DE69509357T2

DE69509357T2 - Marker für entzündungskrankheiten und/oder pathologien, die auf einer autoimmunreaktion beruhen

Info

Publication number: DE69509357T2
Application number: DE69509357T
Authority: DE
Inventors: Jean Duchateau; Genevieve Servais
Original assignee: Universite Libre de Bruxelles ULB
Current assignee: Biotech Tools SA
Priority date: 1994-10-28
Filing date: 1995-10-30
Publication date: 1999-11-18
Anticipated expiration: 2015-10-31
Also published as: WO1996013723A2; CA2179895A1; ES2133820T3; DE69509357D1; US6057097A; EP0737313A1; EP0737313B1; BE1008817A6; WO1996013723A3; CA2179895C

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Marker für pathologische Befunde, die eine Autoimmunreaktion aufweisen, und/oder für entzündliche Krankheiten, auf die Antikörper, die gegen diesen Marker gerichtet sind, und auf die Antikörper, die gegen diese Antikörper gerichtet sind. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf eine diagnostische Vorrichtung, die diesen Marker und/oder diese Antikörper aufweist.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf eine Methode zur Gewinnung des in einer Tierzelle vorhandenen Markers.

Hintergrund der Erfinduno

Zahlreiche pathologische Befunde, die eine Autoimmunreaktion aufweisen, und zahlreiche entzündliche Krankheiten haben eine ungewisse oder unbekannte Ätiologie und können einen Multifaktor-Ursprung haben.
Offensichtlich stellt eine Störung oder eine Stimulation des Immunsystems von Patienten ein wichtiges Element des Fortschreitens dieser Krankheiten oder pathologischen Befunde dar.
Unter den Autoimmunkrankheiten ist die Krankheit systemischer Lupus erythematosus (SLE) durch zahlreiche biologische und klinische Anzeichen gekennzeichnet.
Der SLE ist jedoch ein pathologischer Befund mit mehreren klinischen Anzeichen, die sich weiterentwickeln können und/oder zurückgehen können (d. h. Nieren-, Herz-, Gehirnschäden, ...). Da es keine gemeinsamen und konstanten Anzeichen für alle SLE-Patienten gibt, wurde vorgeschlagen, daß die "Diagnose" dieses pathologischen Befundes nun aufgrund der gleichzeitigen Charakterisierung von mindestens vier mit SLE zusammenhängenden, klinischen und/oder biologischen Anzeichen erhalten wird (Arthritis and Rheumatism, Band 25, Nr. 11 (1982), Official Journal of the American Rheumatism Association Section of the Arthritis Foundation).
Die Tabelle 1 gibt die Empfindlichkeit und die Spezifizität verschiedener vorläufiger Kriterien wieder, die für die Diagnose von systemischem Lupus erythematosus benutzt werden (serologische und klinische Tests). Tabelle 1: Vergleich der Empfindlichkeit und Spezifizität von Elementen in der Patienten-Datenbank von 1982 und 1971
¹: Die Empfindlichkeit wurde bei der SLE-Population bestimmt, und sie ist ausgedrückt als die Anzahl der Patienten, die positiv waren, bezogen auf die Anzahl der Patienten , bei denen Test ausgeführt wurde. Die Anzahl in Klammer gibt den Prozentsatz an.
²: Die Spezifität wurde bei der Kontrollpopulation bestimmt, und sie ist ausgedrückt als die Anzahl der Patienten, die negativ oder normal waren, bezogen auf die Anzahl der Patienten , bei denen Test ausgeführt wurde.
³: = Daten nicht verfügbar

Stand der Technik

Um die Diagnose dieses pathologischen Befundes zu verbessern, wurden jedoch Anstrengungen unternommen, um spezifische und zuverlässige Nachweisvorrichtungen auf der Basis einer Analyse der klinischen Biologie zu entwickeln.
Die gegenwärtig verwendeten Techniken beruhen auf dem Nachweis von antinuklearen Antikörpern (ANA), die gegen die in dem Zellkern vorhandenen autologen Komponenten gerichtet sind, in dem Serum. Das Vorhandensein dieser antinuklearen Komponenten ist mit klinischen Manifestationen einiger Autoimmunkrankheiten verbunden.
Der Nachweis dieser Antikörper wird im allgemeinen vor anderen Tests ausgeführt, um zu bestätigen, daß eine Autoimmunkrankheit vorliegt.
Die antinuklearen Autoantikörper (ANA) können in zwei Untergruppen unterteilt werden, die Anti-DNA-Autoantikörper und die Anti-ENA-Autoantikörper (ENA = extrahierbare nukleare Antigene).
Eine bessere Charakterisierung dieser antinuklearen Autoantikörper (ANA) würde ermöglichen, eine detailliertere Diagnose des Autoimmunkrankheitstyps zu erhalten.
Außerdem wurde gezeigt, daß Seren vor. SLE-Patienten ein Gemisch von Antikörpern enthalten, die nicht nur mit nuklearer DNA, sondern auch mit RNA und Nukleoproteinen reagieren können. Überdies haben manche Patienten, die klinische Anzeichen von systemischem Lupus erythematosus (SLE) aufweisen, keine signifikanten Titer von Anti-DNA-Antikörpern.
Folglich wurde noch nicht gezeigt, daß das Vorhandensein solcher Antikörper bei Patienten als ein charakteristischer SLE-Marker angesehen werden kann.
In dem europäischen Patent EP-0252787, das dem Institut Pasteur und dem INSERM erteilt wurde, werden eine Zusammensetzung von isolierten und gereinigten Zelloberflächen-Polypeptiden und deren Anwendung zum Nachweisen von SLE beschrieben. Diese gereinigten Polypeptide sind durch ein Molekulargewicht von weniger als 60 kD (55 kD, 43 kD, 34 kD, 33 kD, 17 kD, 16 kD und 14 kD) gekennzeichnet.
Für die entzündlichen Krankheiten und die pathologischen Befunde, die eine Autoimmunreaktion aufweisen, insbesondere für SLE, ist es jedoch noch nicht möglich gewesen, eine genügend spezifische antigene Struktur zu verwirklichen, um eine zuverlässige Diagnose (bezüglich der Spezifizität und der Empfindlichkeit) für diese pathologischen Befunde und Krankheiten zu erhalten.

