZ Gens zur Identifizierung der CIITA Transkriptionsaktivierungs- und Interaktionsdomänen verwendet wurde.
Fig. 5 ist eine schematische Darstellung des Plasmids pCMV.ciita.
Fig. 6A-E ist eine Reihe an FACS Profilen, die zeigen, dass eine Expression eines α-TDF/CIITA fusionierten Proteins in Klon 13 und RM3 Zellen eine Expression der MHC Klasse II Gene wiederherstellt.
Fig. 7 ist eine Reihe an FACS Profilen, die zeigen, dass eine Expression von Wildtyp CIITA in Klon 13 Zellen den Expressionsmangel der DR und DP Isotypen korrigiert und eine Expression von DQ steigert.
Fig. 8A-F ist eine schematische Darstellung der hierin beschriebenen Plasmide.

Die CIITA-Transkriptionsaktivierungsdomäne

Wir haben zum ersten Mal ein Segment von CIITA identifiziert, das bei Nichtvorhandensein des restlichen CIITA Proteins und bei Vorhandensein eines ansonsten vollständigen Transkriptionssystems ausreicht, um Transkription zu aktivieren. Wir bezeichnen dieses Segment als die Transkriptionsaktivierungsdomäne von CIITA. Zur Identifizierung dieser Domäne von CIITA wurde eine Reihe von Plasmiden (aus dem Vektor pEG202) zur Herstellung von fusionierten Proteinen, die Teile von CIITA angefügt an die N-terminalen 202 Aminosäuren der Dimerisierungs- und DNA Bindedömäne des E. coli Repressorproteins LexA enthielten, konstruiert. Konstruktionsverfahren dieser Plasmide und anderer hierin beschriebener Plasmide werden unten unter "Konstruktion von Plasmiden" bereitgestellt.
Hefezellen des Stamms EGY48 (his3&supmin; und ura3&supmin;) wurden dann unabhängig mit jedem LexA-CIITA Konstrukt und einem lacZ Reporterplasmid (pSH18-34) gemeinsam transformiert. Die Expression dieser Plasmide in Hefe wurde durch Expression des HIS3 Gens aus dem LexA-CIITA Plasmid und Expression von URA3 aus pSH18-34 aufrechterhalten. Die regulatorischen Sequenzen des lacZ Reporterplasmides umfassten 8 LexA Bindestellen anstelle der GAL1 stromaufwärts aktivierenden Sequenzen (Fig. 2). In diesem Test diente das LexA Polypeptid als ein DNA-Bindeprotein, wobei die CIITA Polypeptide nahe an die Transkriptionsstelle gebracht wurden.
Bei Nichtvorhandensein eines LexA fusionierten Proteins stellte die das pSH18-34 Reportergen enthaltende Hefe nachweisbare Mengen an β-Galactosidase aus dem lacZ Gen nicht her und erschien auf X-gal haltigen Medien weiß (Fig. 3; pHRFM1, eine Negativkontrolle). Zusätzlich konnte Hefe, die ein Plasmid enthielt, das nur die LexA N- terminalen 202 Aminosäuren oder ein fusionierte Protein, das bekannterweise keine transkriptionelle Aktivität (pSH17-4) hat, exprimiert, keine nachweisbare Mengen an β-Galactosidase herstellen. Im Gegensatz dazu induzierten Hefestämme, die das an die Transkriptionsaktivierungsdomäne von CIITA (annähernd die N-terminalen 29%) fusionierte LexA Polypeptid aufwiesen, eine Synthese an ausreichenden Mengen der β-Galactosidase, dass die Wirtshefezellen auf X-gal haltigen Medien blau erschienen (Fig. 3; pSH17-4, eine Positivkontrolle). Zusätzlich wurden quantitative kolorimetrische Tests durch Messung der optischen Dichte der die fusionierten Proteine und o- Nitrophenyl-β-Galactosid (ONPG) haltigen Medien durchgeführt (siehe Fig. 4) (Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology; J. Wiley & Sons, 1994). Unsere Daten sind ebenfalls ein Hinweis, dass ein Polypeptid, das annähernd 8% der N-terminalen Region von CIITA einschließt, zur Transkriptionsaktivierung ausreicht. Dieser Teil von CIITA enthält den sauren Teil der Transkriptionsaktivierungsdomäne; wenn erwünscht, können die mit den N-terminalen 29% durchgeführten Experimente mit den mit den N-terminalen 8% durchgeführten Experimenten verglichen werden. Ein Polypeptid, das annähernd 29% der N-terminalen Region von CIITA einschließt, aktiviert eine Transkription mindestens genauso wirksam wie das CIITA Protein vollständiger Länge. Somit stellen die Aminosäuren 26-352 und die Nucleotide 78 bis 1 056 des CIITA vollständiger Länge (siehe Fig. 1) die Transkriptionsaktivierungsdomäne dar (diese Zahlen beziehen sich auf die CIITA codierende Sequenz, wobei der Anfang bei Nucleotid 116 der CIITA cDNA Sequenz ist (Steimle et al., infra)).

Verwendung der CIITA-Transkriptionsaktivierungsdomäne zur Identifizierung von Autoimmunkrankheits-Therapeutika

Die Aktivierungsdomäne von CIITA kann in einem Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die CIITA- abhängige Transkription hemmen, verwendet werden. Da CIITA zur Aktivierung von MHC Klasse II Genen benötigt I wird, sind Verbindungen, die CIITA abhängige Transkription spezifisch hemmen, ernste Kandidaten für Autoimmunkrankheits-Therapeutika. Unsere Entdeckung, dass ein Segment von CIITA (als die CIITA-Transkriptionsaktivierungsdomäne benannt), die Fähigkeit aufweist, Transkription bei Nichtvorhandensein des restlichen CIITA Proteins und bei Vorhandensein eines ansonsten vollständigen Transkriptionssystems zu aktivieren, vereinfacht die Identifizierung von Verbindungen, die Transkriptionsaktivierung durch CIITA hemmen.
Nützliche Verbindungen werden durch ihre Fähigkeit CIITA abhängige Transkription zu hemmen, identifiziert. Bis jetzt kann die Verbindung bezüglich der Transkriptionshemmung in einem beliebigen Transkriptionstestsystem untersucht werden, das die CIITA-Aktivierungsdomäne einbezieht. Es folgt nun ein Beispiel eines Tests, der zur Identifizierung von Verbindungen verwendet werden kann, die CIITA abhängige Transkription hemmen; die mit diesem Test identifizierten Verbindungen sind Kandidaten für Autoimmunkrankheits-Therapeutika. Andere Tests (z. B. solche beschrieben von Keegan et al., 1986, Science 23: 699; Ma et al., 1987, Cell 48: 847; Lin et al., 1988, Cell 54: 659; Sadowski et al., 1988, Nature 335: 563; Roberts et al., 1993, Nature 363: 741; und Ma et al., 1988, Cell 55: 443) können modifiziert werden, um die CIITA Transkriptionsaktivierungsdomäne, die wir entdeckt haben, anzuwenden. Die CIITA-Transkriptionsaktivierungsdomäne kann einfach in den geeigneten Vektor kloniert werden, und somit sind andere Transkriptionstests nicht von dieser Erfindung ausgeschlossen.

