DE69426129T2

DE69426129T2 - Eine sicherheitsvorrichtung unter verwendung eines hochempfindlichen spurenmittels zum schutz von materialen, artikeln und dergleichen

Info

Publication number: DE69426129T2
Application number: DE69426129T
Authority: DE
Inventors: Cardiff Cypher Science Limited
Original assignee: Cypher Science Ltd
Current assignee: Cypher Science Ltd
Priority date: 1993-07-12
Filing date: 1994-07-12
Publication date: 2001-05-10
Anticipated expiration: 2014-07-13
Also published as: EP0774012A1; GR3034815T3; US5763176A; HK1014376A1; ATE196930T1; DK0774012T3; DE69426129D1; PT774012E; GB9314394D0; ES2152985T3; AU700332B2; WO1995002702A1; CA2167046C; SG52549A1; EP0774012B1; AU7130094A; CA2167046A1

Description

Diese Erfindung betrifft eine Sicherheitsvorrichtung und ein Verfahren, welches möglich macht, eine ultrasensitive Mikrospur zu verwenden, um eine direkte Beziehung oder Wechselwirkung zwischen einem beliebigen Material, Gegenstand oder einer Ware (fest, flüssig oder gasförmig) und Menschen unter geeigneten Bedingungen darzulegen, wenn es erforderlich ist, darzulegen, daß eine Beziehung oder Wechselwirkung stattgefunden hat. Insbesondere legt die Sicherheitsvorrichtung dar, daß ein bestimmtes Individuum oder bestimmte Individuen versucht hat/haben, ein Material, Gegenstand oder eine Ware, die mit der Sicherheitsvorrichtung geschützt ist, zu stehlen oder sie gestohlen hat/haben.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch allgemeiner Verfahren zur Markierung eines Materials und zum nachfolgenden Detektieren, daß das Material markiert worden ist, und zum Identifizieren des Markers.
Es gibt ein ausgedehntes Erfordernis, den Weg verfolgen zu können, den ein bestimmtes Material nimmt, wenn es sich von einem Ort zu einen anderen bewegt. Die Bewegung kann von natürlichen Materialien (z. B. der Wasserfluß unterirdischer wasserführender Schichten) oder Materialien sein, welche durch Menschen behandelt oder hergestellt worden sind (z. B. jeder beliebige von Menschen in einem Herstellungsverfahren gestaltete Gegenstand oder Bodenschätze, wie Getreide und Mineralien). In allen diesen Situationen kann es Gründe geben, warum es erforderlich ist, spezifische Verfahren zum Verfolgen dieser Bewegungen zu entwickeln. Es kann sein, daß direkte Beobachtung nicht möglich ist, z. B., wenn dem Weg eines unterirdischen Stroms gefolgt wird. Es kann sein, daß es erforderlich ist, die Bewegung von Gütern ohne das direkte Wissen der Beförderer zu überwachen, oder um aus rechtlichen Gründen zu beweisen, daß das Auftreten eines Materials an einer bestimmten Stelle in der Biosphäre durch dasselbe Material verursacht war, das von einem bekannten Ausgangspunkt ausgeht.
Zum Beispiel können Erzeugnisse beim Transport gestohlen oder von einem skrupellosen Verteiler zu einem viel niederigeren Preis als dem, der durch den Lieferanten festgesetzt wurde, wiederverkauft werden, zum Beispiel Autokofferraumverkauf. Ein Schlüsselproblem beim Herbeiführen einer Verurteilung ist die Identifizierung der bestimmten verkauften Gegenstände, um nachzuweisen, daß die Güter gestohlen worden sind oder von einem bestimmten Verteiler wiederverkauft wurden. Probleme kommen auch mit Flüssigkeiten, wie Petroleum, welches von Transporteuren routinemäßig in die See ausgewaschen wird, vor. Es ist fast unmöglich, zu identifizieren, welcher Transporteur das Öl hat ausströmen lassen und als solches werden Anklagen und Verurteilungen wegen Verschmutzung der Meere selten herbeigeführt.
Weitere Probleme sind mit der Bewegung natürlicher Materialien verbunden, zum Beispiel der Bewegung von Getreide. Es ist besonders schwierig, eine Charge solcher natürlicher Materialien voneinander zu unterscheiden. Im Falle von Getreide kommen Probleme in der Europäischen Gemeinschaft mit Getreide vor, das über mehrere verschiedene Grenzen transportiert wird, um mehrere EU-Beihilfen für dieselbe Getreidecharge zu kassieren. Ein Verfahren zum Markieren des Getreides, welches leicht detektiert werden kann, ist erforderlich, um solchen Betrug zu verhindern.
WO91/17265 offenbart allgemein Art und Weisen, auf welche Materialien markiert werden können, insbesondere bei Verwendung eines DNS-Moleküls zum Markieren des Materials. WO94/04918 offenbart ein Verfahren zum Markieren einer Flüssigkeit, insbesondere mit zwei Markierungen, von denen eine keine Nucleinsäure-Markierung ist und von denen eine DNS-Moleküle umfaßt. In jedem Fall wird die einzigartige Mikrospur, die DNS- Moleküle umfaßt, zum Material hinzugefügt, wird von dem so erhaltenen Material nach dessen Transport eine Probe genommen und wird das Vorhandensein des Mikrospurzusatzstoffs in der Probe detektiert, analysiert und decodiert.
