DE69428610T2 - Methoden zur kultivierung von infektiösem laryngotracheitis virus und von "egg-drop-syndrome" verursachendem virus - Google Patents

Methoden zur kultivierung von infektiösem laryngotracheitis virus und von "egg-drop-syndrome" verursachendem virus Download PDF

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Diese Erfindung betrifft Verfahren zur Kultivierung von infektiösem Laryngotracheitis-Virus und von "Egg-Drop-Syndrome"-verursachendem Virus bei einer kontinuierlichen Zelllinie.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Das infektiöse Laryngotracheitis-Virus (ILTV), der verursachende Krankheitserreger einer hochinfektiösen Erkrankung der oberen Atemwege bei Hühnern, gehört zur Familie der Herpesviridae, Unterfamilie Alphaherpesviridae und wurde zuerst 1930 identifiziert. ILTV ist hochansteckend mit Sterblichkeitsraten bis zu 70% und ist daher von beträchtlicher ökonomischer Bedeutung. Eine Immunisierung ist der einzige wirksame Weg, um dieser Erkrankung vorzubeugen. Impfstoffe, die gegen ILTV erhältlich sind, basieren auf der Kultivierung von lebenden aber artifiziell abgeschwächten ILTV, natürlich vorkommenden nicht pathogenen Formen des Virus oder Untereinheiten des Virus ab. Siehe z. B. US-Patent Nr. 3,444,293; 3,331,736; und 4,980,162 sowie die Patentanmeldungen WO 91 02053 und WO 92 03554, die alle verschiedene ILTV-Impfstoffe beschreiben.
  • Das "Egg-Drop-Syndrome"-verursachende Virus (EDS), der verursachende Krankheitserreger bei einer Erkrankung, welche hauptsächlich durch einen ernsthaften Rückgang der Eiproduktion bei Scharen von Legehennen charakterisiert wird, ist ein Adenovirus. Während den vergangenen paar Jahren wurde diese Erkrankung in Westeuropa, wo der Virus zuerst isoliert wurde, ökonomisch wichtig (Van Eck et al. (1976) Avian Pathology 5: 261–272). Inaktivierte Impfstoffe, welche die Immunität gegen das Virus verleihen können, wurden in Primärzellen von Fibroplasten des Entenembryos hergestellt (z. B. US-Patent Nr. 4,302,444).
  • Das ILTV wurde traditionsgemäß in Embryoeiern und primären Zellkulturen von Hühnern kultiviert (Guo, P. (1982) Chinese J. Vet. Med. 8(7): 18–20; Guo, P. (1982) J. South China Agri. Univ. 3(4): 13–20), beispielsweise in Zellen der Embryoniere (Chang et al. (1960) Avian Dis. 4: 484–490), Niere (Mayer et al. (1967) Am. J. Vet. Res. 28(124): 825–832) und Embryoleber (Hughes et al. (1988) Avian Pathol. 17: 295–303). Jüngere Publikationen über ILTV zeigen, dass es immer noch in primären Hühnerzellen kultiviert wird (Griffin, A. (1991) J. Gen. Virol. 72: 393–398; Kongsuwan et al. (1991) Virology 184: 404-410; Keeler et al. (1991 Avian dis. 35: 920–929; Sheppard and York, (1991) Acta Virol. 34: 443–448).
  • Gleichermaßen zeigen jüngere Publikationen über EDS, dass es ebenfalls in primären Hühnerzellen kultiviert wird (Zsak et al. (1981) J. Gen Viro1. 56: 87–95; Todd et al. (1978) J. Gen. Virol. 40: 63–75); Todd et al. (1988) Avian Pathology 17: 909-919) .
  • Die Herstellung und der Erhalt von primären Zellkulturen sind arbeitsaufwendig und sind daher zeitaufwendige Unternehmungen, die das Opfer von vielen Tieren erfordern. Bis jetzt wurde keine kontinuierliche Zelllinie identifiziert, die im Stande ist, die Replikation entweder von ILTV oder EDS durchzuführen.
  • Die Vorteile einer kontinuierlichen Zelllinie für die Kultivierung von ILTV und EDS im Vergleich zu primären Zellen sind vielfältig. Wegen den hohen Multiplikationsraten sind große Mengen von Zellen innerhalb eines kurzen Zeitraums erhältlich. Die Ansprüche an die Komplexität des Kulturmediums sind niedrig. Kontinuierliche Zelllinien sind leicht zu halten und passagierbar und können zur Lagerung eingefroren werden. Die Kultivierung einer kontinuierlichen Zelllinie ermöglicht eine konstante und strengere Kontrolle der Parameter bei Experimenten, während jede Herstellung von Primärzellen neue Parameter auferlegt.