Beispiel 1: Identifizierung von Verbindungen, die die CIITA Transkriptionsaktivierungsdomäne hemmen

Zur Identifizierung nützlicher Verbindungen wird der Wirtshefestamm EGY48 (his3&supmin;, ura3&supmin; und leu&supmin;) mit zwei Plasmiden transformiert. Das erste Plasmid, pSH18-34, trägt die GAL1 TATA Transkriptionsstartstelle und ein mit dem lacZ Gen zweckorientiert verknüpftes Segment der GAL1 codierenden Sequenz (Zervos et al., 1993, Cell 72: 223- 232 und Gyuris et al., 1993, Cell 75: 791-803). Dieses Plasmid enthält ebenfalls 8 Bindestellen für LexA anstelle von GAL1 stromaufwärts aktivierenden Sequenzen, und es enthält einen URA3 selektierbaren Marker. Das zweite Plasmid, pEG.ciita.N29 stammt von dem Ausgangsplasmid pEG202 ab und trägt Sequenzen, die die CIITA Transkriptionsaktivierungsdomäne codieren. Dieses Plasmid enthält ebenfalls ein Gen für einen selektierbaren Marker (HIS3) und die DNA Binde- und Dimerisierungsdomänen von LexA (Aminosäuren 1-202). In Kontrollhefestämmen kann das zweite Plasmid pSH17-4 sein (Gyuris et al., 1993, Cell 75: 791-803), das an eine Transkriptionsaktivierungsdomäne, wie zum Beispiel solche von pHRFMI oder CDK2, fusioniertes LexA codiert (Zervos et al., 1993, Cell 72: 223- 232 und Gyuris et al., 1993,Cell 75: 791-803).
Kleine Kulturen der zweifach transformierten Hefezellen werden mit den zu testenden Verbindungen vermischt und in einem geeigneten Medium (z. B. SGR, -his, -ura, + X-gal (80 mg/L) unter geeigneten Bedingungen (z. B. bei 30ºC unter Rühren über Nacht) kultiviert. Die Menge des hergestellten blauen Chromophors wird dann bestimmt (z. B. durch Messen der optischen Dichte oder durch manuelle Untersuchung der Kulturen). Verbindungen, die eine Transkriptionsaktivierung durch das Testplasmid (pEG.ciita.N29) aber nicht durch das Kontrollplasmid (pSH17-4) hemmen, können eine Expression von MHC Klasse II Molekülen hemmen und sind deshalb ernste Kandidaten für Autoimmunkrankheits-Therapeutika.

Die CIITA-Interaktionsdomäne

Die oben beschriebenen Deletionsanalysen zeigen ebenfalls an, dass ein Polypeptid, das die Aminosäuren 1-26 und 301-1130 (Nucleotide 1-78 und 903-3390) des CIITA vollständiger Länge enthielt, eine Transkription alleine nicht aktivierte (Fig. 1, 2 und 3). Da diese Domäne nicht die Fähigkeit hat, Transkription bei Nichtvorhandensein einer Transkriptionsaktivierungsdomäne (die von CIITA oder einem anderen Transkriptionsaktivator abstammt) zu aktivieren, schlussfolgerten wir, dass diese Domäne Transkription durch Binden an eine andere Verbindung der zellulären Transkriptionsmaschienerie (z. B. eine Polymerase oder ein DNA Bindeprotein) vermittelt. Demgemäss wurden die Aminosäuren 301-1130 (die C-terminalen 74%) von CIITA CIITA-Interaktionsdomäne genannt. Obwohl die CIITA-Interaktionsdomäne eine Transkription alleine nicht aktivieren kann, sind Verbindungen, die ein Binden der Interaktionsdomäne an ihr normales zelluläres Zielprotein hemmen, zur Transkriptionshemmung von CIITA nützlich und sind deshalb potentielle Autoimmunkrankheits- Therapeutika.

Verwendung der CIITA-Interaktionsdomäne zur Wiederherstellung der MHC Klasse II Genexpression

Zur Bestätigung, dass die Aminosäuren 301-1130 die CIITA-Interaktionsdomäne umfassen, untersuchten wir die Fähigkeit dieser CIITA Region MHC Klasse II Genexpression in mutierten Zelllinien, die solche Gene nicht exprimieren konnten, wiederherzustellen. In diesen Untersuchungen verwendeten wir das Plasmid pCMV.ciita (Fig. 5) zur Konstruktion eines Plasmides, pCMV.αTDF-CIITA. C70, das ein fusioniertes Protein zwischen der Interaktionsdomäne von CIITA und der Transkriptionsaktivierungsdomäne des α- transduzierenden Faktors des Herpes Simplex Virus (HSV) Stammes F kreiert. Als eine Negativkontrolle wurde ein Plasmid, pCMV.CIITA.C74 erschaffen, in dem die CIITA- Transkriptionsaktivierungsdomäne deletiert war. Als eine zweite Negativkontrolle wurde pCMV.ciitaΔHindIII verwendet, das die CIITA-Transkriptionsaktivierungsdomäne bei Nichtvorhandensein einer Interaktionsdomäne codiert. Als eine Kontrolle für Transfektionseffizienz wurden Zellen mit pCMV/Kb transfiziert. Als eine Positivkontrolle wurden die Zellen mit pCMV.ciita transfiziert, das das vollständige CIITA codiert. Diese Plasmide wurden in menschliche B-Zellen unabhängig transfiziert. Einer B-Zelllinie, RM3, fehlt eine Expression der DR, DP und DQ Isotypen. Einer zweiten B-Zelllinie, Klon 13, fehlt die Expression von DR und DP, aber nicht DQ. Die dritte Zelllinie, Raji, exprimiert Wildtypgehalte der drei MHC Klasse II Gene. Zellen einer jeden Linie wurden unter Verwendung von Standardtechniken mit Antikörpern gegen DR (LB3.1), DQ (SPV. L3, die äquivalent zu Genox.53 sind), DP (B7/21), Klasse I Moleküle (W6/32) oder Kb (Y-3) angefärbt und dann durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS; Fig. 6) analysiert. Diese Daten zeigen an, dass eine Expression des α-TDF/CIITA-Interaktionsdomäne fusionierten Proteins in Säuger B-Zellen eine Expression der MHC Klasse II Gene auf der Oberfläche der mutierten Zelllinien wiederherstellt. Somit können die Aminosäuren 301-1130 von CIITA als eine Interaktionsdomäne fungieren.