In einem beschriebenen bevorzugten Gesichtspunkt ist das zu überwachende Material ein flüssiger Kohlenwasserstoff, wie Öl, und der Mikrospurzusatzstoff ist so gestaltet, daß er durch Waschen mit Wasser nicht leicht aus dem Kohlenwasserstoff entfernt werden kann. Verschiedene Verfahren werden vorgeschlagen, um sicherzustellen, daß die DNS-Mikrospur eher im Kohlenwasserstoff bleibt als sich in die wäßrige Phase zu verteilen, einschließlich Koppeln der DNS an hydrophobe Perlen mit einem Durchmesser von typischerweise 1 bis 5 um, die gestaltet sind, um in Kohlenwasserstoffen und nicht in der wäßrigen Phase zurückgehalten zu werden. Ein Verfahren zum Markieren einer Flüssigkeit und zum nachfolgenden Detektieren, daß die Flüssigkeit markiert worden ist, wird offenbart, dessen Verfahren umfaßt: Hinzufügen eines Zusatzstoffs zu der Flüssigkeit, der eine Mehrzahl von Teilchen in einer Menge von höchstens 1 Gewichtsteil Teilchen pro 106 Gewichtsteilen Flüssigkeit umfaßt, wobei die Teilchen Signalmittel umfassen, um ihre Detektion zu unterstützen, und in der Flüssigkeit mit dem bloßen Auge nicht sichtbar sind; Probenentnahme eines Teils der Flüssigkeit, die den Zusatzstoff umfaßt; Detektieren des Vorhandenseins von Teilchen in der Probe, mit der Maßgabe, daß das Signalmittel nicht nur aus einer Nucleinsäure-Markierung besteht.
WO90/06045 offenbart Nucleinsäure-Sonden, die monodisperse, superparamagnetische Teilchen umfassen, die eine Mehrzahl von Molekülen auf einem Oligonucleotid tragen, welches zum Sequenzieren von Einzelstrang-Nucleinsäuren verwendet werden kann.
WO91/14441 offenbart die Verwendung von Nucleinsäure als eine Markierungsverbindung, das Gebrauch von der Polymerase- Kettenreaktion (PCR) macht, um ausreichende Mengen von Nucleinsäure zum Identifizieren zu erzeugen.
WO92/01812 offenbart eine kompetitive PCR zur Quantifizierung von DNS und einen Kit zur Verwendung darin. Das Verfahren basiert auf kompetitiver Titration, wobei Mengen von Ziel-DNS mit bekannten Mengen von Kompetitor-DNS co-verstärkt werden, um unterschiedliche Verhältnisse von Ziel : Kompetitor- DNS zu erzeugen, wobei die Kompetitor-DNS im wesentlichen dieselbe ist, wie die Ziel-DNS, außer, daß sie eine Erkennungsstelle umfaßt, welche direkt oder indirekt durch eine markierte Species detektiert werden kann. Die co-verstärkte DNS kann an einem festen Träger, z. B. Mikrotitervertiefungen, Pegelstäben, Teilchen, Fasern, Kapillaren und Perlen immobilisiert werden.
Die früheren Anwendungen und Verwendungen von Mikrospur- DNS-Markierungen beschäftigen sich in erster Linie mit der Markierung von Flüssigkeiten und insbesondere mit Kohlenwasserstoffen. Es gibt keine Offenbarung, wie die Markierung von Erzeugnissen oder natürlichen Gegenständen, insbesondere fester Gegenstände durchgeführt werden kann.
Gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein Verfahren zur Markierung eines Feststoffs und zum nachfolgenden Detektieren eines Feststoffs bereitgestellt, welcher markiert worden ist, welches umfaßt:
Auftragen eines Zusatzstoffs, der eine Mehrzahl von Mikroperlen oder Teilchen umfaßt, auf den Feststoff, wobei die Mikroperlen oder Teilchen zwei oder mehr Signalmittel umfassen, um ihre Detektion zu unterstützen, und auf dem Gegenstand mit dem bloßen Auge nicht sichtbar sind, wobei ein erstes Signalmittel eine Nucleinsäure-Markierung umfaßt und ein zweites Signalmittel keine Nucleinsäure-Markierung ist,
Probeentnahme des mit dem Zusatzstoff markierten Feststoffs, und
Detektieren des Vorhandenseins des Zusatzstoffs auf dem Feststoff durch Detektion des zweiten Signalmittels.
Vorzugsweise wird der Zusatzstoff als eine Suspension in einer Flüssigkeit in einer Menge von höchstens einem Gewichtsteil Teilchen oder Mikroperlen pro 106 Gewichtsteilen Flüssigkeit aufgetragen, und das Verfahren umfaßt ferner das Trocknenlassen der Flüssigkeit zum Markieren des Feststoffs.
Die Markierungstechniken nach dem Stand der Technik befassen sich mit der Art der Teilchen, ihrer Größe, den Markereigenschaften, den Verfahren der Anwendung und Detektion, ebenso mit Gesichtspunkten der einzigartigen DNS-Moleküle, die verwendet werden, um die einzigartigen Markierungen bereitzustellen. In allen diesen Anwendungen schließt die Verwendung der Mikrospur-DNS-Markierungen das Hinzufügen der Markierung, die eine einzige DNS-Sequenz für jedes Material umfaßt, zum Material ein, welche nach einer Zeitdauer, während der das Material bewegt worden sein kann, nachfolgend detektiert wird. Das Wissen um das einzigartige Wesen des DNS- Moleküls, insbesondere um eine geheime, aber vorbestimmte Sequenz von Basen innerhalb des DNS-Mikrospur-Moleküls, macht es möglich, den Ursprung und den Transportweg des markierten Materials mit vollkommener Genauigkeit zu bestimmen.
Ein Problem mit dem Stand der Technik ist das Erfordernis, daß jede DNS im wesentlichen von anderen DNS verschieden sein muß, um die erforderliche Spezifität bereitzustellen.
In einem zweiten Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Verfahren zur Markierung eines Materials bereitgestellt, das das Auftragen eines Zusatzstoffs, der eine Mehrzahl von Mikroperlen umfaßt, auf das Material umfaßt, wobei an die Mikroperlen eine Mehrzahl von Nucleinsäure-Molekülen befestigt wurden, wobei wenigstens zwei charakteristische Primersequenzen mit unterschiedlichen Nucleinsäure-Molekülen assoziiert sind, und wobei die Mikroperlen ferner ein zusätzliches Signalmittel umfassen, das kein Nucleinsäure-Molekül umfaßt.