  • Es wurden kontinuierliche Zelllinien von verschiedenen Spezies etabliert. Jedoch stieß man auf beträchtliche Schwierigkeiten, als man versuchte, kontinuierliche Zellkulturlinien aus Hühnergeweben zu erhalten (Schneider et al. (1965) Exp. Cell Res. 39: 631–636; Ponten J. (1970) Int. J. Cancer 6: 323-332; Gey et al. (1974) Exp. Cell Res. 84: 63–71; Beug et al. (1977) Exp. Cell Res. 107: 417–428); Kaji et al. (1979) Exp. Cell Res. 119: 231–236). In letzter Zeit wurde eine Anzahl von kontinuierlichen Zelllinien aus Hühnergeweben beschrieben. Diese schließen Lymphoblastenzelllinien von Lymphomen mit ein, die mit dem Vogelvirus induziert wurden (Akiyama und Kato, (1974) Biken J. 17: 105–116; Hihara et al. (1974) Natl. Inst. Anim. Health Q 14: 163–173), oder Leukämien (Langlors et al. (1976) Cancer Res. 36: 3894–3904; Pfeifer et al. (1980) Int. J. Cancer 25: 235–242), Fibroblastenzellen aus normalen, Rous-Sarcoma-Virus-behandelten oder Karzinogen-behandelten Hühnerembryozellen (Kaaden et al. (1982) In Vitro 18: 827–834; Ogura et al. (1984) Gann. 75: 410–414; Dinowitz M. (1977) J. Natl. Cancer Inst. 57: 295–301), und hepatozelluläre Zellen von Karzinom-behandelten Hühnchen (Kawaguchi et al. (1987) Cancer Res. 47: 4460–4464). Keine dieser Zellen wiesen darauf hin, dass sie fähig sind, die Replikation entweder von ILTV oder EDS durchzuführen.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Die Aufgaben der vorliegenden Erfindung betreffen daher die Bereitstellung von: Verfahren zur Kultivierung von ILTV oder EDS in einer kontinuierlichen Vogel-Karzinom-Zelllinie, Verfahren zur Gewinnung von ILTV oder EDS aus einer kontinuierlichen hepatozellulären Vogel-Karzinom-Zelllinie, Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs zur Verleihung von Immunität gegen ILTV oder EDS, eine kontinuierliche hepatozelluläre Vogel-Karzinom-Zelllinie, enthaltend entweder ILTV oder EDS, eine Zelle einer kontinuierlichen hepatozellulären Vogel-Karzinom-Zelllinie, enthaltend entweder ILTV oder EDS.
  • Die vorliegende Erfindung stellt im Besonderen ein Verfahren bereit zur Gewinnung des infektiösen Laryngotracheitis-Virus oder dem "Egg Drop Syndrome"-verursachenden Virus, umfassend (i) Infizieren einer kontinuierlichen hepatozellulären Vogel-Karzinom-Zelllinie CH-SAH mit dem infektiösen Laryngotracheitis-Virus oder dem "Egg Drop Syndrome"-verursachenden Virus, (ii) Kultivieren der infizierten Zellen, und (iii) Isolieren des dadurch produzierten Virus.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 nicht infizierte konfluente Monoshicht aus CH-SAH-Zellen.
  • 2 Bildung von mehrkernigen Bereichen oder Synzytien nach einer Infektion mit ILTV.
  • 3 Weiterentwicklung der ILTV-induzierten Synzytien zum Stadium des Abrundens und Ablösens.
  • Bester Modus zur Durchführung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt demgemäß ein Verfahren zur Kultivierung von ILTV oder EDS in einer hepatozellulären Karzinom-Zelllinie (CH-SAH, die alternativ auch als LHM-Zelllinie bezeichnet wird) bereit. Die CH-SAH-Zelllinie wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 29852 unter der Hinterlegungsnummer ATCC CRL 11354 am 26. Mai 1993 hinterlegt. Die CH-SAH-Zellen können nach der Passagierung in Waymouth, DMEM mit Glucose oder Fructose, DMEM/F-12-Medium ergänzt mit L-Glutamin, Natriumbicarbonat, geeigneten Antibiotika (bevorzugt Gentamicin), Käl-berserum und fetalem Kälberserum wachsen gelassen werden. Geeignete Serumkonzentrationen liegen bei 0–20%. Die Zellen können geeigneterweise innerhalb eines Temperaturbereichs von 35–40°C (bevorzugt 37–38°C) in einem CO2-Inkubator (bei einer Atmosphäre, die 2-5% CO2 enthält) wachsen gelassen werden. Alternativ können diese Zellen in Rollerflaschen wachsen gelassen werden, welche ein geschlossenes System ohne CO2-Austausch darstellen. Die CH-SAH-Zellen gedeihen gut bei einer etwas höheren Dichte (siehe 1). Die CH-SAH-Zellen können geeigneterweise bei Dichten zwischen 5 × 104 bis 5 × 105 Zellen/cm2, bevorzugt zwischen 1 × 105 Zellen/cm2 bis 4 × 105 Zellen/cm2 ausgesetzt werden und dann am 3. bis 7. Tag mit Medium umgesetzt werden. Die Medien werden bevorzugt alle 3–4 Tage ausgewechselt. Der passende pH-Bereich liegt zwischen 6 und 8 (bevorzugt 7–7,2). Wenn die Zellen in Rollerflaschen wachsen gelassen werden, ist die Dichte für das Aussetzen wie oben beschrieben und die Zellen werden am 3. bis 7. Tag mit 0 bis 2 Medienwechsel während dieses Zeitraumes umgesetzt.