Beispiel 2: Auf Zellen basierender Test von Verbindungen, die Interaktionsdomänen-Inhibitoren sind

Das oben beschriebene Verfahren kann zum Bereitstellen eines Verfahrens zur Bestimmung, ob eine Verbindung CIITA-abhängige Transkription hemmt, modifiziert werden. In diesem Verfahren wird eine zu testende Verbindung einfach zu der Kultur transfizierter Zellen hinzugefügt. Eine Verbindung, die die Fähigkeit des α-TDF/CIITA fusionierten Proteins zur Wiederherstellung der Expression der MHC Klasse II Moleküle auf der Zelloberfläche hemmt, ist ein potentielles Autoimmunkrankheits-Therapeutikum. Dieses Verfahren ermöglicht ebenfalls die Identifizierung von Verbindungen, die Isotyp-spezifische Transkriptionsinhibitoren sind. Zum Beispiel ist eine Verbindung, die bewirkt, dass das α-TDF/CIITA fusionierte Protein eine Expression von nur einer Untergruppe der MHC Klasse II Gene wiederherstellt, ein Isotyp-spezifischer Inhibitor. Solch eine Verbindung ist insbesondere als ein potentielles Autoimmunkrankheits-Therapeutikum wertvoll, da sie eine selektive Hemmung von MHC Klasse II Gentranskription ermöglicht. Der oben beschriebene auf Zellen basierende Test kann alleine oder in Verbindung mit dem unten beschriebenen Test verwendet werden, der zwei fusionierte Proteine verwendet.

Das CIITA-interagierende Zielprotein

In anderen Tests kann eine Verbindung, die CIITA-abhängige Transkription hemmt, ebenfalls aufgrund ihrer Fähigkeit ein Binden der CIITA-Interaktionsdomäne an ihr Zielprotein in der zellulären Transkriptionsmaschinerie zu hemmen, identifiziert werden. Da wir nun entdeckt haben, dass die Funktion der Aminosäuren 301-1130 von CIITA ist, Transkription durch Binden an (ein) andere(s) Protein e) (hierin als das(die) Zielprotein(e) bezeichnet) in der Zelle zu vermitteln, kann das CIITA Zielprotein schnell und herkömmlich durch Anwendung der weitverbreitet verwendeten als Interaction-Trap Klonierung bekannten Technik kloniert werden. Wie unten beschrieben, kann eine Modifikation der Interaction-Trap Klonierung verwendet werden, um Verbindungen zu identifizieren, die ein Binden der CIITA-Interaktionsdomäne an ihr Zielprotein hemmen; solche Verbindungen sind potentielle Autoimmunkrankheits -Therapeutika. Kurz zusammengefasst verwendet Interaction-Trap Klonierung die Interaktionsdomäne eines Proteins und die Aktivierungsdomäne eines zweiten Proteins, um schnell und einfach ein Zielprotein zu identifizieren, das mit der Interaktionsdomäne assoziiert. Das Zielprotein verleiht der Interaktionsdomäne die Fähigkeit, Transkription eines Repotergens zu vermitteln; Transkription kann, wie infra beschrieben, untersucht werden. Unter Verwendung dieses Systems und der CIITA- Interaktionsdomäne, die wir entdeckt haben, kann das Zielprotein der CIITA-Interaktionsdomäne schnell und einfach kloniert werden. Es folgt nun eine Beschreibung der Klonierung des CIITA Zielproteins und der Verwendung der CIITA-Interaktionsdomäne, um potentielle Autoimmunkrankheit-Therapeutika zu identifizieren.

Beispiel 3: Klonierung des CIITA-interagierenden Zielproteins

Zum Klonieren des Zielproteins der CIITA-Interaktionsdomäne, wird eine Wirtszelle (z. B. eine Hefezelle des Stammes EGY48) mit einem ersten Plasmid, das ein erstes fusioniertes Protein codiert, transformiert. Das erste fusionierte Protein schließt ein an die CIITA-Interaktionsdomäne ohne eine CIITA-Aktivierungsdomäne fusioniertes DNA Bindeprotein (z. B. die N-terminalen 202 Aminosäuren von LexA) ein. Die Hefezelle trägt ebenfalls ein Reportergen (z. B. ein lacZ, CAT, GUT, menschliches Wachstumshormon, alkalische Phosphatase oder Luciferase -Gen) das an eine regulatorische Sequenz, an die das erste fusionierte Protein bindet, zweckorientiert verknüpft ist. Das Reportergen kann auf einem Plasmid oder einem Chromosom lokalisiert sein. Zusätzlich wird die Hefezelle mit 7 einem Plasmid transformiert, das ein zweites fusioniertes Protein codiert. Das zweite fusionierte Protein schließt die an ein Testpolypeptid, das wie hierin infra beschrieben bezüglich seiner Fähigkeit Transkription des Reportergens zu vermitteln, getestet ist, fusionierte Transkriptionsaktivierungsdomäne eines Proteins (z. B. die B42 saure Aktivierungsdomäne (Ma et al., 1988, Cell 55: 443-446)) ein. Das Polypeptid, das eine Transkripton des Reportergens ermöglicht, ist das Zielprotein der CIITA-Interaktionsdomäne. DNA Moleküle, die das potentielle Zielprotein codieren, werden aus einer Bibliothek erhalten (wie zum Beispiel eine cDNA Bibliothek, die aus einer poly-A&spplus; RNA präpariert wurde, die aus menschlichem Burkitt B Zell-Lymphom erhalten wurde, Raji). In Kontrolltests wird die CIITA-Interaktionsdomäne durch die Interaktionsdomäne eines anderen Proteins ersetzt (z. B. pHRFM1 oder CDK2 (Zervos und Gyuris, infra)).

Beispiel 4: Verwendung der CIITA-Interaktionsdomäne zur Identifizierung von Autoimmunkrankheits-Therapeutika