Die Verwendungen der Mikrospur-DNS-Markierungen nach dem Stand der Technik gedenken nicht, die Markierung vom Material auf irgendeinen Vertreter, insbesondere. Menschen, die rechtmäßig oder unrechtmäßig in den Transport des markierten Materials, Gegenstands oder Ware verwickelt sein können, zu übertragen. Es gibt auch die Notwendigkeit, jedes Material, jeden Gegenstand oder jede Ware durch Zeigen, daß ein Individuum oder Individuen mit dem markierten Material, Gegenstand oder Ware in Berührung gekommen ist/sind, schützen zu können. Dies ist besonders im Fall jedes Materials, Gegenstands oder jeder Ware wichtig, welche von einem Ort zu einem anderen transportiert wird und ein Ziel für Diebstahl oder Beschädigung sein kann. Die Erfindung verhindert nicht das Stattfinden eines Diebstahls, außer im allgemeinen Sinne des Bereitstellens eines zusätzlichen Abschreckungsmittels, welches bewirken kann, daß mögliche Diebe Abstand nehmen, stellt aber Mittel bereit, einen Dieb oder möglichen Dieb einzigartig und eindeutig mit dem markierten Material, Gegenstand oder Ware in Verbindung zu bringen.
In einem weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung kann das Verfahren zum Überwachen einer Wechselwirkung zwischen irgendeinem Material, Gegenstand oder irgendeiner Ware und einer Person oder einem Tier ausgebildet sein, das das Bereitstellen einer Vorrichtung, die zum Herstellen eines Aerosols des Zusatzstoffs ausgebildet ist, und Mittel zur Aktivierung des Aerosols bei Interferenz mit dem Material, dem Gegenstand oder der Ware durch eine Person oder ein Tier umfaßt, so daß der Zusatzstoff auf die Person oder das Tier aufgetragen wird.
Der allgemeine Grundsatz ist, eine Vorrichtung auf, innerhalb oder dicht bei dem zu schützenden Material, Gegenstand oder der zu schützenden Ware unterzubringen. Die Vorrichtung ist geeignet, auf ein vorbestimmtes Signal ein Aerosol zu erzeugen, um ausreichend breit, schnell und wirksam eine Mikrospur-DNS-Markierung zu dispergieren, um sicherstellen zu können, daß etwas von der Mikrospur-DNS-Markierung auf dem Vertreter, insbesondere auf einem Individuum oder Individuen, welche versuchen können, das Material, den Gegenstand oder die Ware zu entfernen (stehlen), abgelagert wird.
Das Mikrospur-Aerosol kann ein Kanister sein, der mit einem Treibmittel unter Druck gesetzt ist, z. B. ein Aerosolprodukt oder Druckluft und die DNS-Mikrospur-Markierung enthaltend, die in einem Behälter, wie einem Koffer oder einem Versandbehälter, untergebracht ist, der nur aktiviert wird, wenn der Behälter durch ein Individuum, das nicht weiß, wie das Mikrospur-Aerosol vor dem Versuch des Öffnens des Behälters entschärft wird, auf irgendwelche Art und Weise geöffnet wird. Die Tat des Öffnens des Behälters kann auf irgendwelche Art und Weise verwendet werden, um das Mikrospur-Aerosol auszulösen und die DNS-Mikrospur mit ausreichender Kraft in die Atmosphäre zu dispergieren, daß das Individuum, das den Behälter öffnet, unweigerlich mit der Mikrospur bedeckt wird. Nachfolgende Probeentnahme von dem Individuum, das dem Aerosol ausgesetzt war, kann zum Beispiel von der Haut oder von Gewebefasern genommen werden und die Mikrospur-Markierung analysiert werden.
Die Markierung kann in der Form einer Perle sein, an welche wenigstens ein Nucleinsäure-Molekül befestigt ist und an welcher typischerweise zwischen 100-4000 Nucleinsäure-Moleküle befestigt sind. Die Perlen sind typischerweise aus einem polymeren Material gebildet, können aber auch aus natürlichen Materialien, wie Silika, gebildet sein und haben allgemein einen Durchmesser innerhalb des Bereichs von 0,05 um bis 100 um, vorzugsweise innerhalb des Bereichs von 0,01 bis 5 um. Typische Mikroperlen/-kugeln sind im Handel erhältlich von Dynal (UK) Ltd of Wirral, Merseyside, United Kingdom unter den Gattungshandelsnamen DYNABEADS und DYNASPHERES. Die Herstellung dieser Perlen ist z. B. in EP-91453, 10986 und 106873 sowie US- A-4 186 120, 4 530 956, 4 563 510 und 4 654 267 offenbart. Die DNS wird durch Biotin-Streptavidin- oder -Neutralit-Bindung oder durch direkte -COOH oder -NH&sub2; vermittelte oder andere kovalente Bindungen an der Perle befestigt.
Zusätzliche Merkmale des Mikrospur-Aerosols können bei der Detektion von Individuen, die dem Aerosol ausgesetzt waren, helfen. Zum Beispiel können zusätzliche Perlen mit einer Fluoreszenzmarkierung im Aerosol enthalten sein oder die mit Nucleinsäure markierten Mikroperlen können fluoreszierend markiert sein und können in situ z. B. auf der Haut oder Geweben als ein sichtbares Signal detektiert werden, das erzeugt wird, wenn geeignetes Licht auf die Perlen gestrahlt wird, um die Fluoreszenzmarkierung zu aktivieren. In einer anderen Ausführungsform kann ein Farbstoff eines gewissen Wesens im Aerosol enthalten sein, und die erste Detektionsphase ist, einen Haut- oder Gewebebereich zu definieren, welcher das Vorhandensein des Farbstoffs zeigt, was anfänglichen Beweis bereitstellt, daß dies der Bereich sein kann, der genauer auf das Vorhandensein der Mikrospur-Markierung untersucht wird, um die DNS-Mikrospur-Perlen zu finden und zu isolieren. In einer anderen Ausführungsform können die Perlen mit der Hälfte eines spezifischen Bindungspaares bereitgestellt werden, z. B. Antigen oder Antikörper, die zur Detektion radiomarkiert oder magnetisch sein oder Enzyme einschließen können.