Ziele der Erfindung

Die vorliegende Erfindung hat zum Ziel, einen Marker und eine diagnostische Vorrichtung zu verwirklichen, die ermöglichen, die Diagnose bei entzündlichen Krankheiten und/oder pathologischen Befunden, die eine Autoimmunreaktion aufweisen, insbesondere bei SLE und/oder dem Sjögren-Syndrom, zu verbessern.
Ein weiteres Ziel ist, einen Marker zu verwirklichen, der die Spezifizität und Empfindlichkeit der SLE-Diagnose, vorzugsweise einer Frühdiagnose von SLE, verbessert.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist, eine Methode zu verwirklichen, um den erfindungsgemäßen Marker, insbesondere eine Nukleinsäure, zu gewinnen. Noch ein weiteres Ziel der Erfindung ist, eine einfache und reproduzierbare Methode zu verwirklichen, um diesen Marker in großen Mengen zu gewinnen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine diagnostische Vorrichtung, wie sie in dem Patentanspruch 1 angegeben ist.
Unter "pathologischer Befund, der eine Autoimmunreaktion aufweist" werden Autoimmunkrankheiten und/oder Infektionen verstanden, die zu einer Störung des Immunsystems führen.
Autoimmunität ist ein Immunisierungszustand eines Menschen gegen seine eigenen Bestandteile. Die Produktion von Antikörpern durch einen Organismus, die gegen die eigenen Bestandteile des Organismus gerichtet sind, wurde bei einer Reihe von pathologischen Befunden beobachtet, wie bei SLE-Affektionen, dem Gougerot-Sjögren-Syndrom (oder dem Sjögren-Befund), der rheumatoiden Arthritis, usw. Es ist offensichtlich, daß der Ausdruck "pathologischer Befund, der eine Autoimmunreaktion aufweist" in keiner Weise auf diese Krankheiten begrenzt ist, sondern auch andere pathologische Befunde umfaßt, wie Sarkoidose und Osteopenie, Spondylarthritis, Sklerodermie, multiple Sklerose, amyotrophische laterale Sklerose, Hyperthyreoidismus, Addison-Krankheit, autoimmune hämolytische Anämie, Crohn-Krankheit, Goddpasture-Syndrom, Graves- Krankheit, Hashimoto-Thyreoiditis, idiopathische Purpura haemorrhagicä, insulinabhängiger Diabetes, Myasthenie, Pemphigus vulgaris, perniziöse Anämie, poststreptokokkale Glomerulonephritis, Psoriasis, Sklerodermie, spontane Sterilität und AIDS.
Unter "einem Teil der plasmatischen Zellmembran" wird ein aus der plasmatischen Zellmembran gewonnenes Fragment verstanden, das ein Molekulargewicht hat, das größer als 60 kD, vorzugsweise größer als 100 kD ist.
Dieser Teil (oder Epitop) kann irgendein Bestandteil der plasmatischen Membran sein, der einen oder mehr Antikörper binden kann, die in dem Serum eines Patienten vorhanden sind, der an einer entzündlichen Krankheit und/oder einem pathologischen Befund, die eine Autoimmunreaktion aufweisen, leidet. In vorteilhafter Weise ist das Fragment eine Nukleinsäure, vorzugsweise eine DNA.
Die in der plasmatischen Zellmembran vorhandene Nukleinsäure wurde früher von Lerner et al. beschrieben (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Band 68, Nr. 6, S. 1212-1216 (1971)).
Gemäß Lerner et al. ist die spezifische DNA keine virale, mykoplasmische, mitochondriale oder nukleare Nukleinsäure.
Die Erfinder haben festgestellt, daß die Nukleinsäure, die sie aus der plasmatischen Membran isoliert haben, von der plasmatischen Membran stammt und nicht von apoptotischen Zellen kommt (die erhaltene Elektrophorese entspricht nicht der Elektrophorese einer nuklearer. DNA).
Die DNA entspricht nicht einer mitochondrialen DNA, da die ORF&sub1;- und ORF&sub4;- Sonden nicht mit der erfindungsgemäßen DNA hybridisieren können.
Da die Lebensfähigkeit der Wil 2-Zelle zwischen 95 und 98% liegt, kann diese DNA nicht von der nuklearen DNA cer auf der Oberfläche der Wil 2-Zelle absorbierten, toten Zelle kommen.
Gemäß Kuo et al. (Proc. Nat. Acad. Sol. USA, Band 72, S. 5004-5006 (1975) hat die spezifische DNA wahrscheinlich einen chromosomalen Ursprung (Chromosom 9), und gemäß Meinke et al. (J. of Molecular Biology, Band 78, S. 43-56 (1973)) wurde diese DNA auch aus hepatischen und anderen lymphoiden Zellen isoliert. Weitere Merkmale der DNA (Synthese, Lokalisierung, physikalisch-chemische Eigenschaften, ...) wurden von Hall et al. beschrieben (Nature New Biology, Band 234, S. 227-229 (1971)).
Die Erfinder haben nachgewiesen, daß die gegen diese DNA gerichteten Antikörper verschieden von den antinuklearen Autoantikörpern (ANA) sind. Bennet et al. (J. of Clin. Invest., Band 71, S. 611-618 (1983), J. Rheumatol., Band 13, S. 679-685 (1986) und Clin. Exp. Immunol., Band 86, S. 374-379 (1991) konnten nicht bestätigen, daß die antinuklearen Autoantikörper (ANA) die aus der Membran von menschlichen Blutzellen gewonnene DNA binden können.