  • Die CH-SAH-Zellen können passenderweise mit ILTV 3-24 Stunden nach dem Aussetzen durch bekannte Verfahren infiziert werden. Es können die gleichen Medien und Wachstumsbedingungen, wie sie für die Vermehrung dieser Zellen oben beschrieben wurden, zum Kultivieren der infizierten Zellen verwendet werden. Geeignetes ILTV-Impfmaterial kann Material sein, das in befruchteten Eiern, bevorzugt befruchteten Hühnereiern, gewachsen ist, beispielsweise in Chorioallantoismembranen oder al-lantoischem Fluid. Das Impfmaterial kann alternativ auch ein Virus sein, der auf CH-SAH-Zellen gewachsen ist. Vorzugsweise wird das Impfmaterial durch ein oder zwei Gefrierzyklen bei –70°C gefolgt von einem schnellen Auftauen, um Viren aus infizierten Zellen freizusetzen, hergestellt. Das Impfmaterial kann zusätzlich kurz sonifiziert werden. Die Absorption des Impfmaterials an CH-SAH-Zellen kann so kurz wie 1 Stunde dauern. Alternativ kann das Impfmaterial auch auf den CH-SAH-Zellen gelassen werden.
  • Nach der Infektion mit ILTV beginnt die Virenentwicklung gewöhnlicherweise nach 24–48 Stunden. Morphologische Veränderungen (cytopathischer Effekt) können in zellulären Monoschichten auf Grund der Virenentwicklung festgestellt werden, welche zu mehrkernigen Bereichen führen, die am besten als Synzytien beschrieben werden (siehe 2).
  • Wenn diese Bereiche größer werden, runden sich die Synzytien ab, lösen sich von der Gefäßoberfläche ab und beginnen im Überstand zu treiben (siehe 3).
  • Das Virus kann am besten geerntet werden, wenn der maximale cytopathische Effekt festgestellt wird. Geeignete Ernteverfahren schließen mit ein: Schütteln, Absaugen, Abkratzen oder Einfrieren mit Auftauen, begleitet durch Absaugen. Vorzugsweise werden geerntete Viren bei –70°C gelagert.
  • Geerntete ILTV können am besten an CH-SAH-Zellen, befruchteten Eiern oder in primären Zellkulturen aus embryonaler Niere, Niere oder embryonalen Leberzellen titriert werden. Für die Virustitration werden bevorzugt 9–12 Tage alte befruchte te Eier benutzt. Das Impfmaterial wird auf die abgelöste Chorioallantoismembran (CAM) aufgetragen. Das Impfmaterial wird vorzugsweise zellfrei gemacht und in Zellkulturmedium oder in Triptosephosphatnährbrühe verdünnt.
  • Die Feststellung des cytopathischen Effekts in Zellkulturen durch ILTV kann im Endstadium bis zu 7 Tage festgestellt werden; dies wird am besten durch eine Sichtbewertung der morphologischen Veränderung der Monoschicht oder durch Färbetechniken mit fluoreszierenden Antikörpern durchgeführt. Al-ternativ kann der cytopathische Effekt in befruchteten Eiern nach Sicht bewertet werden, indem Plaques auf der CAM nachgewiesen werden, die undurchsichtige Ränder haben und unterdrückte zentrale nekrotische Bereiche haben. Die Plaques entstehen durch Proliferation und Nekrose der betroffenen Zellen in der CAM.
  • Die ILTV-Aktivität wird geeigneterweise quantitativ gemessen, indem Verdünnungen der Probe hergestellt werden und die höchste Verdünnung (Endpunkt), bei der die Aktivität noch nachweisbar ist, bestimmt wird. Die bevorzugte Methode ist die Reed-Muench-Methode, welche die Auswertung des 50%-Endpunkts aus Daten, die von einer Quantenreaktion stammen, erlaubt. Die Formel kann gleichermaßen auf die Infektionsraten bei jedem Wirtssystem angewendet werden. Die Einheiten der Infektiösität, die verwendet werden, um die Ergebnisse darzustellen, ist die mittlere infektiöse Dosis des Embryos, EID50 und die mittlere infektiöse Dosis der Gewebekultur, TCID50.