Die Vorrichtung kann abgeändert sein, um Systeme zum Schutz von Eigentum als Teil eines Hauses oder ein Sicherheitssystem für Geschäftseigentum bereitzustellen, so daß im Falle von illegalem Zugang die Vorrichtung aktiviert werden kann, um Eindringlinge mit einer einzigartigen Mikrospur- Markierung zu besprühen, welche die Detektion und die eindeutige Identifikation des Eindringlings erleichtern kann. Eine andere Abänderung der Grundvorrichtung kann ein Autoalarmsystem sein, das Eindringlinge besprüht, die illegal in ein Fahrzeug steigen. Zusätzlich zu der vorstehend vorgesehenen Verwendung, in der die Vorrichtung passiv aktiviert wird, wenn sich zum Beispiel jemand unbefugt an einem Handkoffer zu schaffen macht, kann die Aerosolvorrichtung auch wissentlich von einem Individuum verwendet werden, das die Vorrichtung hält oder in der Lage ist, die Vorrichtung zu aktivieren. Zum Beispiel kann das Mikrospur-Aerosol als die Basis einer Personenschutzvorrichtung verwendet werden, um einzigartige Markierungen auf einen Angreifer oder möglichen Angreifer zu sprühen. Die Grundvorrichtung kann auf jeden Sachverhalt abgeändert werden, bei welchem die Übertragung der Mikrospur-Markierung durch ein Aerosol zum Identifizieren eines zweiten Individuums oder Materials, Gegenstands oder einer Ware vorteilhaft sein kann.
Erfindungsgemäß zu markierende Einzelhandelsgegenstände oder natürliche Produkte können unter Verwendung einer Aerosolvorrichtung besprüht werden, oder die Perlen können in einer anderen Ausführungsform anders aufgetragen werden, z. B. durch Anstreichen in flüssiger Form oder einer Suspension von Perlen, die in einen Stift zum Markieren des Gegenstands hinzugegeben wurden. Die Perlen können zu einer Tinte hinzugegeben werden, die auf den Gegenstand oder die Verpackung für den Gegenstand zu drucken ist. Die Perlen können auf einen kleinen Bereich des Gegenstands aufgetragen werden, der durch den Markierer oder Lieferant identifizierbar ist, so daß keine zusätzliche Markierung erforderlich ist, um das Vorhandensein der Perlen zu detektieren, die Perlen aber vom relevanten Teil des Gegenstands direkt für die Analyse isoliert werden können. Das Verfahren, durch welches die Perlen aufgetragen werden, variiert, abhängig vom zu markierenden Gegenstand. Zum Beispiel könnte Getreide an einer geeigneten Stelle in der Behandlung in derselben Art und Weise mit den Perlen besprüht werden, in der das Getreide mit Fungiziden besprüht werden kann, wohingegen ein kleiner Bereich eines Einzelhandelsgegestands vielleicht durch Auftragen der Perlen auf einen kleinen Bereich des Gegenstands unter Verwendung eines Stifts zum Ablagern der Perlensuspension markiert werden könnte.
In jedem Fall kann beides die gesamte Ware, die von einem bestimmten Hersteller herausgegeben wird, markieren, so daß jede Charge spezifisch markiert werden kann. In einer anderen Ausführungsform können Chargen, die an Verteiler geliefert wurden, die unter Verdacht standen, markiert oder zufällige Chargen markiert werden, um auf zukünftige Betrüger als ein Abschreckungsmittel zu wirken.
Die Perlen können in Lösung, zum Beispiel einer wäßrigen Lösung zwischen 10 - 100000 Perlen pro ml, suspendiert sein. Sobald die Lösung getrocknet worden ist, haften die Perlen an der Oberfläche, auf welche sie aufgetragen worden sind. Lacke oder Klebstoffe können in die Lösung hinzugegeben werden, um die Adhäsion zu fördern. In einer anderen Ausführungsform kann eine Schicht eines Lacks oder Klebstoffs auf die Mikroperlen aufgetragen werden, um sie vor dem Abnutzen zu schützen.
Die mit DNS beschichteten Mikroperlen sind ziemlich elastisch. In der trockenen Form ist die DNS schwerlich anfällig für den Angriff von Nucleasen und können daher zum Beispiel erfolgreich zum Markieren von Getreide verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform kann die DNS abgeändert werden, um den Widerstand gegen Nuclease-Angriff zu erhöhen. Vorausgesetzt, daß die Markierungen häufig verwendet werden, um Einzelhandelswaren während des Transports und der anfänglichen Verkäufe zu überwachen, kommen sie nicht mit Hitzeextremen in Berührung, welche andernfalls die DNS schädigen können. DNS kann einiger UV-Strahlung widerstehen. Während starkes UV Schaden verursachen kann, würde dieser nur auf einen Teil der Mikroperlen genau festgelegt werden und die im Rest der Perlen vorhandene DNS könnte noch immer brauchbar detektiert und analysiert werden.
Der Gegenstand, das Material oder die Ware, die die DNS- markierten Perlen tragen, können zum Beispiel unter Verwendung der Fluoreszenz- oder magnetischen Eigenschaft der Perle analysiert werden, zuerst um zu detektieren, ob DNS-markierte Perlen vorhanden sind und wo sie lokalisiert sind. Die Perlen stellen einen Brennpunkt für die DNS bereit, der erlaubt, die DNS leichter zu analysieren und zu detektieren. Im Anschluß an das Lokalisieren der Perlen können die Perlen aus dem Material oder Gegenstand oder der Kleidung einer Person ausgewaschen oder abgewaschen und die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) direkt auf den mit DNS-markierten Perlen unter Verwendung geeigneter Primer durchgeführt werden. Die PCR kann an DNS durchgeführt werden, welche von den Perlen abgetrennt worden ist, obwohl es bevorzugt und wirksamer ist, die PCR direkt an den DNS- markierten Perlen durchzuführen.
Die Mikroperlen können mit wenigstens zwei unterschiedlichen, an jede Perle gebundenen DNS-Molekülen hergestellt werden, wobei die Gesamtanzahl an DNS-Molekülen vorzugsweise im Bereich von 100-4000 Molekülen pro Perle liegt. Die unterschiedlichen DNS-Moleküle haben separate Primer für die PCR, wobei jeder Primer aus einem unterschiedlichen Satz von Primern, zum Beispiel einer von zehn bekannten Primern ausgewählt ist. Sobald eine Perle isoliert worden ist, wird die PCR-Reaktion durchgeführt, wobei jeder der Primer vom ersten Satz und jeder der 10 Primer vom zweiten Satz verwendet wird. Erfolgreiche PCR zeigt an, welche Printer vorhanden sind. Dies erlaubt für denselben Pool von zu verwendenden DNS-Primern, viele leicht identifizierbare DNS-Moleküle und Perlen, welche sich voneinander unterscheiden, zu erzeugen.