Verbindungen, die eine Transkription durch Stören der CIITA-Interaktionsdomäne hemmen, können durch Testen der Fähigkeit der Verbindung, ein Binden der CIITA-Interaktionsdomäne an ihr Zielprotein zu hemmen, identifiziert werden. Jedes Verfahren, das Protein-Protein Interaktionen misst, kann zur Identifizierung von Verbindungen verwendet werden, die, wenn sie zu dem Test hinzugefügt werden, die Protein-Protein Interaktion hemmen. Zum Beispiel sind auf ELISAs, Southwestern Blotten, Filter- und Membran-gebundene Proteine und immobilisierte Proteine basierende Tests unter den Tests, die zum Messen der Bindungshemmung der CIITA-Interaktionsdomäne an ihr Zielprotein verwendet werden können. Es folgt nun ein detailliertes Beispiel eines Verfahrens zur Identifizierung von Verbindungen, die die Funktion der CIITA-Interaktionsdomäne hemmen, und die, deshalb potentielle Autoimmunkrankheits-Therapeutika sind.
In einem bevorzugten Verfahren wird eine Wirtszelle (z. B. eine Hefezelle des Stammes EGY48) mit einem ersten Plasmid transformiert, das ein erstes fusioniertes Protein codiert. Das erste fusionierte Protein schließt ein an die CIITA-Interaktionsdomäne ohne eine CIITA-Aktivierungsdomäne fusioniertes DNA-Bindeprotein (z. B. die N- terminalen 202 Aminosäuren von LexA) ein. Die Hefezelle trägt ebenfalls ein Reportergen (z. B. ein lacZ, CAT, GUS, menschliches Wachstumshormon, alkalische Phosphatase oder Luciferase -Gen), das zweckorientiert an eine regulatorische Sequenz verknüpft ist, an die das fusionierte Protein bindet. Das Reportergen kann auf einem Plasmid oder einem Chromosom lokalisiert sein. Zusätzlich wird die Hefezelle mit einem Plasmid transformiert, das ein zweites 1 fusioniertes Protein codiert. Das zweite fusionierte Protein schließt die Transkriptionsaktivierungsdomäne eines Proteins (z. B. B42), die an das Zielprotein der CIITA- Interaktionsdomäne fusioniert ist, ein.
Nützliche Verbindungen werden durch ihre Fähigkeit Transkription des Reportergens in diesem Test zu hemmen, identifiziert. Kleine Kulturen transfomierter Zellen werden mit den zu untersuchenden Verbindungen vermischt und in einem Medium, das geeignet ist, eine Expression der Plasmide unter geeigneten Bedingungen (z. B. bei 30ºC unter Rühren über Nacht) aufrechtzuerhalten, kultiviert. Der Genexpressionsgehalt wird dann gemessen. Zum Beispiel kann, wenn das lacZ Gen als das Reportergen verwendet wird, die Menge des produzierten blauen Chromophors bei Vorhandensein von X-gal bestimmt werden (z. B. durch Messen der optischen Dichte oder durch manuelle Untersuchung der Zellkulturfarbe). Verbindungen, die eine Transkriptionsaktivierung in Tests unter Anwendung der CIITA- Interaktionsdomäne, aber nicht der Kontrollinteraktionsdomäne hemmen, können eine Expression der MHC Klasse II Moleküle hemmen und sind deshalb ernste Kandidaten für Autoimmunkrankheits-Therapeutika. Dieser Test kann alleine oder in Kombination mit dem in Beispiel 2 beschriebenen auf Zellen basierenden Test verwendet werden.

Identifizierung der CIITA Klon 13 Mutante

Wir haben eine Mutation in CIITA identifiziert, die die Fähigkeit des Proteins eine Transkription bestimmter MHC Klasse II Isotypen zu aktivieren, verändert. Dieses mutierte CIITA, Klon 13 CIITA genannt, ist in der Klon 13 Zelllinie, einem Derivat des menschlichen B-Zell Lyphoms, Jijoye (erhältlich von L. Glimcher, Harvard University, MA) vorhanden. Dem Klon 13 CIITA fehlt eine Transkription der DR und DP Isotypen, aber nicht des DQ Isotyps der MHC Klasse II Gene. Wir haben entdeckt, dass eine Expression des Wildtyp CIITA Gens in Klon 13 Zellen, den Zellen die Fähigkeit verleiht, die DR und DP Isotypen zu transkribieren. In diesen Untersuchungen wurde das CIIWA Gen in den Vektor pCMV kloniert und der resultierende Vektor, pCMV. ciita (Fig. 5) wurde dann durch Elektroporation in Klon 13 Zellen transfiziert.
Die transfizierten Zellen wurden mittels FICS hinsichtlich einer Expression der DR und DP Isotypen untersucht (Fig. 7). Als Kontrollen wurden Raji Zellen (die DR, DP und DQ Isotypen exprimieren) und die nichttransformierten Klon 13 Zellen auf gleiche Weise untersucht. Standardtechniken wurden zum Anfärben der Zellen mit Antikörpern verwendet. Zusätzlich zur Färbung der Zellen mit anti-DR (LB3.1; L243 Antikörper von Becton-Dickinson können ebenfalls verwendet werden), anti-DQ (Genox.53; ATCC #HB103) oder anti-DP (B7/21; Becton-Dickinson) Antikörpern wurden die Zellen mit anti-Klasse I Antikörpern (W6/32; eine Positivkontrolle, ATCC #HB95) und anti-Kb Antikörpern (Y-3; eine Negativkontrolle, ATCC #HB176) gefärbt. Bezugnehmend auf Fig. 7 steigert eine Expression von CIITA in Klon 13 Zellen die relative Fluoreszenz solcher Zellen, wenn sie mit anti-DP, anti-DR oder anti-DQ Antikörpern gefärbt sind. Somit korrigiert eine Expression von Wildtyp CIITA in Klon 13 Zellen die Defizienz des mutierten CIITA des Klon 13.

Beispiel 5: Identifizierung von Isotyp-spezifischen Verbindungen

Die Interaktionsdomäne des mutierten CIITA von Klon 13 kann in den in Beispiel 4 beschriebenen Tests zur Identifizierung von Verbindungen, die Isotyp-spezifische Inhibitoren der CIITA-abhängigen Transkription sind, verwendet werden. Wenn erwünscht, kann die Klon 13 CIITA Transkriptionsaktivierungsdomäne oder das Polypeptid vollständiger Länge in anderen Tests zur Identifizierung nützlicher Verbindungen verwendet werden. Verbindungen, die CIITA abhängige Transkription unter Einbeziehung von Wildtyp CIITA, aber nicht unter Einbeziehung des mutierten CIITA von Klon 13 hemmen, sind zur Expressionshemmung der DR und DP MHC Klasse II Isotypen, ohne eine Expression des DQ Isotypes zu hemmen, nützlich. Solche Verbindungen sind Isotyp-spezifisch und können zur Expressionshemmung bestimmter Gene, die an der Induktion einer Immunantwort beteiligt sind, ohne eine allgemeine Immunsuppression zu bewirken, verwendet werden. Da zahlreiche Autoimmunkrankheiten, wie zum Beispiel rheumatoide Arthritis (siehe Tabellen 1 und 2) mit bestimmten Isotypen assoziiert sind, sind Verbindungen, die eine Expression einer Untergruppe der MHC Klasse II Gene hemmen können, besonders wertvoll zur selektiven Beeinflussung des Immunsystems.