  • Die CH-SAH-Zellen können geeigneterweise mit EDS durch die bekannten Methoden 24–72 Stunden, vorzugsweise 48 Stunden nach dem Aussetzen infiziert werden. Die infizierten CH-SAH-Zellen können in Waymouth, DMEM mit Glucose oder Fructose, DMEM/F-12-Medium ergänzt mit L-Glutamin, Natriumbicarbonat, geeigneten Antibiotika (bevorzugt Gentamicin), Kälberserum und fetalem Kälberserum wachsen gelassen werden. Geeignete Serumkonzentrationen sind 0–20%. Die Zellen können geeigneterweise innerhalb eines Temperaturbereichs von 35–40°C (bevorzugt 37–38°C) in einem CO2-Inkubator (bevorzugt bei einer Atmosphäre, die 2-5% CO2 enthält) wachsen gelassen werden. Die mit EDS infizierten CH-SAH-Zellen werden geeigneterweise bei Dichten von 5 × 104 bis 5 × 105 Zellen/cm2, bevorzugt bei 1 × 105 bis 4 × 105 Zellen/cm2 ausgesetzt und dann am 3. bis 7. Tag mit Medium umgesetzt. Das Medium ist vorzugsweise alle 3-4 Tage ausgewechselt. Ein geeigneter pH-Bereich befindet sich zwischen 6–8 (bevorzugt 7,0–7,2).
  • Geeignetes EDS-Impfmaterial kann Material sein, das in embryonalen Eiern, bevorzugt befruchteten Enteneiern im allantonischen Beutel, gewachsen ist. Embryonale Eier werden am besten inokkuliert, indem das Impfmaterial auf den allantonischen Beutel aufgetragen wird. Alternativ kann das EDS-Impfmaterial das Virus sein, das in embryonalen Leberzellen des Huhns entwickelt wurde. Das Impfmaterial kann alternativ Virus sein, das sich auf CH-SAH-Zellen entwickelt hat. Das Impfmaterial wird verdünnt, vorzugsweise in Gewebekulturmedium und mit den CH-SAH-Zellen für eine oder mehrere Stunden in Kontakt gebracht. Alternativ kann das Impfmaterial auf den Zellen bleiben.
  • Nach der Infektion der CH-SAH-Zellen mit dem EDS-Virus treten morphologische Veränderungen bei der Zellkultur auf. Es kann ein cytopathologischer Effekt nachgewiesen werden. Die Zellen degenerieren, runden sich ab und lösen sich von der Oberfläche.
  • Das Virus kann geerntet werden, wenn der cytopathische Effekt 50% ist. Methoden dafür schließen Abkratzen, Schütteln oder Einfrieren mit Auftauen mit ein. Geerntete Virenfluide werden bevorzugt bei weniger als –50°C gelagert.
  • Geerntete EDS-Virenfluide werden am besten in befruchteten Enteneiern, Zellkulturen von embryonalen Leber- oder Nierenzellen titriert. Befruchtete Enteneier, die für 9–12 Tage präinkubiert wurden, werden vorzugsweise für die Titrationen des EDS-Virus verwendet. Das Virusfluid wird in den allantonischen Beutel inokkuliert. Die Entwicklung des EDS-Virus wird durch Verwendung der Hämagglutinationsreaktion verfolgt. Die Titer werden nach der Reed-Muench-Methode oder nach der Spearmann-Karber-Methode berechnet. Nachdem die Erfindung allgemein beschrieben wurde, kann ein weiteres Verständnis durch den Bezug von bestimmten spezifischen Beispielen erhalten werden, wobei diese lediglich zur Illustration gedacht sind und sie sollen nicht beschränkend aufgefasst werden, sofern es nicht anders angegeben ist.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1:
  • Die Absicht dieses Experiments bestand darin, die optimalen Parameter für die Vermehrung von CH-SAH-Zellen in Rollerflaschen zu ermitteln. Die Parameter, die bestimmt wurden, betrafen die Arten der Rollerflasche, das Volumen der Medien und die Dichten bei der Aussetzung.
