DE69430121T2

DE69430121T2 - Verfahren und zusammemsetzungen aehnlich den bindungsprotein des sterol-regulationselements

Info

Publication number: DE69430121T2
Application number: DE69430121T
Authority: DE
Inventors: R. Briggs; S. Brown; L. Goldstein; Xiaodong Wang
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 1993-05-13
Filing date: 1994-05-13
Publication date: 2002-08-01
Anticipated expiration: 2014-05-14
Also published as: EP0698115B1; DE69430121D1; US5891631A; WO1994026922A2; EP0698115A1; US5527690A; WO1994026922A3; AU6911194A

Description

Hinterrund der Erfindung

Die vorliegende Anmeldung ist eine continuation-in-part von US-Anmeldung Nr. 08/061,697, eingereicht am 13. Mai 1993 und USSN 425,852, eingereicht am 20.10.89, und von USSN 33,081, eingereicht am 30.3.87, deren Beschreibungen hierin durch Bezugnahme miteinbezogen werden. Die Regierung besitzt Rechte an der vorliegenden Erfindung aufgrund der Forschungsgelder HL20948 und 5F32HL07883 von den National Institutes of Health.

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen Transkriptionsaktivator-Proteine und Verfahren zum Verändern von Genexpression, Zellfunktion und Metabolismus. Insbesondere betrifft diese Erfindung Sterol-regulatorisches-Element(SRE)-Bindeproteine (SREBPs) und DNA-Segmente, die für solche Proteine kodieren. Verfahren zum Verwenden von SREBP-1, um die SRE-1-vermittelte Gentranskription in der Anwesenheit von Sterolen zu stimulieren, werden ebenso offenbart, die zur Verwendung bei der Reduzierung von Plasma- Cholesterinkonzentrationen und beim Kontrollieren von Hypercholesterinämie und ihrer verwandten Krankheiten in Erwägung gezogen werden.

2. Beschreibung des verwandten Stands der Technik

Es gibt gegenwärtig relativ wenig Kenntnisse, betreffend Feedback-Unterdrückungsmechanismen, die bei der eukaryotischen Genregulation beteiligt sind. Bei tierischen Zellen ist die meiste Aufmerksamkeit auf positiv-regulierte Systeme gerichtet gewesen, bei denen Hormone, metabolische Inducer und Entwicklungsfaktoren die Transkription von Genen erhöhen. Es wird im allgemeinen gedacht, daß diese induzierenden Mittel Komplexe mit Proteinen aktivieren oder bilden, die die Transkription durch Bindung an kurze Sequenzen von 10 bis 20 Basenpaaren (bp) in der 5'-flankierenden Region des Zielgens stimulieren. Über solche Elemente, bezeichnet als GRE, MRE, und IRE ist für Glucocorticoid-, Metall- bzw. Interferron-regulatorische Elemente berichtet worden (Yamamoto, 1985; Stuart et al., 1984; Goodbourn et al., 1986).
Wichtige Fortschritte sind vor kurzem in Bezug auf andere DNA-Segmente gemacht worden, die in der Lage sind, bekannten Genen in eukaryotischen Systemen eine Kontrollfähigkeit zu verleihen. Zum Beispiel wird die Transkription des Gens für den Low-Density- Lipoprotein(LDL)-Rezeptor durch ein 10-Basenpaar(bp)-Element in der 5'-flankierenden Region reguliert, bezeichnet als Sterol-regulatorisches-Element-1 (SRE-1; Goldstein und Brown, 1990; U. S. Patent 4,935,363). Der Rezeptor stellt Cholesterin für Zellen bereit, indem er LDL, ein Plasmacholesterin-Transportprotein, bindet und internalisiert. Wenn der zelluläre Bedarf an Cholesterin hoch ist, zum Beispiel, wenn Zellen in der Abwesenheit von Sterolen wachsen gelassen werden, ist dieses Element transkriptionsaktiv, die Zellen produzieren eine große Anzahl an LDL-Rezeptoren, und LDL wird schnell internalisiert. Auf der anderen Seite wird, wenn sich Sterole innerhalb von Zellen ansammeln, das SRE-1 stillgelegt und die Zellen verringern die Anzahl an LDL-Rezeptoren, wodurch sie eine Cholesterin- Überakkumulierung verhindern. Dieses regulatorische Feedback-System kontrolliert nicht nur den Cholesteringehalt der Zellen, sondern auch den von Plasma (Brown und Goldstein, 1986). Wenn hepatische LDL-Rezeptoren durch eine intrazelluläre Akkumulation von Cholesterin aus der Nahrung reprimiert werden, wird LDL nicht in die Leber mit einer normalen Geschwindigkeit aufgenommen, und das Lipoprotein staut sich zu hohen Konzentrationen im Blut auf.
Das 10-bp-SRE-1 liegt innerhalb einer 16-Basenpaar(bp)-Sequenz, bezeichnet als Repeat 2, das heißt 53 bp stromauf von der Transkriptionsstartstelle des LDL-Rezeptor-Gens (Smith et al., 1990). Diese Sequenz ist der zentrale Teil einer Reihe von drei unvollständigen Repeats in der 5'-flankierenden Region, von denen alle für eine Transkription auf hohem Niveau erforderlich sind (Goldstein und Brown, 1990; Smith et al., 1990; Südhof et al., 1987). Die Repeats 1 und 3 binden Spl, einen konstituiven Transkriptionsfaktor. Mutationen in jeder der drei Repeat-Sequenzen lassen die Hochniveau-Transkription bei Zellen, die bezüglich Sterol verarmt sind, wegfallen (Smith et al., 1990; Südhof et al., 1987; Dawson et al., 1988).
Die Aktivität der Repeats 1 und 3 ist, obwohl notwendig, nicht ausreichend für eine Hochniveau-Transkription. Ein zusätzlicher positiver Beitrag von Repeat 2 ist erforderlich, das nicht an Spl bindet (Smith et al., 1990; Südhof et al., 1987; Dawson et al., 1988). Eine Mutationsanalyse legt nahe, daß Repeat 2 einen konditionell positiven Transkriptionsfaktor bindet, der nur unter Bedingungen eines Sterol-Hungerzustandes aktiv ist (Smith et al., 1990). Wenn Sterole Zellen zugegeben werden, fällt der Beitrag von Repeat 2 weg und die Transkriptionsgeschwindigkeit fällt.
Die Nukleotide innerhalb von Repeat 2, die für seine Transkriptionsaktivität notwendig sind, sind teilweise durch in-vitro-Mutagenese und Expressionsstudien in permanent transfizierten CHO-Zellen beschrieben worden. Die relevanten Nukleotide schließen den 10-Basenpaar- Abschnitt SRE-1 ein, der die Sequenz ATCACCCCAC, SEQ ID NO: 27 (Smith et al., 1990) hat. Es ist gezeigt worden, daß die wesentlichen Elemente dieser Sequenz in der Evolution bis zu dem letzten gemeinsamen Vorfahren von Menschen und Fröschen konserviert worden ist (Mehta et al., 1991).
Leider blieb trotz der Aufklärung der SRE-1-DNA-Sequenz die Natur des vermeintlichen Transkriptionsfaktors, der an SRE-1 bindet, unbekannt. Es wurden zwei Kandidaten vorgeschlagen (Rajavashisth et al., 1989; Stark et al., 1992), aber die Proteine in diesen Berichten zeigten keine spezifische Bindung, die genau mit der Transkriptionsaktivität von modifizierten SRE-1-Elementen korrelierte, und es wurde über keine Aufreinigung der vermeintlichen Bindungsproteine berichtet.
Smith et al. (Journal of Biological Chemistry, Vol. 265, No. 4, 1990, Seiten 2306-2310) offenbart die Nukleotide, die für eine Verstärkung oder die Aktivität von SRE-1 in dem LBL- Rezeptorgen verantwortlich sind.
Osborne (Journal of Biological Chemistry, Vol. 266, No. 21, 1991, Seiten 13947-13951) behandelt die Sterol-regulatorische Region im Promoter für HMG-CoA.
WO-A-8,807,579 offenbart SREs, insbesondere auf den 16-Basenpaar-Sequenzen von Repeat 2 von SRE-1 vom LVL-Rezeptor und Hybrid-Genen, die diese Sequenz in Säugetierwirtszellen enthalten.
Rajavashisth et al. (Science, Vol. 245, 1989, Seiten 640-643) offenbart ein Zinkfingerprotein, das an SRE bindet.
Stark et al. (PNAS USA, Vol. 89, 1992, Seiten 2180-2184) offenbart einen SRE- Bindungsfaktor mit einer apparenten Molekülmasse von 45-49 kDa.
Die Identifizierung eines Proteins, das an die SRE-1-Sequenz bindet und die Transkription fördert, wäre von Vorteil, insbesondere, wenn DNA-Segmente, die für ein solches Protein kodieren, verfügbar wären, so daß es in großen Mengen produziert werden könnte. Ein aufgereinigter SRE-Transkriptionsaktivator, der verwendet werden könnte, um SRE-1-vermittelte Gentranskription in der Anwesenheit von Sterolen zu fördern, wäre sogar noch nützlicher. Die Verfügbarkeit eines solchen Proteins würde einen medizinischen Durchbruch darstellen, da es verwendet werden könnte, um die LDL-Rezeptor-Gentranskription zu fördern, die normalerweise durch Sterole runterreguliert wird, und um Plasma-LDL-Cholesterinkonzentrationen zu reduzieren.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung versucht, diese und andere im Stand der Technik inhärenten Nachteile durch die Identifizierung, partielle Aufreinigung und Klonierung einer Familie von Proteinen zu überwinden, von denen gezeigt wird, daß sie bei dem zellulären homöostatischen Mechanismus des Cholesterin-Metabolismus beteiligt sind. Es wird gezeigt, daß diese Familie von regulatorischen Proteinen, bezeichnet als Sterol-regulatorisches-Element-Bindeproteine (SREBPs), an der Regulation von am Cholesterin-Stoffwechsel beteiligten Genen beteiligt sind, die unter der Kontrolle eines assoziierten Sterol-regulatorischen-Elements-1 (SRE-1) sind. Zwei unterschiedliche Familien SREBPs sind bis heute identifiziert worden, die SREBP-1- und die SREBP-2-Familie, aber es ist wahrscheinlich, daß zusätzliche, verwandte Familien existieren. Die vorliegende Erfindung offenbart eine Vielzahl an nützlichen SREBP- Gensequenzen, sowie Verfahren zum Verwenden eines Mitglieds der SREBP-Familie, um die SRE-1-vermittelte Gentranskription zu fördern, z. B. die Produktion von Low-Density- Lipoprotein(LDL)-Rezeptor in der Anwesenheit von Sterolen. Ebenso offenbart werden Verfahren zum Identifizieren von Kandidatensubstanzen, die in der Lage sind, diese Funktion zu modulieren (z. B. inhibieren oder fördern), z. B. durch die Verwendung von SRE-1- Bindungsdomänen von SREBP. Es werden SREBP-Proteine oder Gensequenzen sowie andere positive Kandidatensubstanzen zur Verwendung als Cholesterin-senkende Mittel vorgeschlagen, um Hypercholesterinämie und die verschiedenen Krankheitsstadien, die mit diesem Zustand assoziiert sind, zu kontrollieren.
Die Sterol-regulatorisches-Element-(SRE-1)-Bindeproteine der vorliegenden Erfindung, bezeichnet als SREBPs, sind DNA-Bindungsproteine, die die Transkription aus SRE-1- Sequenzen fördern. Im vorliegenden Text werden die Begriffe "SREBPs", SRE-1- Bindungsproteine und DNA-Bindungsproteine austauschbar verwendet, und jeder Begriff bezieht sich auf eine proteinhaltige Zusammensetzung, die aus Säugetierzellkernen isolierbar und in der Lage ist, an DNA-Segmente zu binden, die das Sterol-regulatorische Element SRE- 1 einschließen (siehe z. B. SEQ ID NO: 27). SREBPs werden Bindungs"proteine" aus Einfachheitsgründen genannt. Jedoch ist es wichtig, im Gedächtnis zu behalten, daß kürzere Subfragmente von SREBP aus z. B. natürlichen Quellen erhalten werden können, von denen gefunden wird, daß sie die SRE-1-Bindungsdomäne, d. h. eine bHLH-Zip-Sequenz einschließen. Daher wird es klar sein, daß, obwohl aufgereinigte, rekombinante SREBP-Proteine voller Länge von der Erfindung umfaßt sind, der Begriff SREBP nicht notwendigerweise auf Proteine voller Länge beschränkt ist. Der Begriff schließt nützliche Polypeptide, die aus natürlichen Quellen isoliert sind, sowie die innerhalb einer Zusammensetzung vorhandene SRE-1- Bindungsaktivität ein, die aus bestimmten Domänen eines Polypeptids, der kombinierten Wirkungen von einem oder mehreren Polypeptiden, Kombinationen von Polypeptiden und bekannten Transkriptionsfaktoren und/oder Multienzymkomplexen und ähnlichen resultieren kann.
Im vorliegenden Kontext wird SRE-1 verwendet, um eine "funktionelle SRE-1-Sequenz" zu bezeichnen. Solche funktionellen Sequenzen sind diejenigen, die in der Lage sind, die Transkription und Expression von Sterol-empfindlichen Genen zu fördern. Diese können native SRE-1-Sequenzen sein, wie die stromauf von jedem Säugetier-LDL-Rezeptorgen gefundene Sequenz, oder sie können mutante SRE-1-Sequenzen sein, die nichtsdestotrotz dazu in der Lage sind, Sterol-empfindliche Gentranskription zu fördern. Ein SRE-1-Element, das "in der Lage ist, Sterol-empfindliche Gentranskription zu fördern", bezieht sich auf ein Element, das, wenn es sich stromauf (d. h. 5') von und proximal zu einer Transkriptionsinitiationsstelle eines strukturellen Gens befindet, dazu dient, dem Gen eine Sterol-empfindliche Transkriptionsfähigkeit zu verleihen. Dies bedeutet, daß die Gentranskription in der Abwesenheit von Sterolen gefördert wird, daß aber wenig oder keine Transkription in der Anwesenheit von Sterolen zugelassen wird. Die Identifizierung, Herstellung und Verwendung von SRE-1-Sequenzen wird hierin beschrieben, sowie im Detail in den US-Patenten 4,953,363 und 5,215,910 sowie der Anmeldung SN 33,081, eingereicht am 30.3.87, und 425,852, eingereicht am 20.10.89, wobei jede der vorhergehenden hierin durch Bezugnahme einbezogen wird.

Aufgereinigte SREBP-Zusammensetzungen

Wichtige Aspekte der vorliegenden Erfindung betreffen aufgereinigte Proteinzusammensetzungen, die von der Umgebung frei sind, in der sie natürlicherweise in intakten Zellen vorkommen können, und die ein oder mehrere DNA-Bindungsproteine umfassen, die aus Säugetierzellkernen oder aus rekombinanten Quellen isolierbar sind, die in der Lage sind, an ein DNA-Segment zu binden, das das Sterol-regulatorische-Element SRE-1 (SEQ ID NO: 27) umfaßt. In bestimmten Ausführungsformen betrifft die Erfindung im wesentlichen aufgereinigte SREBP-Zusammensetzungen, umfassend ein SREBP-Familienmitglied, wie SREBP-1 oder SREBP-2, oder eine SRE-1-Bindungssubdomäne davon. Intakte SREBP-1 und SREBP- 2-Proteine weisen ein Molekulargewicht von näherungsweise 130 kDa in SDS-PAGE auf. Jedoch können die Proteinzusammensetzungen weiter dahingehend definiert werden, daß sie ein oder mehrere Polypeptide oder DNA-Bindungsdomänen einschließen, die ein apparentes Molekulargewicht in SDS/PAGE von zwischen ungefähr 59 kD und ungefähr 68 kD haben. Dies beruht auf der Beobachtung der Erfinder, daß DNA-Bindungspolypeptide, die diese Molekulargewichte haben und von denen gefunden worden ist, daß sie aus dem entsprechenden SREBP-Protein voller Länge abgeleitet werden können, mit SRE-Sequenzen quervernetzt werden können und, daß man, wie in den Beispielen unten beschrieben, glaubt, daß sie von größeren Proteinen, vielleicht durch proteolytische Spaltung, abgeleitet werden und sE1bst die DNA-Bindungsdomänen und transkriptionell funktionellen Domänen von größeren Protein(en) darstellen.
Unter besonderen Gesichtspunkten offenbaren die Erfinder die Isolierung und Klonierung von zwei separaten Familien von SREBP-Proteinen, bezeichnet als SREBP-1 und SREBP-2, von denen jede die Fähigkeit hat, an SRE-Sequenzen zu binden und SRE-vermittelte Transkription zu modulieren. Beide Proteine sind Mitglieder einer Familie eines basic-Helix-Loop- Helix-Leucin-Zipper(bHLH-Zip)-Transkriptionsfaktor, der das Sterol-regulatorische Element- 1 erkennt. SRE-1, ein konditioneller Enhancer in den Promotoren für die Low-Density- Lipoprotein-Rezeptor- und 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym-A-Synthase-Gene, erhöht die Transkription in der Abwesenheit von Sterolen und wird inaktiviert, wenn sich die Sterole akkumulieren. Menschliches SREBP-2 enthält 1141 Aminosäuren und hat 47% Identität mit einem der verschiedenen SREBP-1-Familienmitglieder, das charakterisiert worden ist, SREBP-1a, dem ersten erkannten Mitglied dieser Familie. SREBP-1a enthält 1147 Aminosäuren. Die Ähnlichkeit zwischen SREBP-1a und SREBP-2 schließt einen sauren NH&sub2;-Terminus, ein stark konserviertes bHLH-Zip-Motiv (71% identisch) und eine ungewöhnlich lange Erweiterung von 740 Aminosäuren auf der COOH-terminalen Seite der bHLH-Zip-Region ein.
SREBP-2 besitzt ein Merkmal, das in SREBP-1a fehlt, nämlich eine Glutamin-reiche Region (27% Glutamin über 121 Reste). In vitro ging SREBP-2 mit SRE-1 eine Bindung mit derselben Spezifität wie SREBP-1a ein. In vivo ähnelte es SREBP-1a dadurch, daß es die Transkription von Reportergenen, enthaltend SRE-1, aktivierte. Ebenso wie bei SREBP-1a fand die Aktivierung von SREBP-2 in der Abwesenheit und Anwesenheit von Sterolen statt, was eine Regulierung wegfallen ließ. Die Cotransfektion von niedrigen Mengen an pSREBP-1a und pSREBP-2 in menschliche 293-Zellen stimuliert auf eine additive Weise die Transkription von Promotoren, die SRE-1 enthalten. In hohen Konzentrationen erreicht die Transkription ein Maximum, und die Effekte sind nicht länger additiv.
Der Begriff "aufgereinigt", wie hierin verwendet, soll sich auf eine DNA-Bindungsprotein- Zusammensetzung beziehen, bei der das SREBP oder SREBPs bis zu einem Grad aufgereinigt sind, relativ zu ihrem natürlich erhältlichen Zustand, wie zum Beispiel relativ zu der Reinheit innerhalb eines partiell aufgereinigten Kernextrakts, der hinsichtlich des SREBP- Gehalts oder -Aktivität angereichert ist. Im allgemeinen wird sich "aufgereinigt" auf eine native oder rekombinante SREBP-Zusammensetzung beziehen, die einer Fraktionierung unterzogen worden ist, um verschiedene nicht-SREBP-Bestandteile zu entfernen, wobei die Zusammensetzung im wesentlichen ihre SRE-1-Bindungs- und/oder transkriptionsfördernde Aktivität beibehält. Wenn der Begriff "im wesentlichen aufgereinigt" im Hinblick auf native oder rekombinante SREBPs verwendet wird, wird sich dies auf eine Zusammensetzung beziehen, in der SREBP oder SREBPs den Hauptbestandteil der Zusammensetzung bilden, wie zum Beispiel ungefähr 50% der Proteine in der Zusammensetzung oder mehr.
"Natives SREBP" bezieht sich auf SREBP-Zusammensetzungen, die aus Quellen, wie Säugetierzellkernen, aufgereinigt sind. "Rekombinantes SREBP" bezieht sich auf SREBP- Zusammensetzungen, einschließlich trunkierter SREBPs, SREBP-Fusionsproteinen und gentechnologisch hergestellten Formen von SREBP, die unter Verwendung eines rekombinanten DNA-Moleküls erhalten werden, das für ein SREBP oder einen Teil davon kodiert. Hinsichtlich aufgereinigter rekombinanter SREBP-Zusammensetzungen wird dem "einer Fraktionierung Unterziehen" oft durch Sammeln des rekombinanten SREBP aus seiner Produktionsquelle Genüge geleistet, wie etwa von einer rekombinanten Wirtszelle oder von einem invitro-Translationssystem. In im wesentlichen aufgereinigten, rekombinanten SREBP- Zusammensetzungen wird das SREBP- Polypeptid im allgemeinen ungefähr 50% des Proteins ausmachen, wie etwa 50% des Proteins in einem rekombinanten Wirtszellextrakt, und kann im wesentlichen reine Zusammensetzungen des Proteins erreichen, dahingehend definiert, daß sie frei von Substanzen, z. B. anderen Proteinen, sind, die die jeweilige, in Erwägung gezogene Verwendung stören.
In bestimmten Ausführungsformen können SREBP-Proteine und Polypeptide in Übereinstimmung mit dieser Erfindung spezifische Aktivitäten von bis zu und ungefähr 5.000 Einheiten/mg Protein oder vorzugsweise von bis zu und ungefähr 70.000 Einheiten/mg Protein haben. Die Erfindung umfaßt ebenso SREBP-Proteine und -Polypeptide, die spezifische Aktivitäten von bis zu und einschließlich ungefähr 8.700.000 Einheiten/mg Protein haben.
Obwohl zur Verwendung bei bestimmten Ausführungsformen bevorzugt, gibt es kein allgemeines Erfordernis, daß SREBPs immer in ihrem am meisten aufgereinigten Zustand bereitgestellt werden. Es wird in Erwägung gezogen, daß weniger im wesentlichen aufgereinigte SREBP-Zusammensetzungen, die nichtsdestotrotz eine gewisse in einem Assay nachweisbare SREBP-Aktivität haben, einen Nutzen bei bestimmten Ausführungsformen haben werden. Diese schließen zum Beispiel die Verwendung als eine positive Kontrolle bei Gel-Shift- Assays ein. Partiell aufgereinigte SREBPs können dadurch gemacht werden, daß man einen Kernextrakt einem oder einer Kombination der unten beschriebenen Schritte aussetzt. SREBPs ohne signifikante biologische Aktivität werden ebenso einen Nutzen haben, wie zum Beispiel bei Antikörpererzeugungsprotokollen.

Proteinaufreinigung und Assays

Verschiedene Verfahren zum Quantifizieren des Grads der Aufreinigung einer SREBP- Zusammensetzung werden für Fachleute auf dem Gebiet im Lichte der vorliegenden Offenbarung bekannt sein. Diese schließen zum Beispiel die Bestimmung der Fähigkeit einer aktiven Fraktion, die Mobilität von Oligonukleotiden zu verzögern, welche funktionelle SRE-1- Sequenzen enthalten, wenn solche "Oligos" einer Elektrophorese unterzogen werden, oder sogar das Bestimmen der Anzahl an Polypeptiden innerhalb einer Fraktion mittels SDS/PAGE-Analyse ein. Ein bevorzugtes Verfahren zum Bestimmen der Reinheit einer SREBP-Fraktion ist es, die spezifische Aktivität der Fraktion zu berechnen, um sie mit der spezifischen Aktivität der ersten Fraktion zu vergleichen, in der eine Aktivität meßbar ist, und einen Grad an Reinheit zu berechnen, der als eine "-fache Aufreinigungszahl" dargestellt werden kann.
Die tatsächlichen Einheiten, die verwendet werden, um die Menge an Bindungsaktivität darzustellen, werden natürlich von der besonderen Assaytechnik abhängig sein, die gewählt worden ist, um die Aufreinigung zu verfolgen. Die vorliegenden Erfinder bevorzugen es, einen "Gel-Shift"-Assay zu verwenden, bei dem die Mobilität von radioaktiv markierten Oligonukleotiden, die Wildtyp- und mutante SRE-1-Sequenzen enthalten, in der Anwesenheit und Abwesenheit der Proteinfraktionen bestimmt wird. Bei diesem System entspricht eine Aktivitäteinheit 1000 cpm einer Sonde, die einen Shift durchlaufen hat (von 6 fmol ³²P-markiert bei 40.000 cpm). Jedoch würde bei Verwendung anderer Assays oder sogar von anderen Sondenzubereitungen die Definition einer Aktivitätseinheit natürlicherweise variieren.
Wie allgemein auf dem Gebiet bekannt ist, würde man, um die spezifische Aktivität zu bestimmen, die Anzahl an Aktivitätseinheiten pro Milligram Gesamtprotein berechnen. Die spezifische Aktivität jeder aufgereinigten SREBP-Fraktion kann mit der spezifischen Aktivität der ersten Fraktion verglichen werden, bei der eine Aktivität meßbar war, und die "-fache Aufreinigung" berechnet werden. Bei bestimmten Ausführungsformen können die SREBPs der vorliegenden Erfindung aus natürlichen Quellen aufgereinigt werden, wie Hamster- oder Rattenleber oder sogar Nebennierengewebe oder bevorzugter aus den Kernen menschlicher HeLa-Zellen, auf zwischen ungefähr 200-fach und größer als 38.000-fach, und am bevorzugtesten werden sie in einem Zustand bereitgestellt, der wenigstens gleich oder größer als 38.000-fach aufgereinigt ist.
Um ein im wesentlichen aufgereinigtes DNA-Bindungsprotein oder SREBP- Zusammensetzung in Übereinstimmung mit bestimmten Aspekten der vorliegenden Erfindung herzustellen, kann man einen Extrakt aus Säugetierzellen herstellen und bevorzugt einen Kernextrakt aus HeLa-Zellen, den Extrakt einer der Fraktionierungsprozeduren unterziehen, die Fachleuten bekannt sind, und die Fraktionen testen, um diejenigen zu identifizieren, die SREBP enthalten. Man kann ebenso derlei Fraktionierungs- und Assayschritte durchführen, um ein rekombinantes SREBP aus einer rekombinanten Wirtszelle zu isolieren und aufzureinigen, die ein SREBP exprimiert, wie eines der SREBP-1 oder SREBP-2-Familienmitglieder. Die Fraktionierungsschritte, wie Ammoniumsulfatfällung, Ultrazentrifugation und verschiedene chromatographische Prozeduren werden bevorzugt. Besonders vorteilhafte Fraktionierungsschritte sollen Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie und am bevorzugtesten DNA-Affinitätschromatographie einschließen, insbesondere die Verwendung von Affinitätssäulen, die die hierin offenbarten Oligonukleotidsonden enthalten (SEQ ID NO : 31-36).
Um die SREBP-Bindungsaktivität zu testen, ziehen die vorliegenden Erfinder es vor, einen "Gel-Shift"-Assay zu verwenden, bei dem die Mobilität von radioaktiv markierten Oligonukleotiden, die Wildtyp- und mutante SRE-1-Sequenzen enthalten, in der Anwesenheit und Abwesenheit der Proteinfraktionen bestimmt wird. SREBP innerhalb einer Fraktion wird an funktionelle SRE-1-Sequenzen binden, aber nicht an nicht-funktionelle Sequenzen und wird die Mobilität von lediglich denjenigen Oligos reduzieren oder "shiften", die funktionelles SRE-1 enthalten. Bei diesem System entspricht eine Aktivitätseinheit 1000 cpm an geshifteter Sonde.
Die vorliegende Erfindung umfaßt dahingehend einen signifikanten Fortschritt gegenüber dem Stand der Technik, daß sie vorteilhafterweise 9 mutante, aber transkriptionellfunktionelle SRE-1-Promotoren bereitstellt, von denen gezeigt wurde, daß sie für eine Sterolregulierte Transkription positiv sind (SEQ ID NO: 2-4, 10 bzw. 15-19), und 9 nichtfunktionelle Mutanten, von denen gezeigt wurde, daß sie die Transkription beseitigen (SEQ ID NO: 5-9 bwz. 11-14). Die Erfindung schließt sowohl Reportergen-Plasmide als auch Oligonukleotidsonden ein, die diese 18 Promotorsequenzen enthalten (SEQ ID NO: 2-19), die für Transfektions- und Reportergen-Expressionstudien bzw. für Gel-Shift-Assays verwendet werden können, um die eindeutige Identifizierung von SREBP zu ermöglichen, oder sogar in einem System zum Kontrollieren der Genexpression.
Die bevorzugtesten Plasmide sind diejenigen, die zwei Kopien von Repeat 2 + 3 (SEQ ID NO: 24) enthalten (mit den transkriptionell funktionellen oder nicht-funktionellen Sequenzen), operativ verknüpft an eine TATA-Box und das Reportergen CAT. Die bevorzugtesten radioaktiv markierten Sonden haben eine Länge von 94 bp und enthalten 2 Kopien von Repeat 2+3 (SEQ ID NO: 24) (mit den transkriptionell funktionellen oder nicht-funktionellen Sequenzen), flankiert von Restriktionsstellen. Jedoch ist die genaue Natur der Plasmide und Oligonukleotidsonden nicht wesentlich, solange sie eine funktionelle oder nicht-funktionelle SRE-1-Sequenz, wie hierin definiert, enthalten.
Da jetzt die funktionellen und nicht-funktionellen SRE-1-Sequenzen von den Erfindern definiert worden sind, können solche Sequenzen, z. B. jeder der 18 spezifischen Sonden, die hierin offenbart worden sind (SEQ ID NO: 2-19) direkt in Gel-Shift-Assays verwendet werden, um SREBPs zu identifizieren, die die Fähigkeit haben, zwischen den funktionellen und nicht-funktionellen Sequenzen zu unterscheiden. Beim Aufreinigen von SREBPs aus Säugetierzellkernen oder rekombinanten Wirtszellen würde man im allgemeinen wenigstens eine Sonde verwenden, an die SREBPs spezifisch binden, und wenigstens eine nicht-funktionelle SRE-1-Sonde, an die SREBPs nicht signifikant binden. Am bevorzugtesten wird die Verwendung eines Satzes von drei Sonden bevorzugt, bezeichnet als H, M und *, da die Erfinder entdeckten, daß diese für eine routinemäßige Assay-Durchführung auf SREBP-Aktivität und zum Unterscheiden zwischen SREBPs und anderen DNA-Bindungskernproteinen am geeignetsten sind. Sonde H schließt eine menschliche Repeat-2+3-Sequenz (SEQ ID NO: 24) ein und ist transkriptions-funktionell; Sonde M schließt eine Maus-Repeat-2 + Mensch-Repeat-3- Sequenz (SEQ ID NO: 21 + SEQ ID NO: 23) ein und ist ebenso transkriptions-funktionell; während Sonde * eine Mutation in Repeat 2 einschließt, die sie transkriptionell nichtfunktionell macht (SEQ ID NO: 14).
Die vorliegende Erfindung umfaßt damit DNA-Segmente, die von assoziierten Proteinkodierenden Gensequenzen frei sind, wobei die DNA-Segmente in der Lage sind, Genen oder DNA-kodierenden Regionen (Transkriptionseinheiten) eine SREBP-vermittelte Kontrolle zu verleihen, wenn sie angrenzend an solche kodierenden Sequenzen oder Einheiten positioniert werden. Diese DNA-Segmente sind durch diejenigen beispielhaft veranschaulicht, die funktionelle SRE-1-Sequenzen umfassen, wie definiert durch SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 und SEQ ID NO: 19. Solche DNA-Segmente können von 10 bis ungefähr 100 Nukleotide oder ähnlich in ihrer Länge.
DNA-Segmente von 10 bis ungefähr 100 Nukleotide oder ähnlich in ihrer Länge, die nichtaktive mutante SRE-1-Sequenzen umfassen, bilden einen weiteren Gesichtspunkt dieser Erfindung. Solche DNA-Segmente werden beispielhaft durch diejenigen Sequenzen veranschaulicht, die frei von assoziierten Protein-kodierenden Genen sind und die nichtaktive SRE-1-artige Sequenzen umfassen, wie definiert durch die Sequenzen SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 und SEQ ID NO: 14.
Das hierin unten offenbarte Aufreinigungsverfahren enthält mehrere Schritte und stellt das beste Verfahren dar, das den Erfindern gegenwärtig bekannt ist; um ein im wesentlichen aufgereinigtes DNA-Bindungsprotein oder SREBP-Zusammensetzung aus einer natürlichen, d. h. nicht-rekombinanten Quelle herzustellen. Dieses Verfahren wird gegenwärtig bevorzugt, da es zu der wesentlichen Aufreinigung von SREBP führt, beurteilt mittels SRE-1-Bindung, die in genauer Weise mit der SRE-1-Funktionalität korreliert, in Ausbeuten, die für eine weitere Charakterisierung und Verwendung ausreichend sind. Diese bevorzugte Art der SREBP- Aufreinigung beinhaltet die Ausführung bestimmter Aufreinigungsschritte in der hierin unten beschriebenen Reihenfolge. Jedoch wird, wie auf dem Gebiet allgemein bekannt ist, geglaubt, daß die Reihenfolge, die verschiedenen Aufreinigungsschritte durchzuführen, verändert werden kann, oder daß bestimmte Schritte ausgelassen oder andere Schritte zugefügt werden können und dies immer noch zu einem geeigneten Verfahren für die Herstellung von im wesentlichen aufgereinigten DNA-Bindungsprotein oder SREBP-Zusammensetzung führt.
Andere Verfahren zum Herstellen von SREBP werden ebenso in Erwägung gezogen und fallen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung. Ein Verfahren beinhaltet die Herstellung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern mit Bindungsaffinität für SREBP und die Verwendung solcher Antikörper bei immunabsorbierenden Protokollen, um SREBP aufzureinigen, zum Beispiel unter Verwendung einer Antikörper-Affinitätssäule. Anti- SREBP-Antikörper können unter Verwendung einer Vielzahl von Bestandteilen als Immunogenen gezogen werden, wie hierin offenbart und Fachleuten auf dem Gebiet bekannt, einschließlich SREBP-Proteinen, wie etwa rekombinantes SREBP-1, aufgereinigte funktionelle Domänen, wie die aktiven Polypeptide mit apparenten Mrs in SDS/PAGE von zwischen ungefähr 59 kD und ungefähr 68 kD, und ebenso synthetische Peptide, die anhand der Kenntnis von SREBP-DNA- und/oder Aminosäuresequenzen hergestellt worden sind.

Molekulares Klonieren und DNA-Segmente, die für SREBP kodieren

Ein besonders vorteilhaftes Verfahren zum Herstellen von SREBP-Zusammensetzungen beinhaltet den Erhalt eines DNA-Segments, das für ein SREBP kodiert, und die Verwendung der DNA, um eine "rekombinante" Version von SREBP zu produzieren. Dies kann durch Verwendung der DNA als ein Insert in einem Expressionsvektor und durch Einführen des Expressionsvektors in eine rekombinante Wirtszelle durchgeführt werden, so daß die Wirtszelle ein SREBP exprimiert. Ebenso kann das DNA-Segment in Zusammenhang mit einem in vitro-Translationssystem verwendet werden, wie etwa einem Retikulozyten-Lysat-System, einschließlich der z. B. von Promega kommerziell erhältlichen.
Der Verfahren zum Erhalt eines DNA-Segments, das für ein SRE-Bindungsprotein kodiert, wird im allgemeinen als das molekulare Klonieren (oder einfach Klonieren) eines SREBP bezeichnet. Verschiedene Techniken zum molekularen Klonieren sind verfügbar, sind in der Literatur beschrieben und sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt. Ein besonders bevorzugtes Verfahren zum Klonieren eines SREBP wird hierin offenbart (siehe Beispiel 3), das erfolgreich verwendet wurde, um ein DNA-Segment zu erhalten, das für ein SRE- Bindungsprotein kodiert, das als SREBP-1 bezeichnet wird.
Um ein SREBP zu klonieren, kann man im allgemeinen die im Detail im Beispiel 3 beschriebene Prozedur befolgen. Bei diesem Verfahren wurde SREBP zuerst aus vereinigten Extrakten von HeLa-Zellkemen aufgereinigt, und die gesamte aktive Fraktion wurde einem tryptischen Verdau unterzogen, die resultierenden Peptide wurden mittels HPLC fraktioniert und sequenziert. Degenerierte Oligonukleotide, die einem Teil eines der Peptide entsprachen, wurden konstruiert, synthetisiert und verwendet, um Polymerasekettenreaktionen (PCR) mit einer HeLa-Zell-cDNA-Bibliothek als Matrize zu starten. Die einzigartige DNA-Sequenz, die so erzeugt wurde, wurde verwendet, um zwei HeLa-cDNA-Bibliotheken zu sondieren und um SREBP- kodierende cDNAs zu erhalten.
Dadurch, daß die Sequenz von SREBP-1 und SREBP-2 jetzt hierin offenbart werden, wird, der Erhalt von SREBP-cDNA oder genomischen Sequenzen oder anderen verwandten Sequenzen eine Routineangelegenheit für Fachleute sein. Geeignete Hybridisierungs- Screeningverfahren und PCR-Technologie sind auf dem Gebiet gut bekannt, zum Beispiel wie von Sambrook et al., 1989 dargestellt. Antikörper können ebenso bei der Expressionsklonierung von SREBPs unter Verwendung von Methoden verwendet werden, wie diejenigen, die von Young et al., 1988 beschrieben worden sind.
Isolierte DNA-Segmente und rekombinante Vektoren, die für SREBPs kodieren, Verfahren zum Verwenden solcher DNA-Segmente und die Erzeugung und Verwendung von SREBPexprimierenden rekombinanten Wirtszellen bilden alle wichtige Gesichtspunkte dieser Erfindung. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "DNA-Segment" auf ein DNA-Molekül, das frei von gesamter genomischer DNA einer besonderen Spezies isoliert worden ist. Deshalb bezieht sich ein DNA-Segment, das für ein SREBP kodiert, auf ein DNA-Segment, das SREBP-kodierende Sequenzen enthält, jedoch isoliert wird von der gesamten genomischen DNA der Spezies, von der das DNA-Segment erhalten wird oder von dieser frei aufgereinigt wird, wie z. B. frei von menschlicher genomischer DNA. Eingeschlossen in den Begriff "DNA-Segment" sind DNA-Segmente und kleinere Fragmente von solchen Segmenten und ebenso rekombinante Vektoren, einschließlich zum Beispiel Plasmiden, Cosmiden, Phagen, Viren und ähnliche.
In ähnlicher Weise bezieht sich ein DNA-Segment, das ein isoliertes oder aufgereinigtes SREBP-Gen umfaßt, auf ein DNA-Segment, das SREBP-kodierende Sequenzen einschließt, die im wesentlichen von anderen natürlich vorkommenden Genen oder Protein-kodierenden Sequenzen isoliert sind. Unter diesem Gesichtspunkt wird der Begriff "Gen" aus Einfachheitsgründen verwendet, um auf eine funktionelle Protein- oder Peptid-kodierende Einheit zu bezeichnen. Wie von Fachleuten verstanden werden wird, schließt dieser funktionelle Begriff sowohl genomische Sequenzen als auch cDNA-Sequenzen ein. "Isoliert im wesentlichen von anderen kodierenden Sequenzen" bedeutet, daß das interessierende Gen, in diesem Falle ein SREBP-Gen, den signifikanten Teil der kodierenden Region des DNA-Segments bildet, und daß das DNA-Segment keine großen Teile von natürlich vorkommender, kodierender DNA enthält, wie große chromosomale Fragmente oder andere funktionelle Gene oder cDNAkodierende Regionen. Natürlich bezieht sich dies auf das DNA-Segment, wie ursprünglich isoliert, und schließt nicht Gene oder kodierende Regionen aus, die später zu dem Segment von Menschenhand hinzugefügt werden.
In bestimmten Ausführungsformen betrifft die Erfindung isolierte DNA-Segmente und Vektoren, die für ein SREBP kodieren, das innerhalb seiner Sequenz eine Aminosäuresequenz einschließt, wie sie im wesentlichen in SEQ ID NO: 38 oder 54 dargestellt ist. Der Begriff "eine Sequenz, im wesentlichen wie in SEQ ID NO: 38 oder 54 dargestellt" bedeutet, daß die Sequenz im wesentlichen einem Teil von SEQ ID NO: 38 oder 54 entspricht und relativ wenige Aminosäuren hat, die nicht identisch mit denjenigen in SEQ ID NO: 38 oder 54 oder ein biologisch funktionelles Äquivalent von diesen sind. Der Begriff "biologisch funktionelles Äquivalent" wird auf dem Gebiet gut verständen und wird weiter im Detail hierin definiert. Entsprechend werden Sequenzen, die zwischen ungefähr 70% und ungefähr 100%, oder bevorzugter zwischen ungefähr 80% und ungefähr 100% oder sogar noch bevorzugter zwischen ungefähr 90% und ungefähr 100% Aminosäuren haben, die identisch oder funktionell äquivalent mit den Aminosäuren von SEQ ID NO: 38 oder 54 sind, Sequenzen sein, die "im wesentlichen wie in SEQ ID NO: 38 dargestellt" sind.
In bestimmten anderen Ausführungsformen betrifft die Erfindung isolierte DNA-Segmente und rekombinante Vektoren, die innerhalb ihrer Sequenz eine Nukleinsäuresequenz enthalten, wie im wesentlichen in SEQ ID NO: 37 oder 53 dargestellt. Der Begriff "im wesentlichen wie in SEQ ID NO: 37 oder 53 dargestellt" wird im sE1ben Sinne, wie oben beschrieben, verwendet und bedeutet, daß die Nukleinsäuresequenz im wesentlichen einem Teil von SEQ ID NO: 37 oder 53 entspricht und relativ wenige Codons hat, die nicht identisch oder funktionell äquivalent mit den Codons von SEQ ID NO: 37 oder 53 sind. Der Begriff "funktionell äquivalentes Codon", bezieht sich hierin auf Codons, die für diesE1be Aminosäure kodieren, und auf Codons, die für biologisch äquivalente Aminosäure kodieren.
Es wird ebenso verstanden werden, daß Aminosäure- und Nukleinsäuresequenzen zusätzliche Reste einschließen können, wie zum Beispiel zusätzliche N- oder C-terminale Aminosäuren und immer noch im wesentlichen so sind, wie in einer der hierin offenbarten Sequenzen dargestellt, solange wie die Sequenz die oben dargelegten Kriterien erfüllt. Dies betrifft insbesondere Nukleinsäuresequenzen, die zum Beispiel verschiedene nicht-kodierende Sequenzen einschließen können, die entweder die 5'- oder 3' -Teile der kodierenden Region flankieren, oder die verschiedene interne Sequenzen einschließen können, d. h. Introns, von denen bekannt ist, daß sie innerhalb von Genen vorkommen.
Ausnehmend intronische oder flankierende Regionen und unter Berücksichtigung der Degeneriertheit des genetischen Codes werden Sequenzen, die zwischen ungefähr 70% und ungefähr 100% oder bevorzugter zwischen ungefähr 80% und ungefähr 100% oder noch bevorzugter zwischen ungefähr 90% und ungefähr 1009% Nukleotide haben, die mit den Nukleotiden von SEQ ID NO: 37 oder 53 identisch sind, Sequenzen sein, die "im wesentlichen wie in SEQ ID NO: 37 oder 53 dargestellt" sind.
Sequenzen, die im wesentlichen diesE1ben wie die in SEQ ID NO: 37 dargestellten sind, können ebenso funktionell als Sequenzen definiert werden, die in der Lage sind, an ein Nukleinsäuresegment zu hybridisieren, das das Komplement von SEQ ID NO: 37 oder 53 unter relativ stringenten Bedingungen enthält. Geeignete relativ stringente Hybridisierungsbedingungen werden Fachleuten im Lichte der vorliegenden Offenbarung gut bekannt sein. Beispielhaft schließen geeignete Hybridisierungsbedingungen, die hierin offenbart werden, diejenigen in Verfahren 5 aus Bespiel 3 und Fig. 18A ein, wobei die Hybridisierung durchgeführt wird unter Verwendung von 5 · SSPE-Puffer, enthaltend 50% Formamid, für 16 Stunden bei 42ºC, gefolgt von einmal Waschen mit 1 · SSC und 0,05% SDS für 30 Minuten bei Zimmertemperatur und zweimal mit 0,1 · SSC und 0,1% SDS für 20 Minuten bei 50ºC.
Natürlicherweise umfaßt die vorliegende Erfindung ebenso DNA-Segmente, die zu der in SEQ ID NO: 37 oder 53 dargestellten Sequenz komplementär oder im wesentlichen komplementär sind. Nukleinsäuresequenzen, die "komplementär" sind, sind diejenigen, die zur Basenpaarung gemäß den Standard-Watson-Crick-Komplementaritätsregeln in der Lage sind. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "komplementäre Sequenzen" Nukleinsäuresequenzen, die im wesentlichen komplementär sind, was durch densE1ben oben dargelegten Nukleotidvergleich beurteilt werden kann, oder dahingehend definiert, daß sie in der Lage sind, an das Nukleinsäuresegment von SEQ ID NO: 37 oder 53 unter relativ stringenten Bedingungen zu hybridisieren, wie die hierin beschriebenen, z. B. in Verfahren 5 aus Beispiel 3.