Andere Anwendungsfälle

Zum Beispiel sind die Aktivierungs- und Interaktionsdomänen von anderen Isotyp-spezifischen CIITA Mutanten als das Klon 13 CIITA im Rahmen der Erfindung. Isotypspezifische CIITA Mutanten können wie unter bei Klon 13 CIITA beschrieben, identifiziert werden. Zelllinien, denen eine Expression einer Untergruppe an MHC Klasse II Genen fehlt, sind mögliche Quellen für Isotyp-spezifische CIITA Proteine. Eine Zelllinie, die ein Isotyp-spezifisches CIITA enthält, kann durch Expression von Wildtyp CIITA in der möglichen Zelllinie und durch Bestimmung, ob eine Expression von CIITA den Expressionsmangel des/der MHC Klasse II Gen(e) korrigiert, identifiziert werden. Das mutierte CIITA Gen kann unter Verwendung der bei Klon 13 CIITA beschriebenen Techniken kloniert werden. Somit sind die in Beispiel 5 dargestellten Verfahren zur Isolierung anderer Isotyp-spezifischer CIITA Mutanten, die zur Bestimmung, ob eine Verbindung ein Isotypspezifischer Transkriptionsinhibitor ist, nützlich. Zusätzliche Verfahren zur Untersuchung von CIITA-abhängiger Transkription sind ebenfalls im Rahmen der Erfindung. Zum Beispiel können die kürzlich beschriebenen Transkriptionstests (siehe z. B. Keegan et al., 1986, Science 23: 699; Ma et al., 1987, Cell 48: 847; Lin et al., 1988, Cell 54: 659; Sadowski et al., 1988, Nature 335: 563; Roberts et al., 1993, Nature 363: 741; und Ma et al., 1988, Cell 55 : 443) mit geeignetem Ersatz der CIITA -Transkriptionsaktivierungsdomäne zur Identifizierung nützlicher Verbindungen durch einfaches Zufügen der Verbindungen zu dem Test verwendet werden. Zusätzlich können Modifikationen des oben beschriebenen Tests in der Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel können andere DNA Bindeproteine, wie GAL4 anstelle von LexA verwendet werden. Reportergene, wie Chloramphenicolacetyltransferase (CAT), Luciferase, β-Glucuronidas (GUS), menschliches Wachstumshormon, alkalische Phosphatase oder ein beliebiges Gen, dessen Expression getestet werden kann, können das lacZ Gen ersetzen. Andere Wirtszellen als Hefe können ebenfalls verwendet werden; zum Beispiel sind prokaryotische und andere eukaryotische Zellen (z. B. bakterielle, Säuger- und Pflanzenzellen) nützlich. Verfahren zur Messung von Protein-Protein Interaktionen, wie zum Beispiel Tests, die auf ELISAs, Southwestern-Blotten, Filter- und Membran-gebundene Proteine und immobilisierte Proteinen basieren, können ebenfalls zur Identifizierung von Verbindungen verwendet werden, die ein Binden der CIITA- Interaktionsdomäne an ihr Zielprotein, hemmen. Es wird schnell deutlich, dass molekularbiologische Standardtechniken einem die Fähigkeit verleihen, die CIITA-Interaktionsdomäne in anderen Test der Protein-Protein Interaktionen zu verwenden.