Die Ergebnisse von Bennet et al. wurden von Kubota et al. bestätigt (Immunology Letters, Band 23, S. 187-194 (1990)). Kubota et al. haben auf der Membran Histon identifiziert, das bei der Kreuzreaktivität einiger antinuklearer Autoantikörper (ANA) gegenüber der Membran der Lymphozyt B-Zell-Linie (Raji) beteiligt ist.
Daher kann dieses Histon exogene DNA binden (Emlem et al., J. Immunol., Band 148, S. 3042-3048 (1992)).
Diese Ergebnisse wurden auch von Muso und Jacob bestätigt (Clin. Immunol. and Immunopathol., Band 42, S. 370-374 (1987)). Muso und Jacob haben das Protein identifiziert, das den Histon-DNA-Komplex binden kann (Jacob et al., Proceeding of National Academy of Sciences USA, Band 86, S. 4669-4673 (1989)). Nachstehend weisen die Erfinder nach, daß es möglich ist, gereinigte Autoantikörper aus dem Serum von SLE-Patienten zu gewinnen. Diese Autoantikörper werden mittels eines chromatographischen Prozesses gewonnen, bei dem eine aus Wil 2-Zellen gewonnene cmDNA auf einem festen Träger fixiert wird. Diese Autoantikörper sind spezifisch für den SLE und können die erfindungsgemäße DNA bei einem ELISA-Test oder bei Immunofluoreszenz binden. Die Erfinder haben auch nachgewiesen, daß diese Antikörper verschieden von den antinuklearen Autoantikörpern (ANA) sind.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die gegen diesen Marker gerichteten (polyklonalen oder monoklonalen) Antikörper, oder einen Teil davon, und auf die gegen die Antimarker-Antikörper gerichteten (polyklonalen oder monoklonalen) Antikörper, oder einen Teil davon.
Der Ausdruck "ein Teil davon" bedeutet ein Fragment dieser Antikörper (wie den Fab'&sub2;-Teil), das den Marker oder die Antikörper der Erfindung spezifisch binden kann.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine diagnostische Vorrichtung, wie eine Ausrüstung oder eine chromatographische Säule, die den Marker und/oder die Antikörper der Erfindung, oder einen Teil davon aufweist. Vorzugsweise weist die diagnostische Vorrichtung auch die Reaktionspartner für den Nachweis und/oder die Bestimmung von Antikörpern oder Nukleotidsequenzen auf, nach einer Methode, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus der In-situ-Hybridisation, Hybridisation oder Erkennung durch markierte Antikörper, wie ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), oder RIA (Radio Immunoassay), Methoden auf Filter, auf einem festen Träger, in Lösung, in "Sandwich", auf Gel, Dot blot-Hybridisation, Northern blot-Hybridisation, Southern blot-Hybridisation, Isotopen- oder Nicht-Isotopen-Markierung (wie Immunofluoreszenz oder Biotinylation), Kalte-Sonden-Technik, genetischer Amplifikation, insbesondere PCR oder LCR, doppelter Immunodiffusion, Gegen- Immunoelektrophorese, Hämagglutination, Enzymkonjugation und/oder einer Kombination davon besteht.
In vorteilhafter Weise wird die Membran aus Tierzellen, vorzugsweise aus menschlichen Blutzellen, insbesondere aus Lymphoblastoiden B, wie den Wil 2- Zellen, isoliert mittels Fixierung der Membran auf einem festen Träger durch Zugabe eines organischen Lösungsmittels.
Vorzugsweise weist die Methode auch die weiteren Schritte auf, bei denen die isolierte Membran mit einem Enzym behandelt wird, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus RNase, DNase, Pronase (oder Peptidase), Lipase, Glykosidase und/oder einem Gemisch davon besteht, und bei der der erhaltene Marker zurückgewonnen wird.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf einen Prozeß gemäß Anspruch 8 für den In-vitro-Nachweis von Antikörpern, die mit entzündlichen Krankheiten und/oder pathologischen Befunden, die eine Autoimmunreaktion aufweisen, vorzugsweise dem systemischen Lupus erythematosus und/oder dem Sjögren-Syndrom zusammenhängen, in einem biologischen Fluid, das die Antikörper enthält, wobei der Prozeß die folgenden Schritte aufweist:
- das biologische Fluid, vorzugsweise ein Serum, wird in Berührung gebracht mit dem erfindungsgemäßen Marker oder einen Marker, der nach der erfindungsgemäßen Methode gewonnen wird, und/oder mit einem Antikörper, oder einem Teil davon, der gegen die Antikörper gerichtet ist (gegen den erfindungsgemäßen Marker gerichtet ist), um eine immunologische Bindung in vitro zwischen dem in dem biologischen Fluid vorhandenen Antikörper und dem Marker oder dem Antikörper zu erhalten, und
- die erhaltene Bindung wird in vitro nachgewiesen.