Nukleinsäurehybridisierung

Im Zusammenhang mit Expressionsausführungsformen, um rekombinante SREBP-Proteine und -Peptide herzustellen, wird in Erwägung gezogen, daß längere DNA-Segmente am häufigsten verwendet werden, wobei DNA-Segmente, die für SREBP-1-funktionelle Domänen oder das gesamte SREBP-1-Protein am bevorzugtesten sind. Jedoch wird erkannt werden, daß die Verwendung von kürzeren DNA-Segmenten, die Expression von SREBP-Peptiden oder epitopischen Kernregionen zu steuern, wie sie verwendet werden können, um anti-SREBP- Antikörper zu erzeugen, ebenso in den Umfang der Erfindung fällt.
Zusätzlich zu ihrer Verwendung beim Steuern der Expression von SREBP-Proteinen haben die hierin offenbarten Nukleinsäuresequenzen ebenso eine von Vielzahl von anderen Verwendungen. Zum Beispiel haben sie ebenso eine Nützlichkeit als Sonden oder Primer bei Nukleinsäurehybridisierungs-Ausführungsformen. In diesem Zusammenhang wird in Erwägung gezogen, daß die Oligonukleotidfragmente, entsprechend der Sequenz von SEQ ID NO: 37 oder SEQ ID NO: 53 für die Abschnitte zwischen ungefähr 10 bis 15 Nukleotiden und ungefähr 20 bis 30 Nukleotiden, besondere Nützlichkeit finden werden. Längere komplementäre Sequenzen, z. B. diejenigen von ungefähr 40, 50, 100, 200, 500, 1000 und sogar Sequenzen voller Länge von ungefähr 4154 Nukleotiden Länge werden ebenso in bestimmten Ausführungsformen von Nutzen sein.
Die Fähigkeit von solchen Nukleinsäuresonden, spezifisch an SREBP-kodierende Sequenzen zu hybridisieren, wird sie in die Lage versetzen, beim Nachweis der Anwesenheit von komplementären Sequenzen in einer gegebenen Probe von Nutzen zu sein. Jedoch werden andere Verwendungen in Erwägung gezogen, einschließlich der Verwendung der Sequenzinformation für die Herstellung von Primern für mutante Spezies oder von Primern zur Verwendung bei der Herstellung von anderen genetischen Konstruktionen.
Nukleinsäuremoleküle mit Abschnitten von 10, 14-15, 20, 30, 50, 100, 500 oder sogar von 1000 Nukleotiden, komplementär zu SEQ ID NO: 37 oder SEQ ID NO: 53, werden als Hybridisierungssonden zur Verwendung bei z. B. Southern- und Northern-Blotting in Erwägung gezogen. Dies würde es ermöglichen, daß SREBP-strukturelle oder -regulatorische Gene analysiert werden, sowohl in verschiedenen Zelltypen als auch in verschiedenen anderen Säugetierspezies. Die Gesamt-Fragmentgröße sowie die Größe des (der) komplementären Abschnitts (Abschnitte) wird letztendlich von der beabsichtigten Verwendung oder Anwendung des jeweiligen Nukleinsäuresegments abhängig. Kleinere Fragmente werden im allgemeinen eine Verwendung bei Hybridisierungsausführungsformen finden, bei denen die Länge der komplementären Region variiert werden kann, wie zwischen ungefähr 10 und ungefähr 100 Nukleotiden, aber größere komplementäre Abschnitte von bis zu ungefähr 4154 Nukleotiden können verwendet werden, gemäß der Länge der komplementären Sequenzen, die man nachzuweisen wünscht.
Die Nukleinsäuresegmente der vorliegenden Erfindung können, ungeachtet der Länge der kodierenden Sequenz sE1bst, mit anderen DNA-Sequenzen kombiniert werden, wie Promotoren, Polyadenylierungssignalen, zusätzlichen Restriktionsenzymstellen, vielfachen Klonierstellen, anderen kodierenden Segmenten und ähnlichen, so daß ihre Länge insgesamt beträchtlich variieren kann. Es wird deshalb in Erwägung gezogen, daß ein Nukleinsäurefragment von beinahe beliebiger Länge verwendet werden kann, wobei die Gesamtlänge vorzugsweise durch die Leichtigkeit der Herstellung und Verwendung bei dem beabsichtigten rekombinanten DNA-Protokoll limitiert wird. Zum Beispiel können Nukleinsäurefragmente hergestellt werden, die einen kurzen Abschnitt, komplementär zu SEQ ID NO: 37 oder 53, einschließen, wie ungefähr 10 Nukleotide, und die eine Länge von bis zu 10.000 oder 5.000 Basenpaaren haben, wobei Segmente von 3.000 in bestimmten Fällen bevorzugt werden. DNA-Segmente mit Gesamtlängen von ungefähr 1.000, 500, 200, 100 und ungefähr 50 Basenpaaren werden ebenso als nützlich betrachtet.
Es wird ebenso klar sein, daß diese Erfindung nicht auf die individuellen Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen der SEQ ID NO: 37, 38, 53 und 54 beschränkt ist. Rekombinante Vektoren und isolierte DNA-Segmente können deshalb in verschiedener Weise SREBPkodierende Regionen sE1bst, kodierende Regionen, die ausgewählte Veränderungen oder Modifizierungen in der grundlegenden Kodierungsregion tragen, einschließen, oder sie können für größere Polypeptide kodieren, die nichtsdestotrotz SREBP-kodierende Regionen einschließen, oder sie können für biologisch-funktionelle äquivalente Proteine oder Peptide kodieren, die verschiedene Aminosäuresequenzen haben.
Die DNA-Segmente der vorliegenden Erfindung umfassen biologisch-funktionelle äquivalente SREBP-Proteine und -Peptide. Solche Sequenzen können als eine Konsequenz der Codon-Redundanz und der funktionellen Äquivalenz entstehen, von denen bekannt ist, daß sie natürlicherweise innerhalb von Nukleinsäuresequenzen und den dadurch kodierten Proteinen entstehen. Alternativ können funktionell äquivalente Proteine oder Peptide über die Anwendung von rekombinanter DNA-Technologie erzeugt werden, bei der Veränderungen in der Proteinstruktur konstruiert werden können, auf der Grundlage von Erwägungen hinsichtlich der Eigenschaften der Aminosäuren, die ausgetauscht werden. Veränderungen, die vom Menschen geplant sind, können durch Anwendung von stellengerichteten Mutagenese-Techniken eingeführt werden, z. B. um Verbesserungen im Hinblick auf die DNA-Bindung des Proteins einzuführen oder um Punkt- oder Deletionsmutanten zu testen, um die SREBP-Aktivität und -Regulierung auf molekularem Niveau zu untersuchen.
Wenn erwünscht, kann man ebenso Fusionsproteine und -peptide herstellen, zum Beispiel wenn die SREBP-kodierenden Regionen innerhalb dersE1ben Expressionseinheit mit anderen Proteinen oder Peptiden, die erwünschte Funktionen haben, aligned sind, zu Aufreinigungs- oder Immunnachweiszwecken (z. B. Proteine, die mittels Affinitätschromatographie bzw. Enzymmarkierung-kodierenden Regionen aufgereinigt werden können).

Rekombinante Vektoren

Diese Erfindung umfaßt ebenso rekombinante Vektoren, die SREBP-DNA-Segmente einschließen. Als besonders nützliche rekombinante Vektoren werden die Vektoren angesehen, bei denen der kodierende Teil des DNA-Segments unter der Kontrolle eines Promoters positioniert ist. Der Promoter kann in der Form des Promoters sein, der natürlicherweise mit SREBP-Gen(en) in Säugetierzellen assoziiert ist, der durch Isolieren der 5'-nicht-kodierenden Sequenzen, die sich stromauf von dem kodierenden Segment oder Exon befinden, zum Beispiel unter Verwendung von rekombinanten Klonierungs- und/oder PCR-Technologie erhalten werden kann, in Zusammenhang mit den hierin offenbarten Zusammensetzungen.
In anderen Ausführungsformen wird in Erwägung gezogen, daß bestimmte Vorteile durch Positionieren des kodierenden DNA-Segments unter der Kontrolle eines rekombinanten oder heterologen Promoters erhalten werden können. Wie hierin verwendet, soll ein rekombinanter oder heterologer Promoter sich auf einen Promoter beziehen, der normalerweise nicht mit einem SREBP-Gen in seiner natürlichen Umgebung assoziiert ist. Solche Promoter können andere Sterol-empfindliche Promoter einschließen, die normalerweise mit anderen Genen assoziiert sind, und ebenso Promoter, die von jeder anderen bakteriellen, viralen, eukaryotischen oder Säugetierzelle isoliert werden. Natürlicherweise wird es wichtig sein, einen Promoter zu verwenden, der die Expression des DNA-Segments in dem für die Expression gewählten Zelltyp auf effektive Weise steuert. Die Verwendung von Promoter- und Zelltyp- Kombinationen für die Proteinexpression ist im allgemeinen Fachleuten auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannt, siehe zum Beispiel Sambrook et al. (1989).
Die verwendeten Promoter können konstitutiv oder induzierbar sein und können unter den geeigneten Bedingungen verwendet werden, um eine Expression des eingeführten DNA- Segments auf hohem Niveau zu steuern, wie es bei der Herstellung von rekombinanten Proteinen oder Peptiden in großem Maßstab von Vorteil ist. Geeignete Promotersysteme, die zur Verwendung bei der Expression auf hohem Niveau in bakteriellen Zellen in Erwägung gezogen werden, wie E. coli, schließen das β-Galactosidasesystem mit IPTG als Inducer, das T7- RNA-Polymerase-Promotersystem, beschrieben von Tabor & Richardson (1985), und das Maltosebindungsprotein-Fusionsprotein-System (Guan et al., 1987; Nagai & Thorgersen, 1987) ein.
Eine Vielzahl von Vektoren sind zur Expression von SREBP in kultivierten Tierzellen verfügbar, von denen jeder beliebige in Übereinstimmung hiermit verwendet werden kann. Die von den vorliegenden Erfindern bevorzugten Vektoren sind diejenigen auf der Grundlage von pCMV7, einer modifizierten Version von pCMVS (Andersson et al., 1989), der ein hybrides Adenovirus/Immunglobulin-Intron enthält. Für therapeutische Anwendungen der SREBPkodierenden Sequenzen wird man natürlich einen Vektor verwenden, der nicht mit menschlicher Therapie inkompatibel ist und der in der Lage ist, das Gen an geeignete Zielzellen, wie etwa Leberzellen, abzuliefern. Beispiele von geeigneten Vektoren unter diesem Gesichtspunkt schließen Adenoviren, Retroviren etc. ein (siehe z. B. USSN 07/968,861, hierin durch Bezugnahme miteinbezogen). Jedoch kann ein DNA-Segment, das für SREBP kodiert, in praktisch jeden Vektor unter Verwendung von Techniken ligiert werden, die heutzutage auf dem Gebiet absolute Routine sind. Alles was erforderlich ist, ist, den Vektor mit einem Restriktionsenzym zu verdauen und ein DNA-Segment, das geeignet angepaßte Termini enthält, in den Vektor zu ligieren.
Abhängig von der beabsichtigten Verwendung können rekombinante Vektoren und isolierte Segmente in variierender Weise die SREBP-kodierenden Regionen sE1bst, kodierende Regionen, die ausgewählte Veränderungen oder Modifizierungen in der grundlegenden Kodierungsregion tragen, einschließen, oder sie können für größere Polypeptide kodieren, die nichtsdestotrotz SREBP-Sequenzen einschließen und die vorzugsweise dahingehend wirken, daß sie bei Überexprimierung die SRE-1-vermittelte Genexpression fördern.
Es wird verstanden werden, daß dieser Aspekt der Erfindung nicht auf die besondere Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen der SEQ ID NO: 37, 38, 53 und 54 beschränkt ist. Entsprechend können DNA-Segmente, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung hergestellt sind, ebenso für biologisch-funktionelle äquivalente Proteine oder Peptide kodieren, die variierende Aminosäuresequenzen haben. Solche Sequenzen können als eine Konsequenz aus der Codon-Redundanz und funktionellen Äquivalenz entstehen, von denen bekannt ist, daß sie innerhalb von Nukleinsäuresequenzen und den dadurch kodierten Proteinen vorkommen. Alternativ können funktionell äquivalente Proteine oder Peptide über die Anwendung von rekombinanter DNA-Technologie erzeugt werden, wobei Veränderungen hinsichtlich der Proteinstruktur auf der Grundlage von Erwägungen hinsichtlich der Eigenschaften der Aminosäuren, die ausgetauscht werden, konstruiert werden können. Eine volle Beschreibung von biologisch funktionellen äquivalenten Aminosäuren wird hierin dargestellt.

Verwendungen von SREBP

Es wird hierin gezeigt, daß SREBP-Proteine die Transkription von Reportergenen mit künstlichen Promotern aktivieren, die vielfache Kopien von SRE-1 enthalten, sowie natürlichen Promotern, wie diejenigen, die die 5'-flankierende Region des LDL-Rezeptor-Gens und des HMG-CoA-Synthase-Gens enthalten. Wenn sie in Tierzellen überproduziert werden, stimulieren SREBPs die Transkription von dem SRE-1 und lassen die Sterol-vermittelte Unterdrückung der Transkription wegfallen. Die Erfinder stellen verschiedene Theorien vor, um dieses Phänomen in der vorliegenden Anmeldung zu erklären. Ungeachtet der zugrundeliegenden Begründung verleiht diese Beobachtung jedoch den SREBP-Proteinen eine sehr wichtige praktische Nützlichkeit, dahingehend, daß es verwendet werden kann, um die Transkription des LDL-Rezeptorgens sogar in der Anwesenheit von Sterolen zu fördern und wird deshalb als ein Cholesterinsenkendes Mittel vorgeschlagen.
Am bemerkenswertesten und wie es in größerem Detail in dem folgenden Abschnitt diskutiert werden wird, wird in Erwägung gezogen, daß die Fähigkeit des SREBP, an SRE-1-Sequenzen zu binden, ein Erfordernis oder eine Basis für seine regulatorische Fähigkeit ist. Daher wird die Fähigkeit, auf Mittel zu screenen, die diese Bindung modifizieren können, eine signifikante Nützlichkeit für die pharmazeutische Industrie haben, in Zusammenhang mit der Identifizierung von Mitteln mit einem Effekt auf den Cholesterin-Metabolismus und die Serum- Cholesterin-Konzentrationen. Zum Beispiel werden Mittel, die die Expression von SREBP oder seine Wechselwirkung mit der SRE-Bindungsstelle fördern, dazu tendieren, die Senkung von Serum-Cholesterin zu fördern (durch Aufheben der Sterol-vermittelten Unterdrückung von z. B. der LDL-Rezeptor-Expression). Daher erwägen die Erfinder ein Screening auf Verbindungen, die die SREBP-Bindung an SRE fördern, oder Mittel, die die Transkription von SREBP stimulieren, als ein Mittel zum Senken der Serum-Cholesterin-Konzentrationen. Auf ähnliche Weise würden Mittel, die dazu tendieren, die Bindung von SREBP zu fördern oder die Expression von SREBP zu inhibieren, eine Tendenz dazu haben, die zelluläre Aufnahme von Cholesterin zu senken. Daher liegt eine wichtige Verwendung der SREBP-Protein- und - Gensequenzen in dem Entwerfen von Assays für die Identifizierung von wichtigen Pharmazeutika, die den Cholesterin-Metabolismus beeinflussen werden.
Zusätzlich zur Verwendung bei dem in-vitro-Screening auf Pharmazeutika wird vorgeschlagen, daß das SREBP und seine Gensequenzen verschiedene Nützlichkeiten in vivo haben werden. Eine in-vivo-Verwendung, die erwogen wird, beinhaltet die Einführung von SREBP- Protein oder von biologisch aktiven Subfragmenten in Zellen als ein Mittel zum Unterdrücken oder Reduzieren der Sterol-vermittelten Unterdrückung der LDL-Rezeptor-Genexpression. Die Identifizierung von biologisch aktiven Subfragmenten von SREBP-Proteinen sollte im Lichte der hierin dargestellten Sequenz und biologischen Information unkompliziert sein.
Andere von den Erfindern vorgesehene Verwendungen schließen die Verwendung von SREBP-Proteinen ein, um die Produktion von jeglichem rekombinanten Protein zu erhöhen, das von einem SRE-1-einschließenden Promoter in Wirtszellen exprimiert wird, die mit und ohne Sterole kultiviert werden; es kann in Antisense-Protokollen verwendet werden, wenn erwünscht; und niedrige Niveaus der SREBP-Expression können sogar verwendet werden, um die Genexpression in hypocholesterinämischen Tieren oder in normalen Tieren zu Zeiten von niedrigen Sterolkonzentrationen zu fördern. Zum Beispiel kann mit SREBP- Gensequenz(en) auf Zellen gezielt werden, die einen Bedarf für eine Cholesterin-senkende Therapie haben, wie etwa Leberzellen, wobei ihre Einführung unter Verwendung eines geeigneten rekombinanten Vektors erreicht wird, wie etwa eines Retrovirus- oder Adenovirus- Vektors (siehe z. B. USSN 07/968,861, einbezogen durch Bezugnahme).
SREBPs sowie SRE-1-bindende Subfragmente können ebenso als die zentralen Bestandteile bei Screening-Assays verwendet werden, um Kandidatensubstanzen zu identifizieren, die in der Lage sind, die LDL-Rezeptorexpression, wie unten beschrieben, zu fördern.
Jedoch können SREBPs in einer Vielzahl von anderen Ausführungsformen verwendet werden, einschließlich zum Beispiel bei Immunisierungs-Behandlungsschemata, um SREBPspezifische Antikörper zu erzeugen, die dann bei der SREBP-Aufreinigung oder einer weiterern SREBP-Klonierung oder zur Erkundung der Struktur, Funktion, Lage und des Wirkmechanismus von SREBPs verwendet werden können.

Kandidatensubstanz-Screening-Assays

Obwohl gezeigt wird, daß die Expression von SREBP sE1bst die SRE-1-vermittelte Genexpression in der Anwesenheit oder Abwesenheit von Sterolen fördern kann, stellt diese Erfindung ebenso eine Vielzahl von Verfahren zum Bewerten von Kandidatensubstanzen bereit, um weitere Verbindungen zu identifizieren, die in der Lage sind, die SRE-1-vermittelte Transkription zu stimulieren. Solche Verbindungen wären in der Lage, die LDL- Rezeptorexpression zu fördern, und, da eine Steigerung in der Anzahl der LDL-Rezeptoren auf der Oberfläche einer Zelle es ermöglicht, daß die Plasma-LDL-Konzentrationen reduziert werden, werden positive Substanzen, die von solchen Assays identifiziert werden, potentielle LDL-Cholesterin-senkende Arzneien sein.
SREBP-1 wirkt dahingehend, daß es an SRE-1-DNA-Sequenzen bindet und die Transkription und Genexpression fördert, und hohe Konzentrationen von SREBP-1 tun dies sogar in der Anwesenheit von Sterolen. Deshalb ist die Identifizierung eines Mittels, das die SREBP- Bindung an SRE-DNA-Sequenzen fördert oder steigert, ein erster Schritt zur Entwicklung von weiteren therapeutischen Produkten zur Verwendung bei der Behandlung von Hypercholesterinämie. Verschiedene Assays werden als ein Mittel in Erwägung gezogen für die Suche nach Mitteln, die die SREBP-Bindung an DNA erhöhen, d. h. die die Affinität dieses Proteins erhöhen.
Die Grundlage eines solchen Assay beruht auf dem Mischen von relativ aufgereinigten SREBP-enthaltenden Zusammensetzungen, einschließlich rekombinantem SREBP-1, und von SRE-1-DNA-Segmenten, und auf der Bildung eines spezifischen gebundenen Komplexes, der von den freien Bestandteilen getrennt werden kann. Eine positive Kandidatensubstanz wäre eine, die dahingehend wirkt, daß sie die Menge an gebildetem Protein: DNA-Komplex erhöht, oder eine, die die Stabilität des Komplexes steigert, sobald er gebildet ist. Im allgemeinen wäre eine der nicht-gebundenen Spezies, entweder das Protein oder DNA, vor dem Beginn des Assays spezifisch markiert, um die Menge an später gebildetem, gebundenem Komplex zu quantifizieren. Radioaktive oder enzymatische Markierungen können verwendet werden, oder der Proteinteil des Komplexes kann mittels eines gegen das Protein gerichteten Antikörpers nachgewiesen werden.
Verschiedene Formen von DNA: Protein-Bindungsassays, die zur Verwendung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung geeignet sind, werden Fachleuten auf dem Gebiet im Lichte der vorliegenden Offenbarung bekannt sein. Diese schließen zum Beispiel Filterbindungsassays und Assays vom Mikrotiterplattentyp ein, die alle auf automatisierte oder halb-automatisierte Weise durchgeführt werden können, um die Analyse einer großen Anzahl an Kandidatensubstanzen in einer kurzen Zeitperiode zu ermöglichen. Natürlich wird die Effizienz von solchen Screening-Assays in starker Weise angesichts der Tatsache erhöht, daß jetzt die cDNA für SREBP-1 und rekombinante Formen des Proteins zur Verfügung stehen.
Weitere Verfahren der Erfindung zum Screenen auf Kandidatensubstanzen beruhen auf zellulären Assays, bei denen die Kandidantensubstanzen auf ihre Fähigkeit gescreent werden, die SRE-1-vermittelte Transkription und Genexpression und insbesondere die Reportergenexpression zu stimulieren. Die bevorzugten Assays zum Screenen auf zelluläre Kandidatensubstanzen umfassen die Herstellung eines rekombinanten Plasmids, einschließlich eines Reportergens, bevorzugt ein CAT-Gen oder Luciferase-Gen, unter der Transkriptionskontrolle einer funktionellen SRE-1-Sequenz, und die Einführung des Plasmids in eine rekombinante Wirtszelle, wie etwa eine CV-1-Zelle vom Affen. Die Wirtszelle wird ebenso ein SREBP-Gen enthalten und dieses exprimieren, entweder natürlich oder aufgrund der Anwesenheit eines rekombinanten Vektors, der SREBP exprimiert. Die Wirtszelle wird dann unter Bedingungen kultiviert, die dahingehend wirksam sind, daß sie eine Expression des Reportergens ermöglichen, wobei die Expression gemessen wird, und dann wird die Zelle in Kontakt mit der Kandidatensubstanz gebracht und das neue Niveau der Reportergenexpression wird gemessen. Eine Steigerung hinsichtlich der Expression des Reportergens in der Anwesenheit der Kandidatensubstanz deutet auf eine Kandidatensubstanz hin, die in der Lage ist, die SRE-1- vermittelte Transkription zu stimulieren.
Noch weitere Ausführungsformen der Erfindung betreffen Verfahren zum Testen auf Kandidatensubstanzen, die in der Lage sind, die SRE-1-vermittelte Gentranskription sogar in der Anwesenheit von Sterolen zu stimulieren. Diese Assays können als ein erstes Screening oder ein zweites Screening verwendet werden, um die Eigenschaften von Kandidatensubstanzen weiter zu analysieren, die in früheren DNA-Bindungs- oder zellulären Assays ein positives Testergebnis lieferten. Das Sterol-empfindlich zelluläre Screening-Verfahren beinhaltet die Kultivierung der Wirtszelle in der Anwesenheit von Sterolen und dann die Zugabe der Kandidatensubstanz, wobei eine Steigerung in der Reportergenexpression auf eine Substanz hindeutet, die in der Lage ist, SRE-1-vermittelte Transkription sogar in der Anwesenheit von Sterolen zu stimulieren. Unter praktischen Gesichtspunkten wird es im allgemeinen bevorzugt, zuerst die Genexpression ohne Sterole zu messen, dann Sterole zuzugeben und die "Sterol-unterdrückte Expression" zu messen und dann die Kandidatensubstanz zuzugeben und auf eine erhöhte Reportergen-Expression relativ zu den Sterol-unterdrückten Expressionsniveaus zu testen.
Andere von den Erfindern erwogene Assays beinhalten die gleichzeitige Einführung von SRE-1-vermittelten Reportergenen zusammen mit SREBP-kodierenden Genen in Wirtszellen. Diese rekombinanten Wirtskonstrukte werden dann verwendet, um auf Mittel zu screenen, die dahingehend wirken, die Expression des Reportergen und/oder SREBP-Gens zu modulieren. Es wird geglaubt, daß die Verwendung des Ansatzes einer gleichzeitigen Einführung besondere Vorteile im Hinblick auf Empfindlichkeit hat, indem er eine Antwort ermöglicht, die in leichter Weise durch automatisierte Nachweismittel nachweisbar ist, wie etwa mittels FACS oder einer verwandten Technologie. Darüberhinaus ermöglicht ein System der gleichzeitigen Einführung eine leichte Handhabung im Hinblick auf die Identifizierung von selektiven Mitteln, die spezifisch wirken, z. B. durch Modulierung der SREBP-Konzentrationen und/oder durch die Modulierung seiner SRE-1-Bindungsfunktion.
Es wird natürlich klar sein, daß all die Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung in sich sE1bst nützlich sind, ungeachtet der Tatsache, daß effektive Kandidaten möglicherweise nicht gefunden werden, da es von praktischem Nutzen wäre, zu wissen, daß SRE-1-positive Stimulatoren und/oder Sterol-Antagonisten nicht existieren. Die Erfindung besteht aus dem Bereitstellen von Verfahren zum Screenen auf solche Kandidaten, nicht in der Auffindung von diesen.

Sonden, Plasmide und weitere Zusammensetzungen

Zusätzlich zu aufgereinigten nativen und rekombinanten Proteinen, DNA-Segmenten und Screening-Assays, umfaßt die vorliegende Erfindung ebenso verschiedene andere Elemente. Zum Beispiel stellt sie in bestimmten Ausführungsformen polyklonale und monoklonale Antikörper bereit, die eine Bindungsaffinität für SREBP haben, Affinitätssäulen, die solche Antikörper enthalten und DNA-Affinitätssäulen, die transkriptionell funktionelle oder transkriptionell nicht-funktionelle SRE-1-Sequenzen enthalten.
In noch weiteren Ausführungsformen betrifft die Erfindung Oligonukleotidsonden und rekombinante Plasmide, die transkriptionell funktionelle oder nicht-funktionelle SRE-1- Sequenzen einschließen, und rekombinante Wirtszellen, wie CV-1-Zellen vom Affen, die solche Plasmide einschließen. Die Sonden und Plasmide dieses Aspekts der Erfindung werden eine besondere SRE-1-abgeleitete Sequenz in Kombination mit einer funktionellen, d. h. Wildtyp, Repeat-3-Sequenz (SEQ ID NO: 23) von dem LDL-Rezeptorgen einschließen. Die Sonden und Plasmide können ebenso in verschiedener Weise vielfache Kopien des SRE-1 (Repeat 2, SEQ ID NO: 22) und/oder Repeat-3-Sequenzen (SEQ ID NO: 23) einschließen.
Transkriptionell-funktionelle SRE-1-Sequenzen schließen die Wildtyp-Sequenzen, die innerhalb von Säugetier-LDL-Rezeptor-Repeat-2-Sequenzen gefunden werden (zum Beispiel SEQ ID NO: 20,21), und ebenso mutante Promotoren ein, die für die Sterol-regulierte Transkription positiv bleiben. Sowohl die funktionellen als auch nicht-funktionellen Versionen haben einen Nutzen, da sie als positive und negative Elemente fungieren, mittels derer SREBP identifiziert werden können. Die bevorzugtesten Plasmide und Sonden sind diejenigen, die zwei Kopien von Repeat 2 + 3 (SEQ ID NO: 24) enthalten (mit den transkriptionell funktionellen oder nicht-funktionellen Sequenzen), obwohl der gesamte Bereich an hierin beschriebenen Konstruktionen eine Nützlichkeit haben wird.
Die Plasmide werden im allgemeinen weiterhin eine TATA-Box-Sequenz haben, die sich stromab von den Repeat-2 (SRE-1) (SEQ ID NO: 22) und Repeat-3 (SEQ ID NO: 23)- Sequenzen befindet, und ein Reportergen, bevorzugt ein CAT-Gen, das sich stromab von besagter TATA-Box-Sequenz befindet. Die Sonden werden ebenso wahrscheinlich flankierende Sequenzen einschließen, die aufgrund der molekularbiologischen Verfahren, wie PCR, die zu ihrer Herstellung verwendet worden sind, vorhanden sein mögen. Die Sonden werden ebenso bevorzugt eine leicht nachweisbare Markierung enthalten, wie etwa eine radioaktive Markierung, zum Beispiel 32P. Die als H, M und * bezeichneten Sonden werden besonders zur Verwendung bei Assays während der SREBP-Aufreinigung bevorzugt.

Abkürzungen

bHLH-Zip = Basic-Helix-Loop-Helix-Leucin-Zipper
bp = Basenpaar
CAT = Chloramphenicolacetyltransferase
DNA = Deoxyribonukleinsäure
DTT = Dithiothreitol
HMG CoA = 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym A
LDL = Low-Density-Lipoprotein
NP-40 = Nonidet P-40
PCR = Polymerase-Kettenreaktion
SDS = Natriumdodecylsulfat
SDS/PAGE = SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
SRE-1 = Sterol-regulatorisches-Element- 1
SREBP = Sterol-regulatorisches-Element-1-Bindeprotein
SREBP-1 = Sterol-regulatorisches-Element-1-Bindeprotein- 1
SREBP-2 = Sterol-regulatorisches-Element-1-Bindeprotein-2