Konstruktion von Plasmiden

Die originalen CIITA Templates wurden mittels RT-PCR mit polyA&spplus; RNA, die αus der HLA Klasse II positiven B- Lymphoidzelllinie Raji extrahiert wurde, erhalten. Die PCR-Produkte wurden dann direkt in pCRII (Invitrogen) kloniert. Von den erhaltenen Klonen wurden drei (pCRII.ciita.b, pCRII.ciita.h und pCRII.ciita.p) verwendet, um ein vollständiges cDNA eukaryotisches Expressionskonstrukt zu erzeugen (siehe Fig. 5 und 8).
pCRII.ciita.b: Die für dieses Konstrukt verwendeten CIITA-spezifischen PCR-Primer waren 5'- GGAAGCTGAGGGCACGAGGAG-3' für das 5'-Ende und 3'- CAGAAGAGACAGGGGACGGTAAC-5' für das 3'-Ende.
pCRII.ciita.h: Die für dieses Konstrukt verwendeten CIITA-spezifischen PCR-Primer waren 5'- CTCCAACAAGCTTCCAAAATG-3' für das 5'-Ende und 3'- GTACAAGAGACTCCTGTGATTG-5' für das 3'-Ende.
pCRII.ciita.p: Die für dieses Konstrukt verwendeten CIITA-spezifischen PCR-Primer waren 5'- GTCCCTGAAGGATGTGGAAGAC-3' für das 5'-Ende und 3'- GTCTGACCTTCGTGTCGAAG-5' für das 3'-Ende.
pCMV.ciita: Dieses Konstrukt wurde über eine Mehrschritt-Subklonierung unter Verwendung von pLB-1 als der Vektor und pCRII.ciita.b, pCRII.ciita.h und pCRII.ciita.p als Inserts durchgeführt. Zuerst wurde die Vektor-DNA mittels Schneiden von pLB-1 mit HindIII, Behandlung mit T4-Polymerase und anschließendem NotI Aktivierungsverdau präpariert; das 5' CIITA-DNA-Insert wurde mittels Schneiden von pCRII.ciita.b mit EcoRI an Stellen, die das PCR- Insert in pCRII-Konstrukten flankieren, Gel-Aufreinigung des kleineren Fragments, T4-Polymerase-Behandlung und anschließendem NotI Aktivierungsverdau (NotI an Nukleotid 1340 in der CIITA-Sequenz) hergestellt. Diese beiden Fragmente wurden mit T4-Ligase ligiert und das resultierende pCMV.ciita Subkonstrukt wird als pCMV.ciita.b bezeichnet.
pCMV.ciita.b wurde dann mit BamHI verdaut und das kleinere Fragment wurde Gel-gereinigt, mit T4-Polymerase stumpfe Enden erzeugt und mittels NotI Verdau aktiviert; pCRII.ciita.p wurde ähnlicherweise mit EcoRI geschnitten, mit T4-Polymerase stumpfe Enden erzeugt und anschließend erfolgte ein NotI Aktivierungsverdau. Das kleinere Fragment wurde Gel-gereinigt und verwendet. Der Vektor und die Insert-Fragmente wurden mit T4-Ligase ligiert und das resultierende zweite Subkonstrukt von pCMV.ciita wurde als pCMV.ciita.bp bezeichnet.
pCMV.ciita.bp wurde weiter mit BamHI und NotI verdaut; pCRII.ciita.h wurde ebenfalls mit BamHI und NotI verdaut und das kleinere Fragment wurde Gel-gereinigt. Diese beiden Fragmente wurden mit T4-Ligase ligiert und das resultierende Konstrukt, das die CIITA cDNA-Sequenzen (Nucleotide 48-4471) enthält, wird als pCMV.ciita.bp bezeichnet.
pCMV.CIITA: Dieses Konstrukt wurde hergestellt, nachdem pCMV.ciita konstruiert und seine biologische Funktion die Wiederherstellung der allgemeinen HLA Klasse II Expression (durch Transfektion von HLA Klasse II negativer Zelllinien (RM3 und Klon 13) und FACS-Analyse) bestätigt worden war. Das als pKS/CIITA (+) bezeichnete CIITA cDNA- Konstrukt (erhalten von Dr. B. Mach, Universität Genf; Genf; Schweiz) wurde ebenfalls in diesen Experimenten verwendet. In diesem Plasmid war pBluescript KS (+) (Stratagene) der Vektor und die cDNA war in der SalI Stelle der multiplen Klonierungsstelle inseriert. Zur Herstellung von pCMV.CIITA wurde pCMV mit XhoI und NheI verdaut und das CIITA-Fragment wurde mittels Schneiden von pKS/CIITA mit XhoI und SpeI, deren Erkennungsstellen das cDNA-Insert flankieren, erhalten. Die beiden Fragmente wurden mit T4-Ligase ligiert und das resultierende Konstrukt wurde als pCMV.CIITA bezeichnet (die Großbuchstaben weisen darauf hin, dass die DNA-Quelle aus der originalen cDNA-Bibliothek stammte).
pEG. CIITA: Dieses Plasmid wurde unter Verwendung von pEG.CIITA. SalI und pTrc.CIITA hergestellt. pEG.CIITA. SalI wurde mit BamHI verdaut und das größere Fragment wurde Gel-gereinigt; die CIITA-Sequenz wurde mittels Verdau von pTrc.ciita mit BamHI erhalten und der Vektor und das Insert wurden mit T4-Ligase ligiert.
pEG.CIITA. SalI pEG202 wurde zuerst mit Sah linearisiert und mit CIP dephosphoryliert; CIITA cDNA wurde mittels SalI Verdau von pCMV.CIITA erhalten; der Vektor und das Insert-Fragment wurden dann ligiert und das resultierende pEG Zwischenkonstrukt mit dem CIITA cDNA Insert wurde als pEG.CIITA. SalI bezeichnet.
pTrc.ciita Dieses Konstrukt wurde ursprünglich aus einer Überexpression des rekombinanten CIITA Proteins erzeugt. Zuerst wurde die 5' CIITA-Sequenz in die BamHI Stelle und die XhoI Stelle von pTrcHis C (Invitrogen) kloniert (unter Verwendung von PCR, auf die selbe Weise wie bei der Konstruktion von pEG.ciita.N29, unten). Das resultierende Plasmid, als pTrc5 oder Trc/ciita5 bezeichnet, wurde mit XhoI linearisiert, mit T4-Polymerase stumpfe Enden erzeugt und mit DraIII aktiviert; die stromabwärts liegenden 3790 bp von CIITA wurden mittels Verdau von pCMV.ciita mit ScaI und DraIII erhalten und die beiden Fragmente wurden ligiert.
pEG.ciita.N29: Ein Paar PCR-Primer wurden entwickelt, um die N-terminalen 29% von CIITA im Leserahmen in pEG202 im Anschluss an das 202. Codon des LexA N-Terminus zu fusionieren. Die Sequenz für den 5' Rückwärtsprimer ist AATGGATCcgttgcctggctcca (Großbuchstaben weisen auf die markierte Sequenz, die eine BamHI Stelle umfasst, um ein Klonieren im Leserahmen zu ermöglichen) und die Sequenz des 3'-Vorwärtsprimer lautet CCGCTCGAGcggcaccatacgtgt (die markierte Sequenz umfasst eine XhoI Stelle). Diese Primer wurden mit dem vollständigen CIITA cDNA Template in der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet, um ein 1060 bp Fragment zu erzeugen. Die PCR-Reaktionsprofile waren drei Zyklen mit 95ºC für 5 Minuten, 55ºC für 5 Minuten und 72ºC für 3 Minuten; anschließend folgten 30 Zyklen mit 95ºC für 1 Minute, 60ºC für 2 Minuten und 72ºC für 1 Minute. Das resultierende DNA-Fragment wurde mit BamHI und XhoI verdaut und in die entsprechenden BamHI und XhoI Stellen des pEG202 Vektors kloniert. Das Stopp- Codon für dieses Fusionsprotein ist durch die Vektor- Sequenz im Anschluss an die XhoI Stelle von pEG202 gegeben.
pCMV und pLB-1: pCMV ist ein EBV Überexpressionsvektor, der mittels partiellem Verdau von pREP7 (Invitrogen) mit SalI; Einfügen eines BglII Linkers in die zweite SalI Stelle (Nt. 1091) nach Herstellen stumpfer Enden mit Klenow; Doppelverdau mit Hindill und BglII; und schließlich Ligation mit dem CMV-Promotor-Fragment von pCDM8 (Invitrogen), das mittels SpeI Verdau von pCDM8 hergestellt wurde; Erzeugen stumpfer Enden mit Klenow; BglII Linker-Insertion; und Hindill und BglII Verdau und Gel- Aufreinigung erzeugt ist. Der zur Herstellung des ersten ciita (Kleinbuchstaben weisen darauf hin, dass das Konstrukt ein PCR-abgeleitetes Produkt ist) Subkonstrukts verwendete tatsächliche Vektor war pLB-1, der von pCMV durch Insertion einer ~1 kb Stuffer-DNA zwischen den HindIII und NotI Stellen abgeleitet war, um den HindIII/NotI Doppelverdau zu erleichtern.
pEG.CIITA.C74: pEG202 wurde mit BamIII linearisiert, mit T4-Polymerase stumpfe Enden erzeugt und mit SalI aktiviert; das Insert wurde mittels Verdau von pCMV.CIITA mit SphI hergestellt, mit T4-Polymerase stumpfe Enden erzeugt und mit SalI aktiviert; die beiden Fragmente wurden dann ligiert.
pEG.CIITA.C50: pEG202 wurde mit EcoRI linearisiert, mit T4-Polymerase stumpfe Enden erzeugt und mit SalI aktiviert; das Insert wurde mittels Verdau von pCMV.CIITA mit NcoI hergestellt, mit T4-Polymerase stumpfe Enden erzeugt und mit SalI aktiviert; die beiden Fragmente wurden dann ligiert.
pEG.CIITA.C30: pEG202 wurde mit BamHI linearisiert, mit T4-Polymerase stumpfe Enden erzeugt und mit SalI aktiviert; das Insert wurde mittels Verdau von pCMV.CIITA mit KpnI hergestellt, mit T4-Polymerase stumpfe Enden erzeugt und mit SalI aktiviert; die beiden Fragmente wurden dann ligiert.
pEG.CIITA.C14: pEG. CiiTA wurde vollständig mit BamHI geschnitten, verdünnt und ligiert. Ein rezirkularisiertes Deletionskonstrukt, das den CIITA ORF N-14% enthält, wurde unter Verwendung von Standardtechniken isoliert.
pEG.ciita.N70: pEG202 wurde mit XhoI linearisiert, mit T4-Polymerase stumpfe Enden erzeugt und mit BamHI aktiviert. Das Insert wurde mittels Verdau von pET.CiiTA mit KpnI hergestellt, mit T4-Polymerase stumpfe Enden erzeugt und mit BamHI aktiviert; die beiden Fragmente wurden dann ligiert. pET.CiiTA, ein Konstrukt für CIITA- Überexpression wurde durch Klonieren des CIITA offenen Leserahmens, wie in der obigen Konstruktion von pEG. CiiTA, in pET28c (Novagen) hergestellt.
pEG.ciita.N56: pEG202 wurde mit XhoI linearisiert, mit T4-Polymerase stumpfe Enden erzeugt und mit BamHI aktiviert; das Insert wurde mittels Verdau von pET.ciiTA mit SfiI hergestellt, mit T4-Polymerase stumpfe Enden erzeugt und mir BamHI aktiviert; die beiden Fragmente wurden dann ligiert.
pEG.ciita.N22: Das Insert wurde mittels Verdau des ciita-haltigen NheI/XhoI Fragments von pTrc5 mit BanI, mit T4-Polymerase stumpfe Enden erzeugt und Schneiden mit BamHI erhalten. Der Vektor wurde durch Linearisieren von pEG202 mit XhoI, Erzeugen stumpfer Enden mit T4-Polymerase und schließlich Schneiden mit BamHI hergestellt. Das hergestellte Insert und der Vektor wurden dann ligiert.
pEG.ciita.N17: Das Insert wurde mittels Verdau des kleinen NheI/XhoI Fragments von pTrc5 mit EaeI, Erzeugen stumpfer Enden mit T4-Polymerase und schließlich Schneiden mit BamHI erhalten. Der Vektor wurde durch Linearisieren von pEG202 mit XhoI, Erzeugen stumpfer Enden mit T4-Polymerase und schließlich Schneiden mit BamHI hergestellt. Das hergestellte Insert und der Vektor wurden dann ligiert.
pEG.ciita.N12: Das Insert wurde mittels Verdau des kleinen NheI/XhoI Fragments von pTrc5 mit MspI, Erzeugen stumpfer Enden mit T4-Polymerase und schließlich Schneiden mit BamHI erhalten. Der Vektor wurde durch Linearisieren von pEG202 mit SalI, Erzeugen stumpfer Enden mit T4-Polymerase und schließlich Schneiden mit BamHI hergestellt. Das hergestellte Insert und der Vektor wurden dann ligiert.
pEG.ciita.N7.6: Das Insert wurde mittels Verdau des kleinen NheI/XhoI Fragments von pTrc5 mit EcoNI, Erzeugen stumpfer Enden mit T4-Polymerase und schließlich Schneiden mit BamHI erhalten; der Vektor wurde durch Linearisieren von pEG202 mit XhoI, Erzeugen stumpfer Enden mit T4-Polymerase und schließlich Schneiden mit BamHI hergestellt. Das hergestellte Insert und der Vektor wurden dann ligiert.
pEG.C-αTDF: Dieses Konstrukt wurde durch Insertion der C-terminalen 16% des HSV1 (Stamm F) α-Transduktionsfaktors (Pellett et al., 1985, PNAS 82 : 5870-5874; Hinterlegungsnummer K03350) in pEG202 hergestellt.
pEG.C'-αTDF: Dieses Konstrukt wurde durch Insertion der C-terminalen 16% (außer den äußersten 3 C-terminalen Codons) vom HSV1 (Stamm F) α-Transduktionsfaktor hergestellt. Das Insert in diesem Konstrukt wurde später zur Konstruktion von pCMV.αTDF-CIITA.C70 verwendet.
pCMV.ciita ΔHindIII: Dieses Konstrukt enthält die CIITA N-terminalen 29% des ORF und wurde mittels Verdau von pCMV.ciita mit HindIII, Reinigung der Hauptbande und Rezirkularisierung hergestellt.
pCMV.CIITA.C74: Dieses Konstrukt enthält die 25 N- terminalen Codons und etwa 74% des C-terminalen ORF von CIITA. Es wurde mit Hilfe einer Mehrschrittklonierurg hergestellt. Zuerst wurde pKS/CIITA(+) mit NcoI geschnitten, mit T4-Polymerase stumpfe Enden erzeugt und mit XhoI wie der Vektor geschnitten. Parallel dazu wurde er mit SphI geschnitten, mit T4-Polymerase stumpfe Enden erzeugt und dann mit XhoI wie das Insert geschnitten. Die beiden Fragmente wurden mit T4-Polymerase ligiert und das resultierende Konstrukt wurde als pKS.CIITA ΔN/S bezeichnet. Zur Erzeugung von pCMV.CIITA.C74 wurde pKS.CIITA ΔN/S mit SpeI und XhoI geschnitten und das CIITA-haltige Fracment wurde dann in einen NheI/XhoI geschnittenen Vektor inseriert.
pCMV.αTDF-CIITA.C70: Dieses wurde mit Hilfe einer Mehrschrittsubklonierung hergestellt. Zuerst wurde pKS/CIITA(+) mit Tth111I geschnitten, mit T4-Polymerase stumpfe Enden erzeugt und dann mit T4-Ligase ligiert. Dieses Zwischenkonstrukt wurde als pKS/CIITA.ΔTth bezeichnet. Es wurde dann mit NcoI und AatII geschnitten, mit T4-Polymerase stumpfe Enden erzeugt und dann im Leserahmen mit einem Fragment, das die C-terminalen 16% (außer die 3 äußeren C-terminalen Codons) von HSV1 (Stamm F) α-Transduktionsfaktor codiert, ligiert. Dieses zweite Zwischenkonstrukt wurde als pKS/αTDF-CIITA. ATth bezeichnet. Das 5' aTDF-CIITA haltige NotI Fragment wurde dann zum Ersetzen des entsprechenden NotI Fragments von pKS/CIITA(+) verwendet. Dieses dritte Zwischenkonstrukt wurde als pKS/αTDF-CIITAC.70 bezeichnet. Zur Erzeugung von pCMV.αTDF-CIITA. C70 wurde pKS/αTDF-CIITAC.70 mit SpeI und XhoI geschnitten. Das αTDF-CIITA haltige Fragment wurde dann in einen NheI/XhoI geschnittenen Vektor inseriert.