Die Erfindung wird nachstehend ausführlicher beispielsweise nur mit Bezug auf die dazugehörigen Zeichnungen beschrieben, in welchen gilt:
Fig. 1 ist ein schematisches Diagramm einer Aerosolvorrichtung zum Dispergieren von DNS-Mikrospur-Perlen; und
Fig. 2 zeigt vier verschiedene DNS-Moleküle, die paarweise an zwei unterscheidbaren Perlen angeordnet sind.
Eine Vorrichtung, wie schematisch in Fig. 1 gezeigt, ist dafür bestimmt, ein geeignetes Aerosol zu erzeugen, wenn sie durch ein geeignetes Signal von dem zu schützenden Material, Gegenstand oder der zu schützenden Ware aktiviert wird. Der Kanister enthält ein geeignetes Treibmittel (1), z. B. Druckluft, welches beim Ausströmen das Aerosol erzeugt, das die DNS-markierten Mikroperlen und etwaiges anderes Material vom Vorratsbehälter (2) enthält. Das Signal kann irgendein elektrisches Signal, mechanisches oder anderes physikalisches Signal, Lichtsignal, magnetisches Signal oder irgendein anderes geeignetes Mittel sein, um das Ventil (3) zu öffnen, damit das Treibmittel ausströmt und die Erzeugung des Aerosols ermöglicht.
Die schematisch in Fig. 1 gezeigte Vorrichtung basiert auf einer Vorrichtung, die von Modellbauern zum Versprühen von Farbe verwendet wird, ein Badger Air Brush 100, kraftbetrieben durch Humbrol Power Pack Druckluft. Jedoch können andere bekannte Aerosolvorrichtungen ausgestaltet sein, um die Mikrospur entweder zum sofortigen Versprühen oder in einem Vorratsbehälter zum späteren Aktivieren oder Anwenden hinzuzugeben.
Der Vorratsbehälter (2) enthält die Mikroperlen mit den daran befestigten DNS-Mikrospur-Molekülen in Suspension. Die Mikrospur-Perlen können in einer Gas- oder Flüssigphase bei Konzentrationen vorliegen, welche eine hohe Konzentration an Perlen im Aerosol ergeben. Typischerweise liegen die Perlen in einer konzentrierten Form vor, so daß, wenn sie im Aerosol dispergiert sind, 1 ml Aerosol zwischen 10 und 108 Perlen enthält, obwohl höhere und niedrigere Perlendichten für bestimmte Anwendungen geeignet sein können. Normalerweise ist die Suspensionsphase Wasser, aber jede andere Flüssigkeit dient dem Aerosol als das Dispersionsmittel.
Die Mikrospur-Perlen können jeder der vorher beschriebenen Formulierungen folgen. Zum Beispiel können die Perlen Q-435 von Dyno Particles AS, PO Box 160, N-2001, Lillestrom, Oslo, Norwegen (5,5 um Perlen, 89,5% Polystyrol, 5,5% Divinylbenzol und 5% Methylmethacrylat, beschichtet mit Streptavidin zum Befestigen von Biotin-markierten DNS-Oligonucleotiden, die die bekannte DNS-Basensequenz der Mikrospur-Markierung tragen) verwendet werden. Ferner können diese oder andere Perlen, die mit einem Fluoreszenz-Chromophor, wie Cumarin 6, markiert sind, als ein zusätzlicher Indikator für das Vorhandensein der Mikrospur-Perlen von einer gesammelten Probe verwendet werden. Perlen, wie Dyno Particles beads MP-887 (0,5 um Durchmesser mit Cumarin 6) oder MP-821 (0,25 um Durchmesser mit Cumarin 6), können verwendet werden.
Der Vorratsbehälter kann, separat von den Perlen, auch zusätzliche Indikatoren für das Vorhandensein des dispergierten Aerosols enthalten. Zum Beispiel kann die Gas- oder Flüssigphase auch spezifische Farbstoffe enthalten, insbesondere Fluoreszenzfarbstoffe oder andere Farbstoffe, die durch eine Reihe von einfachen (Licht) und komplexen (Elektronenmikroskopie, Durchflußzytometrie, NMR, IR oder andere spektroskopischen Techniken) Verfahren detektierbar sind. Der Zweck dieser zu den Mikrospur-Perlen beigegebenen Komponenten ist, geeignete Indikatoren bereitzustellen, daß das Aerosolspray auf einem Individuum direkt, seiner Kleidung oder anderen Waren, die dem markierten Individuum gehören, abgelagert worden ist. Ihr Zweck ist es, schnell und genau anzuzeigen, von welchen Bereichen ausführlich Proben genommen werden sollten, um sie auf das Vorhandensein der Mikrospur-Perlen zu untersuchen. Wegen des Mangels an Variabilität bei der möglichen Anzahl an beigegebenen Farbstoffen oder anderen Indikatoren ergeben sie nicht selbst die Menge an Einzigartigkeit, die mit den unterschiedlichen DNS-Oligonucleotiden, die als Schlüssel- Mikrospur-Markierungen verwendet werden, möglich ist. Außerdem kann das Aerosol zusätzliches Material enthalten, zum Beispiel einen Lack, wie Humbrol Nitratcellulose-Spannlack (Hull UK), oder Klebstoff, um die Befestigung der Mikrospur-Perlen an das gewünschte Ziel zu fördern, um sicherzustellen, daß die Perlen auf dem Zielindividuum oder -material beschichtet sind und dort bleiben.
Die Perlen sind beschichtet (entweder befestigt durch die Bindung von Biotin - enthalten innerhalb des DNS-Oligonucleotids - an entweder Streptavidin oder Neutralit, oder direkt gebunden durch irgendeine Art von -COOH- oder -NH&sub2;- oder eine andere vermittelte kovalente chemische Bindung oder irgendein anderes Verfahren von sicherer, stabiler Befestigung der DNS-Moleküle an die Perlen) mit wenigstens 100 DNS-Oligonucleotidmolekülen, typischerweise 2000 Molekülen, wobei das Besitzen einer bekannten einzigartigen Markierungssequenz geeignet sein würde.