  • Die CH-SAH-Zellen wurden in DMEM/F-12-Medium ergänzt mit 0,2 mM L-Glutamin, 50 mg/ml Gentamicin und 10% nicht hitzeinaktiviertem, steril filtriertem fetalen Kälberserum wachsen gelassen. Es wurde ein Pool von Zellen aus einem Bestand von Rollerflaschen hergestellt, die mit 10% Trypsin-EDTA und 90% Kochsalzlösung A (Kochsalzlösung mit 10 mg/l Glucose und 0,5% Phenol-Rot) abgelöst wurden. Die Zellen wurden am Tag 0 in Rollerflaschen bei einer Zieldichte von 3 × 105 Zellen/cm2 ausgesetzt. Die Hersteller der Rollerflaschen waren Corning (850 und 1700 cm2), Falcon (850 und 1500 cm2) und In Vitro (1020 und 1700 cm2). Die Medienvolumen pro Rollerflasche waren 350 ml/850 cm2, 400 ml/1020 cm2, 450 ml/1500 cm2 und 450 ml/1700 cm2. Die Rollerflaschen wurden für 4 Tage bei 37°C bei täglicher Beobachtung inkubiert.
  • Am Ende dieses Zeitraums wurden die Zellen durch Trypsinierung aus jeder Rollerflasche geerntet. Der individuelle Pool der Zellen aus den Rollerflaschen wurde dann durch Färbung mit Tryphan-Blau gezählt.
  • Figure 00100001
  • Die optimalen Parameter, die für das Wachstum der CH-SAH-Zellen herauskamen, waren Corning 850 cm2- oder Falcon 850 cm2-Rollerflaschen mit 350 ml Medium zu verwenden. Die Zellen, welche bei 3 × 105 pro cm2 ausgesetzt wurden, haben die ursprüngliche Dichte nach 4 Tagen Vermehrung um das 4.6- und 4.0-fache erhöht.
  • Beispiel 2:
  • Die Absicht dieses Experiments war es, die optimalen Parameter für die Infektion von ILTV in CH-SAH-Zellen zu bestimmen. Die Parameter, die bestimmt wurden, waren die Multiplizität der Infektion (m. o. i.) und der Zeitraum der Ernte.
  • Das ILTV-Challenge-Virus, das durch die USDA (nationales Labor für Veterinärdienste) bereitgestellt wurde und 3 mal in befruchteten Eiern passagiert wurde, hat einen Titer von 1 × 106-5 TCID50/ml. Dieses Material bestand aus homogenisierten Chorioallantoismembranen, Es wurde 2 mal eingefroren (–70°C) und aufgetaut (Raumtemperatur). Das Impfmaterial wurde zur gleichen Zeit wie die Zellen zu 20 ml Medium pro Gefäß gegeben. Die CH-SAH-Zellen wurden bei 1 × 105 Zellen/cm2 in 75 cm2 Falcon-Gefäßen mit Filterbelüftung ausgesetzt. Die Medien waren wie in, Beispiel 1 beschrieben und wurden bei 37°C, 2% CO2 für den Zeitraum der Infektion verwendet. Die Erntezeiten entsprachen 24, 48 und 72 Stunden. Nach diesen Zeiten wurden die Gefäße bei –30°C gehalten, bis sie gefroren waren. Die Gefäße wurden dann bei Raumtemperatur gehalten, bis sie aufgetaut waren. Das Virushomogenat wurde dann auf die Aktivität bei TCID50/ml titriert. M. O. I.'s, die verwendet wurden, waren 0.03, 0.006 und 0.0006.
  • Figure 00110001
  • Alle anderen Proben der Ernte nach dem Zeitpunkt 24 Stunden (alle MOIs), und 48 Stunden (MOI 0.006 und 0.0006) waren unterhalb der Untergrenze des Titrationsassay, Die optimalen Ernteparameter, um CH-SAH-Zellen mit CAM-ILTV zu infizieren, waren: Aussetzen der Zellen bei 1 × 105 Zellen/cm2, MOI von 0.006 und Inkubieren für 72 Stunden bevor geerntet wird.
  • Beispiel 3:
  • Die Absicht dieses Experiments war es, den Titer (TCID50) des Virus, das in Beispiel 2 geerntet wurde, zu bestimmen. Die verwendeten Medien wurden soeben in Beispiel 1 beschrieben. Die verwendeten Platten waren Falcon-Primeria-96-Well-MICROTEST IIITM (Flachboden)-Platten, Katalog #3872. Die CH-SAH-Zellen wurden innerhalb eines 24 Stunden-Zeitraums, bevor die Titration durchgeführt wurde, umgesetzt (die Zellen waren noch in der Lag-Phase, dies war nachmittags (p. m.) des Tags –1). Die Dichte beim Aussetzen war 1 × 105 Zellen/cm2. Das Volumen pro Vertiefung war 200 μl. Gehalten wurden sie bei 37°C und 5% CO2 .