SEQUENZLISTE

(1) ALLGEMEINE INFORMATION
(1) ANMELDER: Gincher, Laurie H.
Zhou, Hong
Douhan III, John
(11) TITEL DER ERFINDUNG: VERFAHREN ZUR IDENTIFIZIERUNG VON VERBINDUNGEN, DIE ZUR BEHANDLUNG VON AUTOIMMUNKRANKHEITEN VERWENDBAR SIND
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 1
(iv) POSTANSCHRIFT:
(A) NAME: Fish & Richardson
(B) STRASSE: 225 Franklin Street
(C) STADT: Boston
(D) BUNDESSTAAT: MA
(E) STAAT: USA
(F) PLZ: 02110-2804
(v) COMPUTER LESBARE FORM: Nein
(A) MEDIUMTYP: Floppy Disk
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOC/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30B
(vi) GEGENWÄRTIGE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER:
(B) EINREICHUNGSDATUM:
(C) KLASSIFIKATION:
(viii) PATENTANWALT:
(A) NAME: Freeman, John, W.
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 29.066
(C) REFERENZ/DOCKET NUMBER: 00246/188001
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 1:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 3393 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-TYP: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL: Nein
(A) NAME/SCHLÜSSEL: DCS
(B) ORT: 1..3393 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 1:

Claims

1. Verfahren zur in vitro Bestimmung, ob eine Verbindung die Fähigkeit eines Polypeptids zur Aktivierung der Transkription hemmt, wobei das Polypeptid dadurch gekennzeichnet ist, daß es eine CIITA-Transkriptionsaktivierungsdomäne umfasst und ihm eine funktionelle CIITA-Interaktionsdomäne fehlt, wobei die Transkriptionshemmung anzeigt, daß die Verbindung ein potentielles Autoimmunkrankheits-Therapeutikum ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, (a) wobei die Hemmung der Transkriptionsaktivierung gemessen wird durch

a) Bereitstellen eines fusionierten Proteins, das das an ein DNA-Bindungsprotein fusionierte Polypeptid umfasst;

b) Bereitstellung einer Transkriptionsregulations- DNA-Sequenz, die mit einem Reportergen in einem System zweckorientiert verknüpft ist, das zur Transkription des Reportergens geeignet ist, wenn das fusionierte Protein an die regulatorische DNA-Sequenz gebunden wird;

c) Bereitstellung des fusionierten Proteins und der Verbindung in dem System; und

d) Messen der Fähigkeit der Verbindung zur Hemmung der Transkription des Reportergens; oder

(b) das außerdem das Messen der Fähigkeit der Verbindung zur Hemmung der Fähigkeit eines zweiten Polypeptids zur Aktivierung der Transkription umfasst, wobei das zweite Polypeptid dadurch gekennzeichnet ist, daß es eine Isotyp-spezifische CIITA-Transkriptionsaktivierungsdomäne umfasst und ihm eine funktionelle CIITA-Interaktionsdomäne fehlt, wobei das Verfahren Isotyp-spezifische Verbindungen identifiziert.

3. Eine im wesentlichen reine DNA, die eine CIITA- Transkriptionsaktivierungsdomäne ohne Codierung einer funktionellen CIITA-Interaktionsdomäne codiert.

4. DNA nach Anspruch 3, wobei (a) die DNA die Nucleotidsequenz der Nucleotide 76-1056 von Fig. 1 (SEQ ID Nr: 1), oder degenerierte Varianten hiervon aufweist; oder

(b) die DNA eine Sequenzidentität von etwa 80% oder mehr mit den Nucleotiden 76-1056 der DNA-Sequenz von Fig. 1 aufweist; oder

(c) die CIITA Isotyp-spezifisch ist.

5. Ein im wesentlichen reines Polypeptid, das eine CIITA- Transkriptionsaktivierungsdomäne umfasst und dem eine funktionelle CIITA-Interaktionsdomäne fehlt.

6. Polypeptid nach Anspruch 5, das (a) eine Aminosäuresequenz umfasst, die im wesentlichen mit den Aminosäuren 26-352 der Aminosäuresequenz von Fig. 1 identisch ist; oder wobei (b) die CIITA Isotyp-spezifisch ist.

7. Verfahren zur in vitro Bestimmung, ob eine Verbindung die Fähigkeit eines Polypeptids zur Bindung seines Zielproteins hemmt, wobei das Polypeptid dadurch gekennzeichnet ist, daß es eine CIITA-Interaktionsdomäne umfasst und ihm eine funktionelle CIITA- Transkriptionsaktivierungsdomäne fehlt, wobei die Bindungshemmung anzeigt, daß die Verbindung ein potentielles Autoimmunkrankheits-Therapeutikum ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, (i) wobei das Verfahren die Bestimmung umfasst, ob die Verbindung die Fähigkeit des Polypeptids zur Mediation der Transkription hemmt, wobei die Hemmung der Transkription anzeigt, daß die Verbindung ein potentielles Autoimmunkrankheits- Therapeutikum ist, und die Hemmung beispielsweise gemessen wird durch

a) Bereitstellung eines ersten fusionierten Proteins, das das an ein DNA-Bindungsprotein fusionierte Polypeptid umfasst;

b) Bereitstellung einer Transkriptionsregulationssequenz für DNA-Sequenzen, die zweckorientiert mit einem Reportergen in einem System, das zur Transkription des Reportergens geeignet ist, verknüpft ist;

c) Bereitstellung eines zweiten fusionierten Proteins, wobei das zweite fusionierte Protein dadurch gekennzeichnet ist, daß es eine Transkriptionsaktivierungsdomäne umfasst, die an das Zielprotein einer CIITA-Interaktionsdomäne fusioniert ist;

d) Bereitstellung der ersten und zweiten fusionierten Proteine und der Verbindung in einem System; und

e) Messen der Fähigkeit der Verbindung zur Hemmung der Transkription des Reportergens; oder

(ii) das außerdem das Messen der Fähigkeit der Verbindung zur Hemmung der Fähigkeit eines zweiten Polypeptids zur Bindung seines Zielproteins umfasst, wobei das zweite Polypeptid dadurch gekennzeichnet ist, daß es eine Isotyp-spezifische CIITA-Interaktionsdomäne umfasst und ihm eine funktionelle CIITA-Transkriptionsaktivierungsdomäne fehlt, wobei das Verfahren Isotyp-spezifische Verbindungen identifiziert.

9. Eine im wesentlichen reine DNA, die eine CIITA- Interaktionsdomäne ohne Codieren einer funktionellen CIITA-Transkriptionsaktivierungsdomäne codiert.

10. DNA nach Anspruch 9, wobei (a) die DNA die Nucleotidsequenz der Nucleotide 901-3390 von Fig. 1 oder degenerierte Varianten hiervon aufweist; oder (b) die DNA eine Sequenzidentität von etwa 80% oder mehr mit den Nucleotiden 901-3390 der DNA-Sequenz von Fig. 1 aufweist; oder (c) die CIITA Isotyp-spezifisch ist.

11. Ein im wesentlichen reines Polypeptid, das eine CIITA- Interaktionsdomäne umfasst und dem eine funktionelle CIITA-Transkriptionsaktivierungsdomäne fehlt.

12. Polypeptid nach Anspruch 11, (a) das eine Aminosäuresequenz, die im wesentlichen zu den Aminosäuren 303- 1130 der Aminosäuresequenz von Fig. 1 identisch ist, umfasst; oder (b) wobei die CIITA Isotyp-spezifisch ist.

13. Verfahren zur in vitro Bestimmung, ob eine Verbindung die Fähigkeit eines Polypeptids zur Mediation der Transkription hemmt, wobei das Polypeptid dadurch gekennzeichnet ist, daß es eine CIITA-Interaktionsdomäne umfasst, die an eine CIITA-Transkriptionsaktivierungsdomäne fusioniert ist und ihm eine funktionelle CIITA-Transkriptionsaktivierungsdomäne fehlt, wobei die Hemmung der Transkription anzeigt, daß die Verbindung ein potentielles Autoimmunkrankheits- Therapeutikum ist.

14. Verfahren nach Anspruch 13, das außerdem die Bereitstellung des Polypeptids in einem B-Lymphozyt und Test auf Expression der MHC-Klasse II-Gene umfasst und wobei beispielsweise die Zelle eine menschliche B-Zelle ist.