Ein Aerosol kann auch zum Besprühen eines Gegenstands, wie Getreide, verwendet werden.
Für das Getreidemarkierungsverfahren wurde ein Gemisch aus DNS-markierten Fluoreszenzperlen mit einem Durchmesser von 0,5 um (MP887 von Dyno) und Fluoreszenz-markierten Perlen mit einem Durchmesser von 4,5 um (FC26 von Dyno) verwendet. Die FC26-Perlen wurden als geeignete Perlen für schnelle Identifizierung unter UV-Mikroskopie ausgewählt. Die MP887- Perlen wurden als die DNS-Träger verwendet. Für das Zwei- Perlen-Gemisch in den korrekten Verhältnissen wurde eine Stammsuspension von FC26-Perlen von 2,7 · 10&sup7; Perlen ml&supmin;¹ in TE- Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 8,0) hergestellt. 100 ul FC26-Perlen-Stammsuspension wurde zu 1 ml DNS-markierter MP887- Stammsuspension hinzugefügt. Die Zwei-Perlen-Stammlösung wurde mit TE-Puffer verdünnt, um eine Suspension zu liefern, die 1 · 10&sup6; FC26-Perlen ml&supmin;¹ und 1 · 10&sup8; DNS-markierte MP887-Perlen ml&supmin;¹ enthält. 1,0 ml verdünnte Zwei-Perlen-Stammlösung wurde auf 100 g Weizengetreide gesprüht, auf einem Tablett ausgebreitet und wenige Minuten lang an Luft trocknen gelassen. Das markierte Getreide wurde bei Raumtemperatur (ca. 15 bis 36ºC) in Kunststoffbehältern gelagert. Markieren des Getreides wurde durch Auflichtfluoreszenzmikroskopie unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 495 nm und einer Emissionswellenlänge von 510 nm und einem Bereich von 80facher bis 800facher Vergrößerung gezeigt.
Getreideproben können unter Verwendung der Auflichtfluoreszenz routinemäßig analysiert werden, um das Vorhandensein von Fluoreszenzperlen zu überprüfen. Ein breiter Bereich von Proben ist im Anschluß an verschiedene Lagerungen und Behandlungen mit einem Erfolg von 100% in dem Fall von Proben analysiert worden, welche unter Verwendung dieser Verfahren markiert worden sind. Proben, die für bis zu 9 Monaten markiert worden sind, zeigen weiterhin das Vorhandensein von Perlen ohne Anzeichen von irgendwelchen merklichen Veränderungen in der Anzahl der Perlen, die zu beobachten erwartet werden.
5,0 g Getreide wurde ausgewählt und dreimal in 5,0 ml deionisiertem Wasser gewaschen und die Waschungen wurden vereinigt (15,0 ml). Die Waschungen wurden in der folgenden Reihenfolge durch eine Reihe von Polycarbonatmembranfiltern (Nucleopore) gefiltert:
(a) 8,0 um Porengröße zum Entfernen großer Teilchen, einschließlich jeder merklichen Getreideteilchen.
(b) 0,8 um Porengröße zum Entfernen der nächsten Größe von Teilchen und FC26-Perlen.
(c) 0,22 um Porengröße zum Entfernen und konzentrieren der DNS-markierten MP887-Perlen.
Im Anschluß an jede Phase wurden die Membranen mit 5,0 ml deionisiertem Wasser gewaschen, um sicherzustellen, daß alle kleineren Teilchen, die durch den einzelnen Filter nicht zurückgehalten worden sind, durch die Membran liefen. Der abschließende 0,22 um Filter wurde vorsichtig in einem 1,5 ml Kunststoffröhrchen untergebracht, und 0,1 ml steriles deionisiertes Wasser wurde hinzugefügt. Die Membran und das Wasser wurden 5,0 min lang mit dem Vortexer gemischt, um die DNS-markierten Perlen von der Membran zu entfernen. Die Membran wurde aus dem Röhrchen entfernt und die DNS-markierten Perlen im Anschluß an 20 min langer Zentrifugation bei 13000 Upm als ein Pellet gesammelt. 900 ul des perlenfreien Überstands wurde vorsichtig mit einer Pipette entfernt, ohne das die Perlen enthaltende Pellet durcheinanderzuwirbeln. Die Perlen wurden dann in den verbleibenden 100 ul sterilen Wassers durch kräftiges Mischen mit dem Vortexer resuspendiert. 2,0 ul wurden durch Auflichtfluoreszenzmikroskopie überprüft, um sicherzustellen, daß die 0,5 um DNS-markierten MP887-Perlen wiedergewonnen worden sind. Die verbleibende Suspension wurde für nachfolgende DNS-Amplifizierungsverfahren bei 0,4ºC gelagert.
Um den Aufbau der großen Anzahl an einzigartigen DNS- Mikrospur-Markierungen zu erleichtern, kann mehr als ein anderes DNS-Oligonucleotid an den Perlen befestigt werden. Zum Beispiel kann jede Perle zwei verschiedene DNS-Moleküle tragen (Fig. 2). Außerdem kann jedes Aerosol oder jeder Zusatzstoff mehr als eine wiedererkennbare andere DNS-markierte Perle enthalten. Die Perlen können auf der Grundlage von Größe, Form, Oberflächenstruktur, chemischer Zusammensetzung, chemischen Zusatzstoffen (z. B. anderes Metall, Farbstoffe, Fluoreszenzfarbstoffe, usw.) oder irgendeiner anderen Eigenschaft unterschieden werden, welche möglich macht, eine Probe für verschiedene Arten von Perlen zu analysieren.
Die zwei verschiedenen DNS-Moleküle werden dadurch erkannt, daß sie verschiedene Primersequenzen besitzen. Ein typischer Aufbau besteht aus ungefähr 100 Basenpaaren in der Länge, wobei die ersten und letzten 30 Basenpaare Primer für die PCR-Amplifizierung sind und der mittlere Bereich eine spezifische DNS-Sequenz umfaßt. Die spezifische DNS-Sequenz kann entweder von den PCR-Primern oder in einer anderen Ausführungsform von einer zusätzlichen Region, bekannt als der Sequenzierprimer, sequenziert werden. Eine zusätzliche Sequenz kann zwischen der PCR-Primer- oder Sequenzierprimer- und der spezifischen Sequenz eingeschlossen werden, um sicherzustellen, daß die gesamte spezifische DNS-Sequenz sequenziert werden kann.