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1A. Plasmidkonstrukte, enthaltend SRE-1-Elemente (Repeat 2 + 3) des LDL-Rezeptor- Promoter, eingeführt in E1b TATA-CAT-Vektor; Sequenzen mit einem Kasten [2] (SEQ ID NO: 22) und [3] (SEQ ID NO: 23) beziehen sich auf menschliche LDL-Rezeptor-Gen- Promoter-Sequenzen -68 bis -53 (Repeat 2) und -52 und -37 (Repeat 3) relativ zu der in vivo-RNA-Hauptinitiationsstelle (Smith et al., 1990). Die Sequenz mit Kasten [2] [3] wird als SEQ ID NO: 24 dargestellt. Die mutante Sequenz [2*] [3] enthält die 4-bp-Mutation, die in Kleinbuchstaben gezeigt wird, und wird als SEQ ID NO: 25 bezeichnet.
Fig. 1B. Plasmidkonstrukte, enthaltend SRE-1-Elemente (Repeat 2 + 3) des LDL-Rezeptor- Promoter, eingeführt in E1b TATA-CAT-Vektor, wobei ein Teil der DNA-Sequenz des E1b TATA-CAT-Vektor die SalI-Insertionsstelle für die LDL-Rezeptor-SRE-1-Promoter- Elemente zeigt. Die Sequenz wird als SEQ ID NO: 26 bezeichnet. Der einzelne Unterstrich bezeichnet die SalI-Stelle; der einzelne Überstrich bezeichnet die PstI-Klonierstelle; die Sequenz mit Kasten bezeichnet die Adenovirus-E1b-TATA-Sequenz; und der doppelte Unterstrich bezeichnet das Initiationskodon des CAT-Gens.
Fig. 1C. Plasmidkonstrukte, enthaltend SRE-1-Elemente (Repeat 2 + 3) des LDL-Rezeptor- Promoter, eingeführt in den E1b-TATA-CAT-Vektor; Plasmide B und C wurden konstruiert, indem man komplementäre annealed Oligonukleotide einführt, die aus fünf aneinander grenzenden Elementen mit SalI-Klonierstellen an beiden Enden bestehen. Plasmide D bis 6 wurden durch Ligieren der angezeigten Oligonukleotide in SalI-verdauten, Phosphatasebehandelten E1b-TATA-CAT-Vektor gemacht und sequenziert, um die Orientierung zu bestätigen. Die LDL-Rezeptor(LDLR)- und HMG-CoA-Synthase-Konstrukte beziehen sich auf Plasmide pLDLR-CAT-234 (Südhof et al., 1987) und pSyn-CAT-1 (Smith et al., 1988), beschrieben in den angezeigten Literaturangaben.
Fig. 1D. Plasmidkonstrukte, enthaltend SRE-1-Elemente (Repeat 2 + 3) des LDL-Rezeptor- Promoter, eingeführt in E1b-TATA-CAT-Vektor; die Wildtyp-Nukleotidsequenz des LDL- Rezeptor-Repeat 2 plus zwei angrenzende Basenpaare von Repeat 3 (Plasmid K) wird in Großbuchstaben gezeigt (SEQ ID NO: 1). Die entsprechenden EinzE1basenveränderungen in den mutanten Plasmiden L bis Z und AA bis AE werden in Kleinbuchstaben gezeigt. Diese Plasmide enthalten die als SEQ ID NO: 2-19 bezeichneten Sequenzen. Jedes der 18 Plasmide enthielt zwei Kopien des mutanten Repeat 2 + 3-Konstrukts in Tandem, stromauf von der TATA-Box in dem PstI-SalI-verdauten Vektor.
Fig. 2. Expression der CAT-Aktivität unter Kontrolle von LDL-Rezeptor-Promoter- Elementen in transfizierten CV-1-Zellen. CV-1-Zellen wurden vorübergehend mit dem E1b- TATA-CAT-Plasmid transfiziert, das das angezeigte LDL-Rezeptor-Promoter-Element enthielt. Nach Inkubation für 48 Stunden in der Abwesenheit oder Anwesenheit von 10 ug/ml Cholesterin plus 1 ug/ml 25-Hydroxycholesterin wurden die Zellen zur Messung der CAT- Aktivität geerntet, wie hier unten beschrieben. Die acetylierten Formen von [¹&sup4;C] Chloramphenicol (1-AcCM, 3-AcCM und 1,3-AcCM) wurden von nicht-umgesetztem [¹&sup4;C] Chloramphenicol (cm) mittels Dünnschichtchromatographie getrennt und mittels Autoradiographie nachgewiesen. Die Autoradiogramme wurden für drei Tage exponiert, um eine Visualisierung der niedrigen Expression des LDL-Rezeptor(LDLR)-Konstrukts zu ermöglichen. Plasmid J, der authentische HMG-CoA-Synthase-Promoter (-550 bis +35), fusioniert an CAT, wird zu Vergleichszwecken eingeschlossen.
Fig. 3A. Einzelpunktmutationsanalyse des Repeat 2 des LDL-Rezeptor-Promoter in transfizierten CV-1-Zellen; schematisches Diagramm der Daten in Tabelle II, die den Mittelwert + S. E. von 3 bis 9 unabhängigen Transfektionsstudien darstellt. Die Sequenz in Großbuchstaben wird als SEQ ID NO: 1 bezeichnet. Die mutanten Sequenzen, von denen jede die Sequenz SEQ ID NO: 1 enthält, mit Ausnahme, der in jedem Fall durch die Kleinbuchstaben angezeigten Mutation, werden als SEQ ID NO: 2-19 bezeichnet. Die Daten stellen die relative CAT-Expression dar, die beobachtet wurde, wenn die Zellen in der Abwesenheit (nicht ausgefüllter Balken) oder Anwesenheit (ausgefüllter Balken) von Sterolen kultiviert wurden.
Fig. 3B. Einzelpunktmutationsanalyse von Repeat 2 des LDL-Rezeptor-Promoter in transfizierten CV-1-Zellen; eine einzelne Studie, bei der alle 19 Plasmidkonstrukte transfiziert wurden, und die CAT-Aktivität der transfizierten Zellen, kultiviert in der Abwesenheit (-) oder Anwesenheit (+) von Sterolen, wurde mittels Dünnschicht-Chromatographie getestet. Das Chromatogramm wurde für 24 Stunden bei Zimmertemperatur exponiert. Das SRE-1 (Sequenz SEQ ID NO: 27), enthalten innerhalb von Repeat 2, ist mit einem Kasten versehen.
Fig. 4A. Einzelpunktmutationsanalyse von Repeat 2 des LDL-Rezeptor-Promoter. Die Punktmutationsanalyse von Repeat 2 wird in vitro mittels Gel-Mobilitäts-Shift-Assay bewertet, wie in Fig. 4A, untere Tafel, gezeigt; und in vivo mittels transienter Transfektion in CV- 1-Zellen, wie in Fig. 4B, obere Tafel, gezeigt wird. Wie in der Beschreibung von Fig. 3 angedeutet, wird die Sequenz in Großbuchstaben als SEQ ID NO: 1 bezeichnet. Die mutanten Sequenzen, von denen jede die Sequenz von SEQ ID NO: 1 enthält, mit der Ausnahme einer einzelnen Mutation in jedem Fall, die durch Kleichbuchstaben angezeigt wird, werden als SEQ ID NO: 2-19 bezeichnet. Fig. 4A (obere Tafel) zeigt insbesondere die schematische Repräsentation der Transfektionsdaten in Tabelle II.
Fig. 4B. Einzelpunktmutationsanalyse von Repeat 2 des LDL-Rezeptor-Promoter. Ein Aliquot von partiell aufgereinigtem Rattenleber-SREBP (2,2 ug) wurde für 20 Minuten bei Zimmertemperatur mit der angezeigten Wildtyp- oder mutanten, ³²P-markierten, aus einer PCR stammenden DNA-Sonde von 94bp Länge inkubiert. Jede ³²P-Sonde (A · 104 cpm/Reaktion) enthielt zwei Tandem-Kopien von Repeat 2 + 3 mit der angezeigten Punktmutation in beiden Kopien von Repeat 2. Nach der Elektrophorese wurde das Gel einem Kodak-XAR-Film für 14 Stunden bei -80ºC mit einem Verstärkungsschirm exponiert. Die SRE- 1-Sequenz (SEQ ID NO: 27), enthalten innerhalb von Repeat 2, ist mit einem Kasten versehen.
Fig. 5A. Gel-Mobilität-Shift-Assays von Hela-Zell-SREBP nach verschiedenen Schritten der Aufreinigung; Aliquots der angezeigten Fraktion zu verschiedenen Stadien der Aufreinigung wurden in dem Standard-Gel-Shift-Assay für 20 Minuten bei Zimmertemperatur mit der angezeigten ³²P-markierten, aus einer PCR stammenden DNA-Sonde von 94bp-Länge inkubiert. Jede Sonde (~4 · 10&sup4; cpm/Reaktion) enthielt zwei Tandem-Kopien der Version von Repeats 2 + 3. Die Sonden enthielten die folgenden Versionen von Repeat 2: Sonde H, menschliche SRE-1-Sequenz vom Wildtyp (Plasmid K in Beispiel 1) (SEQ ID NO: 1); Sonde M, Maus-SRE-1-Sequenz vom Wildtyp (SEQ ID NO: 21), die sich um 1bp (C T) von der menschlichen Sequenz unterscheidet (Plasmid AE in Beispiel 1); und Sonde *, mutante Version der menschlichen SRE-1-Sequenz, die eine Substitution von A für C an dersE1ben Position enthält (SEQ ID NO: 14), die die Transkriptionsaktivität von SRE-1 unterdrückt (Plasmid X in Beispiel 1). Pfeile bezeichnen die Position der Wanderung von SREBP, gebunden an eine (unterer Pfeil) oder zwei (oberer Pfeil) Kopien von SRE-1 in der ³²P-Sonde. Das Gel wurde für 2 Stunden exponiert. Die erste DNA-Affmitätsfraktion war einer sequenziellen Aufreinigung auf DNA-Affinitätssäulen A und B unterzogen worden.
Fig. 5B. Gelmobilitäts-Shift-Assays von Hela-Zell-SREBP nach verschiedenen Schritten der Aufreinigung; Hela-Zellen, die in Spin-Kulturen wachsengelassen wurden, wurden auf Monoschichten als 5 · 10&sup5;-Zellen pro 90-mM-Schale in Medium A (Beispiel 1), enthaltend 10% fötales Kälberserum, ausplattiert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen transient mit dem angezeigten LDL-Rezeptor-Promoter-CAT-Plasmid transfiziert, in der Abwesenheit oder Anwesenheit von Sterolen inkubiert und zur Messung der CAT-Aktivität verarbeitet, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Daten stellen den Durchschnitt aus zwei unabhängigen Transfektionsstudien dar und stimmen mit Expressionsdaten in CV-1-Zellen vom Affen überein (Tabelle II). H, M und * beziehen sich auf Plasmide K, AE bzw. X.
Fig. 6A. Superdex-200-Chromatographie von SREBP. Die 40%-Ammoniumsulfatfraktion (Schritt 3) wurde einer Gelfiltration auf einer Superdex 200 26/60-Säule unterzogen. Aliquots von jeder Fraktion wurden auf den Proteingehalt durch Messung der Extinktion bei 280 nm getestet. Die Säule wurde mit Bio-Rad-Molekulargewichtsmarkern, enthaltend Thyreoglobulin (670 kDa), Aldolase (158 kDa) und Ovalbumin (44 kDa), kalibriert. Die Pfeile bezeichnen die Positionen der Elution der Marker.
Fig. 6B. Superdex-200-Chromatographie von SREBP. Ein Aliquot (2 ul) jeder zweiten Fraktion wurde auf die SREBP-Aktivität mit dem Standard-Gelshift-Assay unter Verwendung der drei ³²P-Sonden, beschrieben in Fig. 5, getestet. Ein Pfeil bezeichnet das ³²P-Sondeenthaltende SREBP, gebunden an eine Stelle. Das Gel wurde für zwei Stunden exponiert.
Fig. 7A. Aufreinigung von SREBP mittels DNA-Affinitätschromatographie; die aktiven Fraktionen von der Superdex-200-Säule (Schritt 4) wurden vereinigt und auf eine DNA- Affinitätssäule, enthaltend eine mutante Version von Repeat 2 + Wildtyp-Repeat 3 (Säule A) (SEQ ID NOS: 31,32), aufgebracht und eluiert, wie hier unten beschrieben.
Fig. 7B. Aufreinigung von SREBP mittels DNA-Affinitätschromatographie; der Durchfluß von Säule A wurde direkt auf Säule B, enthaltend Tandem-Kopien des Wildtyp-Repeat 2 (SEQ ID NOS: 33,34), aufgebracht und, wie hierin unten beschrieben, eluiert. Aliquots (2 ul) des Ausgangsmaterial, Durchflußfraktion, 0,3 M KCl-Eluat und 1 M KCl-Eluat von beiden Säulen wurden auf SREBP-Aktivität mit dem Standard-Gelshift-Assay unter Verwendung der drei in Fig. 5 beschriebenen 32P-Sonden getestet. Die Gele wurden für 2 Stunden exponiert. Pfeile bezeichnen das ³²P-Sonden-enthaltende SREBP, gebunden an eine oder zwei Stellen.
Fig. 8A. Aufreinigung von SREBP auf einer zweiten SRE-1-DNA-Affinitätssäule. Die aktiven Fraktionen von dem 1 M KCl-Eluat von der DNA-Affinitätssäule B (Schritt 6) wurden vereinigt, gegen Puffer B, enthaltend 150 mM KCl 0,1% NP-40, dialysiert, aufgebracht auf zwei sequentielle mutante-DNA-Affinitätssäulen (Säule A, SEQ ID NOS: 31,32), gefolgt von einer SRE-1-DNA-Affinitätssäule (Säule C, SEQ ID NOS: 35,36), und wie hierin unten in Beispiel 2 beschrieben, eluiert. Aliquots (2 ul) der schrittweisen NaCl-Elution von Säule C wurden auf SREBP-Aktivität mit dem Standard-Gelshift-Assay unter Verwendung der ³²P- Sonde-H (siehe Fig. 5) getestet. Das Gel wurde für 8 Stunden ohne Verstärkungsschirm exponiert. Pfeile bezeichnen das ³²P-Sonde-enthaltende SREBP, gebunden an eine oder zwei Stellen.
Fig. 8B. Aufreinigung von SREBP auf einer zweiten SRE-1-DNA-Affinitätssäule; Aliquots (20u1) dersE1ben Fraktionen wurden einer Elektrophorese auf einem 8% SDS-Polyacrylamid- Minigel unterzogen. Die Proteinbanden wurden mittels Silberfärbung nachgewiesen.
Fig. 9A. Glyzeringradientensedimentation von aufgereinigtem SREBP. Die Peak-Fraktion von der zweiten SRE-1-DNA-Affinitätssäule (Schritt 8) wurde direkt oben auf einen 4,5 ml 10%-30%-Glyzeringradienten geladen und, wie in Beispiel 2 beschrieben, zentrifugiert. Aliquots (2 ul) jeder Fraktion wurden mit dem Standard-Gelshift-Assay unter Verwendung der ³²P-Sonde H (siehe Fig. 5) getestet. Das Gel wurde für zwei Stunden exponiert. Pfeile bezeichnen das ³²P-Sonde-enthaltende SREBP, gebunden an eine oder zwei Kopien von SREBP.
Fig. 9B. Glyceringradientensedimentation von aufgereinigtem SREBP; Aliquots (20 ul) dersE1ben Fraktionen wurden einer Elektrophorese auf einem 8% SDS-Polyacrylamid-Minigel unterzogen, und die Proteine wurden mittels Silberfärbung nachgewiesen. SM, Ausgangsmaterial.
Fig. 10. Photoaffinitätsmarkierung von SREBP. Aliquots von partiell aufgereinigtem SREBP (Spuren 1-5, Protein aus Schritt 6 in 4 ug/Spur) wurden mit der angezeigten 32Pmarkierten, 5'-Brom-dUTP-substituierten Sonde inkubiert und einem UV-Quervernetzen unterzogen, wie in Beispiel 2 beschrieben. Nach einem Nukleaseverdau wurden die Proben einer Elektrophorese auf einem 8% SDS-Polyacrylamidgel unterzogen. Spuren 1-5, Autoradiogramm des Gels nach Exponieren des Röntgenfilms für 48 Stunden bei -80ºC mit einem Verstärkungsschirm. Spur 6, Silberfärbung von aufgereinigtem SREBP (20 ng Protein aus Schritt 8), das einer Elektrophorese auf demsE1ben Gel, angrenzend an die Proben in Spuren 1-5, unterzogen wurde. Siehe Fig. 5 für eine Beschreibung der Sonden H, M und *.
Fig. 11. Bindung von aufgereinigtem SREBP an Wildtyp- und mutante Formen von Repeat 2. Aliquots (~1 ng) von aufgereinigtem SREBP (Schritt 8) wurden in dem Standard-Gelshift- Assay mit der angezeigtenWildtyp- oder mutanten ³²P-markierten, PCR-abgeleiteten DNA-. Sonde von 94 bp Länge inkubiert. Jede ³²P-Sonde enthielt zwei Tandemkopien von Repeats 2 + 3 mit der angezeigten Punktmutation in beiden Kopien von Repeat 2. Die Sonden wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt. Die Sequenz in Großbuchstaben wird als SEQ ID NO: 22 bezeichnet. Die mutanten Sequenzen, von denen jede die Sequenz SEQ ID NO: 22 enthält, mit der Ausnahme einer einzelnen Mutation in jedem Falle, angezeigt durch die Kleinbuchstaben, werden als SEQ ID NO: 2-17 bezeichnet. Die 10-bp-Sequenz von SRE-1 (SEQ ID NO: 27) in Repeat 2 ist mit einem Kasten versehen. Das Gel wurde für 2 Stunden exponiert. Die Pfeile bezeichnen das ³²P-Sonden-enthaltende SREBP, gebunden an eine oder zwei Stellen von Repeat 2.
Fig. 12. DNAseI-Footprint von LDL-Rezeptor-Promoterelementen mit SREBP und Sp 1. Ein 239-bp-DNA-Fragment von Plasmid K, entsprechend Wildtypsonde H in Gelshiftstudien (Spuren 1-3) oder Plasmid X, entsprechend der mutanten Sonde * (Spuren 4-6), wurde mit ³²P am nicht-kodierenden Strang endmarkiert, wie in Beispiel 2 beschrieben. Das ³²P-Fragment (2 fmol, ~10&sup4; cpm) wurde für 15 Minuten bei Zimmertemperatur mit einem der folgenden Proteine inkubiert: keines, Spuren 3 und 4; 10 ug partiell aufgereinigtes SREBP aus Schritt 6 (Spuren 1 und 6); und 5 Footprint-Einheiten von aufgereinigtem Spl (Spuren 2 und S). Nach Verdau mit 40 ng DNaseI für 1 Minute bei Zimmertemperatur (Briggs et al., 1986), wurde jede Reaktionsmischung gestoppt und einer Elektrophorese auf einem denaturierenden 6%- Gel unterzogen. Das Gel wurde einem Röntgenfilm für 12 Stunden bei -70ºC mit einem Vestärkungsschirm ausgesetzt. Die Positionen von Repeat 2 und Repeat 3 in dem ³²P-DNA- Fragment werden auf der linken Seite angezeigt. Klammern bezeichnen das Ausmaß der geschützten Region (Footprint) durch SREBP (schraffiert) oder Spl (nicht-ausgefüllt).
Figur. 13A. Bindung von SREBP an Oligonukleotide, enthaltend eine oder zwei Kopien von SRE-1; die angezeigte Menge an Affinitäts-aufgereinigtem SREBP (Schritt 6) wurde in dem Standard-Gelshift-Assay mit einer der folgeden ³²P-Sonden inkubiert: Spuren 1-4, 12 fmol (8 x 10&sup4; cmp) der ³²P-Sonde H (siehe Fig. 5), verdaut mit SalI, um ein doppelsträngiges 45-bp- Fragment zu ergeben, enthaltend eine Kopie von Repeat 2 + 3 und einen 5'-Überhang von 4 Nukleotiden; Spuren 5-8, 6 fmol (4 · 10&sup4; cpm) von 32P-Sonde H, enthaltend zwei Tandemkopien von Repeat 2 + 3; Spuren 9-12, 12 fmol (8 · 10&sup4; cpm) eines PCR-erzeugten Fragments, entsprechend Nukleotiden -103 bis -38 in dem menschlichen LDL-Rezeptor-Promoter, das eine Kopie von Repeat 1 + 2+3 enthält (Brown & Goldstein, 1986). Das Gel wurde für eine Stunde exponiert. Pfeile bezeichnen die ³²P-Sonde, enthaltend SREBP, gebunden an eine oder zwei Stellen.
Fig. 13B. Bindung von SREBP an Oligonukleotide, enthaltend ein oder zwei Kopien von SRE-1; die angezeigte Menge an Affinitäts-aufgereinigtem SREBP (Schritt 8) in der Abwesenheit (-) oder Anwesenheit (+) von 1 Footprint-Einheit von aufgereinigtem Sp1 wurde in dem Standard-Gelshift-Assay inkubiert, außer daß der Oligonukleotid-Wettbewerber (mutante Repeat 2 + Wildtyp-Repeat-3-Sequenz) ausgelassen wurde. Die folgenden ³²P-Sonden wurden verwendet: Spuren 1-8, 12 fmol (8 · 10&sup4; cpm) von 32P-Sonde H (siehe Tafel A); Spuren 9-16, 12 fmol (8 · 10&sup4; cpm) eines ³²P-markierten, PCR-erzeugten doppelsträngigen 45-bp- Fragment, enthaltend eine Kopie des Wildtyp-Repeat 2, gefolgt von einer Kopie eines mutanten Repeat 3, der zwei C T-Substitutionen trägt, die die Spl-Bindung eliminieren. Das Gel wurde für 40 Minuten exponiert. Pfeile bezeichnen das ³²P-Sonde-enthaltende, gebundene SREBP und/oder Sp1, wie angezeigt.
Fig. 14. Aktivierung von SREBP durch Milchproteine. Ein Aliquot (~0,14 ug) von affinitätsaufgereinigtem SREBP (Schritt 6) wurde in dem Standard-Gelshift-Assay mit ³²pmarkierter Sonde H (siehe Fig. 5) in der Anwesenheit der angezeigten Menge von entweder Milchproteinen oder bovinem Serumalbumin (BSA, Fraktion V; Sigma) inkubiert. Das Gel wurde für 4 Stunden exponiert. Pfeile bezeichnen das ³²P-Sonde-enthaltende SREBP, gebunden an eine oder zwei Stellen.
Fig. 15A. SREBP-1-Plasmidkonstrukte. cDNAs, kodierend für SREBP-1-Sequenzen (pCY5, pCY21 und pCY22) werden mit den durchgezogenen Linien bezeichnet. Um Plasmidkonstrukte pSREBP-1a und pSREBP-1b zu erzeugen, wurde die Eco47III-Stelle an Nukletidposition 1167 von pSREBP-1a (Fig. 2) verwendet, um das 5'-Ende von pCYS an das 3'-Ende von entweder pCY21 oder pCY22, wie angezeigt, zu fusionieren. Das Plasmid pSREBP-1c wurde als das SalI-Fragment von pCY22 erzeugt. Identische Sequenzen in allen drei Plasmidkonstrukten werden durch die nicht ausgefüllten Kästen bezeichnet. Die 5'-Sequenzen von pCY22 und pCYS unterscheiden sich in den durch die ausgefüllten und schraffierten Kästen bezeichneten Regionen, die in den Plasmidkonstrukten gezeigt werden (siehe unten). Die 3'- Sequenzen von pCY22 und pCY21 unterscheiden sich in den durch die ausgefüllten und schraffierten Kästen bezeichneten Regionen, die in den Plasmidkonstrukten gezeigt werden; die Sequenzen divergieren an Nukleotidposition 3269 in pSREBP-1a (siehe unten und Fig. 16).
Fig. 15B-1 bis Fig. 15B-5. SREBP-1-Plasmidkontrukte. Die 5'- und 3'-Regionen der Nukleotid- und abgeleiteten Aminosäuresequenzen von pCYS, pCY21 und pCY22, die sich voneinander unterscheiden, werden gezeigt. Die Zahlen für die Nukleotidreste (rechts) und Aminosäurereste (links) beziehen sich auf die Zahlen für pSREBP-1a (siehe Fig. 16A bis 16L); d. h. sie beziehen sich auf SEQ ID NO: 37 bzw. SEQ ID NO: 38. Ein In-Frame-Nonsense- Codon in der 5'-nicht-translatierten Region von pCYS wird durch den einzelnen Unterstrich bezeichnet. Vermeintliche Initiationsmethionine in pCYS und pCY22 werden durch doppelte Unterstriche bezeichnet. Vermeintliche Polyadenylierungssignale in pCY21 und pCY22 sind mit einem Kasten versehen. Die Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen des 5'-Endes von pCY22 werden durch SEQ ID NO: 39 bzw. SEQ ID NO: 40 dargestellt; und die Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen des 3'-Endes werden durch SEQ ID NO: 41 bzw. SEQ ID NO: 42 dargestellt.
Fig. 16A bis 16L. Nukleotid- (SEQ ID NO: 37) und die vorhergesagte Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 38) von cDNA, die für menschliches SREBP-1a kodiert.
Aminosäurereste werden auf der linken und rechten numeriert. Aminosäurerest 1 ist das vermeintliche Initiationsmethionin. Fünf tryptische Peptide, die in aufgereinigtem SREBP (Tabelle IV) gefunden wurden, sind unterstrichen. Die Aminosäuresequenzen von pCYS und pCY21 divergieren von pCY22 nach den Resten 28 bzw. 1043 (siehe Fig. 15). Die cDNA- Seugenz von SREBP-1a wird in GenBank (Hinterlegungs Nr. U00968) hinterlegt. Beide Stränge der cDNA wurden sequenziert.
Fig. 17A. Domän-Struktur von SREBP-1a; schematische Darstellung von SREBP-1a. Ein horizontaler Balken mit Zahlen, entsprechend den Aminosäureresten in Fig. 16A bis 16L. Die Helix-Loop-Helix-Region wird durch den schwarzen Kasten bezeichnet; die Leuzin- Zipper-Region durch den punktierten Kästen und zwei Serin/Prolin-reiche Regionen durch die nicht ausgefüllten Kästen. Die NH&sub2;-terminale saure Region wird ebenso angezeigt.
Fig. 17B. Domän-Struktur von SREBP-1a; die Aminosäuresequenz der Helix-Loop-Helix- Region von SREBP-1a (Reste 318 bis 380 von SEQ ID NO: 38) wird mit der von anderen Helix-Loop-Helix-Familienmitgliedern verglichen (Beckmann et al., 1990; Prendergast et al., 1991), und Reste, die mit der Konsensussequenz identisch sind, werden in schwarz gezeigt. Die Grenzen der Basic, Helix-1- und Helix-2-Regionen werden unter der Konsensussequenz angezeigt. Sternchen (*) bezeichnen Aminosäuren in Max, die mit spezifischen Nukleotidbasen in seiner DNA-Erkennungssequenz in Kontakt kommen, bestimmt mittels Röntgenkristallographie (Ferrè-D'Amarè et al., 1993; siehe Fig. 24).
Fig. 17C. Domän-Struktur von SREBP-1a; die Aminosäuresequenz der vermeintlichen Leuzin-Zipper-Region von SREBP-1a wird gezeigt (Reste 359 bis 401 von SEQ ID NO: 38).
Fig. 18A. Expression von menschlichem SREBP-1; Gewebeverteilung von mRNA für SREBP-1. pSREBP-1c wurde an Poly(A)&spplus;-RNA von dem angezeigten Gewebe hybridisiert (2 ug/Spur in den linken und rechten Tafeln und 2,5 ug/Spur in der mittleren Tafel), wie in Verfahren 5 aus Beispiel 3 beschrieben. Die Filter wurden einem Kodak-XAR-5-Film mit einem Verstärkungsschirm bei -70ºC für 16 Stunden exponiert. DiesE1ben Filter wurden daraufhin mit Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase (GAPDH) aus Ratte hybridisiert und einem Film für 4 Stunden exponiert. Die Proben in den linken und mittleren Tafeln sind aus menschlichem erwachsenem Gewebe und die in der rechten Tafel sind aus menschlichen fötalen Geweben.
Fig. 18B. Expression von menschlichem SREBP-1; Immunblot-Analyse von SREBP-1, das in transfizierten 293-Zellen überexprimiert war. Die Proben (siehe unten) wurden einer Elektrophorese auf einem 7,5% SDS-Polyacrylamidgel unterzogen und auf Nitrozellulosefilter übertragen. Die Filter wurden mit 5 ug/ml Kanichen-anti-SREBP-1-IgG inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit anti-Kaninchen-IgG, konjugiert an Meerrettichperoxidase, unter Verwendung des ECL-Western-Kit. Der Filter wurde einem Kodak-XAR-5-Film für 10 Sekunden bei Zimmertemperatur exponiert. Die Position der Migration von vorgefärbten Molekulargewichtsmarkern wird angezeigt. Spuren 1-5 wurden mit 5 ug Protein eines Gesamtextrakt aus 293-Zellen beladen, die mit 3 ug der folgenden Plasmide transfiziert worden waren: Spur 1, pCMV7; Spuren 2 und 5, pSREBP-1a; Spur 3, pSREBP-1b; Spur 4, pSREBP-1c. Spur 6 wurde mit 0,1 ug aufgereinigtem SREBP aus HeLa-Zellen beladen, wie hierin in Schritt 6 aus Beispiel 2 offenbart.
Fig. 19. Gel-Mobilität-Shift-Assays von in-vitro-translatiertem SREBP-1c, DNA-Affinitätsaufgereinigtem SREBP aus HeLa-Zellen und rekombinante bHLH-Zip-Domäne von SREBP- 1.
Aliquots der gezeigten Proteine (siehe unten) wurden in dem Standard-Gel-Shift-Assay inkubiert (Endvolumen von 20 ul) für 20 Minuten bei Zimmertemperatur mit der angezeigten ³²Pmarkierten, PCR-abgeleiteten DNA-Sonde (94 bp). Jede Sonde (~4 · 10&sup4; cpm/Reaktion) enthielt zwei Tandem-Kopien von Repeats 2 + 3 mit den folgenden Versionen von Repeat 2: Sonde H, menschlicher Wildtyp-SRE-1; Sonde M, Wildtyp-Maus-SRE-1, das sich um ein bp (C T) von der menschlichen Sequenz an Position 10 in SRE-1 unterscheidet (siehe Fig. 21); und Sonde *, mutante Version von menschlichem SRE-1, enthaltend eine Substitution von A für C an dersE1ben Position, was die Transkriptionsaktivität unterdrückt. Die folgenden Proteine wurden in den Assays verwendet: Spuren 1 bis 3, 3 ul einer in-vitro- Transkription/Translations-Mischung, der Plasmid pSREBP-1c fehlte; Spuren 4 bis 6, 3 ul einer in-vitro-Transkription/Translations-Mischung mit pSREBP-1c; Spuren 7-9, 0,1 ug partiell aufgereinigtes SREBP aus HeLa-Zellen; Spuren 10 bis 12, 0,1 ug aufgereinigte rekombinante bHLH-Zip-Domäne von SREBP-1. Pfeil a bezeichnet SRE-1, gebunden an SREBP-1c voller Länge; Pfeil b bezeichnet SRE-1, gebunden an aufgereinigtes SREBP; Pfeil c bezeichnet SRE-1, gebunden an die rekombinante bHLH-Zip-Domäne; Pfeil X bezeichnet ein kontaminierendes Protein, das an die mutante Sonde sowie an die beiden Wildtyp-Sonden bindet. Nach der Elektrophorese wurden die Spuren 1 bis 9 einem Kodak-XAR-Film für 6 Stunden bei -80ºC mit Verstärkungsschirm exponiert; Spuren 10 bis 12 wurden für 2 Stunden mit einem Verstärkungsschirm bei -80ºC exponiert.
Fig. 20. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese von in-vitro-translatiertem 325-markiertem SREBP-1c, aufgereinigt durch Bindung an biotinyliertes SRE-1.
Aliquots (10 ul) von in-vitro-translatiertem ³²S-markiertem SREBP-1c (Spuren 2 und 3) wurden in einem Endvolumen von 100 ul inkubiert, enthaltend 0,5 ug einer 5'-Biotin-markierten SRE-1-Oligonukleotidesonde, diesE1be Konzentration an Bestandteilen, die in dem Standard- Gelmobilität-Shift-Assay verwendet wurden, und einen 5'-fachen Überschuß von entweder nicht-markiertem Wildtyp (Spur 2) oder mutantem (Spur 3) Oligonukleotid-Kompetitor, wie hierin in Beispiel 3, Materialien und Methoden, beschrieben. Nach Inkubation für 20 Minuten bei Zimmertemperatur wurde 10 ul an Streptavidin-Agarose (Gibco-BRL), äquilibriert in Puffer A, jedem Röhrchen zugegeben und bei 4ºC für 6 Stunden rotiert. Die Pellets wurden mittels Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge gesammelt und zweimal mit 1 ml Puffer A, enthaltend 0,3 M KCl und 0,1% (v/v) Nonidet P-40, gewaschen. Jedes Pellet wurde dann mit 30 ul SDS-Probenpuffer gemischt, für drei Minuten gekocht und in einer Mikro-Zentrifuge für zwei Minuten gedreht. Der Überstand wurde auf ein 4-15%-Gradientengel geladen. Spur 1,1 ul von in-vitro-translatiertem 325-markiertem SREBP-1c, direkt auf das Gel geladen; Spur 2, Streptavidin-Agarose-Pellet aus einer Reaktion, die Wildtyp-Oligonukleotid-Kompetitor enthielt; Spur 3, Streptavidin-Agarose-Pellet aus einer Reaktion, die mutanten Oligonukleotid- Kompetitor enthielt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel einem Kodak-XAR-Film für 16 Stunden bei -80ºC mit einem Verstärkungsschirm ausgesetzt.
Fig. 21. Bindung von rekombinanter bHLH-Zip-Domäne von SREBP-1 an Wildtyp- und mutante Formen von Repeat 2.
Aliquots der aufgereinigten rekombinanten bHLH-Zip-Domäne von SREBP-1 (0,2 ug) wurden in dem Standard-Gelshift-Assay (Endvolumen 20 ul) für 20 Minuten bei Zimmertemperatur mit der angezeigten Wildtyp- oder mutanten ³²P-markierten, PCR-abgeleiteten DNA- Sonde (45 bp) inkubiert. Jede ³²P-Sonde (4 · 10&sup4;cpm/Reaktion) enthielt eine Kopie von Repeat 2+3 mit der angezeigten Punktmutation in Repeat 2. Nach der Elektrophorese wurde das Gel einem Kodak-XAR-Film für zwei Stunden bei -80ºC mit einem Verstärkungsschirm ausgesetzt. Die SRE-1-Sequenz, enthalten innerhalb von Repeat 2, ist mit einem Kasten versehen.
Fig. 22A. Effekt von SREBP-1a auf die Expression von CAT-Aktivität unter der Kontrolle von synthetischen LDL-Rezeptor-Promoter-Elementen in transfizierten Affen-CV-1-Zellen. Die Zellen wurden vorübergehend mit einem synthetischen LDL-Rezeptor-Promoter-CAT- Gen, das von zwei Tandem-Kopien von Repeats 2 + 3 (Plasmid K, 10 ug) angetrieben war, und den angezeigten Mengen an pSREBP-1a kotransfiziert, wie hierin in Beispiel 3 beschrieben. Nach der Inkubation für 48 Stunden in der Abwesenheit () oder der Anwesenheit () von 10 ug/ml Cholesterin plus 1. ug/ml 25-Hydroxycholesterin wurden Zelischalen in dreifacher Ausfertigung zur Messung der CAT-Aktivität geerntet.
Fig. 22B. Effekt von SREBP-1a auf die Expression der CAT-Aktivität unter der Kontrolle von synthetischen LDL-Rezeptor-Promoter-Elementen in transfizierten menschlichen 293- Zellen. Die Zellen wurden transient mit einem synthetischen LDL-Rezeptor-Promoter-CAT- Gen, angetrieben von zwei Tandem-Kopien von Repeats 2 + 3 (Plasmid K, 1 ug), und den angezeigten Mengen von pSREBP-1a kotransfiziert, wie hierin in Beispiel 3 beschrieben. Nach der Inkubation für 40 Stunden in der Abwesenheit () oder Anwesenheit () von 10 ug/ml Cholesterin plus 1 ug/ml 25-Hydroxycholesterin, wurden Zellschalen in dreifacher Ausfertigung für die Messung der CAT-Aktivität geerntet. Der -fach-Wert bezieht sich auf den Unterschied hinsichtlich der CAT-Aktivität in Zellen, die mit oder ohne Sterole in der Abwesenheit von pSREBP-1a inkubiert wurden.
Fig. 23A. Effekt von SREBP-1a auf die Expression von CAT-Aktivität unter der Kontrolle von synthetischen Promoter-Elementen, enthaltend Wildtyp- und mutante SRE-1-Sequenzen in transfizierten 293-Zellen. 293-Zellen wurden transient mit 0,2 ug von entweder pCMV oder pSREBP-1a, wie angezeigt, und 1 ug eines Reporter-CAT-Gens kotransfiziert, das von der synthetischen Wildtyp-SRE-1-Sequenz, enthaltend zwei Tandem-Kopien von Repeats 2 + 3 (Plasmid K), angetrieben war. Nach der Inkubation für 40 Stunden in der Abwesenheit (ausgefüllte Balken) oder Anwesenheit (gestreifte Balken) von 10 ug/ml Cholesterin plus 1 ug/ml 25-Hydroxycholesterin, wurden Zellschalen in dreifacher Ausfertigung für die Messung der CAT-Aktivität geerntet. Die Daten sind aus zwei separaten Transfektionsstudien.
Fig. 23B. Der Effekt von SREBP-1a auf die Expression von CAT-Aktivität unter der Kontrolle von synthetischen Promoter-Elementen, enthaltend Wildtyp- und mutante SRE-1- Sequenzen in transfizierten 293-Zellen. 293-Zellen wurden mit 0,2 ug von entweder pCMV oder pSREBP-1a, wie angezeigt, und 1 ug eines Reporter-CAT-Gens kotransfiziert, das von der mutanten-SRE-1-Sequenz, enthaltend zwei Tandem-Kopien der Repeats 2 + 3 mit einer Punktmutation in Repeat 2 (Plasmid Q), angetrieben war. Nach der Inkubation für 40 h in der Abwesenheit (ausgefüllte Balken) oder Anwesenheit (gestreifte Balken) von 10 ug/ml Cholesterin plus 1 ug/ml 25-Hydroxycholesterin wurden Zellschalen in dreifacher Ausfertigung zur Messung der CAT-Aktivität geerntet. Die Daten sind aus zwei separaten Transfektionsstudien.
Fig. 23C. Der Effekt von SREBP-1a auf die Expression von CAT-Aktivität unter der Kontrolle von synthetischen Promoter-Elementen, enthaltend Wildtyp und mutante SRE-1- Sequenzen in transfizierten 293-Zellen. 293-Zellen wurden vorübergehend mit 0,2 ug von entweder pCMV oder pSREBP-1a, wie angezeigt, und 1 ug eines Reporter-CAT-Gens kotransfiziert, das von der mutanten SRE-1-Sequenz, enthaltend zwei Tandem-Kopien von Repeat 2 + 3 mit einer Punktmutation in Repeat 2 (Plasmid X), angetrieben war. Nach der Inkubation für 40 Stunden in der Abwesenheit (ausgefüllte Balken) oder Anwesenheit (gestreifte Balken) von 10 ug/ml Cholesterin plus 1 ug/ml 25-Hydroxycholesterin wurden Zellschalen in dreifacher Ausfertigung zur Messung der CAT-Aktivität geerntet. Die Daten sind aus zwei separaten Transfektionsstudien.
Fig. 23D. Effekt von SREBP-1a auf die Expression der CAT-Aktivität unter der Kontrolle von synthetischen Promoter-Elementen, enthaltend native Promoter-Elemente aus drei Sterolregulierten Genen in transfizierten 293-Zellen. 293-Zellen wurden mit 0,2 ug von entweder pCMV oder pSREBP-1a, wie angezeigt, und 1 ug eines Reporter-CAT-Gens kotransfiziert, das durch die synthetische Wildtyp-SRE-1-Sequenz, enthaltend zwei Tandem-Kopien von Repeats 2 + 3 (Plasmid K) angetrieben wurde. Nach der Inkubation für 40 Stunden in der Abwesenheit (ausgefüllte Balken) oder Anwesenheit (gestreifte Balken) von 10 ug/ml Cholesterin plus 1 ug/ml 25-Hydroxycholesterin wurden Zellschalen in dreifacher Ausfertigung zur Messung der CAT-Aktivität geerntet. Die Daten sind aus zwei separaten Transfektionsstudien.
Fig. 23E. Effekt von SREBP-1a auf die Expression von CAT-Aktivität unter der Kontrolle von synthetischen Promoter-Elementen, enthaltend native Promoter-Elemente aus drei Sterolregulierten Genen in transfizierten 293-Zellen. 293-Zellen wurden vorübergehend mit 0,2 ug von entweder pCMV oder pSREBP-1a, wie angezeigt, und 1 ug eines Reporter-CAT-Gens kotransfiziert, das durch den nativen HMG-CoA-Synthase-Promoter, Nukleotide -527 bis +39 (Plasmid J) angetrieben wurde. Nach der Inkubation für 40 h in der Abwesenheit (ausgefüllte Balken) oder Anwesenheit (gestreifte Balken) von 10 ug/ml Cholesterin plus 1 ug/ml 25-Hydroxycholesterin wurden Zellschalen in dreifacher Ausfertigung zur Messung der CAT- Aktivität geerntet. Die Daten sind aus zwei separaten Transfektionsstudien.
Fig. 23F. Effekt von SREBP-1a auf die Expression von CAT-Aktivität unter der Kontrolle von synthetischen Promoter-Elementen, enthaltend native Promoter-Elemente aus drei Sterolregulierten Genen in transfizierten 293-Zellen. 293-Zellen wurden vorübergehend mit 0,2 ug von entweder pCMV oder pSREBP-1a, wie angezeigt, und 1 ug eines Reporter-CAT-Gens kotransfiziert, das durch den nativen HMG-CoA-Reduktase-Promoter, Nukleotide -277 bis +231 (pRedCAT-1) angetrieben wurde. Nach der Inkubation für 40 Stunden in der Abwesenheit (ausgefüllte Balken) oder Anwesenheit (gestreifte Balken) von 10 ug/ml Cholesterin plus 1 ug/ml 25-Hydroxycholesterin wurden Zellschalen in dreifacher Ausfertigung zur Messung der CAT-Aktivität geerntet. Die Daten sind aus zwei separaten Transfektionsstudien.
Fig. 23 G. Effekt von SREBP-1a auf die Expression von CAT-Aktivität unter der Kontrolle von synthetischen Promoter-Elementen, enthaltend native Promoter-Elemente aus drei Sterolregulierten Genen in transfizierten 293-Zellen. 293-Zellen wurden vorübergehend mit 0,2 ug von entweder pCMV oder pSREBP-1a, wie angezeigt, und 1 ug eines Reporter-CAT-Gens kotransfiziert, das durch den nativen LDL-Rezeptor-Promoter, Nukleotide -1471 bis +36 (p1471) angetrieben wurde. Nach Inkubation für 40 Stunden in der Abwesenheit (ausgefüllte Balken) oder Anwesenheit (gestreifte Balken) von 10 ug/ml Cholesterin plus 1 ug/ml 25- Hydroxycholesterin wurden Zellschalen in dreifacher Ausfertigung zur Messung der CAT- Aktivität geerntet. Die Daten sind aus zwei separaten Transfektionsstudien.
Fig. 24A, Obere Tafel. Schematisches Diagramm der Kontakte zwischen Aminosäuren von bHLH-Zip-Proteinen und Nukleotidbasen ihrer Target-DNA; Kontakte zwischen Max- Homodimer und seiner palindromischen Erkennungssequenz, bestimmt mittels Röntgenkristallographie (Fernè D'Amarè et al., 1993).
Fig. 24B, Untere Tafel. Schematisches Diagramm von Kontakten zwischen Aminosäuren von bHLH-Zip-Proteinen und Nukleotidbasen ihrer Target-DNA; mögliche Kontakte zwischen analogen Aminosäuren von SREBP-1 und seiner direkten Repeat-Erkennungssequenz. Die obere Sequenz in der unteren Tafel ist SEQ ID NO: 27, und die untere Sequenz ist SEQ ID NO: 43.
Fig. 25A-1 und 25A-2, Obere Tafel. Vergleich der Aminosäuresequenzen und Domänstrukturen von menschlichem SREBP-2 und SREBP-1a, bei dem die gestrichelte Linie Reste in SREBP-1a bezeichnen, die mit SREBP-2 identisch sind. Der Überstrich bezeichnet die bHLH-Zip-Region.
Fig. 25B, Mittlere Tafel. Vergleich der bHLH-Region von SREBP-2 und 1a mit der Consensus-Sequenz von anderen bHLH-Proteinen (Ferrè-D'Amarè et al., 1993). Sternchen (*) bezeichnen die Aminosäuren in Max, die mit spezifischen Nukleotiden an seiner Erkennungssequenz in Kontakt kommen, bestimmt mittels Röntgenkristallographie (Ferrè-D'Amarè et al., 1993).
Fig. 25C, Obere Tafel. Domänen-Struktur von SREBP-2 und 1a, wobei die Zahl den Aminosäureresten entspricht. Die Basic-Helix-Loop-Helix-Region wird durch den schwarzen Kasten bezeichnet, die Leucin-Zipper-Region durch den gestreiften Kasten und die COOHterminale Domäne durch den schattierten Kasten. Regionen, die an besonderen Aminosäuren reich sind, werden angezeigt. Die %-Identitäten in den drei Regionen mit der größten Homologie werden angezeigt. Die Nukleotidsequenzen voller Länge von pSREBP-1a und 2 sind in GenBank GB hinterlegt (U00968 bzw. U02031).
Fig. 26A. Gewebeverteilung von menschlichem mRNA-SREBP-2. ³²P-markierte Oligonukleotid-Sonden wurden an poly(A)&spplus;-RNA aus dem angezeigten menschlichen Gewebe, wie in Beispiel 4 beschrieben, hybridisiert (2 ug/Spur in den linken und rechten Tafeln und 2,5 ug/Spur in der mittleren Tafel). Die Filter wurden einem Kodak-XAR-5-Film mit einem Verstärkungsschirm bei -70ºC für 16 Stunden exponiert. DiesE1ben Filter wurden darauffolgend mit einer Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase (GAPDH)-Sonde aus Ratte hybridisiert und für 2 Stunden exponiert. Die Proben in den linken und mittleren Tafeln sind aus erwachsenen Geweben und diejenigen in der rechten Tafel sind aus fötalen Geweben.
Fig. 26B. Immunblot-Analyse in transfizierten 293-Zellen. Eine cDNA, kodierend für menschliches SREBP-2, angetrieben durch den CMV-Promoter, wurde in 293-Zellen mittels Transfektion eingeführt. Nach 40 Stunden in einem Medium, enthaltend keine Sterole, wurden Zellextrakte einer Elektrophorese auf einem 7,5% SDS-Polyacrylamidgel unterzogen, auf Nitrozellulosefilter transferiert und mit 5 ug/ml Kaninchen-anti-SREPB-2-IgG inkubiert, gefolgt von anti-Kaninchen-IgG, konjugiert an Meerrettichperoxidase (ECL-Western-Kit). Der Filter wurde einem Kodak-XAR-5-Film für 5 Sekunden bei Zimmertemperatur exponiert. Die Positionen der Molekulargewichtsmarker sind angezeigt. Linke Spur, 10 ug Protein aus Zellen, transfiziert mit 3 ug pCMV7 (Kontrolle). Rechte Spur, 5 ug Protein aus Zellen, transfiziert mit 3 ug pSREBP-2.
Fig. 27. DNA-Bindungsaktivität von rekombinanter bHLH-ZIP-Domäne von SREBP-2. Aliquots (2 ug) der aufgereinigten rekombinanten bHLH-ZIP-Domäne von SREBP-2 wurden in einem Gel-Shift-Mobilität-Assay (siehe Beispiel 4) für 20 Minuten bei Zimmertemperatur mit der angezeigten Wildtyp- oder mutanten 32P-markierten, PCR-abgeleiteten DNA-Sonde (94 bp) inkubiert. Jede ³²P-Sonde (4 · 10&sup4; cpm/Reaktion) enthielt zwei Kopien von Repeat 2 + 3 mit der angezeigten Punktmutation in jeder Kopie von Repeat 2 (Wang et al., 1993). Nach der Elektrophorese wurde das Gel einem Kodak-XAR-Film für eine Stunde bei -80ºC mit einem Verstärkungsschirm exponiert. Die SRE-1-Sequenz innerhalb von Repeat 2 ist mit einem Kasten versehen. Untere und obere Pfeile bezeichnen Protein, das an eine bzw. zwei Kopien von SRE-1 in der Sonde gebunden war (Wang et al., 1993).
Fig. 28A. Effekt von SREBP-2 und 1a auf die Transkription unter Verwendung von CAT- Reporter-Assays in transfizierten 293-Zellen. Die Zellen wurden mit 0,3 ug des angezeigten Plamids und 1 ug eines Reporter-CAT-Gens kotransfiziert, das von einer synthetischen Sequenz angetrieben wurde, die zwei Tandem-Kopien von Repeats 2 + 3 mit Wildtyp-SRE-1 enthielt (Plasmid K). Nach Inkubation für 40 Stunden in der Abwesenheit (ausgefüllte Balken) oder Anwesenheit (gestreifte Balken) von 10 ug/ml Cholesterin plus 1 ug/ml 25- Hydroxycholesterin wurden Zellschalen in dreifacher Ausfertigung zur Messung der CAT- Aktivität geerntet. Die absoluten Werte für die Kontroll-pCMV7-transfizierten Zellen in Fig. 28A bis 28D werden oberhalb der Balken gezeigt. Die Daten in allen Tafeln sind aus derselben Transfektionsstudie.
Fig. 28B. Effekt von SREBP-2 und 1a auf die Transkription, bei der das CAT-Gen durch eine mutante Sequenz angetrieben wurde, enthaltend zwei Tandem-Kopien von Repeat 2 + 3 mit Punktmutation in jedem SRE-1 (Plasmid X).
Fig. 28C. Effekt von SREBP-2 und 1a auf die Transkription, bei der das CAT-Gen durch native HMG-CoA-Synthase, Nukleotide -527 bis +39 angetrieben wurde (Plasmid J).
Fig. 28D. Effekt von SREBP-2 und 1a auf die Transkription, bei der das CAT-Gen durch nativen LDL-Rezeptor, -1471 bis +36 angetrieben wurde (p1471).
Fig. 28E. Effekt von SREBP-2 und 1a auf die Transkription, bei der das CAT-Gen durch native HMG-CoA-Reduktase, -277 bis +231 angetrieben wurde (pRedCAT-1).
Fig. 29A. Additivität von pSREBP-2 und 1a auf die Transkription von LDL-Rezeptor- Promoter-CAT-Reporter-Gen in transfizierten 293-Zellen in der Abwesenheit von Cholesterin und 25-Hydroxycholesterin. Die Zellen wurden mit der angezeigten Menge von pSREBP-2 in der Abwesenheit ( ) oder Anwesenheit ( ) von 0,02 ug pSREBP-1a und 1 ug eines Reporter- CAT-Gens, enthaltend zwei Tandem-Kopien von Repeats 2 + 3 (Plasmid K), kotransfiziert. Nach der Inkubation für 40 Stunden in der Abwesenheit von 10 ug/ml Cholesterin plus 1 ug/ml 25-Hydroxycholesterin wurden Zellschalen in doppelter Ausfertigung zur Ausmessung der CAT-Aktivität geerntet. Die Assays wurden unter Bedingungen durchgeführt (0,25 ug Extraktprotein; 12 min bei 37ºC), bei denen weniger als 20% des [¹&sup4;C]-Chloramphenicol zu butyrylierten Produkten umgewandelt worden war. Ein Nullprobenwert von Zellen, die mit dem Reporter-CAT-Gen und pCMV (Vektorkontrolle) kotransfiziert worden waren, wurde von jedem Wert subtrahiert (9,7 nmol·min&supmin;¹·mg Protein&supmin;¹). Die gepunktete Linie bezeichnet die erwartete Summe der CAT-Aktivität, erzeugt durch pSREBP-2 plus pSREBP-1a.
Fig. 29B. Additivität von pSREBP-2 und 1a auf die Transkription des LDL-Rezeptor- Promoter-CAT-Reporter-Gens in transfizierten 293-Zellen in der Anwesenheit von Cholesterin und 25-Hydroxycholesterin. Die Zellen wurden mit der angezeigten Menge an pSREBP-2 in der Abwesenheit ( ) oder Anwesenheit ( ) von 0,02 ug pSREBP-1a und 1 ug eines Reporter-CAT-Gens, enthaltend zwei Tandem-Kopien von Repeats 2 + 3 (Plasmid K), kotransfiziert. Nach Inkubation für 40 Stunden in der Anwesenheit von 10 ug/ml Cholesterin plus 1 ug/ml 25-Hydroxycholesterin wurden Zelischalen in doppelter Ausfertigung zur Messung der CAT-Aktivität geerntet. Die Assays wurden unter Bedingungen durchgeführt (0,25 ug Extraktprotein; 12 min. bei 37ºC), bei denen weniger als 20% des [¹&sup4;C] Chloramphenicol zu butyrylierten Produkten umgewandelt worden war. Ein Nullprobenwert von Zellen, die mit dem Reporter-CAT-Gen und pCMV (Vektorkontrolle) kotransfiziert worden waren, wurden von jedem Wert abgezogen (2,6 nmol·mm&supmin;¹·mg Protein&supmin;¹). Die gepunkte Linie bezeichnete die erwartete Summe der CAT-Aktivität, erzeugt von pSREBP-2 plus pSREBP-1a.

Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

A. Genetische Kontrollsysteme

In den 32 Jahren, seitdem Jacob und Monod zuerst das lac-Operon-Modell und das Konzept der Messenger-RNA vorschlugen (Jacob et al., 1961), ist die Struktur und Funktion einer Anzahl von prokaryotischen Operons in eleganten Einzelheiten aufgeklärt worden. Zum Beispiel ist gezeigt worden, daß die Transkriptionskontrolle von strukturellen Genen in verschiedenen Operons in regulatorischen Regionen stromauf (d. h. 5' in Bezug auf die strukturellen Gene) liegt. Beim lac-Operon produziert ein regulatorisches Gen einen Protein-Repressor, der mit einem "Operator" wechselwirkt, um die Transkriptionsinitiation des strukturellen Gens zu verhindern. Metabolische Inducer binden an den Repressor und induzieren dadurch die Transkription durch Verhinderung der Bindung des Repressor an den Operator. Zusätzlich gibt es eine Promotor-Stelle P stromauf von dem Operator und stromab von dem regulatorischen Gen, die als eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle dient.
Studien am lac-Operon haben weiterhin zu der Entdeckung und Aufklärung des Mechanismus der prokaryotischen katabolischen Suppression geführt. In E. coli ist gefunden worden, daß die Anwesenheit von Glucose in Wachstumsmedium dazu dient, die Expression von Gluconeogenese-Wegen zu verhindern, einschließlich des lac-Operon und seiner assoziierten strukturellen Gene.
Im Kontrast zu prokaryotischen Systemen ist gegenwärtig viel weniger über die Kontrollmechanismen und insbesondere die Feedback-Suppression in eukaryotischen Systemen bekannt. Positiv-regulierte Systeme, bei denen Hormone, metabolische Inducer und Entwicklungsfaktoren die Transkription von Genen erhöhen, werden ein wenig besser verstanden. In diesen Systemen wird davon ausgegangen, daß positive, induzierende Substanzen Proteine, die die Transkription durch Bindung an kurze Sequenzen von 10 bis 20 Basenpaaren (bp) in der 5'- flankierenden Region des Zielgens stimulieren, aktivieren oder mit ihnen Komplexe bilden. Über die Sequenzen für die Glucocorticoid-, Metall- und Interferon-regulatorischen Elemente (GRE, MRE bzw. IRE) ist berichtet worden (Yamamoto, 1985; Stuart et al., 1984; Goodbourn et al., 1986).
Vor kurzem sind andere DNA-Segmente, die in der Lage sind, bekannten Genen in eukaryotischen Systemen eine Kontrollfähigkeit zu verleihen, identifiziert worden, einschließlich des Sterol-regulatorischen Elements-1 (SRE-1), assoziiert mit dem Low-Density-Lipoprotein (LDL)-Rezeptor. Obwohl dies einen signifikanten Fortschritt darstellt, muß der Proteinfaktor, der an SRE-1 bindet und die Transkription stimuliert, noch identifiziert werden.
Die Identifizierung des SRE-1-Bindeproteins wäre ein wichtiger Schritt zur Aufklärung der Mechanismen der eukaryotischen Genkontrolle und würde ebenso der biomedizinischen Wissenschaft ein starkes Werkzeug zur Verfügung stellen, mit dem eine spezifische Genexpression reguliert werden kann. Eine solche Entwicklung würde zu zahlreichen nützlichen Anwendungen in der pharmazeutischen und biotechnologischen Industrie führen. Obwohl viele Anwendungen in Erwägung gezogen werden, wäre eine besonders nützliche Anwendung als der zentrale Bestandteil bei Screening-Assays, um neue Klassen von pharmakologisch aktiven Substanzen zu identifizieren, die verwendet werden können, um die Transkription von strukturellen Genen, wie des LDL-Rezeptor-Gens zu manipulieren und insbesondere zu fördern.
Ein SRE-1-Bindeprotein oder Transkriptionsfaktor wäre daher von großem Nutzen beim Identifizieren von Mitteln, um Hypercholesterinämie zu bekämpfen. Ein Cholesterinsenkendes Mittel würde dahingehend wirken, die zelluläre Produktion von LDL-Rezeptoren zu fördern, was wiederum dazu dienen würde, die Plasma-LDL-Cholesterin-Konzentrationen durch Erhöhen der zellulären Aufnahme von LDL zu senken.

B. Cholesterin-Metabolismus

Tierzellen regulieren ihren Cholesterin-Gehalt durch die Integration von zwei Wegen, die die Versorgung von exogenem und endogenem Cholesterin steuern. Beide Wege sind durch eine Endprodukt-Repression kontrolliert. Die Zellen können Cholesterin durch die Rezeptorvermittelte Endocytose und lysosomale Hydrolyse von Plasma-Low-Density-Lipoprotein erhalten. Die Zellen können ebenso ihre endogene Cholesterinproduktion durch Steigerung der Menge von zwei Enzymen erhöhen, die bei der de-novo-Cholesterin-Biosynthese beteiligt sind, nämlich 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-coenzym A (HMG-CoA)-Synthase und HMG- CoA-Reduktase.
Das LDL-Rezeptor-Gen ist das strukturelle Gen, das die Produktion des LDL-Rezeptor- Proteins bereitstellt, des Rezeptorproteins, das für die erleichterte Aufnahme von Cholesterin durch Säugetierzellen verantwortlich ist. Stromauf von den kodierenden Sequenzen für das LDL-Rezeptor-Gen ist die SRE-1-Sequenz, die für eine Sterol-vermittelte Regulierung der LDL-Rezeptor-Gen-Transkription sorgt. In der relativen Abwesenheit von Sterolen innerhalb der Zelle wird die Transkription des LDL-Rezeptorgens gefördert, während in der Anwesenheit von Cholesterin die Transkription unterdrückt wird. Die Transkription der HMG-CoA- Synthase und -Reduktase des Cholesterin-Biosynthesewegs wird ebenso reduziert, wenn die Sterole sich innerhalb der Zelle akkumulieren. Wenn die Sterole aufgebraucht sind, erhöht sich die Transkription, und sowohl die Aufnahme als auch die Synthese von Cholesterin wird gefördert.
Gegenwärtig gibt es wenige Cholesterin-senkende Arzneien, die sowohl sicher als auch wirksam sind, und keine Arzneien, von denen bekannt ist, daß sie auf dem genetischen Kontrollniveau, wie oben beschrieben, wirken. Zum Beispiel ist, abgesehen von Mitteln, die so wirken, daß sie Gallensalze im Darm einfangen und dadurch die Cholesterin-Ausscheidung erhöhen, das therapeutische Hauptmittel, das zur Senkung von Cholesterin zur Verfügung steht, Lovastatin, eine Arznei, hergestellt von Merck, Co., die indirekt wirkt, um die Produktion von LDL-Rezeptoren zu stimulieren.
Lovastatin und andere Arzneien in dieser Klasse (Simvastatin, Pravastatin) wirken durch Inhibieren der Aktivität der HMG-CoA-Reduktase, dem geschwindigkeitsbestimmenden Enzym der endogenen Cholesterinsynthese. Diese Arzneien enthalten Seitenketten, die dem nativen Substrat für die HMG-CoA-Reduktase ähneln und damit die Aktivität des Enzyms kompetitiv hemmen. Dies senkt schließlich die endogene Synthese von Cholesterin, und über normale homöostatische Mechanismen wird Plasma-Cholesterin von erhöhten LDL-Rezeptor- Populationen aufgenommen, um das intrazelluläre Cholesterin-Gleichgewicht wieder herzustellen.
Konzeptionell wirken HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren auf der vorletzten Stufe der zellulären Mechanismen für den Cholesterin-Metabolismus. Es wäre am wünscheswertesten, wenn die Synthese des LDL-Rezeptors auf Genniveau direkt hochreguliert werden könnte. Die Hochregulierung der LDL-Rezeptor-Synthese auf dem Genniveau bietet die Aussicht, die Konzentration an Blut-Cholesterin auf ein niedrigeres und klinisch wünscheswerteres Niveau wieder einzustellen (Brown et al., 1984). Jedoch gibt es kein Verfahren zum bequemen Testen der Fähigkeit einer Kandidatenzusammensetzung, einen solchen Effekt auf die Transkription des LDL-Rezeptor-Gens auszuüben.

C. SRE-1-Sequenzen und heterologe Genexpression

Die Identifizierung, Herstellung und Verwendung von SRE-1-Sequenzen wird im Detail hierin beschrieben (siehe, z. B. SEQ ID NO: 2-4, 10, 15-19) und allgemeiner in US- Patentanmeldungen 07/033,302 (U. S. Patent 4,935,363), 07/425,852, 07/532,318, 07/033,081, 07/032,134 und 07/032,130, von denen jede hierin durch Bezugnahme einbezogen wird. SRE- 1-Sequenzen können als neue Kontrolleinheiten verwendet werden, um die Sterol-vermittelte Expression zu steuern. Das Plazieren solcher Sequenzen stromauf von und hinreichend nahe zu einer Transkriptionsinitiationsstelle eines gegebenen Gens wird dem Gen eine Sterolregulierte Transkriptionskontrollfähigkeit verleihen. LDL-Rezeptor-Gen-Repeat-2- und Repeat-3-Sequenzen können vorteilhafterweise verwendet werden und können als vielfache Einheiten in zahlreichen verschiedenen Kombinationen und Organisationen, in Orientierungen vorwärts oder rückwärts verwendet werden, würden sich aber bevorzugt innerhalb von 0-20 Nukleotiden voneinander befinden.
SRE-1-Kontrollsequenzen können verwendet werden, um die Expression von heterologen strukturellen Genen zu steuern. Die genaue Lage der SRE-1-Sequenzen ist nicht besonders wichtig, und sie können sich bis zu ungefähr 300 Nukleotiden oder mehr von einer Transkriptionsstelle befinden, wobei Distanzen von 150, 100 und 50 Nukleotiden bevorzugt sind.
Im allgemeinen wird, je näher die Kontrollsequenzen der Transkriptionsinitiation sind, die erzielte Kontrolle desto deutlicher und wirksamer sein.
Um die Sterol-regulatorischen Elemente im Kontext von heterologer Genexpression zu verwenden, nimmt man einfach das strukturelle Gen und hängt eine oder mehrere solcher Kontrollsequenzen stromauf von einer Transkriptionsinitiationstelle. Zusätzlich, wie auf dem Gebiet bekannt ist, ist es im allgemeinen wünschenswert, TATA-Box-Sequenzen stromauf von und nahe zu einer Transkriptionsinitiationsstelle des heterologen strukturellen Gens einzuschließen. Solche Sequenzen können synthetisiert und auf diesE1be Weise eingeführt werden wie die neuen Kontrollsequenzen. Alternativ kann man einfach die TATA-Sequenzen verwenden wollen, die normalerweise mit dem heterologen Gen assoziiert sind. Auf jeden Fall befinden sich die TATA-Sequenzen am wünschenswertesten zwischen ungefähr 20 und 30 Nukleotiden stromauf von der Transkriptionsinitiation.
Zahlreiche Verfahren sind auf dem Gebiet zum präzisen Einbringen von ausgewählten Sequenzen an ausgewählten Punkten innerhalb von größeren Sequenzen bekannt. Am bequemsten werden die erwünschte Kontrollsequenz oder -sequenzen oder Kombinationen von Sequenzen synthetisiert und Restriktionsstellen-Linker-Fragmente zu den Kontrollsequenz- Termini zugegeben. Dies ermöglicht eine leichte Einführung der Kontrollsequenzen in kompatible Restriktionsstellen innerhalb von Stromauf-Regionen. Alternativ können synthetisierte Kontrollsequenzen direkt an ausgewählte Regionen ligiert werden. Darüberhinaus kann eine stellen-spezifische Mutagenese verwendet werden, um Restriktionsstellen zu gestalten, in die Kontrollsequenzen eingeführt werden können, für den Fall, daß keine bequemen Restriktionsstellen an einer erwünschten Insertionsstelle gefunden werden.

D. SRE-1-Sequenz-Mutanten-Analysen

Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Beschreibung der essentiellen Nukleotide innerhalb der SRE-1-Sequenz und die Identifizierung einer Familie an Kernproteinen, die an diese neu definierte Ziel-Nukleotidsequenz binden.
Um die physiologisch relevanten SRE-1-Bindungsproteine zu identifizieren und aufzureinigen, entwarfen und erzeugten die Erfinder eine Reihe von Oligonukleotidsonden mit Punktmutationen, die entweder das SRE-1 inaktivierten oder die Transkriptionsaktivität beibehielten. Es war dann möglich, die Transkriptionsaktivität der mutanten Sequenzen in transienten Transfektionsassays zu charakterisieren. Dies ist ein Vorteil gegenüber vorherigen Studien des LDL-Rezeptor-Promoter, die permanent transfizierte Zellinie verwendeten und die sich als beschwerlich für die Analyse von vielfachen Mutationen herausstellten (Smith et al., 1990; Sudhofet al., 1987; Dawson et al., 1988). Wie mit anderen transkriptionellen regulatorischen Systemen (Klein-Hitpass et al., 1990; Pascal et al., 1991; Freedman et al., 1989) wurde die Aktivität der Promoterelemente in transienten Assays durch die Erzeugung von künstlichen Promotern mit vielfachen Kopien des Transkriptionselements, kombiniert mit neuen TATA-Boxen, erhöht.
Die vorliegenden Erfinder erzeugten einen künstlichen Sterol-abhängigen Promoter durch Oligomerisieren von vielfachen Kopien von Repeat 2 + 3 in Tandem und durch deren Einführung stromauf von einer TATA-Box, aus dem Adenovirus E1b-Gen stammend (Lillie et al., 1989). Die resultierenden Vektoren erzeugten hohe Transkriptionsniveaus in Sterol-verarmten Zellen nach transienter Transfektion. Die Transkription wurde durch Sterole bis zu einem Grad unterdrückt, der größer ist als derjenige, der bei nativem LDL-Rezeptor beobachtet wurde. Dieses System ermöglichte es den Erfindern, die genauen Nukleotide zu definieren, die für eine Sterol-abhängige Regulation durch eine Punktmutationsanalyse von Repeat 2 erforderlich sind. Es wurde gefunden, daß ein Segment von 10 Nukleotiden innerhalb des 16-bp- Repeat-2-Elements für eine Sterol-empfindliche Transkriptionsaktivität auf hohem Niveau erforderlich ist, und daß die Mutation von jedem einzelnen von 9 Nukleotiden innerhalb dieser Sequenz die Transkriptionsaktivität des SRE-1 merklich reduziert. Die alleinige Ausnahme war das Nukleotid an Position 6 (das zweite C in dem CCCC-Tetramer).
Diese Information wurde verwendet, um eine Reihe von Oligonukleotiden mit Punktmutationen zu entwerfen, die entweder die Sterol-regulierte Transkription ermöglichen oder zerstören, zur Verwendung bei spezifischen Gel-Shift-Assays. Unter Verwendung dieses Systems wurde ein Kernprotein von HeLa-Zellen oder Rattenleber-Kernen identifiziert, das mit der SRE-1-Sequenz eine Bindung auf eine Weise einging, die von jedem der 9 Nukleotide abhängig war, die für die Transkription erforderlich waren. Auffallenderweise hing die Bindung dieses Proteins nicht von einem C-Nukleotid an der sechsten Position ab, das ebenso für die Transkriptionsaktivität nicht notwendig war. Im Lichte der Genauigkeit dieser Korrelation schlagen die Erfinder vor, daß dieses Protein, bezeichnet als Sterol-regulatorisches-Element- 1-Bindeprotein (SREBP) das Protein ist, das für eine Sterol-abhängige Transkription erforderlich ist.