  • Die Titration wurde am Morgen (a. m.) gestartet (Tag 0). Die Virusproben wurden aufgetaut und auf Eis gehalten, bis sie verdünnt wurden. Sie wurden in vollständigen CH-SAH-Medien verdünnt. Nachdem jede Probe verdünnt war, 1 × 10–1 bis 1 × 10–8, wurde sie bei 4°C bis zur Weiterverarbeitung gehalten. Nach der Verdünnung der Proben wurden 90 μl/Vertiefung des Mediums (10 μl verbleiben) durch Verwendung eines Costar-Multipipettors und demselben Satz Spitzen, entfernt. Pro Zeitpunkt wurde eine Probe verarbeitet. Es wurden dann 100 μl/Vertiefung der Virusverdünnung (4 Replikate pro Verdünnung) zu einer Probe pro Zeitpunkt hinzugefügt. Die Zeit für die Adsorption betrug 1 Stunde (nach der letzten Zugabe) bei 37°C und 2% CO2. Nach der Adsorptionszeit wurde vollständiges CH-SAH-Medium zugefügt, 100 μl pro Vertiefung, zu einer Probe pro Zeitpunkt.
  • Die Platten und Zellen wurden wie folgt für einen 7 TageZeitraum beobachtet:
    Tag 0: Vor-Inokulation auf %-Konfluenz (50–70%).
    Tag 0: Nach-Inokulation auf Beeinträchtigung der Monoschicht (keine).
    Tag 1: Auf pH und Konfluenz (pH gut, 80% Konfluenz).
    Tag 3: Gleich wie für Tag 1.
    Tag 7: Kurze Bestimmung der %-Konfluenz (100%) und Abschätzung des CPE-Endpunkts (markierte Platte). Die Platteninhalte wurden dann weggeschüttet und die Monoschicht wurde mit 60% Aceton/40% absolutem Ethanol fixiert.
  • Nach dem Waschen mit PBS wurde eine Färbung mit fluoreszierenden Antikörpern auf diesen Platten durchgeführt. Die Hühnerantiseren wurden 1 : 100 in PBS verdünnt und für 1 Stunde bei 37°C inkubiert (SPAFAS-Antiseren gegen ILTV). Die Platten wurden dann erneut mit PBS gewaschen und das Konjugat wurde 1 Stunde lang bei 37°C zugeführt (KPL FITC-markierter und affinitätsgereinigter Antikörper gegen Hühner-IgG [H + L], hergestellt in Ziegen). Die Platten wurden dann erneut mit PBS gewaschen und dann entweder gemessen oder bei 4°C gelagert.
  • Jede Fluoreszenz wurde als positiv betrachtet. Die Berechnung der Virusaktivität wurde anhand der Methode von Reed Muench durchgeführt (Reed, L. J., und H. Muench. "A simple method for estimating fifty percent endpoints" Am. J. Hvg. (1938) 27: 493-497). Die Titer dieses Materials in TCID50/ml sind in der Tabelle des Beispiels 2 aufgelistet.
  • Beispiel 4:
  • Die Absicht der folgenden Experimente war es, den Titer (TCID50/ml) des Virus, der in Beispiel 2 geerntet wurde, zu erhöhen. Das Verfahren bestand darin, das Virus den CH-SAH-Zellen kontinuierlich über einen Zeitraum durchlaufen zu lassen (tatsächlich 32 Durchläufe).
  • Die CH-SAH-Zellen wurden in 75 cm2 Corning-Gefäßen ausgesetzt und wurden bei 37°C mit 5% CO2 (Vor-Infektion) inkubiert. Das Medium entspricht dem des erwähnten in Beispiel 1. Die Dichte beim Aussetzen schwankte von 30–90% Konfluenz der Monoschicht zum Zeitpunkt der Infektion.
  • Das Impfmaterial wurde sowohl zellgebunden als auch zellfrei passagiert. Zellgebunden bedeutet, dass die Monoschicht der Zellen in der Gegenwart von Medium abgekratzt wurde und dann ein Teil direkt in das nächste Medium eines Gefäßes inokuliert wurde. Zellfrei bedeutet, dass die Monoschicht der Zellen in der Gegenwart von Medium abgekratzt wurde und dann zweimal eingefroren und wieder aufgetaut wurde (–70°C/RT), bevor das nächste Medium im Gefäß inokuliert wurde. Das Volumen des Impfmaterials variierte von der Gesamtmenge (20 ml) bis 1/30 des geernteten Volumens. Auf Grund des häufigen Passagierens des Virus und der Tatsache, dass eine Titration 7 Tage lang dauert, wurde der m. o. i. nicht bestimmt.
  • Nach dem Animpfen wurden die Flaschen bei 37°C, 2% CO2 bis zur Ernte inkubiert. Die Inkubationszeit variierte von 1 bis 7 Tage bei täglicher Beobachtung. Die Erntezeitpunkte wurden bestimmt, sobald eine maximale CPE in Erscheinung trat.