Wenn die beiden DNS-Moleküle verwendet werden, die entweder an denselben oder separaten Perlen befestigt sind, werden verschiedene PCR-Primer verwendet, um die Moleküle voneinander zu unterscheiden, wobei das Vorhandensein eines bestimmten Primers durch die PCR-Amplifizierung der Sequenz in Gegenwart eines bekannten Primers identifiziert wird. Tabelle 7 zeigt, wie 3 DNS-Primer aus einer dreidimensionalen Gruppierung von Primern für eine bestimmte Perle ausgewählt werden kann.
Mit Bezug auf nachstehende Tabelle 7 sind zwei Perlen veranschaulicht, wobei jede drei DNS-Moleküle mit drei verschiedenen Primern hat. Das erste DNS-Molekül hat in jedem Fall einen Primer, der aus A-J ausgewählt ist, das zweite DNS- Molekül für jede Perle hat einen Primer, der aus 1-10 ausgewählt ist, und das dritte DNS-Molekül an jeder Perle hat einen Primer, der aus K bis T ausgewählt ist. In diesem Fall haben die Perlen die Primer C,2,M bzw. E,9,N. Tabelle 7
Sobald eine Perle isoliert worden ist, kann in Gegenwart von jedem der Primer A-J eine PCR separat durchgeführt werden, um herauszufinden, welcher Primer zur Amplifizierung der DNS führt, was den Primer anzeigt, der im ersten DNS-Molekül der Perle vorhanden ist. Weitere Amplifizierung identifiziert, welche der Primer 1 bis 10 und K bis T vorhanden sind. Wenn erforderlich, kann dann die spezifische DNS-Sequenz aufgeklärt werden, um die Perle vollstandig zu identifizieren.
Die Gesamtanzahl an brauchbaren, einzigartigen DNS- Kombinationen für eine gegebene Anzahl an DNS-Molekülen (x), die an einer Art von Perle befestigt sind, ist in Tabelle 1 gezeigt und eine Anordnungsmatrix in Tabelle 2. Tabelle 3 zeigt die Anzahl an brauchbaren, einzigartigen paarweisen Perlen- Kombinationen (p) für eine gegebene Anzahl an paarweisen DNS- Kombinationen auf jeder Perle (n) und eine Anordnungsmatrix in Tabelle 4. Zum Beispiel ist die Gesamtanzahl an einzigartigen Markierungen (73,477 · 10&sup6;) für 100 verschiedene DNS-Oligonucleotide und ein Mikrospur-Produkt, das zwei verschiedene Perlen enthält, die aus 4 verschiedenen Perlen ausgewählt sind, in Tabelle 5 gezeigt. Eine ähnliche Tabelle für 200 verschiedene DNS-Moleküle und dieselbe Anzahl und Kombination an perlen zeigt, daß 182,9 · 10&sup6; einzigartige Markierungen erzeugt werden können (Tabelle 6). Es gibt keine Begrenzung der Anzahl an einzigartigen Mikrospur-Markierungen, weil die Anzahl an verschiedenen DNS-Molekülen oder die Anzahl an Perlen im Aerosol oder Zusatzstoff erhöht werden kann.
Im Fall eines Aerosols im Anschluß an die Verbreitung des Aerosols und Detektion einer Probe, welche mit dem Aerosol in Berührung gekommen ist, kann die Probe zuerst analysiert werden, um einfach das Vorhandensein (oder anderes) der Perlen darzulegen. Sobald Perlen detektiert worden sind, kann die DNS dann, wie vorher beschrieben, durch DNS-Amplifizierung und DNS- Sequenzierung analysiert werden, um die Art der Markierung zu bestimmen. Hierdurch können schlüssige Zusammenhänge zwischen der Art einer Aerosolprobe und dem genauen Ursprung und der genauen Position des Aerosols nachgewiesen werden. Tabelle 1: Anzahl an brauchbaren, einzigartigen paarweisen DNS-Kombinationen (n) für eine gegebene Anzahl an DNS-Molekülen (x) an einer Perle. Fortsetzung Tabelle 1: Anzahl an brauchbaren, einzigartigen paarweisen DNS-Kombinationen (n) für eine gegebene Anzahl an DNS-Molekülen (x) an einer Perle. Tabelle 2: Anordnung von brauchbaren, einzigartigen paarweisen DNS-Kombinationen (n) für eine gegebene Anzahl an DNS-Molekülen (x) an einer Perle.
zeigt aufgegebene Paarung an, weil nur ein einzelnes DNS-Molekül an einer Perle ist
zeigt aufgegebene Paarung an, weil dieselbe paarweise DNS-Kombination anderswo in der Matrix (z. B. ba = ab) ist - keine Möglichkeit der Bestimmung der DNS- Reihenfolge an den Perlen
zeigt brauchbare, einzigartige paarweise DNS-Kombination an
Siehe Tabelle 1 für Berechnungen von Werten von n für verschiedene Werte von x Tabelle 3: Anzahl an brauchbaren, einzigartigen paarweisen Perlen-Kombinationen (p) für eine gegebene Anzahl an paarweisen DNS-Kombinationen an jeder Perle. Tabelle 4: Anzahl an brauchbaren, einzigartigen paarweisen Perlen-Kombinationen (p) für eine gegebene Anzahl an paarweisen DNS-Kombinationen an jeder Perle (n).
zeigt aufgegebene Paarung an, weil dieselbe paarweise DNS-Kombination an einer der Perlen oder jedes Paar von Perlen ein einzelnes DNS-Molekül trägt
zeigt aufgegebene Paarung an, weil dieselbe paarweise DNS-Kombination an einem Paar von Perlen anderswo in der Matrix (z. B. baaa = aaab) ist - keine Möglichkeit der Bestimmung der DNS-Reihenfolge an den Perlen
zeigt brauchbare, einzigartige paarweise DNS-Kombination an
Siehe Tabelle 3 für Berechnungen von Werten von p für verschiedene Werte von n Tabelle 5: Anzahl an brauchbarer, einzigartiger paarweiser DNS aus 100 verschiedenen DNS-Molekülen an 2 verschiedenen Perlen, die aus 4 verschiedenen Perlen ausgewählt sind.
zeigt aufgegebene Paarung an, weil dieselbe Perle, die zum Erzeugen eines Paares verwendet wird - kann nicht als verschieden erkannt werden
zeigt aufgegebene Paarung an, weil dieselbe paarweise DNS-Kombination an einem Perlenpaar anderswo in der Matrix ist - keine Möglichkeit der Bestimmung der DNS- Reihenfolge an den Perlen
jeder Block entspricht der vollständigen Matrix von Tabelle 4