E. SRE-1-Bindeproteine, SREBPs

Ein weiterer wichtiger Aspekt der Erfindung ist die Aufreinigung und Charakterisierung einer Familie von Polypeptiden mit SRE-Bindungsaktivität. Dies stellte sich als besonders schwierig heraus, da SREBPs in Spuren vorhanden sind und da mehrere im Überfluß vorhandene Kernproteine ebenso an die SRE-1-Sequenz binden und die Bindung von SREBPs undeutlich machen. Dies machte es erforderlich, daß die Erfinder die am meisten unterscheidenden Oligonukleotide, hierin als M und * bezeichnet, zur Verwendung in dem SREBP-Assay identifizierten und daß sie viele Hindernisse während der anfänglichen Herstellung überwanden.
Eine SREBP-Zusammensetzung wurde mehr als 38.000-fach aus Kernextrakten von menschlichen HeLa-Zellen durch Ionenaustausch-, Gelfiltration- und DNA- Affinitätschromatographie aufgereinigt. Eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese der aufgereinigten Zubereitung ergab ein Cluster von Banden bei 59-68 kDa, die vielfache Modifizierungen eines einzelnen Proteins oder mehrerer verwandter Proteine repräsentieren kann. Jedes der 59-68 kDa Polypeptide hat die Fähigkeit, an das SRE-1-Element zu binden, was durch Quervernetzungsstudien offenbart wurde und nahelegt, daß alle in der Lage sind, spezifisch an SRE-enthaltende DNA, entweder unabhängig oder durch die Bildung eines Proteinkomplexes, zu binden. Die spätere rekombinante Klonierung der SREBP-Proteine hat Hinweise darauf gegeben, daß diese 59-68 kD-Spezies in der Tat Polypeptide sind, die von den SREBPs voller Länge abgeleitet sind, die die Amino-terminale SRE-1-Bindungsdomänen (pHLH-Zip) einschließen. Darüber hinaus repräsentieren diese Polypeptidbanden unterschiedliche, aber offensichtlich verwandte Proteine, die im großen und ganzen in verschiedene SREBP-Familien fallen, bezeichnet als SREBP-1 und SREBP-2. Diese Familien zeigen gewisse Sequenzähnlichkeiten und Homologien, und Mitglieder jeder Familie scheinen diesE1ben oder ähnliche biologische Eigenschaften hinsichtlich der Bindung an SRE-1 und der Umkehr von Sterol-vermittelter Suppression von SRE-1-vermittelten Genen zu haben.
Die Bindung von SREBP-Proteinen korrelierte perfekt mit der Transkriptionsaktivität in einer Reihe von 16 Sterol-regulatorischen Elementen mit Punktmutationen. Bei dem LDL- Rezeptor-Promoter ist das 10-Basenpaar-SRE-1 (SEQ ID NO: 27) in eine 16- Basenpaarsequenz eingebettet, bezeichnet als Repeat-2 (SEQ ID NO: 22), die an Repeat-3 (SEQ ID NO: 23) angrenzt, einer Bindungsstelle für den Kernfaktor Spl. Oligonukleotide, die Repeat 2 + 3 (SEQ ID NO: 24) enthielten, gingen eine Bindung mit SREBP und Spl ein, was durch Mobilitäts-Shift-Assays offenbart wurde. SREBP erzeugte einen DNase-I-Footprint über die SRE-1-Sequenz, der unmittE1bar angrenzend an den Footprint war, der von Spl erzeugt wurde. Die vorliegenden Daten stimmen mit dem Konzept der Erfinder überein, daß SREBP zusammen mit Sp1 wirkt, um eine Sterol-unterdrückbare Transkription auf hohem Niveau des Gens für den LDL-Rezeptor zu erreichen, und daß SREBPs den letzten regulatorischen Schritt vermitteln, der die LDL-Rezeptor-Genexpression kontrolliert.

F. Klonierung und Analyse von SREBP

Ebenso hierin offenbart wird die Klonierung einer menschlichen cDNA, die für ein SREBP-1 (Beispiel 3) und/oder ein SREBP-2 (Beispiel 4) kodiert. Die Klonierung von SREBP-1 wurde durch Verwendung von Peptidsequenzinformation erreicht, die aus den 59-68 kDa- Polypeptiden stammt, die oben beschrieben worden sind, um Oligonukleotide zur Verwendung bei PCR und beim Screening einer HeLa-Zell-cDNA-Bibliothek zu entwerfen. Das SREBP-Protein, dessen Klonierung in Beispiel 3 dargestellt wird, bezeichnet als SREBP-1, enthält ein Basic-Helix-Loop-Helix-Leucin-Zipper(bHLH-Zip)-Motiv und ist deshalb ein Mitglied der bHLH-Zip-Familie von Transkriptionsfaktoren, die das onkogene Protein Myc und seine Modulatoren Max, Mad und Mxi1 einschließt (Ferrè-D'Amarè et al., 1993; Zervos et al., 1993; Ayer et al., 1993).
Menschliches SREBP-2 enthält 1141 Aminosäuren und zeigt 47% Identität mit menschlichem SREBP-1a, dem ersten erkannten Mitglied dieser Familie. SREBP-1a enthält 1147 Aminosäuren. Die Ähnlichkeit schließt einen sauren NH&sub2;-Terminus, ein stark konserviertes bHLH-Zip- Motiv (71% identisch) und eine ungewöhnlich lange Extension von 740 Aminosäuren auf der COOH-terminalen Seite der bHLH-Zip-Region ein. SREBP-2 besitzt ein Merkmal, das bei SREBP-1a fehlt, nämlich eine Glutamin-reiche Region (27% Glutamin über 121 Reste). In vitro ging SREBP-2 eine Bindung mit SRE-1 mit dersE1ben Spezifität wie SREBP-1a ein. In vivo ähnelte es SREBP-1a dadurch, daß es die Transkription von Reportergenen, enthaltend SRE-1, aktivierte. Ebenso wie bei SREBP-1a fand die Aktivierung durch SREBP-2 in der Abwesenheit und Anwesenheit von Sterolen statt, was eine Regulierung wegfallen ließ. Die Cotransfektion von geringen Mengen an pSREBP-1a und pSREBP-2 in menschliche 293- Zellen stimuliert die Transkription von Promotoren, enthaltend SRE-1, auf eine additive Weise. Bei hohen Konzentrationen erreicht die Transkription ein Maximum, und die Effekte sind nicht länger additiv. Der Grund für die Existenz von zwei SREBPs und der Mechanismus, mittels dessen sie durch Sterole reguliert werden, bleibt zu bestimmen.
Es ist bekannt, daß sich rekombinante Proteine von ihren natürlich-hergestellten Gegenstücken auf bestimmte Weisen unterschieden. Zum Beispiel kann der Grad an posttranslationalen Modifizierungen, wie etwa Glykosylierung und Phosphorylierung, zwischen rekombinanten Proteinen und Proteinen unterschiedlich sein, die nach einer Aufreinigung aus natürlichen Quellen erhalten worden sind. Im Falle von SREBP-1a bestätigte die Klonierung den früheren Vorschlag der Erfinder, daß SREBPs aus mehr als einer funktionellen Domäne zusammengesetzt sind. Das klonierte SREBP-1a ist ein Protein aus 1147 Aminosäuren Länge (entsprechend seiner ungefähren Größe auf SDS-Gelen von ungefähr 130 kDa). Die funktionellen 59- 68 kDa-SREBP-Polypeptide, die anfangs aufgereinigt worden waren, sind deshalb wahrscheinlich SRE-1-DNA-Bindungsdomänen-Polypeptide, die durch proteolytische Spaltung getrennt worden sind. Diese Trennung in unterscheidbare Domänen, die ihre Aktivität behalten, kann das Resultat eines physiologischen Prozesses oder das Resultat einer Proteolyse während der Aufreinigung sein - auf eine Weise, die derjenigen ähnlich ist, über die Gil et al. (1988a; 1988b) berichtet hat.
Obwohl es der bHLH-Zip-Familie angehört, unterscheidet sich das SREBP-1a von anderen bHLH-Zip-Proteinen, weil es größer ist (1147 gg. 160-536 Aminosäuren) und eine unterschiedlich Zielsequenz hat. Klassische bHLH-Zip-Proteine bilden Homodimere und Heterodimere, die Palindrom-Sequenzen erkennen, enthaltend die sogenannte E-Box (CANNTG). Jedoch enthält das SRE-1-Ziel einen direkten Repeat von CAC anstelle eines inverted-Repeat, wie die E-Box. Trotzdem wird vorgeschlagen, daß ein SREBP-1-Monomer an ein einzelnes CAC/GTG seines Ziels auf eine Weise binden kann, die derjenigen ähnlich ist, die zuvor für die Max-Bindung beschrieben worden ist. Die Erfinder schlagen ebenso vor, daß SREBP- 1 Multimere höherer Ordnung durch nicht-symmetrische Wechselwirkungen bilden kann, was es einem zweiten SREBP-1-Monomer ermöglichen wird, an die SRE-1-DNA zu binden und mit ihr wechselzuwirken.
Es wird ebenso in Erwägung gezogen, daß SREBPs in der Lage sind, Multiprotein-Komplexe mit anderen unterscheidbaren SREBP-Polypeptiden oder sogar mit anderen bekannten oder noch nicht-identifizierten Proteinen zu bilden, wie etwa anderen bHLH-Zip-Proteinen. Zum Beispiel wird in Erwägung gezogen, daß SREBPs mit einem weiteren der aufgereinigten SREBP-Polypeptide von 59-68 kDa wechselwirken kann, insbesondere weil die Erfinder vorläufige Hinweise darauf haben, daß eine SREBP-Peptidsequenz, die nicht in den hierin offenbarten cDNAs vorhanden ist, von einem separaten Protein der bHLH-Zip-Familie stammt, die zusammen mit SREBP aufgereinigt werden kann.
Wie hierin in Beispiel 3 gezeigt, aktiviert die Überexpression von SREBP-1a in 293-Zellen die Transkription von Reporter-Genen, enthaltend SRE-1, in der Abwesenheit (15-fach) und Anwesenheit (90-fach) von Sterolen, was die Sterol-Regulierung wegfallen läßt. Die Erfinder schlagen vor, daß SREBP-1 in der natürlichen zellulären Umgebung normalerweise durch einen noch unbekannten regulatorischen Mechanismus reguliert wird, und daß dieser normaler Mechanismus überwältigt wird, wenn SREBP-1 überexprimiert wird. Obwohl dies wissenschaftlich sehr interessant ist, ist der Mechanismus, mit dem SREBP-1 normalerweise reguliert wird, nicht für diejenigen Aspekte der Erfindung wichtig, die die Überexprimierung von SREBP-1 sowie die daraus folgende Stimulierung von SRE-1-vermittelter Transkription betreffen, die daraus resultiert. SREBP-2 zeigt ein praktisch identisches Regulationsmuster wie SREBP-1a.
Die Erfinder schlagen vor, daß eine mögliche Erklärung für die Deregulierung, die bei der Überexprimierung beobachtet wird, diejenige ist, daß SREBP-1 oder SREBP-2 (Fig. 28) durch eine Homo- und Hetero-Oligomerisierung kontrolliert werden kann und daß die Überexprimierung eines SREBP die Bildung von Homo-Oligomeren, die konstitutiv aktiv sind, erzwingen könnte, im Gegensatz zu den Hetero-Oligomeren (z. B. mit einem anderen bHLH-Zip-Protein), die nur in der Abwesenheit von Sterolen aktiv sind. Alternativ kann der Eintritt oder das Zurückhalten von SREBP(s) im Kern durch einen Sterol-vermittelten Prozeß reguliert werden, der überwältigt wird, wenn SREBP überexprimiert wird. In dieser Hinsicht kann der regulierte Kerneintritt oder das Zurückhalten eine Eigenschaft der langen COOHterminalen Hälfte von SREBP sein, die kein Gegenstück bei anderen bHLH-Zip-Proteinen hat.
Auf jeden Fall wird ein Verständnis der Regulierung von SREBPs als wichtig für das Verständnis der Kontrolle der Plasma-Cholesterin-Konzentrationen bei normalen und abnormen Zuständen angesehen. Die cDNA für die SREBP-Familienmitglieder, die von der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt wird, ist deshalb ein lange gesuchtes Werkzeug zur Verwendung beim Aufklären des Signaltransduktionswegs, mit dem zelluläres Cholesterin, das von der Rezeptor-vermittelten Endozytose von LDL stammt, die Genexpression reguliert. In der Zwischenzeit wird die Überexprimierung von SREBPs weiterhin Mittel zur Verfügung stellen, mit denen die Transkription von Genen unter der Kontrolle von Sterol-regulatorischen Elementen, wie etwa dem LDL-Rezeptor-Gen unter der Kontrolle von SRE, erhöht werden kann. Deshalb sind die SREBPs für sich sE1bst besonders nützlich Proteine, die eine direkte Anwendbarkeit haben ohne Hinblick auf die weitere Aufklärung der regulatorischen Mechanismen, von denen es ein Teil sein kann.
Die Gensequenzen und SREBP-Proteine der Erfindung liefern die Möglichkeit, zum ersten Mal die Struktur-Funktionsbeziehung von SREBPs zu erforschen. Die Erfinder erwägen die Durchführung verschiedener Studien, wie etwa z. B. die Behandlung von SREBP mit verschiedenen Mitteln, wie etwa Phosphatasen, Kinasen und Proteasen, um zu bestimmen, wie solche Mittel seine Wirkung beeinträchtigen. Die Expression von SREBP in Kulturzellen wie etwa CV-1-Zellen und 293-Zellen, ist ebenso jetzt möglich und wird es ermöglichen, daß die SREBP-Regulierung erforscht wird unter Verwendung von SREBP voller Länge, trunkiertem SREBP und verschiedenen gentechnologisch veränderten Formen von SREBP. Zum Beispiel wird die Mutation von potentiellen Phosphorylierungsstellen und/oder die Modifizierung oder Deletion von bestimmten SREBP-Domänen in Erwägung gezogen. Die Wechselwirkung von vielen Bestandteilen des intrazellulären Cholesterin-Metabolismus können ebenso unter Verwendung von zellulären Systemen, bei denen SREBP(s) exprimiert wird, bestimmt werden.

G. Biologische funktionelle Äquivalente und Epitop-Kernregionen

Wie auf dem Gebiet bekannt ist, können Modifizierungen und Veränderungen bei der Struktur von Proteinen, wie SREBPs, durchgeführt werden, und man erhält immer noch Moleküle, die gleiche oder andersartig wünschenswerte Eigenschaften haben. Zum Beispiel können bestimmte Aminosäuren andere Aminosäuren in einer Proteinstruktur ersetzen ohne einen bemerkenswerten Verlust an wechselwirkender Bindungsfähigkeit mit Strukturen, wie etwa zum Beispiel Antikörpern, Rezeptoren und Substraten. Weil es die Wechselwirkungsfähigkeit und Natur eines Proteins ist, die die biologische funktionelle Aktivität dieses Proteins definiert, können bestimmte Aminosäuresequenz-Substitutionen in einer Proteinsequenz (oder natürlich seiner zugrundeliegenden kodierenden DNA-Sequenz) gemacht werden, und man wird nichtsdestotrotz ein Protein mit ähnlichen oder sogar ausgleichenden Eigenschaften erhalten (z. B. antagonistisch gg. agonistisch). Es wird somit von den Erfindern erwogen, daß verschiedene Änderungen in der Sequenz von SREBP-Proteinen oder -Peptiden (oder der zugrundeliegenden DNA) gemacht werden können ohne einen bemerkenswerten Verlust ihrer biologischen Nützlichkeit oder Aktivität.
Beim Durchführen von solchen Veränderungen kann der Hydropathie-Index von Aminosäuren betrachtet werden. Die Wichtigkeit des Aminosäure-Hydropathie-Index beim Verleihen von biologischer Wechselwirkungsfunktion an ein Protein wird allgemein auf dem Gebiet verstanden (Kyte & Doolittle, 1982, hierin einbezogen durch Bezugnahme). Es wird akzeptiert, daß der relative Hydropathie-Charakter der Aminosäure zur Sekundärstruktur des resultierenden Proteins beiträgt, was wiederum die Wechselwirkung des Proteins mit anderen Molekülen, zum Beispiel Enzymen, Substraten, Rezeptoren, DNA, Antikörpern, Antigenen und ähnlichen definiert.
Jeder Aminosäure ist ein Hydropathie-Index auf Grundlage ihrer Hydrophobizität- und Ladungseigenschaften (Kyte & Doolittle, 1982) zugeordnet, diese sind: Isoleucin (+4,5); Valin (+4,2); Leucin (+3,8); Phenylalanin (+2,8); Cystein/Cystin (+2,5); Methionin (+1,9); Alanin (+1,8); Glycin (-0,4); Threonin (-0,7); Serin (-0,8); Tryptophan (-0,9); Tyrosin (-1,3); Prolin (- 1,6); Histidin (-3,2); Glutamat (-3,5); Glutamin (-3,5); Aspartat (-3,5); Asparagin (-3,5); Lysin (-3,9) und Arginin (-4,5).
Um ein biologisches, funktionell äquivalentes Protein durch Aminosäureveränderung auf der Grundlage eines ähnlichen Hydrophatie-Index oder -Werts zu erhalten, wird die Substitution von Aminosäuren, deren Hydrophatie-Indizes innerhalb von ± 2 liegen, bevorzugt, diejenigen, die innerhalb ± 1 liegen, werden besonders bevorzugt, und diejenigen, die innerhalb von + 0,5 sind sogar noch bevorzugter.
Es wird ebenso verstanden auf dem Gebiet, daß die Substitution von gleichen Aminosäuren in effektiver Weise auf der Basis von Hydrophilie gemacht werden kann. US-Patent 4,554,101, hierin einbezogen durch Bezugnahme, stellt fest, daß die größte örtliche Durchschnittshydrophilie eines Protein, bestimmt durch die Hydrophilie seiner benachbarten Aminosäuren, mit seiner Immunogenizität und seiner Eigenschaft als Antigen, d. h. mit einer biologischen Eigenschaft des Proteins, korreliert.
Wie in US-Patent 4,554,101 im Detail ausgeführt wird, wurden die folgenden Hydrophilie- Werte Aminosäureresten zugeordnet: Arginin (+3,0); Lysin (+3,0); Aspartat (+3,0 ± 1); Glutamat (+3,0 ± 1); Serin (+0,3); Asparagin (+0,2); Glutamin (+0,2); Glycin (0); Threonin (- 0,4); Prolin (-0,5 ± 1); Alanin (-0,5); Histidin (-0,5); Cystein (-1,0); Methionin (-1,3); Valin (- 1,5); Leucin (-1,8); Isoleucin (-1,8); Tyrosin (-2,3); Phenylalanin (-2,5); Tryptophan (-3,4).
Um ein biologisches, funktionell äquivalentes Protein durch Aminosäureveränderungen auf der Grundlage von ähnlichen Hydrophilie-Wert zu erhalten, wird die Substitution von Aminosäuren bevorzugt, deren Hydrophilie-Werte innerhalb von ± 2 liegen, diejenigen, die innerhalb von ± 1 liegen, sind besonders bevorzugt, und diejenigen innerhalb von ± 0,5 sind sogar noch bevorzugter.
Wie oben dargelegt, beruhen Aminosäuresubstitutionen im allgemeinen auf der relativen Ähnlichkeit der Aminosäure-Seitenketten-Substituenten, z. B. ihre Hydrophobie, Hydrophilie, Ladung, Größe und ähnliches. Beispielhafte Substitutionen, die verschiedene der vorhergehenden Eigenschaften berücksichtigen, sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt und schließen ein: Arginin und Lysin; Glutamat und Aspartat; Serin und Threonin; Glutamin und Asparagin; und Valin, Leucin und Isoleucin.
US-Patent 4,554,101 (Hopp, hierin einbezogen durch Bezugnahme) lehrt ebenso die Identifizierung und Herstellung von Epitopen aus Primär-Aminosäure-Sequenzen auf der Grundlage von Hydrophilie. Durch die von Hopp offenbarten Verfahren wäre ein Fachmann in der Lage, Epitope von innerhalb einer Aminosäuresequenz, wie etwa der hierin offenbarten SREBP-1- Sequenz (SEQ ID NO: 38) zu identifizieren. Diese Regionen werden ebenso als "Epitop- Kernregionen" bezeichnet.
Zahlreiche wissenschaftliche Veröffentlichungen wurden der Vorhersage von Sekundärstruktur und der Identifizierung von Epitopen anhand von Analysen der Aminosäuresequenzen gewidmet (Chou & Fasman, 1974a,b; 1978a,b, 1979). Jede dieser Publikationen kann, wenn erwünscht, verwendet werden, um die Lehren von Hopp im US-Patent 4,554,101 zu ergänzen. Darüberhinaus sind gegenwärtig Computerprogramme verfügbar, um beim Vorhersagen von Antigen-Anteilen und Epitop-Kernregionen von Proteinen zu helfen. Beispiele schließen diejenigen Programme ein auf der Grundlage der Jameson-Wolf-Analyse (Jameson & Wolf, 1998, Wolfet al., 1988), das Programm PepPlot (Brutlag et al., 1990; Weinberger et al., 1985) und andere neue Programme für die Protein-Tertiärstruktur-Vorhersage (Fetrow & Bryant, 1993):
Während die Diskussion sich auf funktionell äquivalente Polypeptide konzentriert hat, die aufgrund von Aminosäureveränderungen entstehen, wird es klar sein, daß diese Veränderungen durch die Veränderung der kodierenden DNA bewirkt werden können; wenn man ebenso berücksichtigt, daß der genetische Code degeneriert ist und daß zwei oder mehrere Kodons für diesE1be Aminosäure kodieren können. Der Austausch von Kodons für andere äquivalente Kodons wird in dem folgenden Abschnitt diskutiert und eine Tabelle von Kodons zur Bezugnahme diesbezüglich wird ebenso zur Verfügung gestellt.

H. Nukleinsäurehybridisierung

Wie oben erwähnt, beinhaltet die vorliegende Erfindung die Verwendung von Nukleinsäuresegmenten in verschiedenen Hybridisierungsausführungsformen. Die Verwendung einer Hybridisierungssonde von ungefähr 10 Nukleotiden Länge ermöglicht die Bildung eines Duplex- Moleküls, das sowohl stabil als auch selektiv ist. Moleküle mit komplementären Sequenzen über Abschnitte, größer als 10 Basen Länge, werden jedoch im allgemeinen bevorzugt, um die Stabilität und Selektivität des Hybrids zu erhöhen und dadurch die Qualität und den Grad der erhaltenen spezifischen Hybridmoleküle zu verbessern. Man wird es im allgemeinen bevorzugen, Nukleinsäuremoleküle mit Gen-komplementären Abschnitten von 10, 14-15 oder 20 Nukleotiden oder sogar länger, falls erwünscht, zu entwerfen.
Die Hybridisierungssonden können aus jedem Teil von jeder der hierin offenbarten Sequenzen ausgewählt werden. Alles, was erforderlich ist, ist es, die in SEQ ID NO: 37 oder 53 dargestellte Sequenz zu überprüfen und einen beliebigen Teil der Sequenz von ungefähr 10-14 Nukleotiden Länge bis zu und einschließlich der Sequenz voller Länge auszuwählen, die man als Sonde oder Primer zu verwenden wünscht. Die Auswahl der Sonden- und Primer- Sequenzen kann durch verschiedene Faktoren bestimmt werden, wie zum Beispiel, daß man Primer von der Gegend in Richtung auf die Termini der gesamten Sequenz oder von den Enden der funktionellen Domän-kodierenden Sequenzen zu verwenden wünscht, um die DNA weiter zu amplifizieren; oder daß man Sonden verwenden kann, die der gesamten DNA oder besonderen DNA-Bindungsmotiv-Regionen entsprechen, um SREBP-artige Gene von anderen Spezies zu klonieren oder um weitere SREBP-artige oder homologe humane Gene zu klonieren.
Der Prozeß der Auswahl und Herstellung eines Nukleinsäuresegments, das eine Sequenz von innerhalb SEQ ID NO: 37 oder SEQ ID NO: 53 einschließt, kann alternativ als die Herstellung eines Nukleinsäurefragments beschrieben werden. Natürlich können Fragmente ebenso mittels anderer Techniken erhalten werden, wie zum Beispiel durch mechanische Scherung oder durch Restriktionsenzymverdau. Kleine Nukleinsäuresegmente oder Fragmente können auf leichte Weise durch zum Beispiel direktes Synthetisieren des Fragments mit chemischen Mitteln hergestellt werden, wie es unter Verwendung eines automatisierten Oligonukleotid- Synthesizers häufig praktiziert wird. Ebenso können Fragmente durch die Anwendung von Nukleinsäuren-Reproduktionstechnologie erhalten werden, wie etwa der PCR-Technologie von US-Patent 4,603,102 (hierin einbezogen durch Bezugnahme), durch Einführen von ausgewählten Sequenzen in rekombinante Vektoren zur rekombinanten Produktion und mittels anderer rekombinanter DNA-Techniken, die im allgemeinen Fachleuten auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannt sind.
Entsprechend können die Nukleotidsequenzen der Erfindung aufgrund ihrer Fähigkeit, selektiv Duplex-Moleküle mit komplementären Abschnitten von SREBP-Genen oder cDNAs zu bilden, verwendet werden. Abhängig von der beabsichtigten Anwendung wird man es wünschen, variierende Hybridisierungsbedingungen zu verwenden, um variierende Grade der Selektivität der Sonde auf eine Zielsequenz zu erreichen. Für Anwendungen, die eine hohe Selektivität erfordern, wird man typischerweise relativ stringente Bedingungen verwenden wollen, um die Hybride zu bilden, zum Beispiel wird man relativ niedrige Salz- und/oder hohe Temperaturbedingungen auswählen, wie sie zum Beispiel von 0,02 M - 0,15 M NaCl bei Temperaturen von 50ºC bis 70ºC geboten werden. Solche selektiven Bedingungen ertragen wenige Fehlpaarungen, wenn überhaupt, zwischen der Sonde und der Matrize oder dem Zielstrang und wären besonders geeignet zum Isolieren von SREBP-Genen.
Für einige Anwendungen, z. B. wenn man es vorhat, Mutanten unter Verwendung eines mutanten Primerstrangs, hybridisiert an eine unterliegende Matrize, herzustellen, oder wenn man SREBP-kodierende Sequenzen von verwandten Spezies, funktionelle Äquivalente oder ähnliches zu isolieren sucht, werden natürlich weniger stringente Hybridisierungsbedingungen benötigt werden, um die Bildung des Heteroduplex zu ermöglichen. Unter diesen Umständen kann man, Bedingungen verwenden wollen, wie 0,15M-0,9M Salz bei Temperaturen im Bereich von 20ºC bis 55ºC. Quer-hybridisierende Spezies können deshalb auf leichte Weise als positiv hybridisierende Signale in Bezug auf Kontrollhybridisierungen identifiziert werden. Auf jeden Fall ist es allgemein anerkannt, daß die Bedingungen stringenter gemacht werden können durch die Zugabe von steigenden Mengen an Formamid, das dazu dient, den Hybrid-Duplex auf diesE1be Weise wie erhöhte Temperatur zu destabilisieren. Daher können die Hybridisierungsbedingungen auf leichte Weise manipuliert werden, und somit wird es im allgemeinen ein Verfahren der Wahl in Abhängigkeit von den erwünschten Resultaten geben.
Bei bestimmten Ausführungsformen wird es vorteilhaft sein, Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung in Kombination mit einem geeigneten Mittel zu verwenden, wie etwa einer Markierung, zum Bestimmen der Hybridisierung. Eine große Vielzahl an geeigneten Indikatormitteln sind auf dem Gebiet bekannt, einschließlich fluoreszierenden, radioaktiven, enzymatischen oder anderen Liganden, wie Avidin/Biotin, die in der Lage sind, ein nachweisbares Signal zu ergeben. Bei bevorzugten Ausführungsformen wird man wahrscheinlich eine fluoreszierende Markierung oder eine Enzymmarkierung verwenden wollen, wie etwa Urease, alkalische Phosphatase oder Peroxidase, anstelle von radioaktiven oder anderen bezüglich der Umwelt unerwünschten Reagenzien. Im Falle von Enzymmarkierungen sind kolorimetrische Indikatorsubstrate bekannt, die verwendet werden können, um ein Mittel bereitzustellen, das für das menschliche Auge oder spektrophotometrisch sichtbar ist, um eine spezifische Hybridisierung mit Proben zu identifizieren, die komplementäre Nukleinsäure enthalten.
Im allgemeinen wird in Erwägung gezogen, daß die hierin beschriebenen Hybridisierungssonden sowohl als Reagenzien bei der Lösungshybridisierung als auch bei Ausführungsformen, die eine Festphase verwenden, nützlich sein werden. Bei Ausführungsformen, die eine Festphase verwenden, wird die Test-DNA (oder RNA) adsorbiert oder andersartig auf eine ausgewählte Matrix oder Oberfläche fixiert. Diese fixierte, einzelsträngige Nukleinsäure wird dann einer spezifischen Hybridisierung mit ausgewählten Sonden unter erwünschten Bedingungen unterzogen. Die ausgewählten Bedingungen werden von den besonderen Umständen auf der Grundlage der jeweiligen erforderlichen Kriterien abhängen (z. B. abhängend von den G+C-Gehalten, der Art der Zielnukleinsäure, der Quelle der Nukleinsäure, der Größe der Hybridisierungssonde, etc.). Nach dem Waschen der hybridisierten Oberfläche, um nichtspezifisch gebundene Sondenmoleküle zu entfernen, wird die spezifische Hybridisierung nachgewiesen oder sogar quantifiziert mittels der Markierung.
Bei diesen Ausführungsformen können DNA-Segmente verwendet werden, die SREBP- Sequenzen einschließen, die im wesentlichen, jedoch nicht exakt wie in SEQ ID NO: 37 oder 53 dargestellt sind. Im wesentlichen bedeutet, daß die Nukleinsäuresequenz in der Hauptsache einem Teil von SEQ ID NO: 37 oder 53 entspricht und relativ wenige Codons hat, die nicht identisch oder funktionell äquivalent mit den Codons von SEQ ID NO: 37 oder 53 sind. Wie auf dem Gebiet bekannt ist, sind Codons Gruppen von drei Nukleotiden, die hinsichtlich der kodierenden Exons für eine besondere Aminosäure kodieren. Der Begriff "funktionell äquivalentes Codon" wird hierin verwendet, um Codons zu bezeichnen, die für diesE1be Aminosäure kodieren, wie etwa die sechs Codons für Arginin oder Serin, und bezieht sich ebenso auf Codons, die für biologisch äquivalente Aminosäuren kodieren. Man kann sich auf die folgende Tabelle beim Auswählen der verschiedenen Codons zur Verwendung bei den Nukleinsäuresegmenten der vorliegenden Erfindung beziehen. TABELLE DER AMINOSÄUREN UND IHRER CODONS

1. Ortsspezifische Mutagenese

Ortsspezifische Mutagenese ist eine Technik, die bei der Herstellung von einzelnen Peptiden oder biologisch funktionellen äquivalenten Proteinen oder Peptiden durch spezifische Mutagenese der zugrundeliegenden DNA nützlich ist. Die Technik stellt weiterhin die Fähigkeit bereit, Sequenzvarianten herzustellen und zu testen, z. B. um die Funktion und Regulation verschiedener Domänen und einzelner Reste innerhalb von SREBP-1 durch Einführung von einer oder mehrerer Nukleotidsequenz-Veränderungen in die DNA zu analysieren.
Ortsspezifische Mutagenese ermöglicht die Produktion von Mutanten durch Verwendung von spezifischen Oligonukleotidsequenzen, die für die DNA-Sequenz der erwünschten Mutation kodieren, sowie eine ausreichende Anzahl an angrenzenden Nukleotiden, um eine Primersequenz von ausreichender Größe und Sequenz-Komplexität bereitzustellen, um einen stabilen Duplex auf beiden Seiten der zu überschreitenden Deletionsverbindung zu bilden. Typischerweise wird ein Primer von ungefähr 17 bis 25 Nukleotiden Länge bevorzugt, wobei ungefähr 5 bis 10 Reste auf beiden Seiten der Verbindung der Sequenz verändert werden.
Im allgemeinen ist die Technik der ortsspezifischen Mutagenese auf dem Gebiet gut bekannt, wie beispielhaft dargestellt durch Publikationen (Adelman et al., 1983). Wie erkannt werden wird, verwendet die Technik typischerweise einen Phagenvektor, der in sowohl einer einzelsträngigen als auch doppelsträngigen Form existiert. Typische Vektoren, die bei ortsgerichteter Mutagenese nützlich sind, schließen Vektoren wie den M13-Phagen ein (Messing et al., 1981). Diese Phagen sind bequem kommerziell erhältlich, und ihre Verwendung ist im allgemeinen Fachleuten gut bekannt. Doppelsträngige Plasmide werden ebenso bei ortsgerichteter Mutagenese routinemäßig verwendet, was den Schritt eliminiert, das interessierende Gen von einem Plasmid auf einen Phagen zu übertragen.
Im allgemeinen wird die ortsgerichtete Mutagenese in Übereinstimmung hiermit durchgeführt, indem zuerst ein einzelsträngiger Vektor erhalten wird oder indem die beiden Stränge eines doppelsträngigen Vektors auseinandergeschmolzen werden, der innerhalb seiner Sequenz eine DNA-Sequenz einschließt, die für das SREBP kodiert. Ein Oligonukleotidprimer, der die erwünschte mutierte Sequenz trägt, wird hergestellt, im allgemeinen synthetisch, zum Beispiel mit dem Verfahren von Crea et al. (1978). Dieser Primer wird dann mit dem einzelsträngigen Vektor gepaart (annealed) und DNA-polymerisierenden Enzymen, wie E. coli- Polymerase-I-Klenow-Fragment ausgesetzt, um die Synthese des mutationstragenden Stranges zu vervollständigen. Somit wird ein Heteroduplex gebildet, bei dem ein Strang für die ursprüngliche, nicht-mutierte Sequenz kodiert, und der zweite Strang die erwünschte Mutation trägt. Dieser Heteroduplex-Vektor wird dann verwendet, um geeignete Zellen zu transformieren, wie etwa E. coli-Zellen, und Klone werden ausgewählt, die rekombinante Vektoren einschließen, welche die mutierte Sequenzanordnung tragen.
Die Herstellung von Sequenzvarianten von SREBP-cDNAs oder -Genen unter Einsatz von stellengerichteter Mutagenese wird als ein Mittel zum Produzieren von potentiell nützlichen SREBP-Spezies bereitgestellt und soll nicht beschränkend sein, da es andere Wege gibt, auf denen Sequenzvarianten von SREBP erhalten werden können. Zum Beispiel können rekombinante Vektoren, die für die erwünschte SREBP-cDNA oder -Gen kodieren, mit mutagenen Mitteln behandelt werden, um Sequenzvarianten zu erhalten (siehe z. B. ein Verfahren, beschrieben von Eichenlaub, 1979) für die Mutagenese von Plasmid-DNA unter Verwendung von Hydroxylamin.

J. Rekombinante Wirtszellen und rekombinante Expression

Wenn ein geeigneter SREBP-Klon erhalten worden ist, sei es auf Grundlage von cDNA oder genomischer DNA, kann man mit der Herstellung eines Expressionssystems für die rekombinante Herstellung von SREBPs weitermachen. Das Konstruieren eines (von) DNA-Segment(en) zur Expression in einem prokaryotischen oder eukaryotischen System kann mittels Techniken durchgeführt werden, die Fachleuten auf dem Gebiet der rekombinanten Expression bekannt sind. Es wird geglaubt, daß praktisch jedes Expressionssystem bei der Expression von SREBP verwendet werden kann.
Man kann sich aussuchen, die in den Beispielen 3 oder 4 dargestellten Verfahren zu befolgen, bei denen die Expression von SREBP-1 oder SREBP-2 in sowohl eukaryotischen als auch prokaryotischen Zellen beschrieben wird, wobei jedes Verfahren zur Produktion von aktivem SREBP führt. Im allgemeinen dürften für die Herstellung von großen Mengen an SREBP bakterielle Expressionssysteme bevorzugt sein. Eine cDNA für SREBP allein kann separat in bakteriellen Systemen exprimiert werden oder kann als ein Fusionsprotein in Zusammenhang mit z. B. β-Galaktosidase, Ubiqitin, Glutathion-S-Transferase von Schistosoma japonicum und ähnlichem exprimiert werden. Es wird geglaubt, daß eine bakterielle Expression Vorteile gegenüber der eukaryotischen Expression bei bestimmten Ausführungsformen hinsichtlich der Leichtigkeit der Verwendung und der Menge von dadurch erhaltenen Materialien haben wird.
Es wird vorgeschlagen, daß die Transformation von Wirtszellen mit DNA-Segmenten, die für SREBPs kodieren, wie SREBP-1, ein bequemes Mittel zum Erhalt von aktivem Enzym bereitstellt. Sowohl cDNA- als auch genomische Sequenzen sind für die eukaryotische Expression geeignet, da die Wirtszelle natürlich die genomischen Transkripte prozessieren wird, um funktionelle mRNA für die Translation in ein Protein zu ergeben. Genomische Sequenzen für SREBP-1 fallen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
Auf ähnliche Weise wird geglaubt, daß beinahe jedes eukaryotische Expressionssystem für die Expression von SREBP verwendet werden kann, z. B. Systeme auf Baculovirus-Basis, Glutamin-Synthase-Basis oder Dihydrofolat-Reduktase-Basis könnten verwendet werden. Jedoch wird in bevorzugten Ausführungsformen in Erwägung gezogen, daß Plasmidvektoren, die einen Replikationsursprung und einen effizienten eukaryotischen Promoter beinhalten, beispielhaft veranschaulicht durch die eukaryotischen Vektoren der pCMV-Reihe, wie pCMVS und pCMV7, am nützlichsten sein werden.
Zur Expression auf diese Weise würde man die kodierenden Sequenzen an den Promoter angrenzend und unter dessen Kontrolle positionieren. Es ist auf dem Fachgebiet klar, daß, um eine kodierende Sequenz unter die Kontrolle eines solchen Promoters zu bringen, man das 5'- Ende der Transkriptionsinitiationsstelle des Transkriptionsleserahmens des Protein zwischen ungefähr 1 und ungefähr 50 Nukleotiden "stromab" von dem gewählten Promoter (d. h. 3' davon) positioniert.
Wenn eine eukaryotische Expression beabsichtigt ist, wird man ebenso typischerweise in die Transkriptionseinheit, die das Enzym einschließt, eine geeignete Polyadenylierungsstelle (z. B. 5'-AATAAA-3') einzubauen wünschen, sofern eine nicht innerhalb des ursprünglich klonierten Segments enthalten war. Typischerweise wird die Poly-A-Additionsstelle ungefähr 30 bis 2000 Nukleotide "stromab" von der Tenninationsstelle des Proteins an einer Position vor der Transkriptionstermination gebracht.
Es wird erwogen, daß praktisch jede der allgemein verwendeten Wirtszellen im Zusammenhang mit der Expression von SREBPs in Übereinstimmung hiermit verwendet werden kann. Beispiele schließen Zellinien ein, die typischerweise für eukaryotische Expression verwendet werden, wie 239-, CV-1-, VERO-, HeLa-, CHO-, WI 38-, BHK-, COS-7-, RIN- und MDCK- Zellinien. Bevorzugte Linien zur Verwendung bei eukaryotischen Expressionsausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind CV-1-Zellen aus Affen und menschliche 293-Zellen.
SREBP kann "überexprimiert" werden, d. h. exprimiert in erhöhten Konzentrationen, relativ zu der natürlichen Expression in den Zellen des menschlichen Körpers. Da SREBPs in der Natur in sehr niedrigen Konzentrationen exprimiert werden, denkt man, daß die Überexprimierung von SREBP kein Problem darstellt. Wenn erwünscht, kann die Überexprimierung mit einer Vielzahl von Verfahren beurteilt werden, einschließlich funktioneller Assays, wie in Beispiel 3 beschrieben, radioaktive Markierung und/oder Proteinaufreinigung. Einfache und direkte Verfahren, wie SDS/PAGE und Proteinfärbung oder Western-Blotting und, sofern erwünscht, quantitatives densitometrisches Scannen des resultierenden Gels oder Blots, werden in Erwägung gezogen. Eine spezifische Erhöhung hinsichtlich der Konzentration des rekombinanten Proteins oder Peptids im Vergleich mit der Konzentration in natürlichen Zellen weist auf eine Überexprimierung hin, ebenso wie ein relativer Überfluß des spezifischen Proteins in Bezug auf die anderen Proteine, die durch die Wirtszelle produziert werden und z. B. auf einem Gel sichtbar sind.
Wie hierin verwendet soll der Betriff "konstruierte" oder "rekombinante" Zelle sich auf eine Zelle beziehen, in die ein exogenes DNA-Segment oder -Gen, wie eine cDNA oder ein für SREBP-1 kodierendes Gen eingeführt worden ist. Deshalb sind konstruierte Zellen von natürlich vorkommenden Zelle unterscheidbar, die kein rekombinant eingeführtes exogenes DNA-Segment oder -Gen enthalten. Konstruierte Zellen sind somit Zellen mit einem Gen oder Genen, die durch Menschenhand eingeführt worden sind. Rekombinant-eingeführte Gene werden entweder in der Form eines cDNA-Gens (d. h. sie werden keine Introns enthalten), einer Kopie eines genomischen Gens sein, oder sie werden Gene enthalten, die an einen Promoter angrenzend positioniert sind, der natürlicherweise nicht mit dem jeweiligen eingefügten Gen assoziiert ist.
Allgemein gesprochen kann es bequemer sein, das rekombinante Gen einer cDNA-Version des Gens zu verwenden. Es wird geglaubt, daß die Verwendung einer cDNA-Version Vorteile bieten wird, dadurch, daß die Größe des Gens im allgemeinen viel kleiner sein wird und leichter verwendet werden kann, um die Zelle, auf die abgezielt wird, zu transfizieren, als dies ein genomisches Gen tun wird, das typischerweise bis zu einer Größenordnung größer als das cDNA-Gen sein wird. Jedoch schließt der Erfinder nicht die Möglichkeit aus, eine genomische Version eines individuellen Gens zu verwenden, sofern erwünscht.

K. Antikörper, gerichtet gegen SREBP

Antikörper, sowohl polyklonale als auch monoklonale, spezifisch für das SREBP der vorliegenden Erfindung, können hergestellt werden unter Verwendung herkömmlicher Immunisierungstechniken, die Fachleuten auf dem Gebiet im allgemeinen bekannt sein werden. Eine Zusammensetzung, enthaltend antigene Epitope des SREBP, kann verwendet werden, um ein oder mehrere Versuchstiere zu immunisieren, wie etwa ein Kaninchen oder eine Maus, die dann im weiteren Verlauf spezifische Antikörper gegen das SREBP produzieren werden. Polyklonale Antiseren können, nachdem man Zeit zur Antikörperbildung verstreichen hat lassen, auf einfache Weise erhalten werden, indem man das Tier bluten läßt und Serumproben aus dem Vollblut herstellt. Ein besonderes Beispiel zur polyklonalen Antikörpererzeugung wird hierin in Verfahren 10 aus Beispiel 3 offenbart. Bei diesem Verfahren wurden synthetische Peptide von der SREBP-1-Sequenz an ein Carrier-Protein gekoppelt und verwendet, um Kaninchen zu immunisieren.
Um monoklonale Antikörper zu erhalten, würde man ebenso anfänglich ein Versuchstier immunisieren, häufig bevorzugt eine Maus, mit einer SREBP-Zusammensetzung. Man würde dann nach einer Zeitperiode, die ausreicht, um eine Antikörperbildung zu ermöglichen, eine Population von Milz- oder Lymphzellen von dem Tier gewinnen. Die Milz- oder Lymphzellen können dann mit Zellinien fusioniert werden, wie menschlichen oder Maus-Myelom- Stämmen, um Antikörper-ausscheidende Hybridome zu erzeugen. Diese Hybridome können isoliert werden, um einzelne Klone zu erhalten, die dann auf die Produktion von Antikörper gegen SREBP gescreent werden können.
Nach der Immunisierung werden die Milzzellen entfernt und fusioniert, unter Verwendung eines Standard-Fusionsprotokolls (siehe z. B. The Cold Spring Harbor Manual for Hybridoma Development, hierin durch Bezugnahme miteinbezogen), mit Plasmacytom-Zellen, um Hybridome zu erzeugen, die monoklonale Antikörper gegen SREBP ausscheiden. Hybridome, die monoklonale Antikörper gegen die ausgewählten Antigene erzeugen, werden unter Verwendung von Standardtechniken identifiziert, wie ELISA und Western-Blot-Verfahren. Hybrodom-Klone, die so identifiziert worden sind, können dann in flüssigen Medien kultiviert werden und die Kulturüberstände aufgereinigt werden, um die SREBP-spezifischen monoklonalen Antikörper bereitzustellen.
Im allgemeinen können sowohl poly- als auch monoklonale Antikörper gegen SREBP in einer Vielzahl von Ausführungsformen verwendet werden. Zum Beispiel können sie in Antikörper- Klonierungsprotokollen verwendet werden, um cDNAs oder Gene zu erhalten, die für SREBP oder verwandte Proteine kodieren. Sie können ebenso bei Inhibitionsstudien verwendet werden, um die Effekte von SREBP oder bestimmten Domänen von SREBP in Zellen oder Tieren zu analysieren. Anti-SREBP-Antikörper werden ebenso bei Immunlokalisierungsstudien nützlich sein, um die Verteilung von SREBP während verschiedener zellulärer Ereignisse zu analysieren, z. B. um die Kern- und/oder zelluläre Verteilung während der Anwesenheit oder Abwesenheit von Sterolen zu bestimmen. Eine besonders nützliche Anwendung von solchen Antikörpern liegt in immunabsorbierenden Protokollen, wie sie verwendet werden können, um natives oder rekombinantes SREBP aufzureinigen, z. B. unter Verwendung einer Antikörper-Affinitätsäule. Der Betrieb von allen solchen immunologischen Techniken wird Fachleuten auf dem Gebiet im Lichte der vorliegenden Offenbarung bekannt sein.