Kurze Beschreibung der Figuren

Die Fig. 1 und 2 geben Elektrophorese-Gele der menschlichen membranösen,
doppelsträngigen DNA wieder, die möglicherweise mit spezifischen Immunoglobulinen (IgG) von SLE präinkubiert wurde und verschiedenen Behandlungen unterworfen wurde.
Die Fig. 3, 4 und 5 geben ein Ergebnis der Immunofluoreszenz wieder, das die Bindung der Immunoglobuline von Lupus- Patienten an Plasmamembranen von kanzerösen menschlichen Lymphozytenzellen veranschaulicht.
Die Erfindung wird nun mittels der folgenden, nicht-begrenzenden Beispiele weiter beschrieben.

Beispiele

Materialien

1. Zell-Linien

Die Zell-Linien von menschlichen Lymphoblastoiden B (Wil 2 NS), die von den ICN Flow Laboratories erhalten wurden (ECACC Nr. 90112121), werden in RPMI 1640, dem 10% fötales Kalbsserum (wärme-inaktiviert und auf die Abwesenheit von Mykoplasmen getest), L-Glutamin und 40 ug/ml Gentamycin zugegeben wurden, aufbewahrt, feuchter Ofen bei 37EC und 5% CO&sub2;. Die Zellen werden in der logarithmischen Wachstumsphase herausgenommen, was einer Zelldichte von 1-1, 2 · 10&sup6; Zellen/ml entspricht, und sie zeigen einen Trypanblau-Ausschluß von mehr als 95%.

2. Seren

Die Seren werden von Patienten, die an verschiedenen entzündlichen Krankheiten oder pathologischen Befunden mit Autoimmunreaktion leiden, oder von normalen Individuen gewonnen. Die Seren werden aus zentrifugiertem, koaguliertem Blut gewonnen, und bis zur Verwendung auf -20EC gehalten.

Methoden

1. Indirekte Immunofluoreszenz bei Zellen

1.1. Immunofluoreszenz bei methanol-fixierten Zellen

Wil 2-Zellen werden mit Hankscher Lösung (Gibco BRL) zweimal gewaschen, und bei 0,5 · 10&sup6;/ml resuspendiert, und danach auf in 22 ul-Vertiefungen unterteilte Objektträger punktförmig aufgetragen.
Nach Trocknen bei 37EC in einem Ofen werden die Zellen während 3 min in Methanol fixiert, und in PBS (Phosphate Buffered Saline, 10 mM pH 7,4) einmal gewaschen. Die Zellen werden dann in Gegenwart von Ziegen-IgG (Fc-Fraktion, Organon Technica) bei 6 ug/Vertiefung in 20 ul PBS während 30 min bei Raumtemperatur inkubiert, und dann in PBS gewaschen. Dann werden sie in Gegenwart verschiedener Verdünnungen von Patienten- oder Kontrollseren bei 20 ul/Vertiefung während 25 min bei Raumtemperatur inkubiert, und wieder in PBS gewaschen. Bei manchen Experimenten wird, wie angegeben, eine IgG-Fraktion anstatt des ganzen Serums verwendet.
Die Objektträger werden in Gegenwart von 20 ul fluoreszin-konjugiertem Ziegen-Antihuman-IgG (Kallestadt), 1/50 in PBS verdünnt, während 30 min weiter inkubiert.
Eine letzte Waschung der Objektträger erfolgt mit PBS allein, und danach mit PBS, das Evansblau als Gegenfarbstoff enthält.
Schließlich werden die Objektträger in Glyzerin/PBS (2 : 1), pH 9 befestigt, und mittels eines UV-Immersionsmikroskops (Leitz Orthoplan) Vergrößerung = 10 · 40, sichtbar gemacht.
Die Auszählung der beobachteten Muster wurde wie folgt vorgenommen:
- ein negatives Ergebnis ("0") entspricht der Abwesenheit von Membran- Fluoreszenz,
- ein punktförmiges Zellmembranmuster wird willkürlich mit "1" bewertet, und
- ein peripherer, kontinuierlicher Zellmembranring wird mit "2" bewertet.

1.2. Immunofluoreszenz bei nicht-fixierten Zellen

Die Reaktionen werden bei den Zellsuspensionen bei 4EC ausgeführt, um den Rezeptorumsatz und die Internalisierung zu verringern. Kurz gesagt, Zellen (1 · 106) in I ml Kulturmedium werden in Plastikröhrchen (5 ml) gegeben, und mit PBS, das 10 mM EDTA und 0,01% Na-Azid enthält (PBS EA) durch Zentrifugation (500 xg, 10 min) gewaschen.
Das Pellet wird mit 600 ug Ziegen-IgG in 900 ul des gleichen Puffers resuspendiert, und während 30 min bei 4EC inkubiert.
Danach werden die Zellen in dem gleichen Puffer wie oben zweimal gewaschen. Seren oder gereinigtes IgG für Patienten oder Kontrollen werden bei verschiedenen Verdünnungen während 30 Minuten bei 4EC mit den Zellen inkubiert. Ein neuer Waschzyklus wird ausgeführt, gefolgt von einer Inkubation mit fluoreszin-konjugiertem Ziegen-Antihuman-IgG (Kallestadt), verdünnt 1/50 in 200 ul PBS EA.
Unter den gleichen Bedingungen wie oben werden vier Waschungen ausgeführt, und dann wird das Zellpellet in PBS EA, das Evansblau als Gegenfarbstoff enthält, resuspendiert. 10 ul dieser Zellsuspension werden auf einen Objektträger gegeben, bedeckt und durch UV-Mikroskopie sichtbar gemacht.

1.3. DNase-. RNase- und Pronase-Behandlung von Zellen

Nach Methanolfixierung der Objektträger wird DNase RQ17, RNase-frei (Promega) (20 ug in 20 ul PBS) während 60 min bei Raumtemperatur mit den Zellen inkubiert. Die RNase-Behandlung (RNase 17, Promega; 2 ug in 20 ul PBS) wird auch während 60 min. aber bei 37EC ausgeführt.
Nach zwei Waschungen der Objektträger in PBS werden die darauf folgenden Schritte der Prozedur so ausgeführt, wie dies oben beschrieben wurde. Die Pronase-Behandlung (10 ul von Sigma) wurde während 1 Stunde bei 37EC ausgeführt. Die darauf folgenden Schritte der Prozedur werden ausgeführt, wie dies oben beschrieben wurde.

2. ELISA bei isolierter Membran von Wil 2-Zellen

Die Wil 2-Zellen-Membranen werden gemäß der von Bennet et al. beschriebenen Methode (J. Clin. Invest., Band 71, S. 611-618 (1983)) gewonnen.