  • Am Ende des Passagierens wurde das an CH-SAH angepasste Virusmaterial entsprechend dem Beispiel 3 titriert. Der Titer des Materials betrug 1 × 106.6 TCID50/ml (geometrisches Mittel [GMT] von 8 Proben).
  • Beispiel 5:
  • Das ILT-Challenge-Virus, das an das Wachstum an CH-SAH wie in Beispiel 4 beschrieben angepasst wurde, wurde einer Gruppe von 7 Wochen alten Leghorn-Hühnern, die von dem spezifischen Pathogen frei waren, verabreicht. Einer zweiten Gruppe wurde das Stammvirus (nicht angepasst) gegeben. Es wurden Gruppen von je 13 Vögeln benutzt. Das Stammvirus und das an die CH-SAH angepasste Virus wurden jeweils mit der gleichen Dosis intratracheal verabreicht (Ziel = 1 × 104.3 EID50). Am Ende eines 14-tägigen Beobachtungszeitraums zeigte die Challenge-Virus-Gruppe eine Krankheitshäufigkeit von 100% (nasaler Ausfluss, feuchte Rasselgeräusche, Husten, Keuchen, starkes Husten und krampfartige Atmung einschließlich Expulsion von Blutklumpen) und eine Mortalität von 38%. Die an CH-SAH angepasste Virusgruppe zeigte eine Krankheitshäufigkeit von 0% und eine Mortalität von 0%. Diese Ergebnisse beweisen, dass eine Vermehrung in CH-SAH-Zellen das Virus abschwächt.
  • Das abgeschwächte Virus wurde 4 Wochen alten Leghorn-Hühnern, die von dem spezifischen Pathogen frei waren, intraokular verabreicht (1 × 103.9 TCID50). Am 14. Tag nach der Impfung der Impfgruppe zusammen mit einer nicht geimpften Kontrollgruppe, wurde das TLT-Challenge-Virus intratracheal gegeben (1 × 104.2 TCID50). Die Vögel wurden 10 Tage lang nach der Verabreichung des Challenge-Virus beobachtet. Die Kontrollgruppe zeigte eine Krankheitshäufigkeit von 100 und eine Mortalität von 73% während die Gruppe mit dem abgeschwächten Virus eine Krankheitshäufigkeit von 0% und eine Mortalität von 0% aufwies.
  • Vergleichsbeispiel 1:
  • Da gezeigt wurde, dass sowohl primäre Hepatozyten und Makrophagen durch ILTV in vitro infiziert werden können (Hughes and Jones (1988), Avian Pathology 17: 295–303; Calnek et al. (1986), Avian Diseases 27: 261–270), wurden die mit dem Retrovirus transformierten Zelllinien durch Dr. Guo von der Purdue University auf die Vermehrung von ILTV untersucht.
  • Die Hühnerzelllinie 249TK– stammte von einem MC29-induzierten Hepatom und wurde von Dr. R. F. Silvia, Avian Diseases and On cology Laboratory, United States Department of Agriculture, East Lansing, Michigan bezogen. Die 249TK–-Zellen wurden in M199-Medium (Gibco), ergänzt mit 10% FCS plus 2% Hühnerserum, wachsen gelassen.
  • Die Makrophagen-Zelllinie HD11 ist eine Zelllinie, die durch das replikationsdefiziente Vogelretrovirus, Reticuloendotheliosisvirus (REV-T) transformiert wurde, und wurde von Dr. V. Hinshaw, University of Wisconsin erhalten. Die HD11-Zellen wurden in RPMI 1640 (Gibco) ergänzt mit 5% FCS wachsen gelassen.
  • Die HD11- und 249TK–-Zellen wurden mit ILTV bei einem m. o. i. von 0,1 infiziert. Primäre embryonale Leberzellen dienten als Kontrollzellen. Weder die HD11- noch die 249TK–-Zellen zeigten irgendein Anzeichen einer Infektion innerhalb einer Inkubationswoche bei 37°C, während die Kontrollzellen eine voll-ständige CPE bereits nach 2 Tagen aufwiesen.
  • Das Fehlen von CPE oder einer Plaquebildung schließt nicht die Möglichkeit aus, dass ILTV-DNA in der Zelle repliziert wurde, aber der virale Zusammenbau oder der Ausschleusungsvorgang blockiert wurde. Um die Frage zu beantworten, ob ILTV-DNA in der Zelle repliziert werden kann, wurden HD11-Zellen, die mit ILTV infiziert wurden, auf das Vorkommen von ILTV-DNA untersucht. Eine Extraktion der ILTV-DNA aus dem Cytoplasma der HD11-Zellen wurde 2 Tage nach der Impfung durchgeführt.