L. In-vitro-Screening-Assays für Kandidatensubstanzen

Weitere Aspekte dieser Erfindung betreffen Verfahren zum bequemen Bewerten von Kandidatensubstanzen, um Verbindungen zu identifizieren, die in der Lage sind, SRE-1-vermittelte Transkription zu stimulieren. Solche Verbindungen werden in der Lage sein, die LDL-Rezeptor-Expression zu fördern, und daher kann gesagt werden, daß sie eine Rezeptor-hochregulierende Aktivität haben. Bezüglich erhöhter LDL-Rezeptor-Expression in den Körperfunktionen, um Plasma-LDL-Konzentrationen zu reduzieren (Brown und Goldstein, 1986), werden alle positiven Substanzen, die durch die Assays der vorliegenden Erfindung identifiziert werden, potentielle Cholesterin-senkende Mittel oder anti-hypercholesterinämische Arzneien sein. Vor einer Anwendung am Menschen würden solche Verbindungen unter Verwendung von herkömmlichen Tiermodellen, die Fachleuten bekannt sind, rigoros getestet werden.
Erfolgreiche Kandidatensubstanzen können in der Abwesenheit von zugegebenen Sterolen funktionieren, in welchem Fall die Kandidatenverbindung als ein "positiver Stimulator" von SRE-1 bezeichnet werden kann. Alternativ können solche Verbindungen die Transkription in der Anwesenheit von Sterolen stimulieren, d. h. dahingehend wirken, daß sie einer Sterol-vermittelten Unterdrückung entgegenwirken, und können daher als "ein Sterol-Antagonist" bezeichnet werden. Es können sogar Verbindungen entdeckt werden, die beide dieser Wirkungen kombinieren, wie dies SREBP-1 tut, abhängig von der Konzentration, in der sie vorhanden ist. Obwohl die Antagonistenklasse von Verbindungen letztendlich die wünschenswertesten zu sein scheinen, werden Verbindungen beider Klassen nützliche therapeutische Mittel zur Verwendung beim Stimulieren von LDL-Rezeptor-Produktion und beim Senken des Blut- Cholesterins beim menschlichen Patienten sein.
Da hierin gezeigt wird, daß SREBP an funktionelle SRE-1-DNA-Sequenzen bindet, beruht ein Verfahren, mit dem Kandidatensubstanzen identifiziert werden, die in der Lage sind, SRE-1-vermittelte Transkriptionen zu stimulieren, auf einer spezifischen Protein: DNA- Bindung. Entspechend kann man, um einen solchen Assay durchzuführen, eine SREBP-1- Protein-Zusammensetzung herstellen, wie etwa rekombinantes SREBP-1, und die Fähigkeit einer Kandidatensubstanz bestimmen, die SREBP-Bindung an ein DNA-Segment, das eine funktionelle SRE-1-Sequenz einschließt, zu erhöhen, d. h. die Menge oder die Bindungsaffinität eines Protein: DNA-Komplexes zu erhöhen.
Dies wird im allgemeinen unter Verwendung zweier paralleler Assays erreicht, von denen einer SREBP-1 und die spezifische DNA alleine enthält und von denen einer SREBP-1, DNA und die Kandidatensubstanzzusammensetzung enthält. Man würde jeden Assay unter Bedingungen und für eine Zeitperiode durchführen, die wirksam ist, um die Bildung von Protein: DNA-Komplexen zu erlauben, und man würde dann die gebundenen Protein: DNA-Komplexe von jeglichem nicht-gebundenen Protein oder DNA trennen und die Menge der Protein: DNA-Komplexe messen. Eine Erhöhung hinsichtlich der Menge des gebundenen Protein: DNA-Komplexes, der in der Anwesenheit einer Kandidatensubstanz gebildet worden ist, würde auf eine Kandidatensubstanz hindeuten, die in der Lage ist, SREBP-1-Bindung zu fördern, und der damit in der Lage ist, SRE-1-vermittelte Transkription zu stimulieren.
Bei solchen Bindungsassays kann die Menge des Protein: DNA-Komplexes nach der Entfernung der nicht-gebundenen Spezies durch Nachweis einer Markierung gemessen werden, wie etwa einer radioaktiven oder enzymatischen Markierung, die in die ursprüngliche SREBP-1- Zusammensetzung oder das rekombinante Protein oder das SRE-1-enthaltende DNA-Segment eingebaut wurde. Alternativ könnte man den Proteinteil des Komplexes mittels eines gegen das Protein gerichteten Antikörpers nachweisen, wie diejenigen, die hierin offenbart sind.
Bevorzugte Bindungsassays sind diejenigen, bei denen entweder das SREBP-rekombinante Protein oder die aufgereinigte Zusammensetzung oder das SRE-1-enthaltende DNA-Segment an einen festen Träger gebunden wird und mit dem anderen Bestandteil in Kontakt gebracht wird, um eine Komplexbildung zu ermöglichen. Nicht-gebundene Protein- oder DNA-Bestandteile werden dann von den Protein: DNA-Komplexen durch Waschen getrennt und die Menge des verbleibenden gebundenen Komplexes durch Nachweis der, Markierung oder mit Antikörpern quantifiziert. Solche DNA-Bindungsassays bilden die Grundlage von Filterbindungsassays und Assays vom Mikrotiterplattentyp und können auf eine semiautomatisierte Weise durchgeführt werden, um eine Analyse einer großen Anzahl an Kandidatensubstanzen in einer kurzen Zeitperiode zu ermöglichen. Elektrophoretische Verfahren, wie etwa der hierin offenbarte Gel-Shift-Assay, könnten ebenso verwendet werden, um nicht-gebundenes Protein oder DNA von gebundenen Protein: DNA-Komplexen zu trennen, aber solche arbeitsintensiven Verfahren werden nicht bevorzugt.
Assays, wie die oben beschriebenen, sind anfangs auf das Identifizieren von positiven stimulatorischen Kandidatensubstanzen gerichtet und sprechen sE1bst nicht die Aktivität der Substanz in der Anwesenheit von Sterolen an. Jedoch kann sich herausstellen, daß solche positive Regulatoren auch als Sterol-Antagonisten wirken und auf jeden Fall eine Nützlichkeit bei der Transkriptionsförderung, entweder in-vitro oder in-vivo, wahrscheinlich haben würden. Positive Regulatoren würden wahrscheinlich weiter bewertet, um die Effekte von Sterolen auf ihre Wirkung zu beurteilen, z. B. durch Verwenden eines zellulären Reporter-Gen-Assay, wie die hierin unten beschriebenen.
Praktisch jede Kandidatensubstanz kann mittels dieser Verfahren analysiert werden, einschließlich von Verbindungen, die mit SREBP, SRE-1 oder Protein: DNA-Komplexen wechselwirken können, und ebenso Substanzen, wie Enzyme, die durch eine physische Veränderung von einer der vorhandenen Strukturen wirken können. Beispiele für die ersteren Substanzen schließen Sterole und Sterol-Derivate ein, und ein Beispiel der letzteren schließt Phosphatase- oder Kinase-Enzyme ein, die die SREBP-Aktivität regulieren können. Natürlich kann jede Verbindung, die aus natürlichen Quellen, wie z. B. Pflanzen, Tieren oder sogar marinen, Wald- oder Bodenproben isoliert wurde, getestet werden, ebenso wie jede synthetische Chemikalie oder rekombinantes Protein dies kann.
Ein weiteres potentielles Verfahren zum Stimulieren von SRE-1-vermittelter Transkription ist es, eine SREBP-Zusammensetzung herzustellen, und die Proteinzusammensetzung auf eine Weise zu modifizieren, die dahingehend wirkt, die SREBP-Bindung an ein DNA-Segment, einschließlich des Sterol-regulatorischen Elements SRE-1, zu erhöhen. Die Bindungsassays würden parallel durchgeführt, ähnlich den oben beschriebenen, was es ermöglicht, daß das native und modifizierte SREBP verglichen wird. Zusätzlich zu Phosphatasen und Kinasen könnten anderen Mittel, einschließlich Proteasen und chemischen Mitteln, verwendet werden, um SREBP zu modifizieren. Die vorliegende Erfindung, mit der Klonierung von SREBP-1- cDNA, eröffnet ebenso den Weg zum gentechnologischen Konstruieren von SREBP, um die LDL-Rezeptor-Transkription zu fördern, die nicht durch Sterole unterdrückbar ist. Unter diesem Gesichtspunkt wird die Mutation von potentiellen Phosphorylierungsstellen und/oder die Modifizierung oder Deletion von anderen Domänen in Erwägung gezogen.

M. Reporter-Gene und Screening-Assays auf Zeligrundlage

Zelluläre Assays sind ebenso zum Screenen von Kandidatensubstanzen verfügbar, um diejenigen zu identifizieren, die in der Lage sind, SRE-1-vermittelte Transkription und Genexpression zu stimulieren. Bei diesen Assays kann die erhöhte Expression von jedem natürlichen oder heterologen Gen unter der Kontrolle eines funktionellen SRE-1-Elements als ein Maß für die stimulatorische Aktivität verwendet werden, obwohl die Verwendung von Reporter-Genen bevorzugt wird. Ein Reporter-Gen ist ein Gen, das seiner rekombinanten Wirtszelle einen leicht nachweisbaren Phänotyp verleiht, der nur unter spezifischen Bedingungen zum Vorschein kommt. Im vorliegenden Fall wird das Reporter-Gen, das unter der Kontrolle eines funktionellen SRE-1-Elements ist, im allgemeinen unter Bedingungen einer Sterol-Verarmung exprimiert werden und wird im allgemeinen in der Anwesenheit von Sterolen reprimiert werden.
Reporter-Gene sind Gene, die für ein Polypeptid kodieren, das ansonsten nicht durch die Wirtszelle produziert wird, das durch Analyse der Zellkultur nachweisbar ist, z. B. durch fluorometrische, radioisotopische oder spektrophotometrische Analyse der Zellkultur. Beispielhafte Enzyme schließen Luziferasen, Transferasen, Esterasen, Phosphatasen, Proteasen (Gewebe-Plasminogen-Aktivator oder Urokinase), und andere Enzyme ein, die in der Lage sind, anhand ihrer physikalischen Anwesenheit oder funktionellen Aktivität nachgewiesen zu werden. Das gegenwärtig bevorzugte Reporter-Gen ist Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT; Osborne et al., 1985), das mit einem radioaktiv markierten Substrat oder Luziferase verwendet werden kann, die fluorometrisch gemessen wird.
Eine andere Klasse von Reporter-Genen, die einer Wirtszelle nachweisbare Eigenschaften verleihen, sind diejenigen, die für Polypeptide, im allgemeinen Enzyme kodieren, die ihre Transformanten gegenüber Toxinen resistent machen, z. B. das neo-Gen, das Wirtszellen gegen toxische Konzentrationen des Antibiotikum G418 schützt, und Gene, die für Dihydrofolatreduktase kodieren, welche eine Resistenz gegenüber Methotrexat verleiht. Gene von dieser Klasse werden im allgemeinen nicht bevorzugt, weil der Phänotyp (Resistenz) kein bequemes oder schnelles quantitatives Ergebnis liefert. Die Resistenz gegenüber einem Antibiotikum oder Toxin erfordert Tage der Kultivierung, um eine Bestätigung zu bekommen, oder komplexe Assay-Prozeduren, wenn eine andere als eine biologische Bestimmung gemacht werden soll.
Andere Gene mit einem Potential zur Verwendung bei Screening-Assays sind diejenigen, die in der Lage sind, Wirte zu transformieren, um einzigartige Zelloberflächen-Antigene zu exprimieren, z. B. virale env-Proteine, wie etwa HIV-gp120 oder Herpes-gD, die mittels Immunoassays leicht nachweisbar sind. Jedoch werden Antigen-Reporter nicht bevorzugt, weil sie, anders als Enzyme, nicht katalytisch sind und deshalb nicht ihre Signale verstärken.
Die Polypeptidprodukte des Reporter-Gens sind ausgeschiedene, intrazelluläre oder, wie oben bemerkt, Membran-gebundene Polypeptide. Wenn das Polypeptid nicht normalerweile ausgeschieden wird, wird es an eine heterologe Signalsequenz zur Verarbeitung und Ausscheidung fusioniert. Unter anderen Umständen wird das Signal modifiziert, um Sequenzen zu entfernen, die eine Ausscheidung verbieten. Zum Beispiel ist das Herpes-gD-Hüllprotein mittels stellengerichteter Deletion seiner Transmembran-Bindungsdomäne modifiziert worden, wodurch seine Ausscheidung erleichtert wurde (EP 139,417A). Diese trunkierte Form des Herpes-gD-Proteins ist im Kulturmedium mittels herkömmlicher Immunoassays nachweisbar. Bevorzugt sind jedoch die Produkte des Reporter-Gens in den intrazellulären oder Membran- Kompartimenten untergebracht. Dann können sie an den Kulturbehälter fixiert werden, z. B. Mikrotiter-Näpfen, in denen sie wachengelassen werden, gefolgt von der Zugabe einer ein nachweisbares Signal erzeugenden Substanz, wie etwa ein chromogenes Substrat für Reporter-Enzyme.
Der Transkriptionsförderungsprozeß, der in seiner Gesamtheit zu einer verstärkten Transkription führt, wird als "Aktivierung" bezeichnet. Der Mechanismus, mit dem eine erfolgreiche Kandidatensubstanz wirkt, ist nicht wesentlich, da die Aufgabe ist, die LDL-Rezeptor-Expression zu fördern oder sogar die LDL-Rezeptor-Expression in der Anwesenheit von Sterolen zu fördern, mit welchen Mitteln auch immer dies funktionieren wird.
Um einen geeigneten Vektor oder Plasmid zur Verwendung bei solchen Assays zu erzeugen, würde man den SRE-1-enthaltenden Promoter, sei es ein Hybrid- oder der native LDL- Rezeptor-Promoter, an ein DNA-Segment, das für das Reporter-Gen kodiert, mit herkömmlichen Verfahren ligieren. Das SRE kann durch in-vitro-Synthese erhalten werden oder aus genomischer DNA gewonnen werden und sollte stromauf vom Startcodon des Reporter- Gens ligiert werden. Eine AT-reiche TATA-Box-Region sollte ebenso verwendet werden und sollte sich zwischen der SRE-1-Sequenz und dem Reporter-Gen-Startcodon befinden. Die Region 3' zu der kodierenden Sequenz für das Reporter-Gen wird idealerweise eine Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungsstelle enthalten. Das Promoter- und Reporter- Gen kann in einen replizierbaren Vektor eingeführt und in einen Klonierwirt, wie E. coli, transfiziert werden, der Wirt kultiviert und der replizierte Vektor wieder entnommen werden, um ausreichende Mengen der Konstruktion für eine spätere Transfektion in einen geeigneten eukaryotischen Wirt herzustellen.
Wirtszellen zur Verwendung bei den Screening-Assays der vorliegenden Erfindung werden im allgemeinen Säugetierzellen sein und sind bevorzugt Zellinien, die im Zusammenhang mit transienten Transfektionsstudien verwendet werden können. Die Zellinien sollten relativ leicht in Kulturen im großen Maßstab zu ziehen sein. Ebenso sollten sie sowenig nativen Hintergrund wie möglich enthalten, in Anbetracht der Natur des Reporter-Polypeptids. Beispiele schließen die Hep-G2-, VERO-, HeLa-, menschliche Embryonennieren-, 293-, CHO-, W138-, BHK-, COS-7- und MDCK-Zellinien ein, wobei CV-1-Zellen vom Affen besonders bevorzugt werden.
Der Screening-Assay wird typischerweise durch Wachsenlassen der rekombinanten Wirtszellen in der Anwesenheit und Abwesenheit von Kandidaten-Substanzen und durch Bestimmen der Menge oder der Aktivität des Reporter-Gens durchgeführt. Um auf Kandidaten-Substanzen zu testen, die in der Lage sind, ihre Wirkungen in der Anwesenheit von Sterolen auszuüben, würde man serielle molare Anteile von Cholesterin und/oder anderen Sterolen machen, die die SRE-1-vermittelte Expression bei den Zellen unterdrücken. Man würde idealerweise das Niveau des Reporter-Signals nach einer Inkubationsperiode messen, die ausreicht, um eine Sterol-vermittelte Repression der Signal-Expression in Kontrollen zu demonstrieren, die nur mit Sterolen inkubiert worden sind, z. B. mit 10 Mikrogramm Cholesterin/ml und 1 Mikrogramm 25-Hydroxycholesterin/ml. Zellen, die variierende Anteile an Kandidaten- Substanzen enthalten, würden dann auf eine Signal-Aktivierung im Vergleich mit den unterdrückten Konzentrationen bewertet werden.
Kandidaten, die eine dosis-bezogene Verstärkung der Reporter-Gen-Transkription oder -Expression zeigen, werden dann für eine weitere Bewertung als klinische therapeutische Mittel ausgewählt. Die Stimulierung der Transkription kann in der Abwesenheit von zugegebenen Sterolen beobachtet werden, in welchem Falle die Kandidaten-Verbindung ein positiver Stimulator des SRE sein könnte. Alternativ könnte die Kandidaten-Verbindung nur eine Stimulation in der Anwesenheit von Sterolen geben, was anzeigen würde, daß sie dahingehend wirkt, daß sie der Sterol-vermittelten Unterdrückung des SRE entgegenwirkt. Kandidaten- Verbindungen beider Klassen könnten nützliche therapeutische Mittel sein, die die Produktion von LDL-Rezeptoren stimulieren und dadurch das Blut-Cholesterin im Patienten senken würden.
Die folgenden Beispiele werden eingeschlossen, um bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung zu demonstrieren. Es sollte von Fachleuten erkannt werden, daß die in den folgenden Beispielen offenbarten Techniken Techniken darstellen, von denen der Erfinder entdeckt hat, daß sie bei der Ausübung der Erfindung gut funktionieren, und somit dahingehend betrachtet werden können, daß sie bevorzugte Ausführungsarten darstellen.

BEISPIEL 1

Identifizierung des Sterol-regulatorischen Element-1-Bindeproteins (SREBP) und Beschreibung seiner Ziel-Nukleotidsequenz

Das vorliegende Beispiel berichtet über die Identifizierung eines Proteins in Rattenleber-Kernen, das an das Sterol-regulatorische Element (SRE-1) bindet, beispielhaft veranschaulicht durch SRE-1 in dem Promoter des Gens für den Low-Density-Lipoprotein (LDL)-Rezeptor (SEQ ID NO: 27).
Das 10-Basenpaar-SRE-1 (SEQ ID NO: 27) ist innerhalb einer 16-Basenpaar-Sequenz eingebettet, bezeichnet als Repeat 2 (SEQ ID NO: 22), die sich unmittE1bar stromauf von einer verwandten Sequenz, bezeichnet als Repeat 3 (SEQ ID NO: 23), befindet. Um zu betätigen, daß die DNA-Erkennung durch das SRE-1-Bindungsprotein (SREBP) mit der Sterol-regulierten Transkription korreliert, wurde ein künstlicher Promoter synthetisiert, der zwei Kopien der Wildtyp- oder mutanten Repeat 2 + 3-Sequenzen unmittE1bar stromauf von einer TATA-Box vom Adenovirus enthält. Die synthetischen Promotoren wurden stromauf von einem Reporter-Gen eingeführt und auf Transkriptionsaktivität in der Abwesenheit und Anwesenheit von Sterolen nach vorübergehender Transfektion in CV-1-Zellen vom Affen getestet.
Das Reporter-Gen mit zwei Kopien der Wildtyp-Repeat-2+3-Sequenz (SEQ ID NO: 25) wurde aktiv in Sterol-verarmten Zellen transkribiert und wurde um mehr als 80% reprimiert, wenn Sterole vorhanden waren. Die Bindung von SREBP an die SRE-1-Sequenz, beurteilt mittels Gel-Mobilitäts-Shift-Assays, korrelierte auf einer Nukleotid-für Nukleotid-Basis genau mit der Transkriptionsaktivität von jedem von 18 synthetischen Promotoren mit Punktmutationen in Repeat 2 (SEQ ID NOS: 2-19). Das SREBP ging eine Bindung mit den 9 mutanten Promotoren ein, die für eine Sterol-regulierte Transkription positiv waren (SEQ ID NOS: 2-4,10,15-19), und es ging keine Bindung mit irgendeinem der 9 Punktmutanten ein, die die Transkription unterdrückten (SEQ ID NO: 5-9,11-14).

A. Materialien und Methoden

1. Materialien. Die bei den Plasmidkonstruktionen verwendeten Enzyme wurden von Pharmacia LKB Biotechnology, Inc. und Life Technologies, Inc. erworben; Artikel für die Chromatographie und das FPLC-System von Pharmacia LKB; Dulbecco's-modifiziertes- Eagle-Medium, hochglukosige Formulierung (DMEM) von JRH Biomedicals, Inc.; Sterole von Steraloids, Inc.; Protease- und Phosphatase-Inhibitoren von Sigma Chemical Co. und Boehringer Mannheim; [¹&sup4;C]Chloramphenicol (55 mCi/mmol) von Amersham; und [α- ³²P]dCTP)3000 Ci/mmol) von Dupont-New England Nuclear. Lipoprotein-defizientes Serum aus neugeborenen Kälbchen (d > 1,215 g/ml) wurde mittels Ultrazentrifugation hergestellt (Goldstein, et al., 1983).
2. Plasmidkonstruktionen. Plasmid pCMV-ßGAL (β-Galaktosidase unter der Kontrolle des menschlichen Zytomegalovirus-Promoter) wurde von Karl Normington erhalten (University of Texas Southwestern Medical Center in Dallas). Die Plasmide wurden mit Standard- Verfahren (Sambrook et al., 1989) unter Verwendung von gepaarten (annealed), komplementären Deoxyoligonukleotiden konstruiert, die in einen E1b-TATA-CAT-Vektor (Lillie et al., 1989) einkloniert waren, der mit entweder SalI (Fig. 2 und Tabelle I) oder PstI-SalI (Fig. 3 und 4 und Tabelle II) verdaut war. Die Oligonukleotide wurden auf einem Applied Biosystems 380B-DNA-Synthesizer synthetisiert. Die Plasmide wurden auf Qiagen-tip-2500- Säulen aufgereinigt. Es wurden die DNA-Sequenzen von allen Konstrukten mittels eines ³²Pmarkierten SP6-Primer unter Verwendung eines Sequenase-Version 2.0-Sequenzierkit von United States Biochemicals, Inc. gemäß den Weisungen des Vertreibers bestimmt.
3. DNA-Transfektion. Alle Zellen wurden in einem 8%-CO&sub2;-Inkubator bei 37ºC wachsen gelassen. African-green-monkey-kidney-CV-1-Zellen (erhalten von der American Type Culturen Collection, Nr. CCL70) wurden in Monoschichten in Medium A wachsen gelassen (DMEM mit 100 U/ml Penicillin und 100 ug/ml Streptomycinsulfat), enthaltend 10% (v/v) fötales Kälberserum.
Am Tag 0 wurden die CV-1-Zellen als 5 · 10&sup5; Zellen pro 90-mm-Petrischale ausplattiert und für 24 Stunden inkubiert. Am Tag 1 erhielt jede Schale 10 ml frisches Medium A, enthaltend 10% fötales Kälberserum und wurden dann mit Calciumphosphat-gefällter DNA transfiziert (Sambrook et al., 1989). In Kürze, es wurden 12,5 oder 25 ug Testplasmid-DNA und 7,5 oder 15 ug pCMV-ßGAL in 0,44 ml 10 mM Tris-HCl/1 mM EDTA bei pH 8,0, zu 0,11 ml 2,5 M CaCl&sub2; zugegeben und mit 0,55 ml von 2X Hanks'-gepufferter Salzlösung gemischt (Sambrook et al., 1989). Den Niederschlag ließ man sich für 45 Minuten bei Zimmertemperatur bilden, wonach 1 ml tropfenweise zu jeder Monoschicht zugegeben wurde. Die Zellen wurden für 14 Stunden mit der DNA inkubiert und dann zweimal mit 6 ml warmer Dulbecco's- Phosphat-gepufferter Salzlösung gewaschen und erneut mit 8 ml Medium A, enthaltend 10% Lipoprotein-defizientes Kälberserum in der Anwesenheit oder Abwesenheit von Sterolen (10ug/gml Cholesterin + 1ug/ml 25-Hydroxycholesterin, zugegeben in 16 ul Ethanol), gefüttert. Nach einer Inkubation für 48 Stunden (Tag 4) wurden die Zellen zur Messung der CAT- und β-Galaktosidase-Aktivität geerntet.
4. CAT-Assay. Transfizierte Zellen wurden dreimal mit Phosphat-gepufferter Salzlösung gewaschen, in 1 ml 40 mM Tris-HCl/1 mM EDTA/150 mM NaCl bei pH 7,4 geschabt, mittels Scherung zehnmal durch eine 25-Gauge-Nadel lysiert und bei 14.000 g für 2 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Ein Aliquot des Überstands (15-25 ug Protein) wurde für 1-2 Stunden bei 37ºC in einem Standard-CAT-Assay (Gorman et al., 1982) in einem Endvolumen von 0,15 ml inkubiert, enthaltend 0,9 nmol [¹&sup4;C]Chloramphenicol (SO nCi) und entweder 0,53 mM Acetyl- CoA oder 0,53 mM Butyryl-CoA (Pothier et al., 1992). Alle Assays waren hinsichtlich der Inkubationszeit und der Konzentration des Extraktproteins linear.
Die Reaktionsprodukte wurden mittels eines von zwei Verfahren quantifiziert. Bei einem Verfahren (Tabelle I) wurden die mittels Ethylacetat solubilisierten Reaktionsprodukte auf Merck-5748-Kieselgelplatten chromatographiert, die in einem Chloroform/Methanol (95/5, v/v) Lösungsmittelsystem entwickelt wurden. Die Platten wurden getrocknet und bei Zimmertemperatur einem Kodak-X-OMAT-XAR-Film für die angezeigte Zeit exponiert. Die radioaktiven Flecken wurden ausgeschnitten und in einem Szintillationszähler gezählt.
Bei dem zweiten Verfahren (Tabelle II) wurden die Reaktionsprodukte mit 0,5 ml Xylenen (Seed et al., 1988) extrahiert. Die Xylenphase wurde zweimal mit 0,2 ml 0,24 M Tris-HCl, pH 8 rück-gewaschen, wonach ein 350-ul-Aliquot der Xylen-Phase in einem Szintillationszähler gezählt wurde. Der Proteingehalt der Zellextrakte wurde mittels des Lowry-Verfahrens gemessen (Lowry et al., 1951).
5. β-Galactosidase-Assay. Ein Aliquot des 14.000 g-Überstands aus den lysierten transfizierten Zellen (15-25 ug Protein) wurde bei 28ºC für 15-60 Minuten mit 0,67 mg/ml o- Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid in einem Endvolumen von 1,2 ml inkubiert (Lee et al., 1984). Die Reaktionen wurden mit 0,5 ml 1 M Na&sub2;CO&sub3; abgebrochen, und die Menge an gebildetem o-Nitrophenol wurde spektrophotometrisch bei 420 nm gemessen.
6. Partielle Aufreinigung von Rattenleber-SRE-1-Bindeprotein (SREBP). Ein Extrakt aus Rattenleber-Kernen wurde mittels des Verfahrens von Lichtsteiner, et al. (Lichtsteiner et al., 1987) hergestellt. Leberorgane aus 100 Ratten, gespült mit kalter Dulbecco's-Phosphatgepufferter Salzlösung (JRH Biosciences), enthaltend Protease-Inhibitoren (1 mM Benzamidin, 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 10 ug/ml Leupeptin, 5 ug/ml Pepstatin, 28 milli- Trypsin-inhibitorische Einheiten Aprotinin) und Phosphatase-Inhibitoren (1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM β-Glycerophosphat, 5 mM Natriumfluorid, 1 mM Natriummolybdat), wurden bei 4ºC für 30 s in einem speziell entworfenen Waring-Blender (kreisförmiges Design mit einem Deckel, um die Luft auszuschließen)(Lichtsteiner et al., 1987) in 4 Volumina Puffer A (10 mM Hepes-KOH, pH 7,6, 2 M Saccharose, 25 mM Kaliumchlorid, 0,15 mM Spermin. 0,5 mM Spermidin, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, Protease-Inhibitoren und Phosphatase- Inhibitoren), homogenisiert.
Nach Filtration durch 4 Schichten Zellstofftuch wurden 30 ml Homogenat über 10 ml Puffer A in AH629-Röhrchen geschichtet und bei 103.600 g bei 4ºC für 30 Minuten zentrifugiert.
Die Kernpellets wurden in Kemlyse-Puffer (10 mM Hepes-KOH, pH 7,6, 100 mM Kaliumchlorid, 3 mM Magnesiumchlorid, 1 mlvi DTT, 10% [v/v] Glycerin, Protease- und Phosphatase-Inhibitoren) unter Verwendung des B-Stößel eines Dounce-Homogenisators suspendiert und auf eine Endkonzentration von 15 A²&sup6;&sup0;-Einheiten/ml eingestellt. Achtundzwanzig ml der Kernsuspension wurden in Hochgeschwindigkeitszentrifugationsröhrchen verteilt, zu denen 2,8 ml 4 M Ammoniumsulfat, pH 7,9 (0,36 M Endkonzentration) zugegeben und durch sanftes Umdrehen gemischt wurde. Der Extrakt wurde sanft für 30 Minuten bei 0ºC geschüttelt. Nach der Zentrifugation bei 244.300 g bei 4ºC für 1 Stunde wurde der Überstand (Kernextrakt) gegen einen 100-fachen Überschuß von Puffer B (25 mM Hepes-KOH, pH 7,6, 12 mM Magnesiumchlorid, 10% Glycerin, 0,5 mM DTT, Protease- und Phosphatase-Inhilitoren) bei 4ºC für 2-3 Stunden dialysiert. Die Dialyse wurde abgestoppt, wenn die Leitfähigkeit des Kernextrakts äquivalent derjenigen von Puffer B, enthaltend 100 mM KCl, wurde. Unlösliches Material wurde mittels Zentrifugation bei 24.000 g für 15 Minuten bei 4ºC entfernt.
Der Überstand (425 mg Protein) wurde auf eine 5-Sepharose (SP-Sepharose, Fharmacia)- Säule (20 ml-Bettvolumen) aufgebracht, die mit Puffer B, enthaltend 100 mM KCl, äquillibriert worden war. Die Säule wurde 2-Säulenvolumina Puffer B, enthaltend 100 mM KCl, gewaschen, und die Fraktion, die die SREBP-Aktivität enthielt, wurde mit Puffer B, enthaltend 300 mM KCl, eluiert. Festes Ammoniumsulfat wurde dem Eluat (40 ml) zugegeben, und das bei 50%-Sättigung erhaltene Pellet wurde in 6 ml aufgelöst und mittels Zertrifugation geklärt. Die resultierende Lösung (88 mg Protein in 6 ml) wurde auf eine FPLC-HiLoadTM 16/60 Superdex-200-Säule aufgebracht, die in Puffer B, enthaltend 100 mM KCl, äquillibriert worden war. Die Fraktionen wurden auf SREBP-Aktivität getestet, und die aktiven Fraktionen wurde vereinigt und bei -80ºC gelagert.
7. PCR-Sonden für Gel-Mobilitäts-Shift-Assay. Jede PCR-Sonde wurde in einer 100 ul- Reaktion synthetisiert, enthaltend 10 mM Tris-HCl, pH 9,0 (bei 25ºC), 50 mM KCl, 0,1% [v/v] Triton X-100, 50 uM dGTP, 50 uM dATP, 50 uM dTTP und 5 uM dCTP, 10 ul [α- ³²P]dCTP (3000 Cl/mmol), 100 ng des entsprechenden für die Transfektionsstudicn verwendeten Plasmids (siehe oben), und 1 nmol von jedem der beiden PCR-Oligonukbotide, die dazu angelegt waren, an die flankierenden Sequenzen der beiden Kopien von Repeat 2 + 3 des LDL-Rezeptor-Promoter in Plasmid K zu hybridisieren (5'-Oligo
GACACTATAGAACTCGAGCAGCTGAAGCTTGCATGC (SEQ ID NO: 28);
3'Oligo
GGTACCCGGGGATCCATTATATACC (SEQ ID NO: 29).
Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2 U Taq-DNA-Polymerase (Promega) initiiert, und die Röhrchen wurden bei 94ºC für 30 s, 55ºC für 1,5 min. 72ºC für 1 min für 15 Zyklen inkubiert.
Die PCR-Produkte wurde darauffolgend mit Xba I und Hind III verdaut, und das ³²Pmarkierte 94-bp doppelsträngige Fragment mit einem 5' -Überhang von 4 Nukleotiden wurde auf einem 6%-Polyacrylamidgel aufgereinigt. Dieses ³²P-Fragment enthält zwei Kopien von Repeat 2 + 3 von der LDL-Rezeptor-Promoter-Region, verknüpft durch eine Sal I-Stelle (70 bp), umgeben von 16 bp 5'-flankierender Sequenz (Hindill-Stelle) und von 7 bp 3'- flankierender Sequenz (Xba I-Stelle).
8. Gel-Mobilität-Shift-Assay. Die Bindungsaktivität von SREBP wurde in einer 20 ul- Reaktion getestet, enthaltend 12,5 mM Hepes-KOH (pH 7,5), 6 mM MgCl&sub2;, 5,5 mM EDTA, 50 mM KCl, 0,5 mM DTT, 0,25 mg/ml fettarmer Trockenmilch (Marke Kroger), 50 ug/ml Natriumpolyd(I-C)·Polyd(I-C) (Pharmacia; durchschnittliche Länge 1.332 bp), 5% (v/v) Glycerin, 25 ug/ml eines doppelsträngigen Oligonukleotids, enthaltend eine Kopie einer 9-bp scrambled (unterstrichen) Mutantenversion von Repeat 2, gefolgt von einer Kopie· einer Wildtyp-Repeat-3-Sequenz (5' TCGACAAAAGATAAGATGTGCAAACTCCTCCCCCTGCG-3% SEQ ID NO: 3 0), 2,2 ug partiell aufgereinigtes Rattenleber-SREBP und 6 fmol der angezeigten ³²P-markierten, PCR-erzeugten Sonde (40.000 cpm). Jede Reaktionsmischung wurde bei Zimmertemperatur für 20 Minuten inkubiert und dann direkt auf ein 4% Polyacrylamidgel in 0,5 X TBE-Puffer geladen (1X TBE-Puffer enthält 90 mM Tris-Borat/2 mM EDTA). Das Gel wurde bei einer konstanten Stromstärke von 22 mA bei Zimmertemperatur für 90 Minuten laufengelassen und im nassen Zustand einem Kodak-XAR-Film über Nacht bei -80ºC exponiert.

B. Resultate

Fig. 1 zeigt die DNA-Sequenzen von Repeats 2 (SEQ ID NO: 22) und 3 (SEQ ID NO: 23), die in dem nativen LDL-Rezeptor-Promoter unmittE1bar aneinandergrenzen (Sufhofet al., 1987). Es wurden Plasmidkonstrukte hergestellt, die vielfache Kopien von Repeat-2+ 3-Oligonukleotid (SEQ ID NO: 24) enthalten, eingeführt 1 Sbp stromauf von einer TATA-Box-Sequenz, abgeleitet aus dem Adenovirus-E1b-Promoter. Diese synthetischen Promoter wurden stromauf von einem Reporter-Gen kloniert, das für bakterielle Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) kodiert, und in CV-1-Zellen vom Affen in transienten Expressionsassays eingeführt.
Fig. 2 zeigt die CAT-Aktivität in CV-1-Zellen, die vorübergehend mit den verschiedenen Promoter-Konstrukten transfiziert und für 48 Stunden entweder in der Abwesenheit oder Anwesenheit von Sterolen inkubiert worden waren. Wenn keine LDL-Rezeptor-Promoter-Elemente in dem Vektor vorhanden waren, wurde keine CAT-Aktivität erhalten (Plasmid A). Fünf Kopien von Repeat 2 (SEQ ID NO: 22) zeigten ebenso keine Aktivität (B). Eine einzelne Kopie von Repeat 3 (SEQ ID NO: 23) ergab nur geringe Niveaus einer nicht-regulierten Transkription (D). Jedoch wurde, wenn das Konstrukt vier Kopien von Repeat 2 (SEQ ID NO: 22) plus eine einzelne Kopie von Repeat 3 (SEQ ID NO: 23) enthielt, eine Transkription in der Abwesenheit von Sterolen beobachtet, und diese wurde reprimiert, wenn die Sterole vorhanden waren (C). Eine einzelne Kopie des Repeat-2+3-Elements (SEQ ID NO: 24) ergab eine Transkription auf niedrigem Niveau, die Sterol-reguliert war (E), ähnlich derjenigen des nativen LDL-Rezeptors (I). Ein viel höheres Niveau von regulierter Transkription wurde beobachtet, wenn das Repeat-2+3-Element (SEQ ID NO: 24) zweimal wiederholt wurde (F). Das induzierte Niveau der Transkription dieses Plasmids war viel höher als dasjenige, das bei dem nativen LDL-Rezeptor-Promoter unter densE1ben Bedingungen gesehen wurde (I).
In einem Vektor, der zwei Kopien der Repeat-2+3-Sequenz (SEQ ID NO: 25) enthielt, verringerte eine 4 bp-Mutation bei beiden Kopien von Repeat 2 die Transkription auf ein niedriges Niveau, das in der Abwesenheit und Anwesenheit von Sterolen ähnlich war (G), was anzeigt, daß die Empfindlichkeit gegenüber Sterol unterdrückt wurde. Diese Mutation enthält zwei Nukleotid-Substitutionen, von denen zuvor gezeigt worden war, daß sie die SRE-1-Funktion in dem nativen LDL-Rezeptor-Promoter auslöschen (Smith et al., 1990).
Tabelle I stellt eine quantitative Analyse der obigen Expressionsdaten dar. Als eine interne Kontrolle für die Transfektionseffizienz wurde in jeder Studie ein Kontrollplasmid eingeschlossen, das für β-Galactosidase unter der Steuerung des CMV-Promoters kodiert. Die beobachtete CAT-Aktivität wurde im Hinblick auf die Menge an β-Galaktosidase-Aktivität in densE1ben Zellen normalisiert, und die Resultate sind als korrigierte CAT-Aktivität ausgedrückt. Das Verhältnis von korrigierten CAT-Aktivitäten in der Abwesenheit und Anwesenheit von Sterolen ist die -fache Regulierung. Tabelle I zeigt die Mittelwertsresultate aus 4 bis 8 unabhängigen Studien für jedes Plasmid. In der Abwesenheit von Sterolen stieg die CAT- Aktivität in CV-1-Zellen von 5,2 auf 62% [¹&sup4;C] Chloramphenicol-Umwandlung an, wenn die Anzahl an Kopien des Repeat 2 + 3-Elements (SEQ ID NO: 24) von 1 auf 2 erhöht wurde. Die Abhängigkeit der Transkription von der Sterol-Verarmung erhöhte sich ebenso von 2,5- auf 5,3-fach, wenn die Repeat 2 + 3-Sequenz (SEQ ID NO: 24) verdoppelt wurde. Die -fache Regulierung durch Sterole war am höchsten (14-fach), wenn vier Kopien von Repeat 2 (SEQ ID NO: 22) an eine Kopie von Repeat 3, SEQ ID NO: 23, angrenzend gebracht wurden (Plasmid C). TABELLE I Sterol-vermittelte Regulierung von E1b-TATA-CAT-Genen, enthaltend LDL-Rezeptor-Promoter-Elemente in transfizierten CV-1- und HeLa- Zellen
Der angezeigte Zelltyp wurde vorübergehend mit 25 ug des E1b-TATA-CAT-Vektor transfiziert, enthaltend das angezeigte LDL-Rezeptor-Promoter-Element, zusammen mit 15 ug pCMV-ßGAL. Nach einer Inkubation für 48 Stunden in der Abwesenheit oder Anwesenheit von 10 ug/ml Cholesterin plus 1 ug/ml 25-Hydroxycholesterin wurden die Zellen zur doppelten Messung der CAT- und β-Galactosidase-Aktivitäten geerntet, wie in den "Materialien und Methoden" beschrieben. Die CAT-Aktivität in einer einzelnen Studie wurde im Hinblick auf die Variation hinsichtlich der Transfektionseffizienz korrigiert, indem man den Wert auf die β-Galactosidase-Aktivität in demsE1ben Extrakt normalisierte. Bei jeder Studie wurde dem ersten getesteten β-Galactosidase-Wert ein willkürlicher Wert von 1 zugewiesen, und alle anderen β-Galactosidase-Werte wurden als Bruchteilsäquivalente dieses Werts ausgedrückt. Plasmid J, der authentische HMG-CoA-Synthase-Promoter, fusioniert an CAT, wird zu Vergleichszwecken eingeschlossen. Bei der Promoter-Element-Säule bezeichnet 2 die SEQ ID NO: 22,3 bezeichnet SEQ ID NO: 23 und 2* + 3 bezeichnet SEQ ID NO: 25.
§ -fache Regulation ist das Verhältnis von korrigierter CAT-Aktivität in der Abwesenheit von Sterolen, dividiert durch die korrigierte Aktivität in der Anwesenheit von Sterolen.
Die Zahl in Klammern bezeichnet die Zahl der unabhängigen Transfektionsstudien.
Mittelwert ± S. E. der angezeigten Anzahl an unabhängigen Transfektionsstudien.
Eine Nukleotid-für-Nucleotid-Mutationsanalyse von Repeat 2 wird graphisch in Fig. 3 gezeigt, und die Daten werden im Detail in Tabelle II zur Verfügung gestellt. Zu diesem Zweck wurde das Konstrukt K verwendet, das zwei Kopien des Wildtyp-Repeat 2 + 3 (SEQ ID NO: 24)-Elements enthält, kloniert in den E1b-CAT-Vektor als ein PstI-SalI-Insert. Bei diesem synthetischen Promoter ergaben die Punktmutationen im wesentlichen Alles-oder-nichts- Resultate. Dies ermöglichte die Identifizierung einer Sequenz von 10 Nukleotiden, SEQ ID NO: 27, innerhalb von Repeat 2, SEQ ID NO: 22, von denen 9 für eine Hochniveau- Transkription in der Abwesenheit von Sterolen wesentlich war. Die einzige Ausnahme war das sechste Nukleotid innerhalb dieser Sequenz, nämlich das zweite C in dem CCCC- Tetramer. Ein Ersatz dieses C durch ein G beeinflußte die Transkription nicht. Dieses Nukleotid ist ein A im Wildtyp-Hamster-Repeat-2-Element, SEQ ID NO: 20 (Bishop, 1992), das bei der Transkription voll aktiv ist (Plasmid AD, Tabelle II). Mit dieser einzigen Ausnahme reduzierte die Mutation von jedem einzelnen Nukleotid innerhalb des SRE-1 die Transkription in der Abwesenheit von Sterolen in starker Weise, beeinflußte aber nicht die konstitutive Transkription in der Anwesenheit von Sterolen. TABELLE II Sterol-vermittelte Regulation von E1b-TATA-CAT-Genen, enthaltend einzelne Punktmutationen in Repeat 2 des LDL-Rezeptor-Promoter in transfizierten CV-1-Zellen
CV-1-Zellen wurde vorübergehend mit 12,5 ug des angezeigten Plasmids, enthaltend 2 Kopien der Repeat-2+3-Sequenz transfiziert, wobei jede Kopie von Repeat 2 die angezeigte Punktmutation trägt, zusammen mit 7,5 ug pCMV-ßGAL. Nach der Inkubation für 48 Stunden in der Abwesenheit oder Anwesenheit von 10 ug/ml Cholesterin plus 1 ug/ml 25- Hydroxycholesterin wurden die Zellen für eine zweimalige Messung der CAT- und β- Galactosidase-Aktivitäten geerntet, wie in "Materialien und Methoden" beschrieben. Korngierte CAT-Aktivitäten wurden berechnet, wie in der Legende zu Tabelle I beschrieben, und als Wert "% der Wildtyp-Kontrolle", der in dersE1ben Studie erhalten wurde, ausgedrückt.
§ -fache Regulation ist das Verhältnis von korrigierter CAT-Aktivität in der Abwesenheit von Sterolen, dividiert durch die korrigierte CAT-Aktivität in der Anwesenheit von Sterolen.
Mittelwert ± S. E. der angezeigten Zahl an Transfektionsstudien.
Die Zahl in Klammern zeigt die Anzahl der unabhängigen Transfektionsstudien an.
* Plasmide AD und AE enthalten jede mutante-Repeat-2-Sequenzen, die dem Wildtyp- Repeat-2 des LDL-Rezeptor-Promoter in den Hamster-(Bishop, 1992) bzw. Mausgenen entsprechen. Die Sequenzen von Plasmiden K bis AE* werden als SEQ ID NO: 1-21 bezeichnet.
Die vorliegenden Erfinder identifizierten dann ein Protein in Rattenleber-Kernextrakten, das an SRE-1 auf eine Weise bindet, die von jedem der 9 Nukleotide abhängt, die für eine Transkriptionsaktivität erforderlich sind. Um ein klares Resultat zu erhalten wurde der Rattenleber-Kernextrakt einer Ionenaustauschchromatographie auf S-Sepharose und Gelfiltration auf Superdex unterzogen, wie im Detail hier unten beschrieben (Beispiel 2). Die aktiven Fraktionen von der Superdex-Säule wurden vereinigt und auf die Spezifität der DNA-Bindung unter Verwendung von Gel-Retardations-Assays getestet.
Fig. 4 zeigt, daß die partiell aufgereinigte Rattenleber-Kernextraktfraktion eine Aktivität enthielt, die die Migration von radioaktiv markiertem Oligonukleotid verzögerte, das aus zwei Tandem-Kopien der Repeat-2+3-Sequenz bestand (SEQ ID NO: 24). Die Bindung wurde merkbar reduziert, wenn irgendeines der 9 essentiellen Nukleotide innerhalb des SRE-1 mutiert wurden. Die Mutation des Nukleotids an Position 6 beeinflußte diese Gelshift-Aktivität nicht. Die Mutation irgendeines der Nukleotide, die das SRE-1 flankierte, reduzierte die Bindung in nicht merkbarer Weise. Diese Resultate entsprachen vollständig den für die in-vivo- Transkription erhaltenen Resultate, wie in der oberen Tafel von Fig. 4 gezeigt.