3.1. DNA (cmDNA), isoliert aus Wil 2-Zellen-Membran

1 · 10&sup9; Wil 2-Zellen werden von diesen Pellets in zwei Röhrchen zusammengegeben, in einem PBS-Puffer (10 mM Salzphosphatpuffer, pH 7,2) resuspendiert, und mit 50 ml des gleichen Puffers gewaschen (500xg, 10 Minuten). Danach werden zwei weitere Waschungen mit 50 ml RBS-Puffer (1 ml HCl 1M, 0,2 ml NaCl 3 M, 0,2 ml MgCl&sub2; 1 M, aufgefüllt auf einen Liter mit destilliertem Wasser) pro Röhrchen ausgeführt. Jedes erhaltene Pellet wird in 10 ml RBS resuspendiert, und 30 ul NP40 werden zu jedem Röhrchen zugegeben. Nach einer Inkubation von 10 Minuten bei Raumtemperatur werden die Röhrchen bei 2000 xg während 4 Minuten zentrifugiert. Die Überstände werden unter den gleichen Bedingungen einer Zentrifugaticn unterworfen, und nach Umfüllen in neue Röhrchen (wobei die folgenden Stoffe zu jedem Überstand zugegeben werden: 0,32 ml EDTA 0,5M, 3,2 ml NaCl 3 M, 1 ml 10% SDS) wird das Volumen in jedem Röhrchen auf 16,7 ml eingestellt.
Nach einer Inkubation über Nacht bei 4EC werden die Überstände einer Zentrifugation (20000 xg, 30 Minuten, 4EC) mit Phenol zweimal extrahiert, und dann mit Chloroform: Isoamylalkohol (24 : 1) extrahiert. Zwischen jedem Schritt wird eine Zentrifugation bei 2000 xg während 3 min ausgeführt, um die Phasen zu trennen. Pro Volumen der erhaltenen wässerigen Phase werden zwei Volumen absolutes Äthanol zugegeben. Nach einer Inkubation über Nacht bei 4EC und einer Zentrifugation während 30 min bei 20000 xg wird das Pellet in 0,2 ml TE-Puffer (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8) resuspendiert.
Eine Elektrophorese des sich ergebenden Produkts auf 1% Agarose ergibt eine DNA-Bande mit ungefähr 17000 Basenpaaren, und zwei schwächere RNA-Bande (die ungefähr 2000 und 1000 Basenpaaren entsprechen).
Die Verwendung dieser Zell-Linien von Lymphoblastoiden B ermöglicht es, auf leichte Weise eine humanspezifische "antigene" Struktur zu erhalten.
3. 2. Enzymatische Behandlung dieser gereinigten DNA (cmDNA) Da diese Struktur jedoch mit DNA, die mit RNA und Proteinen assoziiert ist, gebildet werden kann, wird ein enzymatischer Aufschluß während einer Stunde bei 37EC mit RNase7 von Promega ausgeführt.
Zu 100 ul des Präparats werden 50 E/5 ul RNase und 25 ml Puffer 10 mM Tris Rd, 5 mM EDTA, 200 mM Natriumazetat, pH 7,5, zugegeben. Die Reaktion wird durch Zugabe von 10 ul NaCl 5M gestoppt.
Danach wird eine neue Phenolextraktion ausgeführt, um das Enzym zu entfernen, und das Präparat wird durch eine Säule aus 1 ml Sephadex G50 ("gesponnene Säule") geschickt, um die Oligonukleotide zu entfernen, die sich bei dem RNA-Aufschluß ergeben.
Ein weiterer Aufschluß mit Pronase wird ausgeführt, um die Abwesenheit von mit der DNA-Membran assoziierten Proteinspuren zu bestätigen.
Zu 100 ul des durch die RNase aufgeschldssenen Produkts werden 5 ug/10 ul Pronase während 1 Stunde bei 37EC zugegeben.
Danach werden zwei Extraktionen mit Phenol, und anschließend eine xtraktion mit Chloroform: Isoamylalkohol (24 : 4) ausgeführt, und die wässerige Phase wird durch Sephadex G50 geschickt. Um die so erhaltene Membran-DNA-Größe zu bestätigen, wird eine Elektrophorese auf 1% Agarose ausgeführt.
Durch Vergleichen mit der Größe der durch Hindill aufgeschlossenen DNA- Fragmente wird die Membran-DNA-Größe auf ungefähr 17000 Basenpaare geschätzt. Die Membran-DNA wird dann als rein angesehen, das heißt, in vorteilhafter Weise frei von Verunreinigungen, wie RNA oder Proteine, die bei dem Erkennungsphänomen mit gegen RNA gerichteten Antikörpern interferieren können.

3.3. ELISA bei der mit Enzymen behandelten oder nicht behandelten DNA (cmDNA)

Die Vertiefungen einer Mikroplatte "IMMUNOPLATE MAXISORB7" (NUNC) werden mit 100 ul Poly-L-Lysin (10 ug/ml) während 2 Stunden bei 37EC beschichtet.
Dann werden 100 ul gereinigte Membran-DNA, die durch RNase und Pronase (15 mg/ml) aufgeschlossen wurde, in die Vertiefungen während 3 Stunden bei 37EC inkubiert.
Eine Sättigung der Vertiefungen wird ausgeführt durch Inkubation einer Lösung von 10% Pferdeserum von Pharmacia in einem PBS-Puffer (150 ul/Vertiefung, 2 Stunden, 37EC).
Das Serum von Lupus-Patienten oder Kontrollpatienten (Blutspender) wird dann in den Vertiefungen in Verdünnungsreihen (100 ul der Verdünnungen von 1/20 bis 1/1280 in PBS-Puffer) über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.
Danach werden 100 ul Kaninchen-Immunoglobuline (IgG), die gegen die Human-Immunoglobuline (IgG) gerichtet sind und mit Peroxidase (DAKO) konjugiert sind, 1/250 verdünnt in PBS-Puffer, zu jeder Vertiefung während 2 Stunden bei 37EC zugegeben.
Der letzte Schritt ist eine kolorimetrische Reaktion, die mit der "Substrat"-Lösung (30 ul H&sub2;O2) (Perhydril7, Merck) und 17,5 mg Orthophenylendiamin in 20 ml PBS-Puffer ausgeführt wird.
Zwischen jedem Schritt wird eine Waschung der Becher mit PBS-Puffer ausgeführt.
Ergebnisse