  • Die extrahierte DNA wurde auf einem Agarosegel aufgetrennt und auf eine Nylonmembran geblottet. ILTV-DNA, die aus wachsenden primären embryonalen Hepatozyten stammte, diente als Positivkontrolle. Die DNAs wurden mit einem 32P-markierten ILTV-EcoRI-DNA-Fragment hybridisiert und auf einen Kodak-Röntgenfilm belichtet. Die positive Kontroll-DNA ergab ein Signal, jedoch konnte kein positives Hybridisierungssignal für DNA gefunden werden, die entweder aus der cytoplasmatischen- oder der Kernfraktion der infizierten Makrophagen-Zelllinie stammte, obgleich DNA in allen Präparationen vorkam, was anhand des Agarosegels vor dem Blotten gesehen werden konnte. Es wurde keine ILTV-DNA in der Makrophagen-Zelllinie HD11 synthetisiert. Diese Ergebnisse führen zu der Schlussfolgerung, dass Zellen, die für eine Infektion mit ILTV permissiv sind, beispielsweise Hepatozyten und Makrophagen, für eine Infektion nach der Transformation mit Vogelretroviren nicht permissiv werden.
  • Vergleichsbeispiel 2:
  • Die QT35 ist eine chemisch induzierte Wachtelfibroblasten-Ze111inie. Die QT35-Zellen wurden von Dr. R. Nodgreen, Solvay Animal Health, Inc., Mendota Heights, Minnesota bezogen.
  • Die QT35 wurden von Dr. Guo von der Purdue University auf ihre Fähigkeit hin untersucht, ILTV zu vermehren. QT35-Zellen wurden bei einem m. o. i. von 0,1 infiziert und bei 37°C für 4 Tage inkubiert. Es wurden keine Anzeichen einer Infektion wie beispielsweise von synzytischen Zellen oder Plaques beobachtet.

Claims (6)

  1. Verfahren zur Kultivierung eines Virus, das aus der Gruppe bestehend aus infektiösem Laryngotracheitis-Virus (ILTV) und "Egg-Drop-Syndrome"-verursachendem Virus (EDS) ausgewählt ist, wobei das Verfahren umfaßt: (i) Infizieren von Zellen einer kontinuierlichen heptazellulären Vogel-Karzinom-Zelllinie (CH-SAH), wie sie bei der American Type Culture Cellection unter der Hinterlegungs-Nr. ATCC CRL 11354 hinterlegt ist, mit dem Virus; (ii) Kultivieren der infizierten Zellen.
  2. Verfahren zur Gewinnung eines Virus, das aus der Gruppe bestehend aus infektiösem Laryngotracheitis-Virus (ILTV) und "Egg-Drop-Syndrome"-verursachendem Virus (EDS) ausgewählt ist, wobei das Verfahren umfaßt: (i) Infizieren von Zellen einer kontinuierlichen heptazellulären Vogel-Karzinom-Zelllinie (CH-SAH), wie sie bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungs-Nr. ATCC CRL 11354 hinterlegt ist, mit dem Virus; (ii) Kultivieren der infizierten Zellen; und (iii) Isolieren des dadurch produzierten Virus.
  3. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs zur Verleihung von Immunität gegen ein Virus, das aus der Gruppe bestehend aus infektiösem Laryngotracheitis-Virus (ILTV) und "Egg-Drop-Syndrome"-verursachendem Virus (EDS) ausgewählt ist, wobei das Verfahren umfaßt: (i) Infizieren von Zellen einer kontinuierlichen heptazellulären Vogel-Karzinom-Zelllinie (CH-SAH), wie sie bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungs-Nr. ATCC CRL 11354 hinterlegt ist, mit dem Virus; (ii) Kultivieren der infizierten Zellen; und (iii) Isolieren des dadurch produzierten Virus; und (iv) Herstellen eines Impfstoffs.
  4. Verfahren nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, wobei der Isolierungsschritt durchgeführt wird, nachdem die infizierten Zellen eine maximale cytopathische Wirkung aufweisen.
  5. Kontinuierliche heptazelluläre Vogel-Karzinom-Zelllinie (CH-SAH), wie sie bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungs-Nr. ATCC CRL 11354 hinterlegt ist, wobei die Zelllinie ein Virus enthält, das aus der Gruppe bestehend aus infektiösem Laryngotracheitis-Virus (ILTV) und "Egg-Drop-Syndrome"verursachendem Virus (EDS) ausgewählt ist.
  6. Zelle einer kontinuierlichen heptazellulären Vogel-Karzinom-Zelllinie (CH-SAH), wie sie bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungs-Nr. ATCC CRL 11354 hinterlegt ist, wobei die Zelle ein Virus enthält, das aus der Gruppe bestehend aus infektiösem Laryngotracheitis-Virus (ILTV) und "Egg-Drop-Syndrome"-verursachendem Virus (EDS) ausgewählt ist.
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