C. Diskussion

Im vorliegenden Beispiel wurden künstliche Promoter konstruiert, die vielfache Kopien der Repeat-Sequenzen von dem LDL-Rezeptor-Promoter enthielten, zur Verwendung bei transienten Transfektionsassays, um genau die Nukleotide zu bestimmen, die für eine Sterol-empfindliche Transkription auf hohem Niveau erforderlich sind. Die Resultate zeigen an, daß ein Segment aus 10 Nukleotiden innerhalb des 16-bp-Repeat-2-Elements, SEQ ID NO: 22, die Sterol-empfindliche Transkriptionsaktivität enthält. Die Mutation von irgendeinem der 9 Nukleotide innerhalb dieser Sequenz reduziert die Transkriptionsaktivität des SRE-1 in merkbarer Weise. Die einzige Ausnahme war das Nukleotid an Position 6 (das zweite C in den CCCC-Tetramer).
Repeat 2, SEQ ID NO: 22 sE1bst hatte keine nachweisbare Transkriptionsaktivität, sogar wenn es in fünf Kopien vorhanden war. Wenn jedoch eine dieser Kopien durch eine einzelne Kopie von Repeat 3, SEQ ID NO: 23, ersetzt wurde, trat eine signifikante Sterol-empfindliche Transkription auf. Eine einzelne Kopie von Repeat 3, SEQ ID NO: 23, alleine hatte praktisch keine Transkriptionsaktivität, sowohl in der Abwesenheit als auch Anwesenheit von Sterolen. Diese Daten stimmen mit früheren Daten überein, die zeigen, daß Repeat 2 mit Repeat 3 bei der Förderung der Transkription zusammenwirkt, aber nur in der Abwesenheit von Sterolen (Smith et al., 1990; Sudhofet al., 1987; Dawson et al., 1988).
Bei dem nativen LDL-Rezeptor-Promoter, grenzen Repeats 2 und 3 unmittE1bar aneinander. Wenn Konstrukte erzeugt wurden, die zwei Kopien von Repeat 2 + 3 enthielten, SEQ ID NO: 24, in Tandem, wuchs die Sterol-empfindliche Transkription an, wenn die Anzahl der Repeat-2- und -3-Element-Einheiten anstieg. Bei den Mutagenesestudien wurde das Konstrukt, das zwei Kopien der Repeat-2+3-Sequenz enthielt, verwendet, das die Demonstration ermöglichte, daß Sterol-abhängige Transkription in-vivo jedes Nukleotid in dem 10-bp-SRE-1 erfordert, mit der Ausnahme eines Cytosins. Unter Verwendung von Gel-Retardations-Assays wurde eine Aktivität bei Rattenleber-Kernextrakten identifiziert, die mit der SRE-1-Sequenz eine Bindung auf eine Weise einging, die von jedem der 9 Nukleotide abhing, die für die Transkription erforderlich waren. Auffallenderweise hing die Bindung dieses Proteins nicht von dem Nukleotid in der 6. Position ab, d. h. dem zweiten C in dem CCCC-Tetramer. Dies war ebenso das einzige Nukleotid, dessen Austausch ohne Verlust der Transkriptionsaktivität toleriert werden konnte. Die Genauigkeit dieser Korrelation macht es hochwahrscheinlich, daß die DNA-Bindungsaktivität in den Ratten-Kernextrakten diejenige ist, die für die Sterolempfindliche Transkription erforderlich ist.
Das Ziel dieses Beispiels war es, eine Reihe von Sonden mit einzelnen Punktmutationen in der SRE-1-Sequenz zu erzeugen, die die Sterol-regulierte Transkription unterdrückte und verwendet werden konnte, um physiologisch relevante Kern-Bindungsproteine nachzuweisen. Die vorliegenden Erfinder versuchten nicht, alle möglichen Nukleotide nachzuweisen, die als Ersatz für die nativen ohne Funktionsverlust dienen könnten. Die Resultate dieser Mutagenese-Studien sind mit früheren Studien vollständig übereinstimmend, bei denen Punktmutationen im nativen LDL-Rezeptor-Promoter gemacht wurden (Smith et al., 1990). Die früheren Studien verwendeten CHO-Zellen, die mit rekombinanten Plasmiden permanent transfiziert wurden, die den nativen LDL-Rezeptor-Promoter enthielten. Diese Studien beschrieben diesE1be 10-bp-Sequenz, die in dieser Studie identifiziert wurde. Sie zeigten ebenso, daß eine Umwandlung an Position 6 (Mutation C zu A) die Transkriptionsaktivität konservierte. Jedoch waren die -fachen Veränderungen bei der Transkription in der Abwesenheit und Anwesenheit von Sterolen niedriger in der früheren Studie, und mehrere Mutationen erzeugten dazwischenliegende Effekte. Diese Probleme wurden bei der gegenwärtigen Studie durch die Verwendung eines synthetischen Konstrukts, enthaltend zwei Kopien der Repeat-2+3-Einheit, SEQ ID NO: 24, und durch die Verwendung von transienten Transfektionsassays vermieden, die eine größere Regulationsamplitude und Alles-oder-nichts-Effekte der Mutationen ergaben.
Es war notwendig, die detaillierte Analyse der in diesem Beispiel beschriebenen Nukleotid- Erfordernisse für die Transkriptionsaktivität durchzuführen, wegen der früheren Schwierigkeit, auf die man beim Identifizieren eines DNA-Bindungsproteins stieß, das mit einer SRE-1- abhängigen Transkription korrelierte. Kernextrakte enthalten viele im Überfluß vorhandene DNA-Bindungsproteine, die die elektrophoretische Mobilität von Oligonukleotiden, die die SRE-1-Sequenz enthalten, verschieben (Rajavashisth et al. 1989; Stark et al., 1992). Jedoch zeigen diese Proteine nicht die Spezifität der Bindung, die hier für einen echten Transkriptionsregulator definiert wird. Sobald die genauen Nukleotide identifiziert waren, wurde es möglich, andere Repeat-2-Bindungsproteine auszuschließen und sich auf die Aktivität zu konzentrieren, die in Fig. 4 gezeigt wird.

BEISPIEL 2

Die Aufreinigung von SREBP bis zur Homogenität aus den Kernen von menschlichen HeLa-Zellen

Das vorliegende Beispiel beschreibt die Aufreinigung von SREBP aus den Kernen von menschlichen HeLa-Zellen bis zu einer apparenten Homogenität.

A. Materialien und Methoden

1. Materialien. SP-Sepharose, CNBr-aktivierte Sepharose 4B, eine vorgepackte Superdex-200-26/60-Gelfiltrationssäule und die zur PCT verwendeten Nukleotide wurden von Pharmacia LKB Biotechnology, Inc erhalten; Molekulargewichtsmarker und Silver Stain Plus Kit waren von Bio-Rad; Nonidet P-40 von Pierce Chemical Co.; 5'-Brom-dUTP und Joklikminimum-essential-Medium von Sigma Chemical Co; DNaseI (DPFF-Qualität) von Worthington Biochemical Corp.; Micrococcus-Nuclease von Boehringer Mannheim; und aufgereinigter menschlicher Spl von Promega. Die anderen Materialien wurden von den in Beispiel 1 beschriebenen Quellen erhalten.
2. Zellkultur. Menschliche HeLa-53-Zellen (erhalten von B. Johnson und R. Tjian, University of California, Berkeley, CA) wurden in Spinkultur auf eine Dichte von ~2,5-5 X 10&sup5; Zellen/ml in 4-Liter Spin-Kolben in Joklikminimum-essential-Medium wachsen gelassen, enthaltend 5% (v/v) Neugeborenen-Kälbchen-Serum, 100 U/ml Penicillin und 100 ug/ml Streptomycinsulfat. Die Zellen wurden in ein gleiches Volumen frisches vollständiges Medium alle 24 Stunden aufgetrennt. Am Tag vor der Ernte wurden die Zellen in ein gleiches Volumen Medium ohne Serum aufgetrennt, so daß die Endkonzentration an Neugeborenen- Kälbchen-Serum 2,5% war. Von den gesamten HeLa-Zellen, die bei den gegenwärtigen Studien verwendet wurden, wurde eine Hälfte von dem National Cell Culture Center (Minneapolis, MN) gekauft, und die andere Hälfte wurde in dem Labor der Erfinder wachsengelassen. HeLa-Zellen, die von dem National Cell Culture Center erhalten wurden, wurden über Nacht als ein verpacktes Pellet auf Eis verschickt und innerhalb einer Stunde nach der Ankunft verarbeitet. Pilotstudien zeigten, daß die SREBP-Aktivität in diesen Zellen ähnlich derjenigen in HeLa-Zellen war, die in dem Labor der Erfinder wachsengelassen worden waren.
3. Herstellung von DNA-Affinitäts-Säulen. DNA-Affinitäts-Säulen wurden unter Verwendung von etablierten Verfahren hergestellt (Briggs et al., 1986; Kadonaga und dTjian, 1986), bei denen multimerisierte doppelsträngige Oligonukleotide an CNBr-aktivierte Sepharose 4B gekoppelt wurden. Säule A enthält ein multimerisiertes Oligonukleotid, wobei jedes Monomer aus einer Kopie eines mutanten Repeat 2 mit einer scrambled SRE-1-Sequenz (unterstrichen), gefolgt von einer Kopie eines Wildtyp-Repeat-3 (Südhof et al., 1987), besteht. Jedes Repeat-2+3-Element wird von einem 4-bp-Linker (TCGA) flankiert. Die beiden Sequenzen, die die Säule A umfassen, werden als SEQ ID NO: 31 bzw. 32 bezeichnet. Säule B enthält ein multimerisiertes Oligonukleotid, das von einem TCGA-Linker flankiert wird. Jedes Monomer besteht aus zwei Tandemkopien einer Wildtyp-Repeat-2-Sequenz, außer einer einzelnen bp-Veränderung (C T) in der 3'-Region, die die SRE-1-Sequenz flankiert (unterstrichen). Diese bp-Veränderung war darauf angelegt, ein kontaminierendes Protein, das mit der flankierenden Sequenz eine Bindung einging, zu eliminieren. Die beiden Sequenzen, die die Säule B umfassen, werden als SEQ ID NO: 33 bzw. 34 bezeichnet. Säule C enthält ein multimerisiertes Oligonukleotid, wobei jedes Monomer nur aus der 10-bp-SRE-1-Sequenz besteht, flankiert von einem 4-bp-Linker (CTAG). Die Sequenzen, die die Säule C umfassen, werden als SEQ ID NO: 35 bzw. 36 bezeichnet. Die drei doppelsträngigen Oligonukleotide, die zur Multimerisierung verwendet werden, haben die folgenden Sequenzen (repräsentiert durch SEQ ID NO: 31 bis SEQ ID NO: 36):
SäuleA 5'-TCGACAAAAgataagatatGCAAACTCCTCCCCCTGCG-3 - (31)
3'-GTTTTctattctataCGTTTGAGGAGGGGGACGCAGCTS (32)
Säuleß 5'-TCGACAAAATCACCCCACTGTAAAATCACCCCACTGTG-3 (33)
3'-GTTTTAGTGGGGTGACATTTTAGTGGGGTGACACAGCT-5 - (34)
SäuleC 5'-GATCATCACCCCACTG-3'- (35)
3'-TAGTGGGGTGACCTAG-5' (36)
4. Aufreinigung des SRE-1-Bindeproteins (SREBP). Eine typische Aufreinigung wird beschrieben. Alle Schritte wurden bei 4ºC durchgeführt.
Schritt 1: Kernextrakte - Kernextrakte aus 75-100 Litern HeLa-53-Zellen (4-5 · 10¹&sup0; Zellen) wurden gemäß Dignam, et al. (1983) mit zwei Modifizierungen hergestellt. Erstens wurden die Kerne mit Puffer A extrahiert (20 mM Hepes-KOH, pH 7,6, 25% (v/v) Glycerin, 0,5 M NaCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 1 mM Natrium-EDTA, 1 mM Natrium-EGTA und 0,5 mM DTT), supplementiert mit Protease- und Phosphatase-Inhibitoren (0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 5 ug/ml Pepstatin A, 10 ug/ml Leupeptin, 2 ug/ml Aprotinin, 1 mM Natrium-β- Glycerolphosphat, 5 mM Natriumfluorid und 1 mM Natriummolybdat). Zweitens wurde nach Extraktion in Puffer A der Kernextrakt bei 24.000 rpm für 3 Stunden in einem AH-629-Rotor (Du Pont Sorvall) zentrifugiert, und der 1,03 · 10&sup5; g Überstand wurde zur weiteren Aufreinigung verwendet.
Schritt 2: SP-Sepharose-Chromatographie - Der 1,03 · 10&sup5; g Überstand (1 g Protein) wurde mit 3 Volumina Puffer B verdünnt (25 mM Hepes-KOH, pH 7,5, 12 mM MgCl&sub2;, 10% Glycerin, 1 mM Natrium-EDTA, 1 mM Natrium-EGTA, 0,5 mM DTT), supplementiert mit Protease- und Phosphatase-Inhibitoren (siehe oben) und auf eine SP-Sepharose-Säule (100 ml-Bettvolumen) aufgebracht, die mit Puffer B äquillibriert worden war, enthaltend 0,1 M KCl. Die Säule wurde mit 2,5 Volumina Puffer B mit 0,1 M KCl gewaschen und mit 2 Volumina Puffer B mit 0,3 M KCl eluiert.
Schritte 3 und 4: Ammoniumsulfatfraktionierung und Gelfiltrations-Chromatographie -Festes Ammoniumsulfat wurde dem SP-Sepharose-0,3-M KCl-Eluat (480 mg Protein) zugegeben, um eine 40% Sättigung zu erreichen, und die Mischung wurde für 3 Stunden rotiert. Der Ammoniumsulfat-Niederschlag wurde zentrifugiert (32.000 · g für 15 Minuten), resuspendiert in 25 ml Puffer B und in zwei Aliquots aufgeteilt. Jedes Aliquot wurde auf eine Superdex-200-26/60-Gelfiltration-Säule (330 ml Bettvolumen) unter Verwendung eines Fast Protein Liquid Chromatography-System (FPLC, Pharmacia Biotechnology, Inc.) geladen. Die Säule wurde äquillibriert und in Puffer B eluiert, enthaltend 0,15 M KCl. Nach einer Elution von 90 ml wurden einzelne Fraktionen von 4 ml gesammelt. Die SREBP-Aktivität wurde typischerweise in den Fraktionen 9-13 gefunden, die vereinigt, in flüssigem Stickstoff gefroren und bei -80ºC für 1-7 Tage gelagert wurden.
Schritte 5 und 6: Erste DNA-Affinitätschromatographie - Die aktiven Fraktionen von 12 separaten Superdex-Zubereitungen (die 6 unterschiedliche Kernextraktzubereitungen darstellen) wurden aufgetaut und vereinigt (498 mg Protein in 240 ml), wonach Natrium-EDTA (5 mM) und Natriummolybdat (10 mM) zugegeben wurden, um die angezeigte Endkonzentration zu erreichen. Die Mischung wurde auf eine 20-ml-DNA-Affinitätssäule geladen, die eine mutante Version von Repeat 2 + ein Wildtyp-Repeat-3 enthielt (Säule A, SEQ ID NO: 31 und 32, siehe oben). Der Durchfluß, enthaltend SREBP-Aktivität, wurde gesammelt und Natriumpoly(dI-dC)·Poly(dI-dC) (Pharmacia; durchschnittliche Länge 1332 bp) wurde zugegeben, um eine Endkonzentration von 40 ug/ml zu erhalten. Nach der Inkubation auf Eis für 10 Minuten wurde die Mischung in sechs Aliquots aufgeteilt, von denen jedes auf eine 1 ml-DNA- Affinitätssäule geladen wurde, die Tandemkopien von Repeat 2 enthielt (Säule B, SEQ ID NO: 33 und 34). Die Säulen wurden jede mit 30 Säulenvolumina Puffer B gewaschen, enthaltend 0,3 M KCl und 0,1% (v/v) Nonidet P-40 (NP-40) und mit Puffer B mit 1 M KCl plus 0,1% NP-40 eluiert.
Schritte 7 und 8: Repeat-DNA-Affinitätschromatographie - Die aktiven Fraktionen aus dem Eluat von Schritt 6 (1,7 mg Protein in 18 ml) wurden vereinigt und über Nacht gegen Puffer B dialysiert, enthaltend 0,15 M KCl und 0,1% NP-40. Nach der Dialyse wurden Natrium-EDTA und Natriummolybdat zugegeben, um Endkonzentrationen von 5 mM bzw. 10 mM zu erreichen. Das Protein wurde dann auf zwei sequentielle 2-ml-DNA-Affinitäts-Säulen, enthaltend eine mutante Version von Repeat 2 + einem Wildtyp-Repeat-3, geladen (Säule A, SEQ ID NO: 31 und 32). Die Durchflußfraktionen wurden gesammelt, und Poly(dIdC)·Poly(dIdC) wurde auf eine Endkonzentration von 40 ug/ml zugegeben. Nach der Inkubation auf Eis für 10 Minuten wurde die Mischung auf eine 1-ml-DNA-Affinitätssäule geladen, die nur den SRE-1-Teil von Repeat 2 enthielt (Säule C, SEQ ID NO: 35 und 36). Die Säule wurde mit 30 Säulenvolumina Puffer B gewaschen, enthaltend 0,3 M KCl und 0,1% NP-40, und schrittweise mit 1 ml-Aliquots von Puffer B eluiert, enthaltend 0,1% NP-40 und Konzentrationen von NaCl, die von 0,4 M auf 1,0 M in Inkrementen von 0,1 M anstiegen.
Schritt 9: Glycerin-Gradientensedimentation - Die aktiven Fraktionen aus Schritt 8 (0,5 M - 0,7 M NaCl-Schritt-Elutionen) wurden vereinigt, und ein 0,2 ml-Aliquot der 3 ml-vereinigten Fraktion wurden auf einen 4,5 ml 10%-30% (v/v) Glycerin-Gradienten geladen, enthaltend 25 mM Hepes, 12 mM MgCl&sub2;, 5 mM Natrium-EDTA, 0,6 M NaCl, 1 mM DTT und 0,1% NP-40 bei pH 7,5. Der Gradient wurde in einem SW-60-Rotor (Beckman) bei 55.000 rpm für 15 Stunden zentrifugiert. Es wurden Fraktionen von 0,45 ml von oben gesammelt.
5. Gel-Mobilitäts-Shift-Assay. PCR-Sonden, enthaltend Kopien von Wildtyp- und mutanten Repeat 2 + 3-Elementen (SEQ ID NO: 28 und 29) wurden hergestellt und für Gel-Mobilitäts- Shift-Assays verwendet, wie in Beispiel 1 beschrieben. Wenn nicht andersartig festgestellt, wurden Gele einem Kodak-XAR-Film bei -80ºC für die angezeigte Zeit mit Verstärkungsschirmen ausgesetzt. Die SREBP-Aktivität wurde durch Scannen des Gels für 15 Minuten auf dem Ambis-100-Radioanalytic-Imaging-System quantifiziert. Jede Aktivitätseinheit entspricht 1.000 cpm einer Sonde, die eine Verschiebung (Shift) durchlaufen hat.
6. UV-Quervernetzung. Das allgemeine Protokoll, beschrieben von Chodosh et al. (1986) wurde befolgt. Die ³²P-markierten Sonden, die zur UV-Quervernetzung verwendet wurden, wurden auf diesE1be Weise hergestellt, wie diejenigen, die für den Gel-Mobilitäts-Shift-Assay verwendet wurden, außer daß 5'-Brom-dUTP gegen dTTP in der PCR-Reaktion ausgetauscht wurde. Die DNA-Bindungsreaktion wurden in einem 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen in einem Endvolumen von 0,1 ml durchgeführt, enthaltend 60 fmol ³²P-markierter Sonde (5 · 10&sup5; cpm), ~4 ug partiell aufgereinigtes SREBP (1 M KCl Eluat aus Schritt 6, das gegen Puffer B, enthaltend 0,15 M KCl und 0,1% NP-40, dialysiert worden war), und diesE1ben Pufferbestandteile, die in dem Gel-Mobilitäts-Shift-Assay verwendet wurden. Die Sonden wurden unmittE1bar vor den Reaktionen hergestellt.
Nach Inkubation für 20 Minuten bei Zimmertemperatur wurden die Eppendorf-Röhrchen auf Eis gelegt und einer UV-Lampe (254 nM) für 1 Stunde ausgesetzt, wonach ein 10 ul-Aliquot für einen Gel-Mobilitäts-Shift-Assay entnommen wurde. Bei den verbleibenden 90 ul wurde die Konzentration von MgCl&sub2; auf 10 mM eingestellt, CaCl&sub2; wurde auf 10 mM zugegeben, DNaseI wurde auf 736 Einheiten/ml zugegeben, und Micrococcus-Nuclease wurde auf 28 Einheiten/ml zugegeben. Jede Mischung wurde bei 37ºC für 25 Minuten inkubiert. Nach einem Nuclease-Verdau wurden die Proben mit 10% (w/v) Trichloressigsäure ausgefällt, mit kaltem Aceton gewaschen, in SDS-PAGE-Probenpuffer resuspendiert (Laemmli, 1970), auf ein 8% SDS-Polyacrylamid-Minigel geladen und zusammen mit Molekulargewichtsmarkern und aufgereinigtem SREBP laufengelassen. Das Gel wurde mit Silber gefärbt, getrocknet und einem Röntgenfilm ausgesetzt.
7. DNase-I-Footprinting. DNase-I-Footprinting wurde durchgeführt, wie von Briggs et al. (1986) beschrieben, mit den folgenden Modifizierungen. Die DNA-Bindungsreaktionen enthielten in einem Endvolumen von 50 ul 2 fmol eines einzelsträngigen, ³²P-endmarkierten DNA-Fragments (~10&sup4; cpm/Röhrchen), 12,5 mM Hepes-KOH (pH 7,5), 6 mM MgCl&sub2;, 5 mM Natrium-EDTA, 50 mM KCl, 0,25 mg/ml fettarme Trockenmilch (Marke Kroger), 20 ug/ml Poly d(I-C)·Poly d(I-C), 10% Glycerin, 0,5 mM DTT und die angezeigten Proteinfraktionen. Einzelne 5'-endmarkierte doppelsträngige DNA-Footprint-Sonden (239 bp), umfassend Repeat 2 + 3 aus Plasmiden K und X (SEQ ID NO: 24, Beispiel 1) wurden mittels sequentiellen Verdaus mit EcoRI, Behandlung mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm und T4- Polynukleotidkinase in der Anwesenheit von [γ-³²P]ATP, Verdau mit NdeI, und Gelaufreinigung hergestellt.
8. Andere Verfahren. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde durchgeführt, wie von Laemmli beschrieben (1970). Die Gele wurden mit SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese- Standard im hohen Bereich (Bio-Rad) kalibriert. Alle Proteingele wurden mit einem Silver Stain Plus Kit von Bio-Rad gefärbt. Die Gelfiltrationssäulen wurden kalibriert mit Gelfiltrations-Standardmarkern von Bio-Rad. Der Proteingehalt von allen Proben (außer Schritt 8) wurde mittels des Lowry-Verfahrens (1951) bestimmt. Der Proteingehalt von aufgereinigtem SREBP in Schritt 8 wurde mittels Silberfärbung und densitometrischem Scanning eines 8% SDS-Polyacrylamidgels abgeschätzt, bei dem bekannte Mengen (10 ng bis 1 ug) des bovinen- Serumalbumin-Bestandteils einer Bio-Rad-Standard-Proteinmischung als Bezug verwendet wurden.

B. Resultate

Obwohl die SREBP-Aktivität mit Gel-Mobilitäts-Shift-Assays in partiell aufgereinigten Extrakten von Rattenleber-Kernen sichtbar gemacht werden konnte, verlor das Protein während der Aufreinigung Aktivität, und es war nicht möglich, es aus dieser Quelle zu isolieren (Beispiel 1). Auf ähnliche Schwierigkeiten stieß man mit Kernen aus Lebern von Hamstern, Kaninchen und Kühen. Auf der anderen Seite war das Protein aus menschlichen HeLa- Zellkernen stabil und wurde aus Kulturen dieser Zellen in großem Maßstab isoliert.
Fig. 5 zeigt die Resultate von Gel-Mobilitäts-Shift-Assays von SREBP in Extrakten von HeLa-Zellkernen, die sequenziellen Fraktionierungsprozeduren unterzogen wurden. Als ein Routmetest für die Spezifität während der Aufreinigung verwendeten wir einen Satz von drei ³²P-markierten Sonden. Sonde H besteht aus zwei Tandem-Kopien der menschlichen Repeat- 2+3-Sequenz, SEQ ID NO: 24, und sie erzeugt eine regulierte Transkription, wenn in HeLa- Zellen transfiziert (Fig. 5, rechte Tafel). Sonden M und * bestehen ebenso aus zwei Tandem- Kopien der Repeat-2+3-Sequenz, aber sie unterscheiden sich von der menschlichen Sequenz an einer Position innerhalb des SRE-1 (das C, das sich am meisten 3' befindet) in beiden Kopien von Repeat 2, SEQ ID NO: 14 und 21. Sonde M enthält ein T an dieser Position, was der Wildtyp-Maus-LDL-Rezeptor-Repeat-2-Sequenz entspricht und in HeLa-Zellen (Fig. 5) und in kultivierten CV-1-Zellen von Affen (Beispiel 1) transkriptionell aktiv ist. Bei Sonde * wird dassE1be 3'-C durch ein A in beiden Kopien des Repeat 2 ersetzt. Diese Mutation inaktiviert die Funktion von Repeat 2 in HeLa-Zellen (Fig. 5) und CV-1-Zellen (Beispiel 1).
In rohen Kernextrakten konnten Gel-Mobilitäts-Shift-Assays keine Bande mit einem Shift aufzeigen, die bei den Sonden H und M, aber nicht bei * erschien, was das Kriterium für Spezifität war (Fig. 5, linke Tafel). Auf ähnliche Weise wurde keine solche Aktivität in einer Fraktion von einer SP-Sepharose-Anionenaustauschsäule gefunden, von der darauffolgend gezeigt wurde, daß sie SREBP-Aktivität enthält (Fig. 5). Wenn diese Fraktion jedoch mit 40% Amoniumsulfat ausgefällt wurde, wurde eine Spur spezifischer Bindungsaktivität beobachtet, d. h. es gab zwei Banden mit Shifl (bezeichnet mit Pfeilen in Fig. 5), die geringfügig intensiver bei den Wildtyp-Sonden (H und M) waren, als sie bei der mutanten Sonde * waren. Ein ähnlicher Hinweis auf die Spezifität wurde bei bestimmten Säulenfraktionen beobachtet, wenn der Ammoniumsulfatniederschlag einer Superdex-Gelfiltrationschromatographie unterzogen wurde (Fig. 6). Die aktiven Fraktionen von der Superdex-Säule wurden dann einer sequentiellen DNA-Affinitätschromatographie auf zwei Säulen unterzogen. Die erste Säule enthielt multimerisierte Kopien eines Oligonukleotids, bestehend aus einer mutierten, transkriptionell inaktiven Form von Repeat 2, angrenzend an Wildtyp-Repeat 3. Die Durchflußfraktion von dieser Säule wurde dann auf eine Säule adsorbiert, enthaltend vielfache Tandem- Kopien von Repeat 2, und mit einem Puffer, enthaltend 1 M KCl, eluiert. Das Eluat enthielt eine Aktivität, die mit den H- und M-Sonden eine starke Bindung eingingen, aber nicht nachweisbar mit der mutanten Sonde * (die letzten drei Spuren der linken Tafel aus Fig. 5) eine Bindung eingingen.
Fig. 6 zeigt Assays von SREBP, wie es aus der Superdex-Gelfiltrationssäule herauskam, was der erste Schritt war, zu dem die spezifische Bindungsaktivität klar sichtbar gemacht werden konnte. Die Peakfraktion (Nr. 11) war zwischen den 670-kDa- und 158-kDa-Markern an einer Position, die näherungsweise 500 kDa entspricht.
Fig. 7 zeigt die Resultate der DNA-Affinitäts-Chromatographie-Schritte. Das Ausgangsmaterial, das aus der Superdex-Säule stammte, enthielt die spezifische SREBP-Aktivität sowie ein kontaminierendes Protein, das mit der mutanten *-Sonde eine Bindung einging. Die spezifische SREBP-Aktivität kam in dem Durchfluß der ersten Säule heraus, der eine inaktive mutante Form von Repeat 2 in Tandem mit Wildtyp-Repeat 3 enthielt (SEQ ID NO: 31 und 32) (Fig. 7A). Wenn dieses Durchflußmaterial auf eine Säule aufgebracht wurde, die oligomerisiertes Repeat 2 enthielt, wurde die Bindungsaktivität adsorbiert und erschien nicht in dem 0,3 M-KCl-Eluat (SEQ ID NO: 33 und 34) (Fig. 7B). Sie wurde eluiert, wenn die KCl- Konzentration auf 1,0 M erhöht wurde. Dieses 1,0 M KCl-Eluat war frei von dem kontaminierenden Material, das mit der mutanten * -Sonde eine Bindung einging. Die Pfeile in Fig. 7B stellen Banden mit einem Shift dar, enthaltend das SREBP, gebunden an eine bzw. beide Kopien der Repeat -2-Sequenz in der Sonde.
Um die Aufreinigung des SREBP zu vervollständigen, wurde das 1,0 M-KCl-Eluat aus der Repeat 2 + 3-Säule auf eine andere Säule aufgebracht, enthaltend Oligomere des 10-bp-SRE- 1, flankiert nur von einem 4-bp-Linker, dessen Nukleotide sich von den flankierenden Nukleotiden in Repeat 2 unterschied (SEQ ID NO: 35 und 36). Diese Säule wurde schrittweise mit Aliquots von Lösungen eluiert, die 0,1 M-Inkremente NaCl von 0,4 M bis 1,0 M enthielten. Die Mobilitäts-Shifl-Assays zeigten, daß die Spitze der SREBP-Aktivität in Fraktion 6 (0,6 M NaCl), mit geringeren Mengen in den angrenzenden Fraktionen war. Alle diese Fraktionen wurden SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Silberfärbung unterzogen. Ein Cluster von Proteinbanden mit Molekülmassen zwischen 59 und 68 kDa eluierte zusammen mit der SREBP-Aktivität, die ihre Spitze in Fraktion 6 hatte (rechte Tafel von Fig. 8).
Tabelle III zeigt quantitative Abschätzungen der Resultate einer vollständigen Aufreinigung, ausgehend von Kernextrakt aus ~500 Litern HeLa-Zellen, die 6 g Protein enthielten. Wie in Fig. 5 gezeigt, konnte die SREBP-Aktivität aus frühen Fraktionen nicht geschätzt werden, aufgrund der Anwesenheit von kontaminierenden Proteinen, die mit der mutanten sowie der Wildtyp-Sonde auf Gel-Mobilitäts-Shift-Assays eine Bindung eingingen. Nach der Gelfiltrations-Chromatographie auf Superdex 200 (Schritt 4), wurden näherungsweise 500 mg Protein gewonnen, das näherungsweise 114.000 Einheiten SREBP-Aktivität enthielt. Jede Einheit wird als die Aktivität definiert, die 1.000 cpm der spezifischen Sonde unter den Standardbedingungen des Assays mit einer Verschiebung (Shift) versieht. Nach den vier DNA- Affinitätssäule-Schritten wurde die Menge an Protein um einen Faktor von mehr als 100.000 (auf 4 ug) mit einer Wiedergewinnungsrate von 31% der SREBP-Aktivität reduziert. Die gesamte berechnete Aufreinigung war näherungsweise 38.000-fach mit Schritt 4 als dem Ausgangspunkt. Tabelle III Aufreinigung von SREBP aus menschlichen HeLa-Zellen
Kernextrakte wurde aus ingesamt ~500 Litern HeLa-Zellen-Spin-Kultur (was 6 unterschiedliche Zubereitungen darstellt) hergestellt, wie in den "Materialien und Methoden" beschrieben. Die SREBP-Aktivität der Fraktionen wurde mit dem Standard-Gel-Mobilitäts-Shift-Assay bei zwei Proteinkonzentrationen getestet. Die Aktivität in den Fraktionen, die Schritten 1-3 stammen, nicht akkurat gemessen werden.
Tabelle III - Fortsetzung
Säule A enthält SEQ ID NO: 31 und 32; Säule B enthält SEQ ID NO: 33 und 34; und Säule C enthält SEQ ID NO: 35 und 36.
* Die Proteinkonzentration der verschiedenen Fraktionen wurde bestimmt, wie in "Materialen und Methoden" beschrieben.
Eine Aktivitätseinheit wird definiert, wie in "Materialien und Methoden" beschreiben. Eine Reihe von Studien wurden als nächstes durchgeführt, um zu bestätigen, daß die in der aufgereinigten Zubereitung gesehenen Banden tatsächlich SREBP darstellen. In einer solchen Studie wurden die aufgereinigten Proteine einer Ultrazentrifugation auf einem Glycerin- Gradienten unterzogen, und die Fraktionen wurden auf die SREBP-Aktivität (Fig. 9, links) und auf Proteingehalt mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Fig. 9, rechts) getestet. Die Spitze der SREBP-Aktivität wurde in Fraktion 3 gefunden, die ebenso den Cluster an Proteinen zwischen 59 und 68 kDa enthielt. Diese Position der Sedimentation entsprach einer Molekülmasse, die ein wenig geringer als die des Ovalbumin-Standard (44 kDa) war, dessen Peak in Fraktion 4 gefunden wurde.
Um die Hypothese der Erfinder weiter zu bekräftigen, wurde eine partiell aufgereinigte Zubereitung von SREBP mit einer ³²P-markierten SRE-1-Sequenz inkubiert, bei der Deoxythymidin durch 5-Bromdeoxyuridin ersetzt war. Nach Exponieren gegenüber ultraviolettem Licht und Verdau mit Nukleasen wurden die Proteine einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Ein Cluster an radioaktiv markierten Banden wurde in der Region von 59 bis 68 kDa (Fig. 10, Spur 3) gesehen, der genau der Wanderung des aufgereinigten SREBP in demsE1ben Elektrophoresesystem entsprach (Spur 6). Die Markierung wurde ebenso bei der M- Sonde gesehen (Spur 5), aber nicht mit der mutanten * -Sonde (Spur 4). Diese Resultate legen nahe, daß jedes der Proteine in dem 59-68 kDa-Cluster das SRE-1-Element auf eine spezifische Weise erkennt.
Um die Spezifität des SREBP im Hinblick auf seine DNA-Erkennungsstelle zu bestätigen, wurde das aufgereinigte SREBP Gel-Mobilitäts-Shift-Assays mit einem Satz von 16 mutanten Sonden unterzogen, die im Hinblick auf ihre Transkriptionsaktivität in Beispiel 1 charakterisiert wurden (Fig. 11). Das SREBP ging nur eine Bindung mit den Sonden ein, die bei der Transkription aktiv waren, einschließlich der Sonde, die ein G anstelle eines C an Position 6 des SRE-1 enthielt. Dieses Resultat bestätigt, daß das aufgereinigte SREBP eine Bindungsspezifität hat, die exakt mit der Transkriptionsaktivität des SRE-1-Element übereinstimmt (Beispiel 1).
DNaseI-Footprinting-Analyse zeigte daß das SREBP mit der SRE-1-Sequenz innerhalb von Repeat 2, SEQ ID NO: 27, eine Bindung einging, während Spl eine Bindung mit Repeat 3 (SEQ ID NO: 23) (Fig. 12, Spuren 1 und 2) einging. Die beiden Footprint-Regionen überlappten, wobei der Sp1-Footprint sich teilweise in Repeat 2 erstreckte. Wenn die SRE-1- Sequenz mutiert war, wurde der SREBP-Footprint unterdrückt, aber der Spl-Footprint wurde beibehalten (Fig. 12, Spuren 5 und 6).
Bei Gel-Mobilitäts-Shift-Assays erzeugte partiell aufgereinigtes SREBP zwei Banden mit Shift, wenn mit der ³²P-markierten Sonde inkubiert wurde, die zwei Tandem-Kopien der Repeat-2+3-Sequenz enthielt (Fig. 13A, Spuren 5-8). Wenn die Menge an SREBP erhöht wurde, wuchs die Menge der oberen Bande fortschreitend und die Menge der unteren Bande nahm entsprechend ab. Wenn die Sonde nur eine einzelne Kopie der Repeat 2 + 3-Sequenz enthielt, wurde nur die verschobene Bande geringerer Mobilität beobachtet (Spuren 1-4). Darüberhinaus war die untere Bande die einzige sichtbar gemachte, wenn eine Sonde, enthaltend alle drei Repeats in dem nativen LDL-Rezeptor-Promotor, verwendet wurde, die nur eine Kopie von Repeat 2 (Spuren 9-12) einschließt. Die vorliegenden Erfinder schlußfolgerten, daß die untere Bande SREBP, gebunden an eine Kopie von Repeat 2, repräsentiert, und daß die obere Bande die Bindung an zwei Kopien darstellt.
Wenn eine Sonde, die eine Kopie der Repeat-2+3-Sequenz enthielt, verwendet wurde, erzeugten steigende Mengen an aufgereinigtem SREBP nur eine verzögerte Bande (Fig. 13B, Spuren 1-4) wie in Fig. 13A. Aufgereinigtes Sp1 produzierte eine ähnliche Bande (Spur 5 in Fig. 13B). Die Zugabe von steigenden Mengen an aufgereinigtem SREBP in der Anwesenheit von Spl erzeugte steigende Mengen einer zweiten Bande mit geringerer Mobilität (Spuren 6-8), was darauf hinweist, daß Sp1 und SREBP beide an das Oligonukleotid binden. Wenn die Repeat-3-Sequenz mutiert wurde, um die Sp1-Bindungsstelle zu zerstören, ging die Sonde immer noch eine Bindung mit SREBP ein (Spuren 9-12), aber sie ging keine Bindung mit Spl ein (Spur 13). In der Anwesenheit von beiden Proteinen erzeugte die mutante Sonde nur die einzelne verzögerte Bande, die der Bindung von SREBP entsprach (Spuren 14-16). Diese Daten bestätigen, daß SREBP die SRE-1-Sequenz in Repeat 2, SEQ ID NO: 27, in der Abwesenheit von jeglichem Beitrag von Repeat 3, SEQ ID NO: 23 erkennen kann, und daß die Bindung von Spl und SREBP additiv sind.
Während des Verlaufs dieser Studien schien SREBP die Bindungsaktivität in den Mobilitäts- Shift-Assays zu verlieren, während das Protein stärker aufgereinigt wurde. Dieser Verlust war besonders dramatisch nach den ersten zwei DNA-Affinitätssäulenschritten. Dieser Verlust konnte durch Einschluß einer Vielzahl von Proteinen in dem Assay-Gemisch verhindert werden, das für die Mobilitäts-Shift-Assays verwendet wurde. Das wirksamste Mittel bestand aus einer Zubereitung von bovinen Proteinen aus fettarmer Milch, was häufig verwendet wird, um eine nicht-spezifische Bindung auf Nitrozelluloseprotein-Blots zu verhindern. Fig. 14 zeigt, daß partiell aufgereinigtes SREBP keine nachweisbare Bandenverschiebungsaktivität verursachte, wenn in der Abwesenheit von Milchproteinen getestet. Eine Erhöhung der Konzentration von Milchproteinen von 0,3 auf 20 ug/Röhrchen (0,015 bis 1 mg/ml) verursachte ein fortschreitendes Ansteigen in der Bindungsaktivität. Die Milchproteine hatten keine Bindungsaktivität in der Abwesenheit von SREBP. Vergleichbare Konzentrationen an bovinem Serumalbumin hatten einen sehr geringen stimulatorischen Effekt auf SREBP (Fig. 14).
Zusätzlich zu den Milchproteinen stimulierten mehrere andere Proteine die SREBP-Aktivität, wenn bei 250 ug/ml getestet. Diese schlossen bovines Milchcasein, Thyreoglobulin, Fetuin, Asialofetuin, bovines Submaxilla-Mucin (Typ I), fötales Kälberserum und die Lipoproteindefiziente Fraktion von neugeborenem Kälberserum ein. Zusätzlich zu bovinem Serumalbumin schlossen andere Proteine, denen eine stimulatorische Aktivität fehlte, menschliches IgG, bovines Milch-Lactalbumin und bovines Milch-Lactoglobulin ein, wenn bei 250 ug/ml getestet.

C. Diskussion

Die Wichtigkeit der Repeats 1, 2 und 3 bei der Transkription wurde zuerst 1987 anhand von Linker-Scanning-Mutagenese-Studien mit dem LDL-Rezeptor-Promoter demonstriert (Südhofet al., 1987). Mutationen in irgendeiner der drei 16-bp-Sequenzen unterdrückte eine Hochniveau-Transkription in der Abwesenheit von Sterolen. Repeats 1 und 3 wurden Funktionen beim Binden von Sp1 zugeordnet, auf der Grundlage ihrer Konformität mit der Konsensus-Erkennungssequenz für diesen Faktor und ihrer demonstrierten Fähigkeit, Sp1 in vitro zu binden (Dawson et al., 1988). Repeat 2 entsprach diesem Konsensus nicht, und es ging keine Bindung mit Spl ein. Wenn in heterologe Promoter eingeführt, erhöhte Repeat 3 die Transkription konstitutiv in der Abwesenheit oder Anwesenheit von Sterolen, insbesondere wenn in mehrfachen Kopien vorhanden (Dawson et al., 1988). Repeat 2 hatte eine Enhancer- Aktivität nur dann, wenn die Zellen in der Abwesenheit von Sterolen inkubiert wurden und nur, wenn es zusammen mit Repeat 3 oder einer Sp1-Bindungsstelle vorhanden war, die durch den heterologen Promoter bereitgestellt wurde (Smith et al., 1990; Dawson et al., 1988). Dies führte zu der Hypothese, daß Repeat 2 einen bedingten Enhancer enthält, der die Aktivität von Repeat 3 erhöht, aber nur in Sterol-verarmten Zellen (Goldstein und Brown, 1990; Smith et al., 1990). Die Natur des vermeintlichen Sterol-regulierten Proteins, das Repeat 2 erkennt, war nicht geklärt worden, trotz intensiver früherer Anstrengungen (Rajavashisth et al., 1989; Stark et al., 1992).
Studien an Punktmutanten offenbarten, daß die aktive Sequenz innerhalb von Repeat 2 ein 10- bp-Segment ist, bezeichnet als SRE-1, SEQ ID NO: 27 (Smith et al., 1990; Beispiel 1). Im vorliegenden Beispiel ist ein Proteinfaktor aufgereinigt worden, bezeichnet als SREBP, der spezifisch an das SRE-1 in einer Weise bindet, die genau mit den Nukleotid-für-Nukleotid- Erfordernissen für die in Beispiel 1 definierte Sterol-regulierte Transkription korreliert. Auf der Grundlage dieser weitreichenden Korrelation glauben die Erfinder, daß SREBP die konditionelle Enhancer-Aktivität von SRE-1 vermittelt.
Die Identifizierung und Aufreinigung von SREBP waren besonders schwierig, weil der Faktor in Spuren vorhanden ist, und weil Kernextrakte mehrere im Überfluß vorhandene Proteine enthalten, die an Oligonukleotide binden, die diese Sequenz enthalten, was die Bindung von SREBP verschleiert (Fig. 5). Diese im Überfluß vorhandenen Proteine sind nicht bei der regulierten Transkription beteiligt, weil sie an Oligonukleotide binden, die Punktmutationen enthalten, von denen bekannt ist, daß sie SRE-1 inaktivieren (Smith et al., 1990; Beispiel 1). Nach vielen Herumprobieren fanden die Erfinder, daß das Paar von Mutanten, die als M und * bezeichnet wurden, die am stärksten unterscheidenden waren. Diese enthalten ein T bzw. A anstelle des C, das in dem SRE-1 am weitesten 3' ist. Die T-enthaltende Sequenz, die der nativen SRE-1-Sequenz in der Maus entspricht, ist bei der Transkription aktiv, während die Aenthaltende Sequenz inaktiv ist (Beispiel 1).
Sogar mit diesem Satz von drei unterscheidenden Oligonukleotiden wurden die ersten Aufreinigungsschritte auf eine blinde Weise durchgeführt, ohne in der Lage zu sein, auf spezifische Bindung zu testen. Das empirische Aufreinigungsschema, das letztendlich verwendet wurde, beruhte auf Erkenntnissen, die während des Aufspürens mehrerer kontaminierender Proteine gewonnen wurden, die mit Repeat 2 auf eine Weise eine Bindung eingingen, die nicht mit der physiologischen Funktion korrelierte. Jetzt, da das SREBP identifiziert und aufgereinigt worden ist, sollte es möglich sein, das Aufreinigungsschema zu verfeinern und wirkungsvoller zu machen, insbesondere wenn Antikörper gegen SREBP zur Verfügung stehen. Darüberhinaus sind, wie in Beispiel 3 detailliert ausgeführt, da jetzt die vorliegenden Erfinder die cDNA für SREBP-1 erhalten haben, eine Vielzahl an besonders effizienten Verfahren zu seiner Herstellung in einer rekombinanten Form verfügbar.
Die endgültige Herstellung von SREBP, aufgereinigt mehr als 38.000-fach, enthält einen Cluster an Proteinbanden zwischen 59 und 68 kDa, die an das SRE-1 auf eine spezifische Weise binden, wie durch die Quervernetzungsstudie angezeigt (Fig. 10). Es ist möglich, daß alle dieser Banden ein einzelnes Protein repräsentieren, das entweder vielfachen kovalenten Modifikationen unterliegt, wie etwa Phosphorylierung oder partieller Proteolyse. Es ist ebenso möglich, daß SREBP aus mehreren eng verwandten Proteinen besteht. Diese Fragen sind teilweise durch die Klonierung der SREBP-1-cDNA gelöst worden (Beispiel 3), und weitere Klonierstudien laufen derzeit, die es ermöglichen werden, daß diese Fragen vollständig gelöst werden können.
Bei einer Größenfraktionierung mittels Gelfiltration zu einem frühen Stadium in der Aufreinigung kam SREBP aus der Säule in einer Position heraus, die einer Molekülmasse von 500 kDa entspricht (Fig. 6). Im Gegensatz dazu sedimentierte das aufgereinigte Protein in einer Glycerin-Gradienten-Zentrifugation mit einer langsameren Geschwindigkeit als Ovalbumin (Mr 44.000) (Fig. 9). Diese Beobachtungen können darauf hinweisen, daß SREBP als ein Multiproteinkomplex existiert, der während der Aufreinigung dissoziiert, oder daß SREBP ein elongiertes Molekül ist, das sich in der Gelfiltration anomal verhält.
In den Gel-Mobilitäts-Shift-Assays wurde die Aktivität von aufgereinigtem SREBP merkbar durch eine Vielzahl von Proteinen, einschließlich der Bestandteile von boviner, fettarmer Milch, stimuliert. Diese verstärkende Aktivität war ursprünglich in der Durchflußfraktion von der ersten Repeat-2-enthaltenden DNA-Affinitätssäule bemerkt worden. Der stimulatorische Effekt war nicht vollkommen unspezifisch, da Proteine, wie Albumin und Immunglobuline keinen Ersatz darstellten. Es ist möglich, daß ein weiteres Protein die SREBP-Aktivität verstärken kann, aber SREBP ist deutlich aktiv unter den hierin beschriebenen Bedingungen.
Die Verfügbarkeit des SREBP-Proteins wird es zum ersten Mal möglich machen, die Mittel zu erforschen, mit denen Zellen die SREBP-Aktivität in Antwort auf Cholesterin regulieren. Der Erhalt des aufgereinigten Proteins hat es ebenso möglich gemacht, daß sowohl die Erzeugung von Antikörpern gegen dieses Protein als auch das molekulare Klonieren einer cDNA, die für das SREBP-Protein kodiert, erreicht wurde (Beispiel 3). Mittels des Proteins sE1bst und der anderen biologischen Produkte, die jetzt erhalten werden können, einschließlich der hierin offenbarten cDNA, schlagen die Erfinder vor, weitere Ereignisse in dem Sterolregulierten Transkriptionsweg des LDL-Rezeptor-Gens zu bestimmen. Dies ist eines der Themen des folgenden Beispiels, Beispiel 3.
Zusätzlich zu dem LDL-Rezeptor-Gen werden die Gene für 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl- CoA (HMG CoA)-Synthase und HMG-CoA-Reduktase durch Sterole reprimiert (Goldstein und Brown, 1990). Die 5'-flankierende Region des HMG-CoA-Synthasegens enthält drei Regionen, die für Sterol-regulierte Transkription erforderlich sind (Smith et al., 1988). Zwei dieser Regionen enthalten SRE-1-Sequenzen, die den Erfordernissen für eine Bindung von SREBP entsprechen. Die 5'-flankierende Region des HMG-CoA-Reduktase-Gens enthält ebenso eine Region, die für die Sterol-vermittelte Regulation notwendig ist (Goldstein und Brown, 1990; Osborne et al., 1988). Diese Region enthält eine Sequenz, die lose dem SRE-1 ähnelt, was zu dem Vorschlag führte, daß das HMG-CoA-Reduktase-Gen durch dassE1be Protein reguliert werden könnte, das den LDL-Rezeptor reguliert (Smith et al., 1988). Ausführlichere Mutagenestudien (Osborne, 1991) deuten daraufhin, daß das vermeintliche Sterolregulatorische Element in der HMG-CoA-Reduktase nicht an SREBP binden sollte, wie in den gegenwärtigen Studien definiert (Beispiel 1), und dies hat sich in der Tat als richtig herausgestellt, siehe Fig. 23, wie in Beispiel 3 diskutiert. Darüberhinaus haben Osborne et al. (1992) vor kurzem ein Protein identifiziert, bezeichnet als Red25, das die Sterol-empfindliche HMG CoA-Reduktase-Sequenz erkennt. Dieses Protein erkennt nicht das SRE-1 von dem LDL-Rezeptor, was darauf hinweist, daß die Kontrollmechanismen für die beiden Gene unterschiedlich sind.