1 Gereinigte DNA (cmDNA) von Wil 2-Membranen

Die Fig. 1 und 2 geben Bilder von Elektrophorese-Gelen der sich ergebenden (möglicherweise mit lupus-spezifischen Immunoglobulinen bei verschiedenen Verdünnungen inkubierten) Präparate wieder, die mit verschiedenen Enzymen, insbesondere Phospholipase, Pronase, RNase und DNase behandelt wurden. Die sich ergebenden Produkte werden mit DNA-Größenmarkern verglichen.
Die Fig. 2 zeigt, daß das Rohpräparat einige Proteine enthält, die durch Pronase entfernt werden (Spalte 4), aber daß es möglich ist, ein RNA-freies, reines Produkt zu erhalten (Spalte 5).
Die Spalte 6 zeigt klar, daß das sich ergebende, aktive Produkt aus DNA besteht.
Weitere Produktionsmethoden können verwendet werden, um eine verunreinigungsfreie, membranöse Human-Nukleinsäure, insbesondere DNA, zu erhalten. Es ist insbesondere möglich, spezielle Derivate der Nukleinsäure, wie Fragmente oder Epitope der Nukleinsäure, zu gewinnen.
Ein Reinigungsprozeß kann eine Affinitätschromatographie umfassen, bei der spezifische Antikörper verwendet werden, die gegen die gesamte, an eine feste Phase gebundene Nukleinsäure, oder einen Teil davon gerichtet ist. Die Nukleinsäure oder Fragmente davon können auch durch Elektrophorese auf einem geeigneten Gel gereinigt werden.
Die gegen diese Nukleinsäuren gerichteten Antikörper, und die gegen diese Antikörper gerichteten Antikörper können durch Immunisierung von Tieren gewonnen werden, und durch Auswahl bestimmter Hybridome in großen Mengen produziert werden.

2. Effekt der Präinkubation von Immunoglobulinen (IgG) von Lupus-Patienten oder gesunden Patienten mit der gereinigten Membran-DNA bei ihrer Migration auf Agarosegel

Wie das Bild der Fig. 1 zeigt, ergibt sich bei der Präinkubation von Membran-DNA mit den verschiedenen Verdünnungen von gereinigten Immunoglobulinen (IgG) aus Serum eines Lupus-Patienten eine zu der zugegebenen IgG-Menge proportionale Migrationsverzögerung.
Der Aufschluß dieses Gemischs durch Pronase bewirkt, daß diese Verzögerung aufgehoben oder stark verringert wird. Im Gegensatz dazu ergibt sich bei dem gleichen Experiment, das mit den gleichen Mengen gereinigter Immunoglobuline (IgG) aus einem Serum eines Blutspenders gemacht wird, keine Wirkung auf die elektrophoretische Migration der Membran-DNA.

3. Effekt des Voraufschlusses von Zellen mit RNase oder DNase auf die Bindung der IgG von Lupus-Patienten an Plasmamembranen von Wil 2-Zellen

Die Tabelle 2 gibt den Prozentsatz der fluoreszierenden Zellen wieder, der sich bei jedem Bild ergibt ("0" = Reine Fluoreszenz, "1" = punktförmige Membranfluoreszenz, "2" = kontinuierliche Membranfluoreszenz). Die wiedergegebenen Werte sind der arithmetische Mittelwert der Ergebnisse von 6 Experimenten.
Die Zellbehandlung mit DNase ergibt bei den Seren der Patienten 1, 2, 6 eine Verringerung des Zell-Prozentsatzes, der ein Bild "2" ergibt, während bei den Seren der Patienten 3, 4, 5 entweder kein Enzymeffekt, oder sogar eine Zunahme des Zell-Prozentsatzes "2" erhalten wird.
Dies könnte auf die Tatsache zurückzuführen sein, daß das Fluoreszenzbild verschiedene erkannte Spezifizitäten bei der Membran der Wil 2-Zellen zusammenfaßt, wobei diese Spezifizitäten die Membran-DNA umfassen.
Die Behandlung mit RNase ruft per se eine Zunahme des Zell-Prozentsatzes, der das Bild "2" ergibt, hervor, was darauf hinweist, daß RNA, vielleicht mit Membran-DNA assoziiert, die spezifischen Stellen für diese Antikörper teilweise maskieren kann.

4. Fluoreszenz erhalten bei Membranen von Wil 2-Zellen nach Bindung von Serum. IgG-Fraktioh oder spezifischer IgG-Fraktion der Membran-DNA