Zusammenfassung

Für 100 verschiedene DNS-Moleküle, die in verschiedenen paarweisen Kombinationen in einem Gemisch von zwei verschiedenen Perlen angeordnet wurden, die aus vier verschiedenen Arten von Perlen genommen wurden, gibt es:
6 · 12,246 · 10&sup6; = Tabelle 6: Anzahl an brauchbaren, einzigartigen paarweisen Kombinationen von DNS-Molekülen aus 200 verschiedenen DNS-Molekülen an einer paarweisen Perlen-Kombination, die aus 4 verschiedenen Perlen ausgewählt ist.
zeigt aufgegebene Paarung an, weil dieselbe Perle, die zum Erzeugen eines Paares verwendet wird - kann nicht als verschieden erkannt werden
zeigt aufgegebene Paarung an, weil dieselbe paarweise DNS-Kombination an einem Perlenpaar anderswo in der Matrix ist - keine Möglichkeit der Bestimmung der DNS- Reihenfolge an den Perlen
jeder Block entspricht der vollständigen Matrix von Tabelle 4

Zusammenfassung

Für 200 verschiedene DNS-Moleküle, die in verschiedenen paarweisen Kombinationen in einem Gemisch von zwei verschiedenen Perlen angeordnet wurden, die aus vier verschiedenen Arten von Perlen genommen wurden, gibt es:
6 · 197 · 10&sup6; =

Claims

1. Verfahren zur Markierung eines Feststoffs und nachfolgendes Detektieren eines Feststoffs, welcher markiert worden ist, welches umfaßt:

Auftragen eines Zusatzstoffs, umfassend eine Mehrzahl von Mikroperlen oder Teilchen, auf den Feststoff, wobei die Mikroperlen oder Teilchen zwei oder mehr Signalmittel umfassen, um ihre Detektion zu unterstützen, und auf dem Gegenstand mit dem bloßen Auge nicht sichtbar sind, wobei ein erstes Signalmittel eine Nucleinsäure-Markierung umfaßt und ein zweites Signalmittel keine Nucleinsäure-Markierung ist,

Probeentnahme des mit dem Zusatzstoff markierten Feststoffs, und

Detektieren des Vorhandenseins des Zusatzstoffs auf dem Feststoff durch Detektion des zweiten Signalmittels.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Zusatzstoff als eine Suspension in einer Flüssigkeit in einer Menge von höchstens einem Gewichtsteil Teilchen oder Mikroperlen pro 106 Gewichtsteilen Flüssigkeit aufgetragen wird und das Verfahren ferner das Trocknenlassen der Flüssigkeit zum Markieren des Feststoffs umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Teilchen oder Mikroperlen durch Besprühen des Feststoffs mit der Flüssigkeit, die die Teilchen oder Mikroperlen enthält, aufgetragen werden.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, wobei zwischen 10-10&sup8; Teilchen oder Mikroperlen pro ml Flüssigkeit vorhanden sind.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei die Flüssigkeit zusätzlich einen Lack oder einen Klebstoff umfaßt.

6. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei ein Lack oder Klebstoff auf die Mikroperlen oder Teilchen auf dem Feststoff aufgetragen wird.

7. Verfahren nach einem der vorangegangenen Anspruche, wobei das zweite Signalmittel in einem separaten Satz von Teilchen oder Mikroperlen einen Fluoreszenzfarbstoff umfaßt, der zu den mit Nucleinsäure markierten Teilchen oder Mikroperlen hinzugegeben wurde.

8. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Feststoff aus einem Erzeugnis, einem natürlich vorkommenden Material, Menschen und Tieren ausgewählt ist.

9. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, das ferner den Schritt des Analysierens der Nucleinsaure- Markierung umfaßt.

10. Verfahren zur Markierung eines Materials, umfassend das Auftragen eines Zusatzstoffs, umfassend eine Mehrzahl von Mikroperlen, auf das Material, wobei an die Mikroperlen eine Mehrzahl von Nucleinsäure-Molekülen befestigt wurden, wobei wenigstens zwei charakteristische Primersequenzen mit unterschiedlichen Nucleinsäure-Molekülen assoziiert sind, und wobei die Mikroperlen ferner ein zusätzliches Signalmittel umfassen, das kein Nucleinsäure-Molekül umfaßt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Signalmittel eine Fluoreszenzmarkierung umfaßt.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Mikroperle eine mittlere Größe von 0,05 bis 5 um hat.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei an jede Mikroperle zwischen 100 und 4000 Nucleinsaure-Molekule befestigt worden sind.

14. Verfahren nach einem der Anspruche 10 bis 13, wobei die unterschiedlichen Nucleinsäuren mit den beiden charakteristischen Primersequenzen an derselben Mikroperle befestigt sind.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, umfassend die zusätzlichen Schritte des Sammelns einer Probe des Materials und Detektierens des zusätzlichen Signalmittels.

16. Verfahren nach Anspruch 15, das ferner den Schritt des Analysierens der Primersequenzen umfaßt.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 16, das ferner die Schritte des Sammelns einer Probe des Materials und Analysierens der Nucleinsäure-Sequenz umfaßt.

18. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche zur Verwendung bei der Überwachung einer Wechselwirkung zwischen irgendeinem Material, Gegenstand oder Ware und einer Person oder eines Tieres, umfassend das Bereitstellen einer Vorrichtung, die zum Herstellen eines die Zusatzstoffmarkierung enthaltenden Aerosols ausgebildet ist, und Mittel zur Aktivierung des Aerosols bei Interferenz mit dem Material, dem Gegenstand oder der Ware durch eine Person oder ein Tier, so daß der Zusatzstoff als ein Aerosol auf die Person oder das Tier aufgetragen wird.

19. Aerosolkanister, umfassend ein Treibmittel, eine Flüssigkeit und einen Zusatzstoff, wobei der Zusatzstoff eine Mehrzahl von Teilchen oder Mikroperlen in einer Menge von höchstens 1 Gewichtsteil Teilchen pro 106 Gewichtsteilen Flüssigkeit einschließt, wobei die Teilchen Signalmittel umfassen, um ihre Detektion zu unterstützen, und in der Flüssigkeit mit dem bloßen Auge nicht sichtbar sind; wobei der Zusatzstoff zwei oder mehr Arten von Teilchen, wobei jede unterschiedliche Signalmittel hat, oder Teilchen mit zwei oder mehr unterschiedlichen Signalmitteln einschließt; wobei ein erstes Signalmittel Nucleinsäure einschließt und ein zweites Signalmittel keine Nucleinsäure-Markierung ist.

20. Aerosolkanister nach Anspruch 19, wobei zwischen 100 -10&sup8; Teilchenpro oder Mikroperlen pro ml Flüssigkeit vorhanden sind.

21. Aerosolkanister nach Anspruch 19 oder 20, wobei die Flüssigkeit zusätzlich einen Lack oder einen Klebstoff einschließt.

22. Aerosolkanister nach einem der Ansprüche 19 bis 21, wobei das zweite Signalmittel einen Fluoreszenzfarbstoff einschließt, der zu den mit Nucleinsäure markierten Teilchen oder Mikroperlen hinzugegeben wurde.

23. Aerosolkanister nach einem der Ansprüche 19 bis 22, wobei an die Mikroperlen eine Mehrzahl von Nucleinsäure- Molekülen befestigt wurde, wobei wenigstens zwei charakteristische Primersequenzen mit unterschiedlichen Nucleinsäure-Molekülen assoziiert sind.

24. Aerosolkanister nach Anspruch 23, der Mikroperlen, wie in einem der Ansprüche 12 bis 14 definiert, umfaßt.