BEISPIEL 3

Molekulares Klonieren, Sequenzieren und weitere Analyse von SREBP-1

Das vorliegende Beispiel beschreibt die Isolierung und funktionelle Analyse einer cDNA, die für SREBP-1 kodiert. Die Analyse zeigt, daß SREBP-1 ein neues Mitglied der Basic-Helix- Loop-Helix-Leucin-Zipper (bHLH-Zip)-Familie von DNA-Bindungsproteinen ist (Murre und Baltimore, 1992; Pabo und Sauer, 1992; Ferrè-D'Amarè et al., 1993). Dieses Beispiel demonstriert ebenso, daß SREBP-1, wenn in Tierzellen mittels Transfektion exprimiert, die Transkription eines Reporter-Gens, angetrieben durch die SRE-1-Sequenz, aktiviert.

A. Materialien und Methoden

1. Materialien. Standard-Molekularbiologie-Techniken wurden verwendet (Sambrook et al., 1989). cDNA-Fragmente wurden in pBluescriptII SK+ (Stratagene) oder pCRII-Vektoren (Invitrogen) subkloniert und mit der Dideoxy-Kettenterminationsmethode (Sanger et al., 1980) unter Verwendung von M13-universal- und reverse-sequencing-Primern sequenziert; T7, T3 und 5P6-Promoter-Primer oder spezifische interne Primer. Die Sequenzierreaktionen wurden auf einem Applied Biosystems DNA-Sequenzierer Modell 373A durchgeführt. Ausgewählte Regionen der cDNA wurden manuell mit einem Sequenase-Kit (U. S. Biochemicals) sequenziert. Sonden, die zufallsmäßig mit einem Primer versehen wurden, wurden synthetisiert unter Verwendung eines Random-Primer-Labelling-Kit (Pharmacia). p1471 (Smith et al., 1990) und pRedCAT-1 (Osborne et al., 1988) wurden in den angezeigten Literaturstellen beschrieben, von denen jede hierin durch Bezugnahme einbezogen ist.
2. Aminosäuresequenz von menschlichem SREBP. SREBP wurde aus Kernextrakten aufgereinigt, die aus 1.500 Litern HeLa-Zellen durch Wiederholungen der hierin in Beispiel 2 beschriebenen Prozedur hergestellt worden waren. Ungefähr 6 ug des aufgereinigten Proteins, bestehend aus einem Cluster aus Banden bei 59-68 kDa auf SDS-PAGE, wurde mit 10% (v/v) Trichloressigsäure ausgefällt, mit Aceton gewaschen und in einem Puffer aufgelöst, enthaltend 0,4 M Ammoniumhydrogencarbonat, 8 M Harnstoff und 5 mM Dithiothreitol bei 55ºC unter Schütteln mit einem Vortex. Nach einer Behandlung mit 10 mM Iodacetamid wurde das Protein mit Trypsin von Sequenzierqualität (Boehringer-Mannheim), wie beschrieben (Stone et al., 1989), verdaut. Die resultierenden Peptide wurden mittels Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung eines 0,1% (v/v) Trifluoressigsäure- und -Acetonitril-Gradienten auf einer 1- mm · 25-cm RP-300-Säule (Applied Biosystems) getrennt. Die aufgelösten Peptide wurden gesammelt und mittels automatisiertem Edman-Abbaus auf einem Applied Biosystems Sequenzierer Modell 477A unter Verwendung von Standardchemie, einer Mikroreaktionskartusche und schnellen Zyklen sequenziert.
3. cDNA-Klonierung von menschlichem SREBP-1. Ein Aliquot (10 ng) aufgereinigter Phagen- Matrizen-DNA aus einer HeLa-λgt10-cDNA-Bibliothek (Clontech) wurde mit 300 umol eines degenerierten Oligonukleotids (Primer 1; SEQ ID NO: 45) vom COOH-terminalen Ende von Pepfid3(Tabelle IV), 5'- TT (T/C) TC (T/C) TG (T/C) TTIAG (T/C) TT (T/C) TG-3'; und 20 pmol eines λgt10-Vektor-Reverse-Primer, 5'- GGCTTATGAGTATTTCTTCCAGGG-3' SEQ ID NO: 46 amplifiziert. Die Primer wurden mittels Durchlauf durch eine Qiagen Tip-5- Säule entfernt, und 1/20tel des PCR-Reaktionsprodukts wurde einer zweiten Runde PCR mit 160 umol eines degenerierten Oligonukleotids (Primer 2; SEQ ID NO: 47) von dem NH&sub2;- terminalen Ende von Peptid 3,5'-TT (T/C) TG (A/G) TTIGA (A/G) TG (T/C) TG-3' und 20 umol des λgt10-Vektor-Reverse-Primer unterzogen. Die PCR-Produkte wurden mittels Agarose-Gelelektrophorese isoliert und in den pCRII-Vektor unter Verwendung eines TA- CloningTM- Kit(Invitrogen) subkloniert. Die DNA-Sequenz des resultierenden 345-bp-PCR- Produkts kodierte für Peptide 2, 5 und 6 von SREBP (Tabelle N). Das 345-bp-PCR-Produkt wurde zufallsmäßig markiert mit ³²P-dCTP (4 · 10&sup5; cpm/ml) und verwendet, um HeLacDNA-Bibliotheken, wie oben beschrieben, zu screenen.
Poly(A)&spplus;-RNA von HeLa-53-Zellen, kultiviert in 2,5% (v/v) neugeborenem Kälberserum (Beispiel 2; Wang et al., 1993) wurde mit Oligotex-(dT)30®-Harz (Qiagen) isoliert und verwendet, um eine T7-angetriebene λEXlox®-Vektor-basierende cDNA-Bibliothek zu konstruieren (Novagen). Eine Erststrangsynthese wurde mit einer Kombination von Oligo(dT) und Zufallsprimern durchgeführt. Nach der Zweitstrangsynthese wurde die doppelsträngige cDNA an EcoRI(NotI)-Adapter ligiert, enthaltend eine SalI-Restriktionsstelle (Gibco-BRL), eingeführt in λEXlox-EcoRI-Arme (Novagen) und mit Gigapack®II-Packaging-Extract (Stratagene) verpackt.
Die HeLa-λgt10- und HeLa-λEXlox-Bibliotheken wurden durch Hybridisieren von Filtern in doppelter Ausfertigung mit der 345-bp-PCR-Sonde gescreent (siehe unmittE1bar oben) bei 60ºC über Nacht in 3 · SSC, enthaltend 0,1% (w/v) SDS, 5 · Denhardt's und 50 ug/ml Lachsspermium-DNA, und dreimal gewaschen mit 3 · SSC/0,1% SDS bei Zimmertemperatur. für 5 Minuten und zweimal mit 0,1 · SSC/0,1% SDS bei 60ºC für 20 Minuten. Von 6 · 10&sup5; Plaques, die in der λEXlox-Bibliothek gescreent wurden, wurden 7 positivie Klone identifiziert, und in die NotI-Stelle von pBluescriptII SK+ subkloniert. Die zwei längsten Klone (pCY21 und pCY22) wurden charakterisiert. Von den 5 · 10&sup5; Plaques, die in der λgt10- Bibliothek gescreent wurden, wurden 6 positive Klone identifiziert und in die EcoRI-Stelle von pBluescriptII-SK+ subkloniert. Der Klon, der die meiste 5'-Sequenz enthielt (pCY5) wurde charakterisiert.
4. Konstruktion von Expressionsvektoren für pSREBP-1. Vektoren zur Expression von menschlichem SREBP-1 in kultivierten Tierzellen wurden in pCMV7, einer modifizierten Version von pCMVS (Andersson et al., 1989) konstruiert, das ein Hybrid- Adenovirus/Immunglobulin-Intron enthält (erhalten von David W. Russel von der University of Texas Southwestern Medical Centre in Dallas). Das Plasmid pSREBP-1a wurde durch Verdau von pCYS mit SalI und Eco47III konstruiert, um den Vektor und 5'-cDNA- Sequenzen zu erhalten, und durch Ligation in das 2989-bp-Eco47III-SalI-Fragment, das für das 3'-Ende von pCY21 kodiert (Figure 15). Dieser pBluescriptII-SK-basierende Vektor wurde mit BamHI und HincII verdaut, und das cDNA-Fragment (4183-bp) wurde in BamHI- SmaI-verdauten pCMV7-Vektor kloniert. pSREBP-1b wurde konstruiert durch Verdau von pCY5 mit XbaI und Eco47III (1204-bp), um die 5'-cDNA-Sequenz zu erhalten, und durch seine Ligation in ein XbaI-Eco47III (5615-bp)-Fragment, das für das 3'-Ende von pCY22 kodiert. Diese cDNA wurde in pCMV7 subkloniert, wie für pSREBP-1a beschrieben. pSREBP-1c wurde konstruiert durch Einführen des SalI-Fragments von pCY22 in die SalI- Stelle von pCMV7, und die Orientierung wurde durch Restriktionskartierung bestätigt. Alle Restriktionsstellen, die in den obigen Konstruktionen verwendet wurden, außer Eco47III, sind in den Linkersequenzen vorhanden.
5. Blot Hybridisierung von RNA. Poly(A)&spplus;-RNA aus menschlicher Nebenniere und Northern- Blots, enthaltend 2 ug Poly(A)&spplus;-RNA von vielfachen menschlichen erwachsenen und fötalen Geweben, wurden von Clontech erworben. Poly(A)&spplus;-RNA aus HeLa-S3-Zellen, kultiviert in 2,5% (v/v) neugeborenem Kälberserum (Beispiel 2; Wang et al., 1993) wurde mit Oligotex- (dT)30®-Kügelchen (Qiagen) hergestellt. Die Blots wurden mit einer Zufalls-geprimten Sonde hybridisiert, die aus dem 3,6-kb-NotI-Fragment von pSREBP-1c synthetisiert worden war. Die Hybridisierungen wurden in 5 · SSPE durchgeführt, enthaltend 50% Formamid bei 2 · 10&sup6; cpm pro ml für 16 Stunden bei 42ºC. Nach der Hybridisierung wurde jeder Filter einmal mit 1 · SSC und 0,05% SDS für 30 Minuten bei Zimmertemperatur und zweimal mit 0,1 · SSC und 0,1% SDS für 20 Minuten, jeweils bei 50ºC, gewaschen. Nach dem Exponieren gegenüber Kodak-XAR-5-Film für die angezeigte Zeit wurde jeder Filter erneut mit einer ³²Pmarkierten cDNA (1,2 kb) auf Ratten-Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (Chen et al., 1991) bei 4 · 10&sup6; cpm pro ml sondiert.
6. In-Yitro-Translation von SREBP-1 mRNA. pSREBP-1c wurde in die SalI-Stelle von pBluescript-SK+ kloniert, aufgereinigt mittels CsCl-Bandenbildung und in ein TNTTM-T7- gekoppeltes Reticulocyten-Lysat-System (Promega) translatiert. Jede gekoppelte Transkriptions-Translations-Reaktion enthielt 1 ug Plasmid-DNA in einem Endvolumen von 50 ul und wurde bei 30ºC für 2 h inkubiert. Zum radioaktiven Markieren wurde pSREBP-1c in einer Methionin-freien Aminosäuremischung translatiert, die mit [³S]-Methionin supplementiert war, gemäß den Anweisungen des Herstellers. Ein Aliquot (1 ul) der Reaktion wurde zu 20 ul SDS-Probenpuffer (Laemmli, 1970) zugegeben, und einer Elektrophorese auf einem 4-15%- Gradientengel unterzogen. Das Gel wurde in 50% (v/v) Methanol und 10% (v/v) Essigsäure für 20 Minuten fixiert, mit EnlighteningTM-Enhancer-Lösung (NEN-DuPont) für 15 Minuten bei Zimmertemperatur behandelt, getrocknet und einem Kodak-Röntgenfilm bei -80ºC für 16 Stunden ausgesetzt. Für die Gel-Mobilitäts-Shift-Assays wurde pSREBP-1c mit nichtmarkierten Aminosäuren translatiert. Ein Aliquot (3 ul) der Reaktion wurde direkt in dem Gel-Mobilitäts-Shift-Assay getestet.
7. Gel-Mobilitäts-Shift-Assays. SREBP wurde mit einer PCR-erzeugten, ³²P-markierten DNA- Sonde inkubiert, die eine oder zwei Tandem-Kopien von Wildtyp- oder mutanten Repeat 2 + 3-Elementen des LDL-Rezeptor-Promoters enthielt, wie oben in Beispielen 1 und 2 und in der kurzen Beschreibung der Zeichnungen beschrieben. Die Sonden wurden synthetisiert, und eine Elektrophorese wurde durchgeführt, wie zuvor in Beispielen 1 und 2 oben beschrieben (und Briggs et al., 1993; Wang et al., 1993).
Das hierin verwendete, 5'-Biotin-markierte, doppelsträngige Oligonukleotid (synthetisiert, wie beschrieben in Applied Biosystems User Bulletin Number 70 38X/39X), enthält zwei Tandem-Kopien der Repeat-2-Sequenz, wobei das C an Position 6 in der SRE-1-Sequenz in ein G umgewandelt ist, das seine in-vitro-Bindung oder in-vivo-transkriptionelle Aktivität nicht beeinflußt. Die Wildtyp- und die mutanten Kompetitor-Oligonukleotide (doppelsträngig), die verwendet wurden, sind diesE1ben, die verwendet wurden, um die DNA- Affinitätssäule B bzw. A zu konstruieren, wie oben in Beispiel 2 und in Wang et al. (1993) beschrieben.
8. Produktion von rekombinanter bHLH Zip-Domäne von SREBP-1. pSREBP-1 (bHLH-Zip) ist ein rekombinantes Plasmid, das für ein Fusionsprotein von 130 Aminosäuren kodiert. Die COOH-terminalen 107 Aminosäuren umfaßt die Basic-Helix-Loop-Helix-Zipper (bHLH- Zip)-Domäne von SREBP-1a (Reste 301-407 von SEQ ID NO: 38). Die NH&sub2;-terminalen 23 Aminosäuren schließen ein Initiationsmethionin ein, gefolgt von 3 funktionellen Elementen:
1) His His His His His His (SEQ ID NO: 48), Stelle für Ni²&spplus;-Bindung;
2) Asp Asp Asp Asp Lys (SEQ ID NO: 49), Stelle für eine spezifische Endopeptidase (Enterokinase); und 3) Arg Arg Ala Ser Val (SEQ ID NO: 50), Stelle für die katalytische Domäne der Herzmuskelkinase (Blanar und Rutter, 1992).
pSREBP-1 (bHLH-Zip) wurde mittels PCR mit pSREBP-1c als Matrize und den folgenden beiden Primern konstruiert: 5' -Oligonukleotid, CGCGGATCCGATGACGATGACAAACGTCGTG CATCTGTTGAGAAGCTGCCTATCAACCGG (SEQ ID NO: 51; entspre- chend 5' bis 3' der BamHI-Klonierstelle, gefolgt von Sequenzen für die Enterokinase-Stelle, Herzmuskelkinase-Stelle und SREBP-1); 3' -Oligonukleotid, CTAATTAAGCTTACTATCCACT GCCACAGGCCGACAC (SEQ ID NO: 52; entsprechend 3' bis 5' der HindIII-Klonierstelle und Teil der SREBP-1-Sequenz). Das amplifizierte PCR-Produkt wurde mit BamHI und HindIII verdaut und in pQE-30 eingefügt, einem bakteriellen Expressionsvektor, der Sequenzen enthält, die für ein Initiations-Methionin kodieren, und 6 aufeinanderfolgende Histidinreste, die einer Polylinker-Klonierstelle vorangehen (Qiagen).
Das resultierende pSREBP-1 (bHLH-Zip) wurde in den E. coli Wirtsstamm M15 [pREP4] (Qiagen) transformiert, die in 1 Liter-Kulturen bei 37ºC wachsen gelassen wurden und mit IPTG für 5 h induziert wurden. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation gesammelt, durch Rühren bei Zimmertemperatur für 1 Stunde in 6 M Guanidin-HCl, 0,1 M Natriumphosphat, 10 mM Tris-Chlorid bei pH 8,0 aufgebrochen und bei 10.000 g für 15 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Die Überstandslösung wurde einer Ni²&spplus;-Sepharose-Affinitätschromatographie unter Bedingungen, die von dem Hersteller (Qiagen) empfohlen wurden, unterzogen. Das bHLH- Zip-Fusionsprotein wurde mit 250 mM Imidazol, 8 M Harnstoff, 0,1 M Natriumphosphat, 10 mM Tris-Chlorid bei pH 6,3 eluiert und dann über Nacht bei 4ºC in Puffer A dialysiert (25 mM Hepes-KOH bei pH 7,5, 12 mM MgCl&sub2;, 10% (v/v) Glycerin, 0,5 mM Phenylmethylsülfonylfluorid, 0,5 mM Dithiothreitol, 0,1 M KCl). Das dialysierte Fusionsprotein (~0,2 mg/ml) wurde in vielfachen Aliquots bei -80ºC gelagert.
9. Transfektion, Immunblot-Analyse und Reporter-CAT Assays. Für die Immunblot-Analyse wurden Monoschichten von menschlichen embryonischen Nieren-293-Zellen angesetzt (3 · 10&sup5;-Zellen/60-mm-Schale) in Dulbecco's-modifiziertem Eagle's-Medium (DMEM), enthaltend 10% fötales bovines Serum, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin. Nach der Inkubation für 24 Stunden wurden die Zellen mit 3 ug von entweder dem angezeigten pSREBP-1 oder dem Kontrollvektor pCMV7 plus 0,3 ug pVA transfiziert (einem Plasmid, das für Adenovirus-VA-RNA&sub1; kodiert) (Akusjarvi et al., 1987), unter Verwendung des Calciumphosphat-Verfahrens (Sambrook et al., 1989). Vier Stunden nach den Transfektionen wurden die Zellen zweimal mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und erneut mit frischem Medium gefüttert. Nach 40 Stunden wurden die Zellen einmal mit eiskaltem PBS gewaschen und in PBS geerntet. Die resultierenden Zellpellets wurden mit 0,3 ml Lysepuffer lysiert, enthaltend 1% (w/v) SDS (Gil et al. 1985). Die Zellextrakte wurden einer Scherung durch eine 20-G-Nadel unterzogen und einer Elektrophorese und Immunblot-Analyse unterworfen.
Für die in vivo-funktionelle Analyse wurden Monoschichten von menschlichen 293-Zellen und Affen-CV-1-Zellen, wie oben in Beispiel 1 beschrieben, etabliert. Verschiedene Mengen an pSREBP-1a (0 bis 1 ug) wurden mit dem angezeigten Reporter-CAT-Gen cotransfiziert (Beispiel 1; Briggs et al., 1993). In Fig. 22 wurde die Gesamtmenge an DNA auf 3,3 ug (293-Zellen) oder 12 ug (CV-1-Zellen) durch die Zugabe von pCMV7 eingestellt. Nach der Transfektion wurde das Medium zu DMEM umgestellt, enthaltend 10% Lipoproteindefizientes Kälberserum in der Abwesenheit oder Anwesenheit von Sterolen (10 ug/ml Cholesterin plus 1 ug/ml 25-Hydroxycholesterin, zugegeben in 20 ul Ethanol). Nach der Inkubation für 40-48 Stunden wurden die Zellen geerntet und die CAT-Aktivität wurde mittels dem Xylen-Extraktionsverfahrens gemessen. Die Proteinkonzentration wurde mittels des Verfahrens von Bradford (1976):
10. Antikörper und Immunblotting. Ein Antikörper, der gegen SREBP-1 gerichtet war, wurde durch Immunisieren von Kaninchen mit einem synthetischen Peptid, (C)KPEQRPSLHS, entsprechend Aminosäuren 470 bis 479 in SREBP-1a (Fig. 16, SEQ ID NO: 38), erzeugt. Das Peptid wurde an Keyhole-Limpet-Hemocyanin unter Verwendung von m- Maleimidobenzoesäure-N-Hydroxysuccinimidester gekoppelt (Harlow und Lane, 1988). New Zealand-White-Kaninchen wurden mit 500 ug gekoppeltem Peptid in Freundschem vollständigem Adjuvans immunisiert, und IgG-Fraktionen wurden hergestellt (Harlow und Lane, 1988). Eine Immunblot-Analyse wurde mit Anti-Kaninchen-Meerrettichperoxidasekonjugiertem IgG unter Verwendung des Enhanced Chemiluminescence (ECL) Western- Blotting-Detection-System-KitTM (Amersham) durchgeführt. Die Gele wurden mit vorgefärbten Hoch- und Niedrigbereich-Molekulargewichtsmarkern (BioRad) kalibriert.

B. Resultate

SREBP wurde aus vereinigten Extrakten von HeLa-Zellkernen, wie zuvor beschrieben (Beispiel 2; Wang et al., 1993), aufgereinigt. Die endgültige Zubereitung zeigte einen Cluster von Banden zwischen 59 und 68 kDa auf silbergefärbten SDS-Polyacrylamid-Gelen. Die gesamte Fraktion von dem letzten DNA-Affinitätschromatographieschritt wurde einem tryptischen Verdau unterzogen, und die Peptide wurden mittels HPLC fraktioniert und sequenziert, wie in experimentellen Prozeduren beschrieben. Sechs eindeutige Sequenzen wurden erhalten (Tabelle IV). Degenerierte Oligonukleotide, die für einen Teil von Peptid 3 (Rest 372 bis 387 von SEQ ID NO: 38) kodierten, wurden verwendet, um Polymerasekettenreaktionen (PCR) mit einer HeLa-Zell-cDNA-Bibliothek als Matrize zu primen. Dies ergab eine einzigartige DNA- Sequenz, die verwendet wurde, um zwei HeLa-cDNA-Bibliotheken zu sondieren. Drei überlappende partielle cDNAs, bezeichnet als pCY5, pCY21 und pCY22, wurden charakterisiert. Diese drei cDNAs hatten die identische Sequenz über einen Großteil der kodierenden Region (angezeigt durch den nicht ausgefüllten Kasten in Fig. 15A), aber sie unterschieden sich an den 5'- und 3'-Enden, was die Möglichkeit von altemativem Splicing oder Klonierartefakten nahelegt (Fig. 15A). TABELLE IV
Die Sequenzen wurden aus HPLC-aufgereinigten tryptischen Peptiden erhalten, die aus aufgereinigten SREBP isoliert worden waren. Jedes Peptid stellt eine reine Spezies von einem einzelnen HPCL-Peak dar. Aminosäuresequenzen, entsprechend 5 der 6 Peptide, wurden in der Aminosäuresequenz gefunden, die aus den cDNAs für SREBP-1 (SEQ ID NO: 38) vorhergesagt worden war. Die Sequenz, entsprechend Peptid 4 (SEQ ID NO: 44), wurde nicht in der cDNA gefunden (Fig. 15). Drei Positionen der Mehrdeutigkeit in den Aminosäuresequenzen werden verzeichnet, und der Rest in Fettdruck bezeichnet die Aminosäure, die in der cDNA-abgeleiteten Sequenz gefunden wird. Die festen und gepunkteten Unterstriche für Peptid 3 entsprechen den Aminosäuren, die verwendet wurden, um Oligonukleotid-Primer 1 bzw. 2 für die PCR-Reaktionen beim cDNA-Klonieren abzuleiten, wie hierin beschrieben.
Fig. 15B-1 bis Fig. 15B-5 zeigt die divergierenden Sequenzen. Das 5'-Ende von pCYS sagt eine 5'-nicht-translatierte Region von 166 nt (Reste 1-166 von SEQ ID NO: 37) vor, die ein Inframe-Stopcodon (einzelner Unterstrich in Fig. 15B-1) enthält. Das erste Methionin (doppelter Unterstrich) tritt innerhalb eines guten Konsensus für die Translationsinitiation auf, wie sie von Kozak definiert wird (1984). Das 5'-Ende von pCY22 ist kürzer als das von pCYS, und der offene Leserahmen erstreckt sich weiter bis zu dem 5'-Ende. Die 5'- Nukleinsäuresequenz von pCY22 wird durch SEQ ID NO: 39 dargestellt und die entsprechende Aminosäuresequenz durch SEQ ID NO: 40. Am 3'-Ende sind die Sequenzen von pCY21 und pCY22 identisch bis zu Nukleotid 3268 der zusammengesetzten Sequenz (Fig. 15A), wonach sie vollständig voneinander divergieren. pCY21 kodiert für zusätzliche 113 Aminosäuren, gefolgt von einem Stopcodon und einer 3'-nicht-translatierten Region von 544 bp mit einem potentiellen Polyadenylierungssignal 16 bp von dem 3'-Ende des Klons. Beide dieser Sequenzen befinden sich innerhalb von SEQ ID NO: 37 und 38. Keine Poly(A)- Sequenz ist vorhanden. pCY22 kodiert nur für 37 Aminosäuren (SEQ ID NO: 42), gefolgt von einem Stopcodon, 433 bp von der 3'-nicht-translatierten Region, einschließlich einer Poly(A)-Sequenz, der ein potentielles Polyadenylierungssignal vorangeht. Die 3'- Nukleinsäuresequenz von pCY22 wird durch SEQ ID NO: 41 repräsentiert.
Für funktionelle Studien erzeugten die Erfinder eine exprimierbare zusammengesetzte cDNA, die das S'-Ende von pCYS, die invariante Region, und das 3'-Ende von pCY21 (bezeichnet als pSREBP-1a in Fig. 15A) umfaßte. Diese Kombination wurde auf der Grundlage der Information gewählt, die von zwei verschiedenen cDNA-Klonen erhalten wurde, die aus zwei unterschiedlichen cDNA-Bibliothek von Eierstockzellen des chinesischen Hamsters isoliert worden waren. Diese Klone, anscheinend mit vollständiger Länge, enthielten S'-Enden, die der kodierenden Region von pCYS stark ähnelten, und 3'-Enden, deren kodierende Regionen denen von pCY21 ähnelten. Beide Hamster-cDNAs kodieren für ein Protein von 1133 Aminosäuren, das 81% Identität mit der vorhergesagten Sequenz zeigt, die durch das menschliche pSREBP-1a kodiert wird. Menschliches pSREBP-1b (5'-Ende von pCYS und 3'-Ende von pCY22) und pSREBP-1c (5' und -3' -Enden von pCY22) wurden ebenso hergestellt.
Fig. 16A bis 16L zeigt die vorhergesagte Aminosäuresequenz, die von menschlichem pSREBP-1a kodiert wird, SEQ ID NO: 37 bzw. 38. Die cDNA kodiert für ein Protein von 1147 Aminosäuren, das 5 der 6 Peptide einschließt, deren Sequenzen erhalten wurden (angezeigt durch Unterstriche in Fig. 16C-E). Das sechste Peptid (Peptid 4 in Tabelle IV; SEQ ID NO: 44) wurde nicht in der cDNA-Sequenz gefunden, und es wird geglaubt, daß es von einem anderen Protein in der aufgereinigten SREBP-Zubereitung stammt (siehe Diskussion unten).
Eine Suche der GenBank-, PIR- und SWISS-PROT-Datenbanken zeigte nur eine Region von SREBP-1 auf, die eine enge Übereinstimmung mit anderen Proteinen zeigte. Aminosäurereste 324-394 von SREBP-1 (d. h. von SEQ ID NO: 38) entsprechen der Konsensus-Sequenz für die Basic-Helix-Loop-Helix-Leucin-Zipper(bHLH-Zip)-Klasse der DNA-Bindungsproteine (Fig. 17A). In der bHLH-Region ist die genaueste Gesamtübereinstimmung mit SREBP- 1 ein Transkriptionsfaktor, der als TFE3 bezeichnet wird, der das Immunglobulin-uE3-Motiv aktiviert (Beckmann et al., 1990). Die Sequenzidentität innerhalb dieser Region war 44%. Die Sequenzidentität mit anderen bHLH-Proteinen war im Bereich von 33%. Die vermeintliche Leucin-Zipper-Region von pSREBP-1 besteht aus einem Alanin, drei Leucinen und einem Serin, im Abstand von 7 Resten positioniert (Fig. 17B). Diese Sequenz beginnt innerhalb der zweiten Helix des HLH-Motivs, einem Merkmal, das ebenso in mehreren anderen Transkriptionsfaktoren beobachtet wird, einschließlich AP4, CBF1, TFE3 und TFEB (Ferrè-D'Amarè et al., 1993). Eine Helix-Rad-Analyse dieser Sequenz bestätigt die Trennung der hydrophoben Reste auf eine Seite, was einen echten "Leucin-Zipper" nahelegt (Landschulz et al., 1988; Pablo und Sauer, 1992).
Das durch pSREBP-1a (SEQ ID NO: 38) kodierte Protein enthält mehrere andere bemerkenswerte Merkmale. Am äußersten NHZ-Terminus gibt es einen Abschnitt von 42 Resten, der 12 negativ geladene Aminosäuren und keine positiv geladene Aminosäure enthält (der erste positiv geladene Rest tritt bei Position 108 auf). Es wird vorhergesagt, daß die saure Region weitgehend α-helikal ist, bestimmt mit dem Verfahren von Garnier et al. (1978). Die saure Region (Reste 1-42) wird von einer Serin-/Prolin-reichen Region (28% Prolin und 18% Serin) gefolgt, die sich von Resten 61-178 erstreckt. Nach der bHLH-Zip-Region gibt es einen Abschnitt von 36 Aminosäuren (Reste 427-462), der 33% Serin, 19% Glycin und 19% Prolin enthält (71% Ser + Gly + Pro).
Northern Blots von menschlicher Poly(A)&spplus;-RNA zeigen an, daß pSREBP-1 in einer großen Vielzahl von Gewebe exprimiert wird und am meisten im Überfluß in der Leber und den Nebennieren vorkommt (Fig. 18A, linke und mittlere Tafeln), den beiden Geweben, die die höchste Konzentration an LDL-Rezeptoren exprimieren (Brown und Goldstein, 1986). Unter den fötalen Geweben (Fig. 18A, rechte Tafel) zeigte die Leber und Lunge eine hohe Expression (die fötalen Nebennieren wurden nicht getestet). Bei allen Geweben gab es eine vorherrschende mRNA von ~4.000 Nukleotiden. Die diffuse Natur der Bande bringt die Möglichkeit von alternativ-gespleißten Varianten von ähnlicher Größe auf.
Ein polyklonaler Antikörper wurde gegen Aminosäurereste 470-479 von SREBP-1a gezogen (470-479 von SEQ ID NO: 38; Teil von Peptid 1 in Tabelle IV), und dieser reagierte mit aufgereinigtem SREBP auf Immunblots (Fig. 17B). Der Antikörper reagierte ebenso mit SREBP-1, das in menschlicher Embryonennieren-293-Zellen nach der Transfektion mit einem Expressionsvektor produziert wurde, enthaltend pSREBP-1a (Spuren 2 und 5), pSREBP-1b (Spur 3) und pSREBP-1c (Spur 4). Wie erwartet, produzierten pSREBP-1b und pSREBP-1c Proteine, die geringfügig kleiner als dasjenige war, das durch pSREBP-1a kodiert wurde, aufgrund von kürzeren Kodierungsregionen an den 5'- und 3'-Enden (siehe Fig. 15). Die Kontrollzellen, die mit dem Vektor allein transfiziert worden waren, enthielten nicht ausreichend endogenes SREBP-1, um von diesem Antikörper erkannt zu werden (Spur 1). Alle der cDNAkodierten Versionen von SREBP-1 waren beträchtlich größer als das Protein, das aus HeLa- Zellen aufgereinigt wurde (Spur 6), was andeutet, daß das aufgereinigte Protein proteolysiert wurde; entweder mittels eines physiologischen Prozesses, der innerhalb der Zelle stattfindet, oder während der Aufreinigungsprozedur.
Um die DNA-Bindungsaktivität des Proteins, das durch pSREBP-1 kodiert wird, zu testen, wurden Gel-Retardationsassays durchgeführt (Fig. 19) mit drei ³²P-markierten Oligonukleotid-Sonden: Sonde H, die die Wildtyp-menschliche-SRE-1-Sequenz enthält; Sonde M, die transkriptionell aktiv ist und ein T enthält, ausgetauscht für ein C an Position 10 in der SRE- 1-Sequenz (entsprechend der Wildtyp-Maus-Sequenz); und Sonde *, die ein A für ein C an Position 10 enthält und transkriptionell inaktiv ist, wie hierin oben in Beispiel 1 und 2 offenbart wurde. Das partiell aufgereinigte SREBP von HeLa-Zellen ging eine Bindung mit den Sonden H und M, aber nicht * ein (Fig. 19, Spuren 7-9). Das SREBP-1c voller Länge, das in einem Retikulocyten-Lysat-System translatiert wurde, ging eine Bindung mit den Sonden H und M, aber nicht mit Sonde * (Spuren 4-6) ein. Die zurückgehaltende Bande wanderte langsamer als die Bande, die durch aufgereinigtes HeLa-SREBP (Spuren 7-9) produziert wurde, was das erwartete Resultat auf der Grundlage der größeren Größe des in-vitro-translatierten Produkts ist. Die Retikulocyten-Lysat-Mischung ohne pSREBP-1c ergab keine retardierte Bande (Spuren 1-3). Im sE1ben Assay wurde die Bindungsaktivität eines kleinen Fragments getestet, enthaltend die bHLH-Zip-Domäne von SREBP-1 (Aminosäuren 301-407 von SEQ ID NO: 38), die durch Expression eines Fragments von pSREBP-1c in E. coli produziert wurde. Dieses Peptid ging ebenso eine Bindung mit Sonden H und M, aber nicht mit * ein (Spuren 10-12), was anzeigt, daß die bHLH-Zip-Domäne die spezifische DNA-Bindungsaktivität enthält. Wie erwartet, zeigte diese zurückgehaltene Bande eine schnelle Mobilität, aufgrund der geringen Größe des bHLH-Zip-Fragments (107 Aminosäuren).
Wenn ein Plasmid, enthaltend pSREBP-1c, in einem Retikulozcyten-Lysat-System in der Anwesenheit von [³&sup5;S] Methionin translatiert wurde, wanderte das Translationsprodukt auf SDS-PAGE als ein Hauptprotein von ~130 kDa und als mehrere weniger häufige Proteine von niedrigerem Molekulargewicht (Fig. 20, Spur 1). Um zu demonstrieren, daß die DNA- Bindungsaktivität, die mittels Gel-Mobilitäts-Shift-Assay in Fig. 19 nachgewiesen wurde, auf dem translatierten SREBP-1 voller Länge beruhte, wurden Aliquots der translatierten Mischung mit einem biotinylierten Oligonukleotid inkubiert, das eine Wildtyp-SRE-1-Sequenz enthielt. Die gebundenen Proteine wurden durch Adsorption an ein Streptavidin-Agarosegel isoliert und mittels SDS-PAGE analysiert. Wenn die Inkubationsmischung einen Überschuß von nicht-biotinyliertem Oligonukleotid enthielt, das für die Wildtyp-SRE-1-Sequenz als einen Kompetitor kodierte, ging keines der SREBP-1 eine Bindung mit der Streptavidin- Agarose ein (Spur 2). Wenn das nicht-biotinylierte Oligonukleotid eine mutante-SRE-1- Sequenz enthielt, die nicht transkriptionell aktiv ist, konnte kein Wettbewerb stattfinden, und das SREBP-1 voller Länge wurde an die Streptavidin-Agarose gebunden (Spur 3).
Hierin oben beschrieben (siehe Beispiel 1) sind eine Reihe von 16 Punktmutationen in dem SRE-1 und flankierenden Sequenzen, die eindeutige Resultate in Bezug auf die Transkriptionsaktivität ergeben. Sieben der Mutanten werden normal mittels Sterol-Verarmung nach Transfektion in kultivierte Zellen induziert, und neun werden in schwacher Weise, wenn überhaupt, induziert. Aufgereinigtes SREBP von HeLa-Zellen ging nur eine Bindung mit den sieben Mutanten ein, die effizient induziert wurden (Beispiel 2). Fig. 21 zeigt, daß dassE1be Bindungsmuster für die rekombinante trunkierte bHLH-Zip-Domäne von SREBP-1 gefunden wurde, die in E. coli produziert wurde. Die bHLH-Zip-Domäne ging mit der Wildtyp-SRE-1- Sequenz und mit allen sieben der Mutanten eine Bindung ein, die eine Transkriptionsinduktion beibehielten, einschließlich der stark diagnostischen Sequenz, die ein G anstelle des C an Position 6 des SRE-1 enthält. Auf der anderen Seite konnte das bHLH-Zip-Domänenprotein an keines der Oligonukleotide binden, die Punktmutationen an irgendeinem der anderen neun Positionen in der SRE-1-Sequenz hatte. Dieses Ergebnis zeigt an, daß die bHLH-Zip- Domäne, die nur 107 Aminosäuren enthält, die strukturelle Information enthält, die für eine spezifische DNA-Bindung ausreicht.
Um die funktionelle Aktivität von SREBP-1 in vivo zu testen, wurde ein Reporter-Plasmid (Plasmid K) verwendet, das zwei Kopien der SRE-1-Sequenz stromauf von einem Gen enthält, das für bakterielle Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) kodiert. Im nativen LDL- Rezeptor-Promoter ist die 10-bp-SRE-1-Sequenz innerhalb eines 16-bp-Elements, das als Repeat 2 bezeichnet wird, enthalten, dem eine entfernt verwandte Sequenz folgt, bezeichnet als Repeat 3. Obwohl Repeat 3 den Transkriptionsfaktor Sp1 bindet, reicht es nicht aus, um alleine eine Transkription auf hohem Niveau zu ergeben, und es erfordert einen Beitrag von dem SRE-1-Element innerhalb von Repeat 2 (Smith et al., 1990; Beispiel 1 hier oben). Das letztere Element ist nur aktiv, wenn die Zellen an Sterolen verarmt werden. Plasmid K enthält zwei Kopien der Repeat 2 + 3 Sequenz in Tandem, gefolgt von einer TATA-Box aus Adenovirus-E1b (Beispiel 1). Wenn in Zellen transfiziert, verursacht dieses Konstrukt hohe Niveaus an CAT-Enzym-Aktivität in der Abwesenheit von Sterolen, und die Aktivität wird von Sterolen unterdrückt, aufgrund des Entfernens des positiven Beitrags der SRE-1-Sequenzen (Beispiel 1).
Plasmid K wurde in Affen-CV-1-Zellen cotransfiziert (Fig. 22A) und menschliche 293- Zellen (Fig. 22B), zusammen mit verschiedenen Mengen eines Plasmids, das für pSREBPla kodiert. In der Abwesenheit von pSREBP-1a produzierten die CV-1-Zellen 7-mal mehr CAT-Aktivität in der Abwesenheit von Sterolen im Vergleich zu deren Anwesenheit. Steigende Mengen an pSREBP-1a erhöhten die Menge an CAT-Aktivität unter beiden Inkubationsbedingungen, aber der relative Effekt in der Anwesenheit von Sterolen war deutlicher. Als ein Resultat war bei hohen Konzentrationen von SREBP die CAT-Aktivität diesE1be in der Abwesenheit und Anwesenheit von Sterolen. Ähnliche Resultate wurden mit den 293-Zellen erhalten. In der Abwesenheit von SREBP zeigten diese Zellen ebenso eine 5-fach höhere CAT-Aktivität, wenn eine Verarmung an Sterolen stattfand. Wenn pSREBP-1a vorhanden war, wurde die CAT-Aktivität 15-fach in der Abwesenheit von Sterolen gesteigert. Wiederum war die relative Stimulierung am größten in der Anwesenheit von Sterolen (90-fach), so daß bei hohen Konzentrationen von pSREBP-1a die CAT-Aktivität tatsächlich höher in der Anwesenheit von Sterolen als in ihrer Abwesenheit war.
Um zu bestätigen, daß die Transkriptionsstimulation durch pSREBP-1a von dem SRE-1 abhing, wurde die Cotransfektionsstudie mit Reporterplasmiden wiederholt, die inaktivierende Mutationen in beiden Kopien des SRE-1 enthalten (Fig. 23, obere Tafeln). Einer dieser Plasmide (Q) enthält ein A anstelle von C an Position 3 des SRE-1 (das 5' -C des ersten CAC- Trimers), und das andere Plasmid (X) enthält ein A anstelle von C an Position 10 (das 3'-C des zweiten CAC-Trimers) (siehe Fig. 21). Die Transkription von dem Plasmid, das die Wildtyp-SRE-1-Sequenz enthält (Plasmid K) wurde 10-fach durch eine Co-Transfektion mit pSREBP-1a stimuliert, und die Sterol-Unterdrückung wurde nahezu eliminiert (Fig. 23A). Im Gegensatz dazu wurde die Transkription, die von Plasmid Q angetrieben wurde, nur geringfügig durch pSREBP-1a stimuliert (B), und Plasmid X wurde überhaupt nicht stimuliert (C).
Die Fähigkeit von pSREBP-1a, die Transkription von Reporterkonstrukten, enthaltend die nativen Promoter von drei Sterol-regulierten Genen, zu stimulieren, wurde als nächstes bestimmt (Fig. 23, untere Tafeln). Als eine positive Kontrolle in dieser Studie wurde pSREBPla zusammen mit Plasmid K cotransfiziert, und wiederum wurde eine merkbare Stimulierung der Transkription und ein Wegfall der Sterol-Unterdrückung beobachtet (Fig. 23D). Ein ähnlicher Effekt wurde beobachtet, wenn die Transkription des CAT-Gens durch ein Fragment des nativen LDL-Rezeptor-Promoter angetrieben wurde (G), der Repeats 2 + 3 ebenso wie Repeat 1, eine andere schwache Sp1-Bindungsstelle enthält (Dawson et al., 1988). Das absolute Niveau der CAT-Aktivität war viel niedriger mit dem nativen Promoter-Konstrukt als mit Plasmid K (man beachte die unterschiedlichen Maßstäbe für D und G). Der Promoter für 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-CoA(HMG CoA)-Synthase war viel aktiver als der LDL- Rezeptor-Promoter in diesem Assay, und auch er wurde durch pSREBP-1a mit einem Wegfall der Sterolregulation stimuliert (E). Im Gegensatz dazu wurde der Promoter für die HMG- CoA-Reduktase nicht durch pSREBP-1a beeinflußt (F). Der Promoter für HMG-CoA- Synthase, aber nicht HMG-CoA-Reduktase, enthält eine Sequenz, die die Erfordernisse zur Bindung von SREBP-1 erfüllt (Beispiel 2; Wang et al., 1993; Osborne et al., 1992).