Die Tabelle 3 veranschaulicht, daß die Serumfraktion, die das fluoreszierende Bild hervorruft, auf Immunoglobuline (IgG) zurückzuführen ist. Außerdem ermöglichen die für die Membran-DNA spezifischen IgG manchmal, ein fluoreszierendes Bild zu erhalten. Dabei ist darauf hinzuweisen, daß die für die Membran-DNA spezifischen IgG bei einer niedrigeren Konzentration verwendet werden als die gesamten IgG (siehe auch die Fig. 3 bis 5). Tabelle 2: Bilder, beobachtet durch Fluoreszenz bei Wil 2-Zellen, nach Inkubation bei Serum von Lupus-Patienten
Anmerkungen: Bild "0" = keine Fluoreszenz
Bild "1" punktförmige Membran-Fluoreszenz
Bild "2" kontinuierliche Membran-Fluoreszenz
Die erste Zeile von Ergebnissen entspricht dem Mittelwert (bei 6 Experimenten) der Anzahl der Zellen, die ein fluoreszierendes Bild ergeben. Die zweite Zeile (DNase) und die dritte Zeile (RNase) geben den Prozentsatz der Zellen nach einem Voraufschluß mit DNase oder RNase an. Tabelle 3: Immunofluoreszenz-Bilder die auf die Binduns von Serum der gesamten IgG oder der spezifischen Marker-IgG an Wil 2-Zellen zurückzuführen sind
Diese Tabelle gibt die Ergebnisse von drei verschiedenen Experimenten wieder. Tabelle 4: Ergebnisse bei Fluoreszenz, erhalten aus Seren von Patienten mit SLE bei drei verschiedenen Epitopen, die aus der Membran von Wil 2-Zellen gewonnen wurden (in Prozentsätzen)
Bild "2" für eine Reihenverdünnung von 1/40
Diese Ergebnisse zeigen an, daß die enzymatische Behandlung der Membran die Fähigkeit der Membran, die Antikörper zu binden, verändert.
Für die Diagnose von SLE ist die Immunofluoreszenz durch eine Spezifizität von 100% und eine Empfindlichkeit von 43% gekennzeichnet, und für den Nachweis von Sjögren beträgt die Empfindlichkeit 3%.

5. Nachweis von Membran-Anti-DNA-Antikörpern durch die ELISA-Technik bei verschiedenen Autoimmunkrankheiten

Das physiologische Fluid (Serum) der folgenden Patienten wurde mit der erfindungsgemäßen ELISA-Diagnosevorrichtung getestet:
- 68 Lupus
- 34 Sjögren
- 15 ankylosierende Spondylarthritis
- 17 Osteopenie
- 44 gesunde Spender

5.1. Merkmale der ELISA-Vorrichtung

Spezifizität: Der ELISA ist spezifisch, da dann, wenn Autoantikörper (IgG) durch Affinität gereinigt werden und zu einem Serum eines gesunden Spenders zugegeben werden, die optische Dichte bei dem ELISA sich von 0,241 in 0,898 ändert.
Empfindlichkeit: bis zu 16 AU/ml cc, was einer Serumverdünnung von 1/3200 eines positiven Serums entspricht.

Reproduzierbarkeit:

Intra-assay: CV < 5%, berechnet bei den optischen Dichten der Kurve, CV < 6%, berechnet bei willkürlichen Einheiten (Patientenseren),
Inter-assay: CV < 10%, berechnet bei willkürlichen Einheiten (Patientenseren),
CV = 10%, bei den Anstiegen der 4 Standardkurven, die bei 4 verschiedenen Versuchen an verschiedenen Tagen erhalten wurden. Positivitätsschwelle: 69 AU/ml (Mittelwert +2 sd von 44 Spendern).

5.2. Bestimmung des Markers mit der ELISA-Diagnoseausrüstung

Per Definition haben die gesunden Spender kein Anti-Membran-IgG. Osteopenie-Patienten sind negativ, Lupus-Patienten haben hohe Niveaus, und Sjögren-Patienten haben deutlich höhere Niveaus als Lupus-Patienten.
Ein besonders hohes diagnostisches Niveau wird auch bei Sarkoidose- Patienten beobachtet. Tabelle 5
Daher scheint es, daß die Antigenizität des Markers entsprechend der enzymatischen Behandlung des Markers verändert wird.
Außerdem wird die bei ELISA gemessene optische Dichte verändert, wenn der Marker (die Membran) durch eine enzymatische Behandlung verändert wird.

Tabelle 6

Marker Optische Dichte
Nicht-behandelte Membran 0,660
Membran mit DNase behandelt 0,508
Membran mit RNase behandelt 0,673
Die folgende Tabelle 7 beschreibt die Bestimmung der Membran-Anti-DNA mit der ELISA-Diagnoseausrüstung. Tabelle 7

5. 3. Korrelation zwischen bei ELISA und Immunofluoreszenz bei Wil 2-Zellen berechneten Autoantikörpern ELISA und Immunofluoreszenz bei Wil 2-Zellen

Die Niveaus bei ELISA sind mit der Zunahme des Prozentsatzes der Bilder "1" und "2", und einer Verringerung des Prozentsatzes der negativen Bilder "0" korreliert.
Durch Immunofluoreszenz erhaltene Bilder
Chi im Quadrat 9,47 p = 0,0088
Wenn die pathologischen Befunde berücksichtigt werden:
Chi im Quadrat 49 p = 0,0001
Wenn die ELISA-Niveaus und die Immunofluoreszenzbilder für verschiedene pathologische Befunde in Beziehung gebracht werden:
Chi im Quadrat 55 p = 0,0001
Dies bedeutet, daß bei Lupus die höheren Niveaus von ELISA mit einem Bild "2" korreliert sind, während bei Sjögren die höheren Niveaus von ELISA mit einem Bild "0" korreliert sind.

5. 4. Korrelation zwischen Antimarker (cmDNA)-Autoantikörger-Niveaus bei ELISA und Niveaus von einzelsträngigen oder doppelsträngigen, antinuklearen DNA- Antikörpern (ANA) bei ELISA

Es wurden 262 Seren mit 3 = ELISA gemessen und gemäß dem Niveau ihrer Antikörper klassifiziert.
Die Verteilungen sind verschieden, da bei den beiden Versuchen nicht die gleichen Antikörper-Spezifizitäten gemessen werden.
ANA IgG (DNA ds) bei ELISA Chi im Quadrat 12,0 p < 0,005
ANA IgG (DNA ss) bei ELISA Chi im Quadrat 8,35 p < 0,004
Viele Seren mit einem hohen Anti-cmDNA IgG-Niveau sind negativ bei ANA (DNA ds oder ss) 6. Langzeituntersuchung von Lupus-Patienten/Anti-cmDNA IgG bei ELISA und Immunofluoreszenz, verglichen mit Anti-ANA (DNA ds und ss) bei ELISA

Beschreibung der Figuren

Fig. 1

1. Lambda-HindIII-Marker
2. mDNA, aufgeschlossen mit Phospholipase
3. mDNA, aufgeschlossen mit Pronase
4. mDNA, präinkubiert mit IgG Lupus 1/20
5. mDNA, präinkubiert mit IgG Lupus 1/20, und dann mit Pronase aufgeschlossen
6. mDNA, präinkubiert mit IgG Lupus 1/5
7. mDNA, präinkubiert mit IgG Lupus 1/5, und dann mit Pronase aufgeschlossen 8. Ecor-Marker
9. reine mDNA, aufgeschlossen mit DNase
10. reine mDNA, aufgeschlossen mit RNase und Pronase

Fig. 2

1. Leer
2. HindIII
3. Rohpräparat
4. Rohpräparat, mit Pronase aufgeschlossen
5. Rohpräparat, mit RNase aufgeschlossen
6. Rohpräparat, mit DNase aufgeschlossen

Fig. 3 bis 5

Die Fig. 3 bis 5 geben kanzeröse menschliche Lymphozytenzellen wieder, die Immunoglobuline von Lupus-Patienten an ihre Membran gebunden haben.

Fig. 3

Kontinuierliche Membran-Fluoreszenz (2)

Fig. 4

Keine Fluoreszenz

Fig. 5

Punktförmige Membran-Fluoreszenz (1)

Claims

1. Diagnostische Vorrichtung für entzündliche Krankheiten und/oder pathologische Befunde, die eine Autcimmunreaktion aufweisen, dadurch gekennzeichnet, daß sie aufweist:

- einen Marker, der aus einer Tierzelle erhalten wird, und eine plasmatische Membran ist, die eine membranöse DNA enthält, oder ein Teil dieser Membran ist, der eine membranöse DNA enthält oder aus einer membranösen DNA besteht und ein Molekulargewicht von mehr als 60 kD hat,

- den Antimarker-Antikörper oder einen gegen den Marker gerichteten Teil des Antikörpers,

- und/oder den Antikörper oder einen gegen den Antimarker-Antikcroer gerichteten Teil des Antikörpers,

2. Diagnostische Vorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie auch die Reaktionspartner zum Nachweis und/ oder zur Bestimmung von Antikörpern oder Nukleotidsequenzen aufweist, nach einer Methode, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus In-situ-Hybridisation, Hybridisation oder Erkennung durch markierte Antikörper, insbesondere ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), oder RIA (Radio Immunoassay), Methoden auf Filter, auf einem festen Träger, in Lösung, in "Sandwich", auf Gel, Dot blot Hybridisation, Northern blot-Hybridisation, Southern blot-Hybridisation, Isotopen- oder Nicht-Isotopen-Markierung (wie Immunofluoreszenz oder Biotinylation), Kalte-Sonden-Technik, genetischer Amplifikation, insbesondere PCR oder LCR, doppelter Immunodiffusion, Gegen-Immunoelektropherese, Hämagglutination und/oder einer Kombination davon besteht.

3. Diagnostische Vorrichtung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der pathologische Befund, der eine Autoimmunreaktion aufweist, der systemische Lupus erythematosus und/oder das Sjögren-Syndrom ist.

4. Diagnostische Vorrichtung gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine diagnostische Ausrüstung oder eine chromatographische Säule ist.

5. Diagnostische Vorrichtung gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Tierzeile eine menschliche Blutzelle ist.

6. Diagnostische Vorrichtung gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die menschliche Blutzelle ein Lymphoblastoid B, vorzugsweise eine Wil 2- Zelle ist.

7. Diagnostische Vorrichtung gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Marker eine Nukleinsäure, vorzugs weise eine DNA ist.

8. Prozeß für den In-vitro-Nachweis von Antikörpern, die mit entzündlichen Krankheiten und/oder pathologischen Befunden verbunden sind, aufweisend eine Autoimmunreaktion in einem biologischen Fluid, das diese Antikörper enhält, dadurch gekennzeichnet, daß er die folgenden Schritte aufweist:

- das biologische Fluid wird in Berührung gebracht mit:

- einer Marker, der aus einer Tierzelle erhalten wird, und eine plasmatische Membran ist, die eine membranöse DNA enthält, der ein Teil dieser plasmatischen Membran ist, der eine membranöse DNA enthält oder aus einer membranösen DNA besteht und ein Molekulargewicht von mehr als 60 kD hat, und/oder

- einen Antimarker-Antikörper oder einen gegen den Marker gerichteten Teil des Antikörpers,

- um eine biologische Bindung in vitro zu erhalten zwischen:

- entweder den in dem biologischen Fluid enthaltenen Antikörpern und dem Marker, oder

- den in dem biologischen Fluid enthaltener. Antikörpern und dem Antzmarker- Antikörper oder einem gegen den Marker gerichteten Teil des Antikörpers, und

- die erhaltene Bindung wird in vitro nachgewiesen.

9. Prozeß gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische Fluid ein Serum ist.

10. Prozeß gemäß Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß der pathologische Befund, der eine Autoimmunreaktion aufweist, der systemische Lupus erythematosus und/oder das Sjögren-Syndrom ist.

11. Prozeß gemäß irgendeinem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Tierzelle ein menschlicher Lymphoblastoid B, vorzugsweise eine Wil 2-Zelle ist.

12. Prozeß gemäß irgendeinem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Marker eine Nukleinsäure, vorzugsweise eine DNA ist.

13. Verwendung eines Markers, der aus einer Tierzelle erhalten wird, und eine plasmatische Membran ist, die eine membranöse DNA enthält, oder ein Teil dieser Membran ist, der eine membranöse DNA enthält oder aus einer membranösen DNA besteht und ein Molekulargewicht von mehr als 60 kD hat, für die In-vitro-Diagnostik von entzündlichen Krankheiten und/oder pathologischen Befunden, die eine Autoimmunreaktion aufweisen.