C. Diskussion

SREBP-1, ein Regulator von Cholesterin-Konzentrationen. Das gegenwärtige Beispiel berichtet über die Klonierung und funktionelle Expression von SREBP-1, einem Transkriptionsfaktor der bHLH-Zip-Familie, der die Transkription des LDL-Rezeptor-Gens durch die Bindung an das Sterol-regulatorische Element (SRE-1) aktiviert. Die folgenden Ergebnisgruppen deuten an, daß SREBP-1 ein wesentliches Molekül beim Kontrollieren der LDL-Rezeptor- Gen-Expression ist und daher ein Schlüsselement bei der Kontrolle der Plasma-Cholesterin- Konzentration bei Menschen ist.
Zuerst aktiviert SREBP-1, wenn es in Tierzellen durch Transfektion überproduziert wird, die Transkription von Reportergenen mit artifiziellen Promotern, die vielfache Kopien von SRE-1 enthalten, ebenso wie mit natürlichen Promotern, die die 5'-flankierende Region des LDL- Rezeptor-Gens oder des HMG-CoA-Synthase-Gens enthalten. Zweitens korrelieren die Erfordernisse für die Aktivität von SREBP-1 mit den bekannten Erfordernissen für die Transkription des LDL-Rezeptor-Gens. Drittens ging das von pSREBP-1 produzierte Protein eine Bindung mit Sequenzen ein, die das SRE-1 enthalten, bestimmt durch Gel-Mobilitäts-Shift- Assays. Viertens stimmten die Sequenzerfordernisse zur Bindung genau mit den Erfordernissen für die transkriptionelle Aktivierung durch SRE-1 überein.
SREBP-1 ist ein bHLH-Zip-Protein. Die Sequenz von SREBP-1 macht deutlich, daß es ein Mitglied der bHLH-Zip-Familie von Transkriptionsfaktoren ist. Diese wachsende Familie schließt das onkogene Protein Myc und seine Modulatoren Max, Mad und Mxi1 ein (Ferre- D'Amare et al., 1993; Zervos et al., 1993; Ayer et al., 1993). Sie schließt eine Vielzahl von Proteinen, wie TFE3, die die Transkription von Immunglobulin-Genen regulieren (Beckmann et al., 1990); AP-4, das die Transkription vom SV40-Enhancer aktiviert (Hu et al., 1990) und bestimmte Transkriptionsfaktoren ein, die die Differenzierung in Säugetieren und Insekten regulieren (Murre und Baltimore, 1992). Die bHLH-Zip-Proteine bilden Homodimere und Heterodimere durch Wechselwirkungen zwischen den gepaarten Helices auf aneinandergrenzenden Monomeren. Die Dimerisierung wird durch die angrenzenden Leucin-Zipper verstärkt, die coiled Coils bilden. Die Dimerisierung orientiert die nahegelegenen basischen Regionen der beiden Monomere so, daß sie spezifische Kontakte mit palindromischen Sequenzen in der großen Furche der Ziel-DNA eingehen können (Ferrè-D'Amarè et al., 1993).
Alle der klassischen bHLH-Zip-Proteine erkennen palindromische Sequenzen, die die sogenannte E-Box enthalten (CANNTG). Diese Proteine können in zwei Klassen aufgeteilt werden, abhängig von den beiden zentralen Nukleotiden der E-Box (Dang et al., 1992). Die Klasse-B-Proteine erkennen CACGTC, während die Klasse-A-Proteine CAGCTG erkennen. Vor kurzem haben Ferrè-D'Amarè et al. (1993) über die dreidimensionale Struktur von Max berichtet, einem Klasse-B-bHLH-Zip-Protein, in einem Komplex mit DNA. Die beiden basischen Regionen bilden ausgestreckte α-Helices, die der DNA wie Eßstäbchen ("Chopsticks") aufsitzen. Drei Reste der basischen Region eines einzelnen Monomers machen spezifische Kontakte mit einem der CAC-Trimere und seines gegenüberliegenden GTG (Fig. 24A (oben)). Diese Reste sind His 28, Glu 32 und Arg 36 (im Zählungsschema von Ferre- D'Amare et al. (1993)). Das zweite Proteinmonomer ist an das erste in einer symmetrischen Kopf-an-Kopf-Weise angehängt, wodurch es ermöglicht wird, daß es an die zweite CAC/GTG-Sequenz in umgekehrter Orientierung bindet.
Neue Merkmale von SREBP-1. SREBP-1 unterscheidet sich von den anderen bHLH-Zip- Proteinen in zwei wesentlichen Gesichtspunkten. Erstens ist SREBP-1a, das 1147 Aminosäuren enthält, viel größer als die anderen bHLH-Zip-Proteine, die 160 bis 536 Aminosäuren enthalten. Die Extralänge befindet sich am COOH-terminalen Ende des Proteines. Zweitens erkennt SREBP-1 keine klassische E-Box. Die SRE-1-Zielsequenz hat keine Dyaden- Symmetrie, enthält aber statt dessen eine direkte Wiederholung der Ziel-CAC-Sequenz auf demsE1ben DNA-Strang, getrennt durch zwei Cs (Fig. 24B, (unten)). Die beiden CAC- Sequenzen sind 5 Reste voneinander getrennt, und somit liegen sie auf gegenüberliegenden Seiten der Doppelhelix. Die Bindung von SREBP-1 erfordert beide Kopien von CAC: Punktmutationen (Transversionen) in beiden Kopien lassen die Bindung ebenso wie die Transkriptionsaktivität von SRE-1 wegfallen (Fig. 21).
SREBP-1 hat mit Max die drei Aminosäuren in der basischen Domäne gemeinsam, die mit der CAC/GTG-Sequenz in Kontakt kommen. In SREBP-1 sind diese His 328, Glu 332 und Arg 336 (siehe Fig. 17 (Sternchen) und Fig. 24). Es ist deshalb wahrscheinlich, daß ein Monomer SREBP-1 an ein einzelnes CAC/GTG auf eine Weise bindet, die ähnlich derjenigen ist, die zuvor für Max beschrieben worden ist (Fig. 24). Aber die Bindung von SREBP-1 erfordert zwei sequentielle CAC-Sequenzen ebenso wie die flankierenden Nukleotide. Wie kann ein zweites SREBP-1 Monomer an das zweite CAC/GTG binden? Dies wäre nicht möglich, wenn zwei SREBP-1-Monomere in einem symmetrischen Kopf-an-Kopf-Dimer verbunden wären, wie dasjenige, das für Max beschrieben worden ist. Vielleicht binden zwei Monomere von SREBP-1 an die DNA unabhängig und in dersE1ben Orientierung. Wahrscheinlicher bildet SREBP-1 Multimere höherer Ordnung durch nicht-symmetrische Wechselwirkungen zwischen Helices, wie von Farmer et al. (1992) für die bHLH-Proteine ohne Leucin-Zipper postuliert. Ein solches Multimer könnte sich um die DNA winden, um es den beiden basischen Regionen in dersE1ben Orientierung zu ermöglichen, sich an zwei CAC- Sequenzen auf demsE1ben DNA-Strang anzuhängen, aber auf gegenüberliegenden Seiten der Helix. Die beiden Monomere müßten geringfügig unterschiedliche Kontakte mit der DNA machen, da die beiden Halbseiten eine unterschiedliche Sequenz haben (ATCAC und CCCAC). Darüberhinaus ist das Erfordernis für das terminale C in dem zweiten CAC nicht absolut. Ein Übergang zu einem T wird toleriert (Wildtyp-Maus-SRE-1-Sequenz M in Fig. 19), aber eine Umwandlung in ein A wird nicht toleriert (mutante *-Sequenz in Fig. 19). Die Erfinder erwägen die Durchführung einer detaillierten physikochemischen Charakerisierung von SREBP-1/DNA-Komplexen, um diese Punkte aufzulösen.
Die vorhergesagte α-helikale, saure Region am NH&sub2;-Terminus von SREBP-1a ist wahrscheinlich eine Transkriptionsaktivierungsdomäne. Saure Regionen, die die Transkription aktivieren, werden an den NH&sub2;-Termini von einigen, aber nicht allen bHLH-Zip-Proteinen gefunden, einschließlich Myc und TFE3 (Kato et al., 1990; Beckmann et al., 1990). Die Prolin-reiche Region, die an die saure Region von SREBP-1 angrenzt, kann ebenso eine Rolle bei der Transaktivierung spielen (Mermod et al., 1989).
Alternativ gespleißte Formen von SREBP-1. Die Bedeutung der pCY22-cDNA, deren kodierende Sequenz sich von pCY5 und pCY22 an den NHZ- bzw. COOH-Termini unterscheidet (Fig. 15), muß noch festgestellt werden. Die Erfinder glauben, daß pCY5 und pCY21 die Hauptform von SREBP-1 wiedergeben, weil die beiden cDNAs voller Länge mit Enden, die diesen Sequenzen entsprechen, aus zwei unterschiedlichen Bibliotheken von chinesischen Hamsterzellen isoliert wurden. Die pCY22-Sequenz könnte durch alternatives Spleißen erzeugt werden, oder sie könnte aus einer Umordnung während des Klonierens resultieren. Die vorliegenden Erfinder haben gefunden, daß pSREBP-1c, das pCY22 entspricht, an diesE1be SRE-1-Sequenz bindet, wie pSREBP-1a, und es die von Plasmid K angetriebene Transkription in transfizierten Zellen aktiviert. Darüberhinaus wird die durch pSREBP-1c stimulierte Transkription ebenso wie die durch pSREBP-1a angetriebene nicht durch Sterole unterdrückt. Somit haben die Erfinder bis heute keinen Hinweis auf einen funktionellen Unterschied zwischen pSREBP-1a und pSREBP-1c gefunden. Es sollte bemerkt werden, daß dem NH&sub2;- Terminus des SREBP-1c-Proteins einige der sauren Aminosäuren fehlen, die in SREBP-1a gefunden werden. Jedoch behält der NH&sub2;-Terminus von SREBP-1c insgesamt einen sauren Charakter mit 7 negativ geladenen Resten und keinen positiven bis zu dem Rest, der dem Rest 42 von SREBP-1a entspricht.
Vorgeschlagene regulatorische Rolle von SREBP-1 in Sterol-vermittelter Regulation. Die Überexpression von SREBP-1 stimuliert die Transkription von dem SRE-l, aber es läßt die Sterol-Empfindlichkeit wegfallen. Mehrere Erklärungen sind möglich. Erstens kann SREBP- 1, wie andere bHLH-Zip-Proteine mittels Homo- und Hetero-Oligomerisierung kontrolliert werden. Es ist möglich, daß Homo-Oligomere von SREBP-1 konstitutiv aktiv sind, während Hetero-Oligomere mit einem anderen bHLH-Zip-Protein nur in der Abwesenheit von Sterolen aktiv sind. Die Überexpression von SREBP-1 kann die Bildung von Homo-Oligomeren erzwingen, wodurch eine konstitutive Transkription erzeugt wird. In diesem Hinblick ist es interessant, daß aufgereinigtes SREBP als ein Cluster von Proteinen von 59-68 kDa auf SDS- Polyacrylamidgelen erscheint (Beispiel 2; Wang et al., 1993), und daß eine kodierende Sequenz in keine der pSREBP-1-cDNAs für eines von sechs Peptiden gefunden worden ist (Peptid 4; SEQ ID NO: 44), das aus aufgereinigtem SREBP sequenziert worden ist (Tabelle N). Vorläufige Ergebnisse der Erfinder deuten daraufhin, daß diese Sequenz von einem separaten Protein der bHLH-Zip-Familie kommt, die mit SREBP zusammen aufgereinigt wird.
Andere Mechanismen der Regulation zusätzlich zur Hetero-Oligomerisierung sind möglich, einschließlich Sterol-vermittelter Regulation von SREBP-1-Eintritt oder -Zurückhaltung im Kern durch einen Prozeß, der überwältigt wird, wenn SREBP-1 überexprimiert wird. Der regulierte Kerneintritt oder -Zurückhaltung kann eine Eigenschaft der langen COOHterminalen Hälfte von SREBP-1 sein, das kein Gegenstück in anderen bHLH-Zip-Proteinen hat.

BEISPIEL 4

Molekulare HIonierung, Sequenzierung und weitere Analyse von SREBP-2

Im gegenwärtigen Beispiel offenbaren die Erfinder die Isolierung einer cDNA, die für ein Protein kodiert, das das einzelne Peptid enthält, das nicht in SREBP-1 gefunden wurde. Dieses neue Protein, bezeichnet als SREBP-2, enthält 1141 Aminosäuren, zeigt 47% Identität mit SREBP-1a und hat das bHLH-Zip-Motiv, die saure NH&sub2;-terminale Domäne und den langen COOH-Terminus gemeinsam. SREBP-2 zeigt dieselbe Spezifität zur Bindung von SRE-1, ebenso wie SREBP-1 dies tut, und es aktiviert ebenso die Transkription, die durch Promotoren angetrieben wird, die SRE-1 enthalten. Die Aktivierung findet in der Anwesenheit und Abwesenheit von Sterolen statt, was die Sterol-Unterdrückung wegfallen läßt. Damit haben HeLa-Zellen zwei eng verwandte bHLH-Zip-Transkriptionsfaktoren, von denen jeder die Promotoren aktivieren kann, die eine SRE-1-Sequenz enthalten.

A. Materialien und Methoden

1. Molekularbiologische Techniken. Standardmolekularbiologische Techniken wurden verwendet (Sambrook et al., 1989). Die DNA-Sequenzierung wurde mittels der Dideoxy- Kettenterminierungsmethode manuell oder auf einem Applied Biosystems-DNA-Sequenzierer Modell 373A durchgeführt. Die Blot-Hybridisierung der RNA wurde unter Verwendung von drei endmarkierten Oligonukleotiden, entsprechend Nukleotiden 598-651, 1357-1410 und 2146-2196 von menschlichem pSREBP-2, als Sonden durchgeführt. Ein Antikörper, gerichtet gegen SREBP-2 wurde durch Immunisierung von Kaninchen mit einem synthetischen Peptid produziert, (C)SFTQVTLPSFSPS, entsprechend Aminosäuren 91-103 in SREBP-2 (Fig. 25). Die Immunblot-Analyse wurde unter Verwendung eines ECL-Westem-Blotting- Detection-Kit (Amersham) durchgeführt. Gel-Mobilitäts-Shift-Assays wurden durchgeführt, wie mit einer PCR-erzeugten, ³²P-markierten DNA-Sonde, enthaltend zwei Kopien von Wildtyp- oder mutanten Repeat 2 + 3-Elementen des LDL-Rezeptor-Promoters unter Verwendung eines Reporter-CAT-Gens beschrieben.
2. cDNA-Klonierung von menschlichem SREBP-2. Um eine cDNA-Sonde, entsprechend Peptid 4 von aufgereinigtem SREBP (SFTQVTLPSFSPSAASPQA), zu erhalten, wurden vier Pools degenerierter Oligonukleotide synthetisiert, umfassend
5'-TT(T/C)ACICA(A/G)GT(T/A/G/C)AC(T/A/G/C)(T/C)T-3'
auf der Grundlage des NHZ-Terminus des Peptids, und drei Pools der degenerierten Oligonukleotide, umfassend
5'-GC(T/C)TGIGG(T/A/G/C)(G/C)(A/T)(T/A/G/C)GC-3'
auf der Grundlage des COOH-Terminus des Peptids. Die 12 Primer-Paare wurden in allen Kombinationen in einer zweistufigen PCR-Reaktion (94ºC/50ºC) verwendet, um die Matrizen-DNA zu amplifizieren, die aus einer HeLa-λgt10-cDNA-Bibliothek aufgereinigt worden war (Clontech). Ein Primer-Paar, 5'-TT (T/C) ACICA (A/G) GT (C/G) AC (T/A) (T/C) T-3' und 5'-GC(T/C)TGIGG(A/T/G/C/)GA(G/C)GC-3' ergab ein 53-bp-Insert, das darauffolgend von einem Polyacrylamidgel isoliert, reamplifiziert und in den pCRII-Vektor in einem TA-Klonierkit subkloniert wurde (Invitrogen). Die translatierte Nukleotidsequenz stimmte mit Peptid 4 überein.
Zwei partiell überlappende Paare von Oligonukleotiden auf der Grundlage der 53-bp-Insert- Sequenz (5' -GGTCACATTACCTTCCTTCTC-3' / 5'-TTCCTTCCTTCTCTCCCTCGGC-3' und 5' -GGAGGCCGCCGAGGGAG-3' / 5'-CGAGGGAGAGAAGGAAGGTA-3') wurden zusammen mit forward- und reverse-Primern von λgt10 (New England Biolabs) in einer Anker-PCR-Reaktion verwendet, die mit einem "Touchdown"-Programm (Don et al., 1991) durchgeführt wurde, um die angrenzenden Sequenzen des Insert aus der HeLa-λgt10- cDNA-Bibliothek zu amplifizieren. Fragmente von 168 und 348 bp wurden von den 5'- bzw. 3'-Enden des Insert amplifiziert. Die beiden amplifizierten Fragmente wurden ³²P-markiert mittels des Random-Primer-Verfahrens und verwendet, um eine HeLa-λEXlox-cDNA- Bibliothek zu screenen. Elf positive Klone wurden aus 4,2 · 10&sup5; Plaques erhalten. Ein 4,2-kb- Klon, pXH-4, wurde auf beiden Strängen sequenziert.
Um auf längere cDNAs zu screenen, erzeugten die Erfinder ein PCR-Fragment, entsprechend den 258 bp von pXH-4, die am meisten 5' waren. Dieses 258-bp-Fragment wurde ³²Pmarkiert mittels des Random-Primer-Verfahrens und verwendet, um 5,2 · 10&sup5; Plaques aus der HeLa-λEXlox-cDNA-Bibliothek zu screenen. Zwanzig positive Klone wurden erhalten. Der längste Klon, pXH-11, war ~5,2 kb lang. Er erstreckte sich nicht über das 5'-Ende von pXH- 4 hinaus. Stattdessen erstreckte er sich weiter in der 3'-Richtung. Die 3'-nicht-translatierte Region von pXH-11 (1,1 kb) wurde auf beiden Strängen sequenziert.
3. Transfektion und Reporter-CAT Assays. Ein Expressionsvektor für SREBP-2, bezeichnet als pSREBP-2, wurde durch Klonierung des SalI-4,2-kb-Insert aus pXH-2 in die SalI-Stelle von pCMV7 konstruiert (Andersson et al., 1989). Monoschichten von 293-Zellen aus menschlichen Embryonennieren wurden mit 0-0,6 ug pSREBP-1 oder pSREBP-2, 0,3 ug pVA und 1 ug des angezeigten Reporter-CAT-Gens, wie beschrieben, cotransfiziert. Die Gesamtmenge an cDNA wurde auf 3 ug durch Zugabe von pCMV (Vektorkontrolle) und Lachs- Spermium-DNA eingestellt. Nach 2 Tagen wurden die Zellen geerntet, und die CAT-Aktivität wurde mittels des Xylen-Extraktionsverfahrens (Briggs et al., 1993) gemessen. Der Proteingehalt wurde mittels des Verfahrens von Bradford gemessen (Bradford, 1976).
4. Produktion von rekombinanter bHLH-Zip-Domäne von SREBP-2. Die Nukleotidsequenz, entsprechend den Aminosäuren 48-403 von SREBP-2, wurde mittels PCR amplifiziert, zwischen den BamHI/HindIII-Stellen eines pQE-30-Vektors subkloniert (enthaltend 6 aufeinanderfolgende Histidine nach dem Initiationsmethionin) (Qiagen) und in E. coli exprimiert. Das resultierende Fusionsprotein wurde mittels NI²&spplus;-Sepharose-Affinitätschromatographie aufgereinigt.

B. Resultate

In Beispiel 3 wurde die Sequenz von 6 Peptiden offenbart, die aus einer Mischung von SREBPs, isoliert aus HeLa-Zellen, erhalten worden waren. Die DNA-Sequenzen, die für 5 der 6 Peptide kodieren, wurden in SREBP-1 gefunden. Unter Verwendung einer Strategie auf Grundlage einer sequentiellen PCR, angewendet auf eine HeLa-Zell-cDNA-Bibliothek, isolierten die Erfinder eine cDNA, die für das einzelne Peptid kodierte (Peptid 4), das in SREBP- 1 fehlte (siehe Materialien und Methoden). Der längste der anfänglichen Klone, bezeichnet als pXH-4, hatte 4,2 kb Länge (Nukleotide 1 bis 4249) und kodierte für ein Protein von 1141 Aminosäuren. Diese cDNA hatte eine vermeintliche 5'-nicht-translatierte Region von 117 bp; ihm fehlte ein Terminationskodon stromauf von dem ersten In-Frame-Methionin. Um sicherzustellen, daß das erste Methionin in der Tat das Initiationsmethionin war, wurde die Bibliothek unter Verwendung einer Sonde, entsprechend dem 5'-Ende von pXH-4, erneut gescreent. Der längste isolierte Klon (pXH-11) hatte 5,2 kb Länge und kodierte nicht für zusätzliche 5'- Sequenz (Nukleotide 88 bis 5197). Stattdessen erstreckte er sich weiter in der 3'-Richtung und endete in einem Poly-A-Abschnitt.
Eine exprimierbare cDNA wurde aus pXH-4 konstruiert. Die Sequenz dieser cDNA, bezeichnet als pSREBP-2, wurde in GenBank hinterlegt (Hinterlegungsnummer U02031). pSREBP-2 schließt eine 5'-nicht-translatierte Region von 117 bp und einen offenen Leserahmen von 3423 bp und eine 3'-nicht-translatierte Region von 1654 bp ein, die in einem Poly-A- Abschnitt endet, der 18 Nukleotide entfernt von einem Konsensus-Polyadenylierungssignal von Nukleotid 5164 ist. Die 3' -nicht-translatierte Region enthält zwei weitere vermeintliche Polyadenylierungsstellen, eine nahe dem 3'-Ende von pXH-4 bei Nukleotid 4234 und die andere an Nukleotid 4611. Es wird geglaubt, daß pSREBP-2 eine cDNA voller Länge repräsentiert, weil seine Länge der längsten mRNA entspricht, die auf Northern Blots nachgewiesen wird (siehe unten) und weil das Initiationsmethionin in einer Position auftritt, die dem Initiationsmethionin in SREBP-1a entspricht (siehe Fig. 25; SEQ ID NO: 53). SREBP-2 enthält 1141 Aminosäuren. Die Reste 91-109 entsprechen genau der Sequenz von Peptid 4, stammend aus der aufgereinigten SREBP-Zubereitung.
Fig. 25 (A-1, A-2, B & C) vergleicht die Aminosäuresequenzen und Domän-Karten von SREBP-1a und SREBP-2. Die zwei Proteine haben 47% ihrer Aminosäuren gemeinsam, und die Identitäten erstrecken sich durch die gesamten Proteine. In der bHLH-Zip-Region sind die Proteine 71% identisch, und SREBP-2 hat alle der wichtigen Aminosäuren gemeinsam, die die bHLH-Zip-Konsensus-Sequenz bilden. SREBP-2 hat ebenso die Histidin-, Glutaminsäure- und Arginin-Reste gemeinsam (bezeichnet durch die Sternchen in Fig. 25B), die in SREBP- 1 gefunden werden und die bei der DNA-Erkennung durch Max, einem anderen b-HLH-Zip- Protein impliziert worden sind (Ferre-D'Amare et al., 1993). Beide Proteine haben ein Paar negativer Reste, die unmittelbar dem Initiationsmethionin folgen. Obwohl die NH&sub2;-terminalen Enden der beiden Proteine nur 33% identisch sind, haben sie einen extrem sauren Charakter gemeinsam. Die NH&sub2;-terminalen 51 Aminosäuren von SREBP-2 schließen 14 negative Reste (27%) ein. Die erste basische Aminosäure (ein Arginin) tritt nicht bis Position 77 auf. Dies ist ähnlich der Situation bei SREBP-1a, bei dem der erste basische Rest an Position 108 auftritt. Die saure Region von SREBP-2 wird von einer Region gefolgt, bei der Serin, Prolin und Glycin 60% der Reste ausmachen. Die entsprechende Region von SREBP-1a ist ebenso reich an Prolin und Serin, aber nicht an Glycin. SREBP-2 enthält ein Merkmal, das nicht in SREBP-1 vorhanden ist, nämlich eine Glutamin-reiche Region, die sich von den Resten 125- 246 erstreckt (27% Gln). Die COOH-terminalen Hälften beider Proteine haben lange Identitätsabschnitte gemeinsam (49% identisch über 684 Reste).
Die mRNA für SREBP-2, wie die für SREBP-1, wird in einer großen Vielzahl menschlicher Gewebe exprimiert, was durch Northern Blots aufgezeigt wird (Fig. 26A). In den meisten Geweben hat die vorherrschende mRNA 5,2 kb Länge, entsprechend pXH-11. Eine weniger reichlich vorhandene mRNA von ~4,2 kb wird ebenso gesehen. Es wird von den Erfindern geglaubt, daß dies pXH-4 entspricht und die Verwendung eines Stromauf- Polyadenylierungssignals repräsentiert. Die mRNA wird ebenso verbreitet in menschlichen fötalen Geweben exprimiert, wie in den fünf Spuren auf der rechten Seite von Fig. 26A gezeigt wird.
Die Sequenz von pXH-4 wurde in ein Expressionsplasmid unter Kontrolle des CMV- Promoters eingefügt und in 293-Zellen mittels Transfektion eingeführt. Die Zellextrakte wurden einer SDS-Elektrophorese und Immunblotting mit einem anti-Peptid-Antikörper unterzogen, der gegen SREBP-2 gerichtet war. Fig. 26B zeigt, daß die Zellen ein Protein von näherungsweise 120 kDa produzierten, übereinstimmend mit dem vorhergesagten Molekulargewicht von SREBP-2, was 123.665 ist.
Bei dem LDL-Rezeptor-Promoter wird das SRE-1 innerhalb einer 16-bp-Sequenz enthalten, die als Repeat 2 bezeichnet wird, der unmittelbar eine 16-bp-Sequenz folgt, die als Repeat 3 bezeichnet wird (siehe frühere Beispiele und Smith et al., 1990; Goldstein et al., 1990). Repeat 3 bindet nicht an SREBP, aber es enthält stattdessen eine Bindungsstelle für einen anderen Transkriptionsfaktor, Sp1 (siehe frühere Beispiele und Dawson et al., 1988). Die Transkription auf hohem Niveau erfordert Repeats 2 und 3. Um die Bindungsaktivität von SREBP-2 zu testen, wurde ein Teil der cDNA, die für die bHLH-Zip-Region kodiert, in einen E. coli-Expressionsvektor eingeführt. Das Protein wurde mit einer NH&sub2;-terminalen Erweiterung von 6 Histidinresten produziert, die die Isolierung auf einer Ni²&spplus;-Agarose-Säule erlaubte (siehe Materialien und Methoden). Das aufgereinigte Protein ergab eine verzögerte Bande, wenn es mit einem ³²P-markierten Oligonukleotid inkubiert wurde, das zwei Tandern-Kopien von Repeats 2 + 3 (Fig. 27) enthielt. Die Bindung wurde merkbar verringert oder fiel weg, weim irgendeines der Nukleotide in dem SRE-1 einer Transversionsmutation unterzogen wurde, mit der Ausnahme des C an Position 6, das das einzige der SRE-1-Mutanten ist, das aktiv in vivo transkribiert wird. Ein geringer Bindungsgrad wurde beobachtet, wenn das A an Position 4 zu einem T mutiert wurde. Diese Sequenz verursacht eine niedrige, aber nachweisbare Transkription in vivo. Die Mutationen in den Repeat 2-Sequenzen, die SRE-1 flankieren, hatten keinen Effekt auf die SREBP-2-Bindung.
Um die Aktivität von SREBP-2 auf die Gentranskription zu testen, verwendeten wir den Säugetier-Expressionsvektor, der SREBP-2 produziert, angetrieben durch den CMV-Promoter (siehe Fig. 26B), und einen ähnlichen Vektor, der SREBP-1a produziert (Beispiel 3). Diese Konstrukte oder ein Kontroll-pCMV-Vektor wurden in 293-Zellen zusammen mit Plasmiden eingeführt, die ein CAT-Transkriptions-Reporter-Gen enthalten, angetrieben durch Promotoren, die SRE-1 enthalten. Wenn zusammen mit pCMV transkribiert, wurde das Plasmid K, das zwei Tandern-Kopien von Repeats 2 + 3 enthält (Beispiele 2 und 3), in der Abwesenheit von Sterolen transkribiert und durch Sterole reprimiert (Fig. 28A). Eine Cotransfektion mit entweder pSREBP-2 oder pSREBP-1a verstärkte in merkbarer Weise die Transkription in der Abwesenheit und Anwesenheit von Sterolen, was die Sterol-Unterdrückung wegfallen ließ. Diese Stimulierung wurde nicht mit Plasmid X beobachet, das eine Punktmutation enthält, die das SRE-1 inaktiviert (Fig. 28B). Die Promotoren für HMG-CoA-Synthase (Fig. 28C) und der LDL-Rezeptor (Fig. 28D) wurden ebenso mittels pSREBP-2 zu einem ähnlichen Ausmaß wie pSREBP-1a stimuliert. Es gab keine signifikante Stimulierung des Promoters für die HMG-CoA-Reduktase, der nicht SRE-1 enthält (Fig. 28E).
Die Daten von Fig. 28 legen nahe, daß SREBP-2 und -1a auf ähnliche Weise bei der Stimulierung der Transkription wirken, angetrieben durch die Promotoren, die SRE-1 enthalten. Um zu bestimmen, ob die Effekte additiv sind, führten die Erfinder eine Titrationsstudie durch (Fig. 29). 293-Zellen wurden mit Plasmid K plus steigenden Konzentrationen von pSREBP- 2, alleine oder zusammen mit einer festen Menge (0,02 ug) pSREBP-1a, cotransfiziert. Als ein Leerwert für die CAT-Assays wurde die in der Abwesenheit von beiden SREBP beobachtete Aktivität subtrahiert, und deshalb repräsentieren die Daten, die SREBP-stimulierte Transkriptionsaktivität. Die gestrichelte Linie in Fig. 29 zeigt die zu erwartende CAT- Aktivität an, wenn die Wirkungen von SREBP-1a und -2 additiv wären. In der Abwesenheit von Sterolen ergaben steigende Mengen pSREBP-2 eine nahezu lineare Steigerung in der CAT-Aktivität bis zu 100 nmol·miri&supmin;¹·mg&supmin;¹ (Fig. 29A, ausgefüllte Kreise). pSREBP-1a alleine erhöhte die CAT-Aktivität um 40 nmol·min&supmin;¹·mg&supmin;¹. In der Anwesenheit von SREBP-1a ergab die weitere Zugabe von pSREBP-2 in Mengen bis zu 0,2 ug einen additiven Effekt, was zum Erreichen eines Plateau bei 80 nmol·min&supmin;¹·mg&supmin;¹ führte (ausgefüllte Dreiecke). Ein Erhöhen von pSREBP-2 über dieses Niveau erzeugte keine weitere Steigerung in der CAT- Aktivität. Ähnliche Resultate wurden in der Anwesenheit von Sterolen erhalten (Fig. 29B).

C. Diskussion

Dieses Beispiel demonstriert die Primärstruktur und das Aktivitätsprofil von SREBP-2, dem zweiten Mitglied einer Familie von Sterol-regulatorischen-Element-Bindeproteinen. Die Sequenz und biologischen Aktivitäten dieses Proteins ähneln denjenigen von SREBP-1a, das in dem vorhergehenden Beispiel diskutiert wurde. Der Grund für die Existenz von zwei Sterol- Bindungsproteinen ist noch nicht klar. Beide Proteine werden wahrscheinlich in denselben Zellen exprimiert, worauf die Beobachtung hinweist, daß mRNAs für SREBP-1a und 2 in denselben Geweben vorhanden sind und beide Proteine aus HeLa-Zellen aufgereinigt und ihre cDNAs kloniert wurden.
bHLH-Proteine mit oder ohne Leucin-Zipper, funktionieren gewöhnlich durch Bildung von Homo- oder Heterodimeren (Ferre-D'Amare et al., 1993). Die Erfinder haben vorläufige Ergebnisse dahingehend, daß SREBP-1a Homodimere und Homomultimere höherer Ordnung bilden kann. Bis heute haben die Erfinder nicht potentielle Wechselwirkungen zwischen SREBP-1a und 2 nicht untersucht. Jedes ist in der Lage, DNA unabhängig zu binden, was durch Gel-Retardationsassay unter Verwendung von rekombinanten Proteinen, die in E. coli hergestellt oder in Retikulocyten-Lysaten translatiert worden sind, gezeigt worden ist. Darüber hinaus stimuliert jedes unabhängig die Transkription aus SRE-1-enthaltenden Promotoren in transfizierten Zellen. Die letztere Schlußfolgerung muß abgeschwächt werden, weil wir nicht die formale Möglichkeit ausschließen können, daß die aktive Spezies ein Heterodimer zwischen dem durch die transfizierte cDNA produzierten Protein und einem endogenen Partner ist.
Wenn zusammen in niedrigen Konzentrationen transfiziert, produzieren pSREBP-1a und -2 additive Effekte auf die Transkription, wie durch CAT-Assays angezeigt. In höheren Konzentrationen wird ein Plateau erreicht, und eine Additivität ist nicht länger sichtbar. Die einfachste Erklärung ist die, daß jedes Protein in der Lage ist, an SRE-1 zu binden und die Transkription unabhängig zu aktivieren, und daß das SRE-1 allmählich mit einem oder dem anderen SREBP gesättigt wird, was jegliche weitere Steigerung beschränkt. Ob separat oder zusammen transfiziert, lassen SREBP-1a und SREBP-2 die Sterol-Unterdrückung wegfallen.
Der eine auffallende Unterschied zwischen SREBP-2 und -1a ist die Glutamin-reiche Region in dem ersteren. Es wird über Glutamin-reiche Region berichtet, daß sie die Transkription aktivieren, vermutlich durch Wechselwirkung mit Co-Aktivator-Proteinen (Pugh et al., 1990). SREBP-1a und -2 haben beide saure NH&sub2;-Termini, die wahrscheinlich transkriptionsaktivierende Domänen sind. Es ist möglich, daß die zusätzliche Glutamin-reiche Domäne in SREBP-2 ermöglicht, daß es mit einem zusätzlichen Co-Aktivator wechselwirkt und dadurch Effekte produziert, die von denjenigen von SREBP-1a unterschiedlich sind.
Der Mechanismus mit dem Sterole die Aktivität von SREBP-1 und 2 reduzieren, bleibt verschleiert. Die Erfinder stellen die Hypothese auf, daß diese Kontrolle in transfizierten Zellen wegfällt, weil ein Bestandteil der regulatorischen Maschinerie durch die große Menge an SREBP überwältigt wird, das produziert wird.
Während die Zusammensetzungen und Verfahren dieser Erfindung hinsichtlich der bevorzugten Ausführungsformen beschrieben worden sind, wird es Fachleuten klar sein, daß Variationen der Zusammensetzung, den Verfahren und in den Schritten oder in der Folge der Schritte des hierin beschriebenen Verfahren angebracht werden können, ohne von dem Konzept, dem Geist und dem Umfang der Erfindung abzuweichen. Genauer, es wird deutlich sein, daß bestimmte Mittel, die sowohl chemisch als auch physiologisch verwandt sind, für die hierin beschriebenen Mittel substituiert werden können, während gleichzeitig dieselben oder ähnliche Resultate immer noch erreicht würden. Alle solchen ähnlichen Substitute oder Modifizierungen, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, sollen innerhalb des Geistes, des Umfangs und des Konzepts der Erfindung sein, wie durch die angehängten Ansprüche definiert. Alles, was beansprucht ist, kann ohne übermäßige Experimentierung gemacht werden.
LITERATURANGABEN
Die folgenden Literaturangaben, in dem Ausmaß, wie sie beispielhafle Verfahrens- oder andere Einzelheiten bereitstellen, die zu den hierin dargestellten ergänzend sind, werden spezifisch durch Bezugnahme einbezogen.
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Claims

1. Sterol-regulatorisches-Element-Bindeprotein (SREBP-Protein) oder -Polypeptid, wobei das SREBP-Protein oder -Polypeptid eine bHLH-Zip-Domäne umfaßt, die selektiv an SRE-1 DNA bindet, welche die in SEQ ID NO: 27 dargestellte Sequenz aufweist, wobei die selektive Bindung als die Fähigkeit des Proteins oder Polypeptids gekennzeichnet ist, die Mobilität eines Oligonukleotids zu verzögern, daß die SRE-1 DNA enthält, wenn das Oligonukleotid einer Gelelektrophorese unterzogen wird, wobei das SREBP-Protein oder -Polypeptid die Fähigkeit aufweist, die Transkription von Genen unter der Kontrolle solcher SRE-1 DNA in der Abwesenheit oder Anwesenheit von Sterolen zu stimulieren.

2. SREBP-Protein oder -Polypeptid nach Anspruch 1, weiter als ein SREBP-Protein definiert, das ein scheinbares Molekulargewicht von ungefähr 130 kD aufweist, wenn durch SDS-PAGE gemessen.

3. SREBP-Protein oder -Polypeptid nach Anspruch 1, weiterhin definiert als ein SREBP- Polypeptid-Subfragment von SREBP-1 oder SREBP-2, das ein scheinbares Molekulargewicht von 59 kD bis 68 kD aufweist, wenn durch SDS-PAGE gemessen.

4. SREBP-Protein oder -Polypeptid nach Anspruch 3, weiter als ein SREBP-1a oder SREBP-2-Protein definiert, das eine Aminosäuresequenz in Übereinstimmung mit der jeweils in SEQ ID NO: 38 und in SEQ ID NO: 54 angegebenen aufweist.

5. SREBP-Protein oder -Polypeptid nach einem der voranstehenden Ansprüche, das eine spezifische Aktivität von bis zu ungefähr 5.000 Einheiten/mg Protein aufweist.

6. SREBP-Protein oder -Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das eine spezifische Aktivität von bis zu ungefähr 70.000 Einheiten/mg Protein aufweist.

7. SREBP-Protein oder -Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das eine spezifische Aktivität von bis zu ungefähr 8.700.000 Einheiten/mg Protein aufweist.

8. Zusammensetzung, umfassend ein gereinigtes DNA bindendes SREBP-Protein oder - Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7, das eine DNA bindende Domäne aufweist, wobei die Bindedomäne ein scheinbares Molekulargewicht von 59 kD bis 68 kD auf SDS-PAGE zeigt, wobei das DNA bindende Polypeptid aus Säugerzellkernen erhältlich ist, das an das Sterol regulatorische Element SRE-1 bindet, das die in SEQ ID NO: 27 gezeigte Sequenz zeigt.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei die Säugerzellen Hela-Zellen sind.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 9, wobei das DNA bindende Polypeptid durch rekombinante DNA-Techniken erhältlich ist, die einen Expressionsvektor einschließen, der für das DNA bindende Polypeptid kodiert.

11. SREPB-Protein oder -Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7, 200-fach bis 38.000-fach gereinigt, relativ zu seinem natürlichen Zustand.

12. Antikörper, der eine Bindungsaffinität für ein SREBP-Protein oder -Polypeptid wie definiert in einem der Ansprüche 1 bis 7 aufweist, wobei der Antikörper ein polyklonaler Antikörper oder ein monoklonaler Antikörper ist.

13. Nukleinsäuresegement, umfassend ein Gen, das für ein SREBP-Protein oder -Polypeptid, wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 definiert, kodiert, oder Fragemente von solchen Nukleinsäuresegmenten, wobei die Fragmente der Segmente einen mindestens 20, 30, 50, 100 oder 1000 Nukleotide langen Abschnitt umfassen, der sequenziell identisch zu einer Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 37 oder 53 ist.

14. Nukleinsäuresegement nach Anspruch 13, weiter definiert als ein DNA-Segment.

15. Nukleinsäuresegment nach Anspruch 13 oder 14, wobei das Segment eine Länge von bis zu 10.000, 5.000, 1.000, 500 oder 50 Basenpaaren aufweist.

16. DNA-Segment, frei von einem assoziierten, für ein Protein kodierendes Gen, wobei das Segment angrenzend an solch eine kodierende Sequenz positionierbar ist, um so SREBP-vermittelte Kontrolle dafür zu vermitteln, wobei das Segment eine SRE-1- Sequenz umfaßt, wie durch SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 15. SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 oder SEQ ID NO: 19 definiert, wobei das DNA-Segment eine Länge von 18 bis 100 Nukleotiden aufweist.

17. DNA-Segment, frei von einem assoziierten, für ein Protein kodierendes Gen, wobei das Segment eine nicht-aktive SRE-1-Mutante, wie durch die Sequenzen nach SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 oder SEQ ID NO: 14 definiert umfaßt, wobei das DNA-Segment eine Länge von 18 bis 100 Nukleotiden aufweist.

18. Rekombinante Wirtszelle, umfassend ein Nukleinsäuresegment, wie in einem der Ansprüche 13 bis 15 definiert, wobei die Wirtszelle eine prokaryontische oder eukaryontische Zelle ist.

19. Verfahren zur Herstellung eines SREBP-Proteins, wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 definiert, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt von:

(i) Herstellen eines rekombinanten Expressionsvektors, der ein isoliertes Gen umfaßt, das für ein SREBP kodiert, das an das SRE-1-DNA-Segment von SEQ ID NO: 27 bindet, wobei das isolierte Gel unter der Kontrolle eines Promotors positioniert vorliegt;

(ii) Einführen des rekombinanten Expressionsvektors in eine Wirtszelle;

(iii) Anziehen der Wirtszelle unter Bedingungen, die effektiv sind, um die Expression des kodierten SREBP-Proteins zu ermöglichen; und

(iv) Sammeln des exprimierten SREBP-Proteins.

20. Verfahren zur Unterstützung von SRE-1 vermittelter Transkription mit SREBP, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt von:

(i) Erhalten eines Genkonstrukts, das eine kodierende Region unter der transkriptionellen Kontrolle einer SRE-1-Sequenz von SEQ ID NO: 27 einschließt;

(ii) Supprimieren der Expression des Genkonstrukts mit einem Sterol; und

(iii) Unterstützen der Expression des Konstrukts mit einem SREBP-Protein oder Polypeptid, wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 definiert.

21. Verfahren zur Herstellung einer im wesentlichen gereinigten DNA-Bindeprotein- Zusammensetzung, die in der Lage ist, an das Sterol regulatorische Element SRE-1 zu binden, das die in SEQ ID NO: 27 dargestellte Sequenz aufweist, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt von:

(i) Herstellen eines Extrakts aus Säugerzellen, insbesondere von Hela-Zellen;

(ii) Unterziehen des Extrakts einer Fraktionierung, insbesondere einer Fraktionierung durch Ammoniumsulfat-Fällung, Chromatographie oder Ultrazentrifugieren;

(iii) Identifizieren einer positiven Fraktion, die ein DNA bindendes Protein enthält, das an das Sterol regulatorische Element SRE-1 bindet, wobei dieser Schritt insbesondere die Durchführung eines Gel-Shift-Assays umfaßt; und

(iv) Sammeln dieser positiven Fraktion.

22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei der Extrakt durch Ionen- Austauschchromatographie, Gelfiltrations-Chromatographie oder DNA-Affinitäts- Chromatographie fraktioniert wird.

23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Fraktionierung unter der Verwendung eines wie in Anspruch 12 definierten Antikörpers durchgeführt wird.

24. Verfahren zur Identifizierung einer Kandidaten-Substanz, die in der Lage ist, SRE-1 vermittelte Transkription zu stimulieren, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt von:

(i) Herstellen eines SREBP-Proteins oder Polypeptids, wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 definiert; und

(ii) Bestimmen der Fähigkeit einer Kandidaten-Substanz, die Bildung eines SREBP-Protein: DNA-Komplexes zwischen der SREBP- Proteinzusammensetzung und einem DNA-Segment zu erhöhen, das das Sterol regulatorische Element SRE-1 nach SEQ ID NO: 27 einschließt.

25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei Schritt (ii) umfaßt;

(i) In Kontakt bringen einer ersten Probe des SREBP-Proteins oder -Polypeptids mit einem ersten SRE-1 DNA-Segment unter Bedingungen, die effektiv sind, um die Bildung eines ersten SREBP-Protein: DNA-Komplexes zu ermöglichen;

(ii) In Kontakt bringen einer zweiten Probe des SREBP-Proteins oder -Polypeptids mit einer Kandidaten-Substanz, bevorzugterweise eines Sterolderivats, einer Phosphatase oder einer Kinase und einem zweiten SRE-1 DNA-Segment, unter Bedingungen, die effektiv sind, um die Bildung eines zweiten SREBP- Protein: DNA-Komplexes zu ermöglichen;

(iii) Trennen des ersten und zweiten SREBP-Protein: DNA-Komplexes von ungebundem SREBP-Protein oder - DNA; und

(iv) Messen der Menge von ersten und zweiten SREBP-Protein: DNA-Komplexen, wobei eine erhöhte Menge des zweiten Komplexes relativ zum ersten Komplex eine Kandidaten-Substanz anzeigt, die in der Lage ist, SRE-1 vermittelte Transkription zu stimulieren.

26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei das SREBP-Protein oder -Polypeptid oder das DNA-Segment eine nachweisbare Markierung einschließt.

27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei die Markierung eine radioaktive oder Enzym- Markierung ist.

28. Verfahren nach Anspruch 25, wobei das SREBP-Protein oder- Polypeptid oder das DNA-Segment an einen festen Träger gebunden ist, und nicht gebundenes SREBP- Protein oder -DNA von den SREBP-Protein: DNA-Komplexen durch Waschen abgetrennt wird, und/oder wobei die SREBP-Protein: DNA-Komplexe mittels eines gegen das SREBP-Protein oder -Polypeptid gerichteten Antikörpers nachgewiesen werden und/oder wobei nicht gebundenes SREBP-Protein oder -DNA von den SREBP- Protein: DNA-Komplexen durch Elektrophorese abgetrennt wird.

29. Verfahren zur Stimulierung von SRE-1-vermittelter Transkription, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt von:

(i) Herstellen eines SREBP-Proteins oder -Polypeptids, wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 definiert; und

(ii) Modifizieren des SREBP-Proteins auf eine Weise, die effektiv ist, um die Bindung an ein DNA-Segment zu erhöhen, das das Sterol regulatorische Element von SRE-1 nach SEQ ID NO: 27 einschließt.

30. Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Modifikation durch Behandlung mit einer Phosphatase oder Kinase erreicht wird.

31. Verfahren zur Identifizierung einer Kandidaten-Substanz, die in der Lage ist, SRE-1vermittelte Transkription zu stimulieren, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt von:

(i) Herstellen einer rekombinanten Wirtszelle, die ein SREBP-Gen enthält, das für ein SREBP-Protein oder -Polypeptid, wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 definiert, kodiert und ein Reportergen unter der transkriptionellen Kontrolle eines funktionellen SRE-1 Sterol-regulatorischen Elements das die in SEQ ID NO: 27 dargestellte Sequenz aufweist;

(ii) Anziehen der Wirtszelle unter Bedingungen, die effektiv sind, um die Expression des Reportergens zu ermöglichen;

(iii) In Kontakt bringen der Wirtszelle mit einer Kandidaten-Substanz; und

(iv) Messen der Expression des Reportergens, wobei eine Zunahme der Reportergen-Expression in Anwesenheit der Kandidaten-Substanz auf eine Kandidaten- Substanz hinweist, die in der Lage ist, SRE-1-vermittelte Transkription zu stimulieren.

32. Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Wirtszelle in der Anwesenheit von Sterolen angezogen wird und wobei eine Zunahme der Reportergen-Expression in der Anwesenheit der Kandidaten-Substanz auf eine Kandidaten-Substanz hinweist, die in der Lage ist, SRE-1-vermittelte Transkription in der Anwesenheit von Sterolen zu stimulieren.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN

(i) ANMELDER:

(A) NAME: BOARD OF REGENTS THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM

(B) STRASSE: 201 WEST 7TH STREET

(C) ORT: AUSTIN

(D) STAAT: TEXAS

(E) LAND: USA

(F) POSTLEITZAHL: 78701

(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: VERFAHREN UND ZUSAMMEN- SETZUNGEN, BETREFFEND STEROL-REGULATORISCHE-ELEMENT- BINDEPROTEINE

(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 54

(iv) KORRESPONDENZANSCHRIFT:

(A) EMPFÄNGER: ARNOLD, WHITE & DURKEE

(B) STRASSE: P. O. BOX 4433

(C) ORT: HOUSTON

(D) STAAT: TEXAS

(E) LAND: USA

(F) POSTLEITZAHL: 77210

(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:

(A) DATENTRÄGER: Floppy disk

(B) COMPUTER: IBM-PC-kompatibel

(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: WordPerfect 5.1

(vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:

(A) ANMELDENUMMER: NICHT BEKANNT

(B) ANMELDETAG: MIT DIESER ANMELDUNG

(C) KLASSIFIKATION: NICHT BEKANNT

(vii) DATEN DER VORANMELDUNG

(A) ANMELDENUMMER: 08/131,365

(B) ANMELDETAG: 01/10/93

(viii) INFORMATION ZUM ANWALT:

(A) NAME: PARKER, DAVID L.

(B) REGISTRIERNUMMER: 32,165

(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: UTFD372P--

(ix) INFORMATION ZUR TELEKOMMUNIKTION:

(A) TELEFON: (S 12) 320-7200

(B) TELEFAX: (512) 474-7577

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 18 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

AAAATCACCC CACTGCAA 18

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 18 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

TAAATCACCC CACTGCAA 18

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 18 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:

ATAATCACCC CACTGCAA 18

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 18 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

AATATCACCC CACTGCAA 18

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 18 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:

AAATTCACCC CACTGCAA 18

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 18 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:

AAAAGCACCC CACTGCAA 18

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 18 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:

AAAATAACCC CACTGCAA 18

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 18 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:

AAAATCTCCC CACTGCAA

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 18 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:

AAAATCAACC CACTGCAA 18

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 18 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:

AAAATCACGC CACTGCAA 18

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 18 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQIJENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:

AAAATCACCG CACTGCAA 18

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 18 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:

AAAATCACCC AACTGCAA 18

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 18 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:

AAAATCACCC CTCTGCAA 18

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 18 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:

AAAATCACCC CAATGCAA 18

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 18 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:

AAAATCACCC CACGGCAA 18

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 18 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:

AAAATCACCC CACTTCAA 18

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 18 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:

AAAATCACCC CACTGAAA 18

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 18 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:

AAAATCACCC CACTGCTA 18

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 18 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:

AAAATCACCC CACTGCAT 18

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 20:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 18 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:

AAAATCACAC CACTGCAA 18

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 21:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 18 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:

AAAATCACCC CATTGCAA 18

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 22:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 16 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22:

AAAATCACCC CACTGC 16

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 23:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 16 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 23:

AAACTCCTCC CCCTGC 16

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 24:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 32 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 24:

AAAATCACCC CACTGCAAAC TCCTCCCCCT GC 32

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 25:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 32 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 25:

AAAAGAACCC CTATGCAAAC TCCTCCCCCT GC 32

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 26:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 117 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 26:

TGAAGCTTGC ATGCCTGCAG GTCGACTCGA CTCTAGAGGG TATATAATGG ATCCCCGGGT 60

ACCGAGCTCG AATTCATCAG CTTGGCGAGA TTTTCAGGAG CTAAGGAAGC TAAAATG 117

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 27:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 10 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 27:

ATCACCCCAC 10

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 28:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 36 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 28:

GACACTATAG AACTCGAGCA GCTGAAGCTT GCATGC 36

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 29:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 25 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 29:

GGTACCCGGG GATCCATTAT ATACC 25

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 30:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 38 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 30:

TCGACAAAAG ATAAGATGTG CAAACTCCTC CCCCTGCG 38

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 31:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 38 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 31:

TCGACAAAAG ATAAGATATG CAAACTCCTC CCCCTGCG 38

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 32:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 38 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 32:

TCGACGCAGG GGGAGGAGTT TGCATATCTT ATCTTTTG 38

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 33:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 38 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 33:

TCGACAAAAT CACCCCACTG TAAAATCACC CCACTGTG 38

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 34:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 38 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 34:

TCGACACAGT GGGGTGATTT TACAGTGGGG TGATTTTG 38

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 35:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 16 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 35:

GATCATCACC CCACTG 16

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 36:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 16 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 36:

GATCCAGTGG GGTGAT 16

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 37:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 4154 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(ix) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) LAGE: 167..3607

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 37:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 38:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 1147 Aminosäuren

(8) ART: Aminosäure

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 38:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 39:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 71 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(ix) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) LAGE: 3..71

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 39:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 40:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 23 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 40:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 41:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 547 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(ix) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) LAGE: 1311

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 41:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 42:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 37 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 42:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 43:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 10 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 43:

TAGTGGGGTG 10

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 44:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 19 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ D N0: 44:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 45:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 20 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 45:

TTYTCYTGYT TIAGYTTYTG

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 46:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 24 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 46:

GGCTTATGAG TATTTCTTCC AGGG

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 47:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 17 Nukleinsäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 47:

TTYTGRTTIG ARTGYTG

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 48:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 48:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 49:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 49:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 50:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 50

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 51

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 60 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 51:

CGCGGATCCG ATGACGATGA CAAACGTCGT GCATCTGTTG AGAAGCTGCC TATCAACCGG

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 52:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 37 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 52:

CTAATTAAGC TTACTATCCA CTGCCACAGG CCGACAC

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 53:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 5197 Basenpaare

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)

(iii) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 53:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 54:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 1141

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM: Einzelstrang

(D) TOPOLOGIE: Linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein

(iii) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 54: