DE69423865T2

DE69423865T2 - Trockene, analytische Vielschichtelemente für die Analyse von Transaminasen

Info

Publication number: DE69423865T2
Application number: DE69423865T
Authority: DE
Inventors: Marsha Denise Bale Oenick; Richard Linn Detwiler; Jon Nathan Eikenberry; John William Henderson Sutherland
Original assignee: Johnson and Johnson Clinical Diagnostics Inc
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1993-12-29
Filing date: 1994-12-28
Publication date: 2000-08-17
Anticipated expiration: 2014-12-29
Also published as: US5462858A; DK0661539T3; EP0661539B1; ATE191564T1; EP0661539A2; SG55049A1; JPH0819398A; DE69423865D1; EP0661539A3

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf das Feld der klinischen Chemie.
Alanintransaminase (ALT), auch bekannt als Glutamat-Pynivattransaminase (GPT, SGPT) und Aspartattransaminase (AST), auch bekannt als Glutamatoxalacetattransaminase (GOT, SGOT) haben für die Diagnose von Krankheiten klinische Bedeutung. Anomale Spiegel beider Transaminasen werden bei Patienten mit Leberkrankheiten, Herzmuskel- und Skelettmuskelnekrosen und anderen Krankheiten beobachtet.
Verfahren und mehrschichtige Trockenelemente zur Analyse beider Transaminasen sind bekannt. US-A-4,897,347 offenbart ein Verfahren und ein Element auf Grundlage der folgenden chemischen Reaktionen:
US-A-4,897,347 erfordert, daß die Pyruvatoxidase in der obersten porösen Schicht und in einer Schicht, die an die oberste Schicht angrenzt, vorliegt. Bezugsbeispiele 1 und 2 sind dort dargestellt. Die Elemente dieser Beispiele verwenden eine Schicht, die eine Titandioxidschicht zwischen der obersten Schicht und der Schicht verwendet, die die Pyruvatoxidase enthält. Diese Beispiele zeigen, daß solche Elemente dahingehend unbefriedigend sind, daß der mit dem Element bestimmbare Konzentrationsbereich der Transaminase eng ist, bei einer maximalen Konzentration von weniger als 200 U/L. Siehe dort Fig. 10.
Das Problem ist, daß der Einbau von Enzymen in Spreitschichten, die aus dispergierten anorganischen Verbindungen oder Polymerkügelchen auf eine Art und Weise, in der die enzymatische Aktivität beibehalten wird, schwierig ist und oft einen anschließenden Beschichtungsschritt erfordert, um das Enzym auf eine vorgeformte Spreitschicht aufzugeben. Überdies erfordern Spreitschichten im allgemeinen eine Unterlageschicht zwischen sich und darunterliegenden Reagenzschichten zur Anhaftung. Auch ist Pyruvatoxidase teuer.
Die vorliegende Erfindung stellt ein trockenes mehrschichtiges Analysenelement zur Analyse von Transaminasen zur Verfügung, die in der folgenden Abfolge eine Spreitschicht, eine Reagenzschicht und einen Träger aufweisen und das Element umfaßt:
a) ein Transaminasesubstrat;
b) Reagenzien, die in Gegenwart einer Transaminase und des Transaminsesubstrates Pyruvat erzeugen;
c) Pyruvatoxidase und Cofaktoren für Pyruvatoxidase;
d) Reagenzien, die Farbe im Verhältnis zu einer Konzentration an Wasserstoffperoxid erzeugen; dadurch gekennzeichnet, daß
e) die Spreitschicht das Transaminasesubstrat und ein Material enthält, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Polymerkügelchen, Bariumsulfat, Titandioxid und Mischungen daraus besteht,
f) die Reagenzschicht die Pyruvatoxidase enthält; und
g) wenigstens eine Schicht die Spreitschicht von der Reagenzschicht trennt.
Eine zweckmäßige Ausführungsform der Erfindung ist ein trockenes mehrschichtiges Element zur Analyse von Aspartataminotransaminase, das in der folgenden Abfolge eine Spreitschicht, eine Reagenzschicht und einen Träger aufweist, und das Element umfaßt:
a) Aspartat;
b) Reagenzien, die Pyruvat in Gegenwart von Aspartataminotransaminase und Aspartat erzeugen;
c) Pyruvatoxidase und Cofaktoren für Pyruvatoxidase;
d) Reagenzien, die Farbe im Verhältnis zu einer Konzentration an Wasserstoffperoxid erzeugen; dadurch gekennzeichnet, daß:
e) die Spreitschicht das Transaminasesubstrat und ein Material enthält, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Polymerkügelchen, Bariumsulfat, Titandioxid und Mischungen daraus besteht;
f) die Reagenzschicht die Pyruvatoxidase enthält; und
g) wenigstens eine Schicht die Spreitschicht von der Reagenzschicht trennt.
Eine andere zweckmäßige Ausführungsform ist ein trockenes mehrschichtiges Element zur Analyse von Alaninaminotransaminase, das in der folgenden Abfolge eine Spreitschicht, eine Reagenzschicht und einen Träger aufweist und das Element umfaßt:
a) Alanin;
b) Reagenzien, die Pyruvat in Gegenwart von Alaninaminotransaminase und Alanin erzeugen;
c) Pyruvatoxidase und Cofaktoren für Pyruvatoxidase;
d) Reagenzien, die Farbe im Verhältnis zu einer Konzentration an Wasserstoffperoxid erzeugen; dadurch gekennzeichnet, daß:
e) die Spreitschicht das Transaminasesubstrat und ein Material enthält, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Polymerkügelchen, Bariumsulfat, Titandioxid und Mischungen daraus besteht;
f) die Reagenzschicht die Pyruvatoxidase enthält; und
g) wenigstend eine Schicht die Spreitschicht von der Reagenzschicht trennt.
Die Verwendbarkeit dieses Elementes ist mit Blick auf die Lehre der obigen US-A- 4,897,347 überraschend, wo die Anordnung von Schichten zwischen den obersten Schichten und der die Pyruvatoxidase enthaltenden Schicht die Verwendbarkeit von Elementen zerstörte. Dieses Element erlaubt die kolorimetrische Analyse von Transaminasen unter Verwendung von viel weniger Pyruvatoxidase, als in den Beispielen des obigen US-Patentes verwendet wurde. Die oben genannten Beschichtungsprobleme werden vermieden.
Spreitschichten, einschließlich ihrer Arbeitsweise und Herstellung, sind in der Technik zur trockenen Analyse gut bekannt. Sie sind in vielen Patenten, wie US-A-4,357,363, EP-A- 0353026 und vielen anderen beschrieben. Bariumsulfat oder Titandioxid oder Mischungen daraus sind verwendbare Spreitschichten. Spreitschichten aus Polymerkügelchen, in US-A- 4,258,001 offenbart, können auch verwendet werden. Sie haften durch eine Unterlageschicht auf den verschiedenen Unterschichten an. Die Pyruvatoxidase enthaltende Schicht kann auch die Reagenzien zur Farberzeugung in Gegenwart von Wasserstoffperoxid enthalten. Die letzteren Reagenzien können in einer getrennten Schicht gehalten werden. Auf jeden Fall gibt es eine Unterlageschicht zwischen der Spreitschicht und den Enzymschichten. Wenn die die Pyruvatoxidase enthaltende Schicht auch die farberzeugenden Reagenzien enthält, wird das Vermeiden physikalischer Fehler und erhöhte Genauigkeit durch die eingeschobenen Unterlage- und/oder Gelatineschichten bewirkt.
Die Reagenzien, die Farbe im Verhältnis zu der Konzentration an Wasserstoffperoxid erzeugen, können eine einzelne Verbindung sein, die einen nachweisbaren Farbstoff durch die enzymatische Reaktion erzeugt, oder eine Kombination von Reagenzien, die den Farbstoff erzeugen. Die kolorimetrische Indikatorzusammensetzung kann einen Koppler und eine oxidierbare Verbindung enthalten, die reagiert, um den Farbstoff bereitzustellen. Auf eine andere Weise können die Reagenzien einen Leukofarbstoff und Peroxidase enthalten, wie Meerrettichperoxidase oder eine andere peroxidierende Verbindung, wie Meerrettichperoxidase, die einen nachweisbaren Farbstoff als Ergebnis des Vorliegens von Wasserstoffperoxid erzeugen. Geeignete Leukofarbstoffe sind im Stand der Technik bekannt und schließen diejenigen ein, die zum Beispiel in US-A-4,089,747 und US-A-612,509 beschrieben sind.
Die Arbeitsweise und Herstellung der Unterlageschichten sind in diesem Fachgebiet gut bekannt. Das Fachgebiet stellt eine große Vielfalt von Materialien zur Auswahl von Unterlageschichten zur Verfügung. In den Beispielen der vorliegenden Erfindung werden verschiedene Qualitäten von Polyvinylpyrrolidon auf Grundlage des Molekulargewichtes verwendet. Andere Unterlageschichten schließen Gelatine, andere natürliche Kolloide und hydrophile synthetische Polymere wie Polyacrylamid, Poly(N-isopropylacrylamid) und Polymethacrylamid und andere N-substituierte Acrylamidpolymere und Copolymere eines substituierten oder unsubstituierten Acrylamids oder cyklischen Aminmonomers, wie Vinylpyrrolidon und Vinylimidazol mit einem oder mehreren anderen hydrophilen Monomeren, wie Hydroxyalkylacrylaten und -methacrylaten, zum Beispiel Hydroxyethylmethacrylat, und Acryl- und Methacrylsäure, und optional mit einem polyfunktionellen Vernetzungsmonomer, wie N, N'-Methylenbisacrylamid, Ethylendiacrylat, Divinylbenzol, ein.
Die Schichten können unter Verwendung im Fachgebiet bekannter Beschichtungsverfahren beschichtet werden. Zum Beispiel sind oft Extrusionsgleittrichter der Art, wie sie in US- A-2,761,417 beschrieben ist, zur gleichzeitigen Beschichtung einer Vielzahl von Schichten vorteilhaft.
Transaminasen, die mit der vorliegenden Erfindung gemessen werden, sind diejenigen, die besonders in der Klassifizierung Nr. 2.6.1. der Enzymnomenklatur, Ausgabe 1972, heraus gegeben von Elsevia Co. (1973), von der International Union of Biochemistry genehmigt, beschrieben sind, wie diejenigen, die im Hintergrund der Erfindung erwähnt sind, aao.-
Eine indirekte Reaktion, bei der Pyruvat erzeugt wird, kann eine sein, bei der eine andere enzymatische Reaktion betroffen ist oder kann eine nicht-enzymatische chemische Reaktion sein. Auf jeden Fall kann jedes Verfahren, bei dem eine enzymatische oder chemische Reaktion in Verbindung mit einer Transaminasereaktion verwendet wird, um Wasserstoffperoxid als Endprodukt aus Pyruvat herzustellen, verwendet werden. Unter diesen sind die Messungen der Aktivitäten von ALT und AST die diagnostisch bedeutendsten.
Von der Substanz, die ein Substrat für die Transaminase ist, wird nur gefordert, daß sie eine Aminogruppe in sich trägt und, da die Beziehung zwischen einem Substrat-Enzym-Paar dem Fachmann gut bekannt ist, wird keine detaillierte Erklärung gegeben.
Transaminase ist ein Enzym, das den Transfer der Aminogruppe einer Aminosäure auf eine α-Ketosäure fördert. Das Substrat für Transaminase schließt die Aminosäure und die α- Ketosäure ein. Alanin und Aspartat werden zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung verwendet.
Pyruvatoxidase, die in den mehrschichtigen Analysefilmen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wird üblicherweise durch einen Pyruvatoxidaseaktivator aktiviert, um die Reaktion zu beschleunigen. Beispiele für den Pyruvatoxidaseaktivator schließen Coenzyme, anorganische Phosphate, zweiwertige Metallionen und dergleichen ein.
Der Pyruvatoxidaseaktivator wird im allgemeinen in einer Menge von 10&supmin;&sup9; bis 10&supmin;&sup5; Mol pro Einheit Pyruvatoxidase verwendet.
Typische Coenzyme schließen Flavin-Adenin-Dinucleotid, Cocarboxylase (Thiaminpyrophosphat), usw. ein; typische anorganische Phosphate schließen primäre und sekundäre Natriumphosphate, primäre und sekundäre Kaliumphosphate usw. ein; und typische zweiwertige Metallionen schließen Mg²&spplus;, Mn²&spplus;, Ca²&spplus;, Co²&spplus; und dergleichen ein. Im allgemeinen sind die Konzentrationsbereiche der verschiedenen Reagenzien, die in den Elementen der Erfindung verwendet werden, entsprechend dem Bereich der in den Patientenproben beobachteten Transaminasen eingestellt. Solche Bereiche können von jedem Fachmann eingestellt werden. Im allgemeinen können die Bereiche entsprechend der folgenden Tabelle eingestellt werden.
All die benötigten Reagenzien, um die Reaktionsreihe durchzuführen, auf die die vorliegende Analyse aufgebaut ist und die im Hintergrund der Erfindung beschrieben sind, sind im Handel erhältlich.
Das Element dieser Erfindung kann zur qualitativen und quantitativen Analyse von Transaminasen in biologischen Flüssigkeiten von Tieren oder Menschen verwendet werden, jedoch vorzugsweise von Menschen. Solche Flüssigkeiten schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Vollblut, Plasma, Serum, Lymphe, Galle, Urin, Liquor, Sputum, Schweiß und dergleichen, sowie Stuhlausscheidungen. Es ist auch möglich, flüssige Präparate menschlichen oder tierischen Gewebes zu analysieren, wie Skelettmuskel, Herz, Niere, Lungen, Gehirn, Knochenmark, Haut und dergleichen.
Elemente der Erfindung können in einer Vielfalt von Formen aufgebaut werden, einschließlich langgestreckten Bändern jeder erwünschten Breite, Folien, Objektträgern oder Chips.
Die Elemente können in manuellen oder automatisierten Analyseverfabren verwendet werden. Im allgemeinen wird beim Verwenden der Elemente die Analytenbestimmung durch Entnahme des Elementes von einer Vorratsrolle, einem Chippaket oder einer anderen Quelle und physisches Inkontaktbringen mit einer Probe (zum Beispiel bis zu 200 uL, vorzugsweise 10 bis 12 uL) der zu testenden Flüssigkeit gemacht, so daß die Probe und Reagenzien mit der Flüssigkeit gemischt werden und innerhalb des Elementes zusammenwirken, und die aufeinanderfolgenden Reaktionen, die zur Farbentwicklung notwendig sind, hervorzubringen. Ein solcher Kontakt kann auf jede geeignete Art und Weise erzielt werden, zum Beispiel durch Eintauchen oder Untertauchen des Elementes in die Probe oder, bevorzugt, durch Betropfen des Elementes per Hand oder Maschine mit einem Probentropfen mit einer geeigneten Abgabevorrichtung. Nach der Probenaufbringung wird das Element für eine Dauer von bis zu 5 Minuten inkubiert, um die Farbentwicklung zu erleichtern. Mit Inkubation meinen wir einfach, daß die Reagenzien in Kontakt miteinander für eine Dauer von bis zu 5 Minuten gehalten werden, bevor die Farbmessungen gemacht werden.
Die Schichten sind im allgemeinen miteinander in Flüssigkeitskontakt, was bedeutet, daß Flüssigkeiten, Reagenzien und auch Reaktionsprodukte (zum Beispiel Farbstoffe) durch übereinander gelegte Bereiche angrenzender Zonen hindurchtreten oder dazwischen transportiert werden können. In anderen Worten, wenn das Element mit einer wäßrigen Flüssigkeit in Kontakt gebracht wird, werden alle Reagenzien der analytischen Zusammensetzung dieser Erfindung gemischt, wie zuvor dargestellt, und können sich einfach innerhalb des Elementes als eine Zusammensetzung bewegen. Jede Schicht kann einzeln vorliegen oder zwei oder mehrere Zonen können getrennte Bereiche in einer einzelnen Schicht des Elementes sein. Neben den oben genannten Schriften sind geeignete Bestandteile für Elemente auch zum Beispiel in US-A- 4,042,335, US-A-4, 132,528 und US-A-4, 144,306 beschrieben.
Da die Probe im allgemeinen direkt auf die Spreitschicht aufgebracht wird, ist es wünschenswert, daß die Spreitschicht isotropisch porös ist, was bedeutet, daß die Porösität in jeder Richtung der Schicht die gleiche ist, wie sie durch miteinander verbundene Räume oder Poren zwischen Partikeln, Fasern oder Polymersträngen hervorgerufen wird.
Die Schichten können auf durchsichtige Träger, wie Polyethylenterephthalat, geschichtet sein. Andere Träger sind im Fachgebiet gut bekannt. Der Rücken des Trägers kann mit einer Farbzusammensetzung beschichtet sein, die unerwünschte Strahlung herausfiltert.
Die Elemente dieser Erfindung können auch eine oder mehrere Zusätze enthalten, die herkömmlicherweise in Elemente für verschiedener Herstellungs- oder Verwendungsvorteile eingeführt werden. Solche Zusätze schließen Tenside, Puffer, Lösungsmittel, Härter und andere im Fachgebiet bekannte Materialien ein.

Beispiele

Die folgenden Beispiele erläutern die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung.

Beispiel 1:

Fig. 1 zeigt die Strukturen und Zusammensetzungen von drei Elementen der Erfindung zur Analyse von Alanintransaminase (ALT). Fig. 1
Das * bedeutet, daß die Mengen U/m² sind. Ansonsten sind sie g/m². Die Symbole und Markennamen in den obigen und folgenden Elementen der Fig. 2-5 haben die folgenden Bedeutungen:
TX405: Triton X405: Ein Octylphenoxypolyethoxyethanol-nichtionisches Tensid, verkauft von Rohm und Haas.
Estane: Ein Polyester/Polyurethane, verkauft von B. F. Goodrich.
PVPK30: Polyvinylpyrrolidon, von GAF verkauft, mit einem Molekulargewicht von etwa 40.000. PVPK15 und PVPK90 sind dasselbe Polymer, außer daß sie Molekulargewichte von etwa 20.000 bzw. 360.000 haben.
TX200: Triton X200: Das Natriumsalz eines anionischen Alkylarylpolyethersulfonat-Tensids, verkauft von Rohm und Haas.
Tricin: N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-glycin-Puffer.
Leukofarbstoff: 4,5-Bis(4-dimethylaminophenyl)-2-(3,5-dimethoxy-4- hydroxyphenyl)imidazol.
Alkanol XC: Ein anionisches Natrium-Alkylnaphtalinsulfat-Tensid, verkauft von E. I. duPont de Nemours.
Bis-Tris: Bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methan.
Brij 98: Anionisches Polyoxyethylenoleylether-Tensid, verkauft von ICI Americas.
Die gezeigten Schichten werden auf einen klaren Polyesterträger geschichtet, der mit Uvinul (von BASF) Eastone Orange 2R Farbstoff, Eastone Yellow 6 GN Farbstoff und Eastone Red R Farbstoff beschichtet ist, um einen Ausschlußfilter für Licht niederer Wellenlänge zur Verfügung zu stellen. Die Eastone Farbstoffe sind von der Eastman Fine Chemicals oder Eastman Kodak Company erhältlich.
Die Analyse von ALT wird durch Zugabe einer 11 mL Probe Serum oder Plasma, die ALT enthält, auf die Oberfläche des Elementes erzielt. Das Element wird für fünf Minuten bei 37ºC inkubiert. Reflexionsdichtemessungen werden alle 6 s während der 5-minütigen Inkubation gemacht. Die Änderungsgesschwindigkeit der Reflexionsdichte über die Zeit wird über den linearen Bereich der Kurve der Reflexionsdichte gegen die Zeit errechnet. Die Geschwindigkeit wird durch Vergleich mit einer Kalibrationskurve, die mit drei Spiegeln ALT bestimmt wurde, umgerechnet.
Tabelle I unten zeigt die Ergebnisse des Verwendens der Elemente, die in Fig. 1 gezeigt sind, zur Analyse von Flüssigkeiten auf Basis menschlichen Serums, die ALT in verschiedenen Konzentrationen enthalten. Alle drei Elemente zeigen, daß ALT-Konzentrationen bis mindestens 922 U/L meßbare und deutliche Geschwindigkeiten ergeben. Das Vorliegen der gehärteten Gelschichten zwischen der Unterlagenschicht und der die Pyruvatoxidase enthaltenden Schicht (Beschichtungen A und B) hat die Geschwindigkeiten, die für eine gegebene ALT- Konzentration erhalten wurden, nicht wesentlich geändert.
Tabelle I zeigt auch, daß physikalische Fehler in der Spreitschicht für das Element vermerkt wurden, das keine Zwischenschicht aus gehärtetem Gel zwischen der Unterlageschicht und der die Pyruvatoxidase enthaltenden Schicht (Beschichtung C) enthielt, während dies die anderen nicht hatten. Tabelle I

Beispiel 2:

Fig. 2 zeigt den Aufbau und die Zusammensetzung eines alternativen mehrschichtigen Dünnschichtelementes zur Analyse von ALT, das auf einen klaren Polyesterträger geschichtet wurde, der mit Farbstoffen wie im Beispiel beschichtet war, um einen Ausschlußfilter für niedere Wellenlängen zu ergeben. Fig. 2
Die Analyse auf ALT wurde, wie in Beispiel 1 beschreiben, erzielt. Tabelle II zeigt die Geschwindigkeitsänderung der Reflexionsdichte über die Zeit für ALT-Konzentrationen im Bereich von 9 bis 992 U/L. Wieder werden meßbare und deutliche Geschwindigkeiten für ALT-Konzentrationen über diesen Bereich erhalten, die anzeigen, daß dieses Element auch für die Analyse von ALT verwendet werden kann.

Tabelle II

ALT Konz. Geschwindigkeiten
U/L Beschichtung D
9 0,0077
20 0,0205
405 0,0269
60 0,0316
99 0,0368
405 0,0543
715 0,0940
992 0,1718
Fehler? Nein

Beispiel 3:

Fig. 3 zeigt die Aufbauten und Zusammensetzungen der mehrschichtigen Dünnschichtelemente zur Analyse von ALT, die auf einen klaren Polyesterträger geschichtet waren, der mit Farbstoffen beschichtet war, um einen Ausschußfilter für niedere Wellenlängen, wie in Beispiel 1, zu ergeben. Fig. 3
Die gemessenen Flüssigkeiten waren von Kodak hergestellte Kontrollflüssigkeiten, die ALT enthalten. Die ALT-Konzentrationen wurden durch Vergleich mit der Geschwindigkeitsänderung der Reflexionsdichte über die Zeit mit einer Kalibrationskurve, die mit drei Kalibrationsflüssigkeiten erzeugt wurde, errechnet. Die Standardabweichung der Messung wurde aus fünf Parallelansätzen errechnet. Die Variationskoeffizienten (Standardabweichung / durchschnittliche Konzentration) sind in Tabelle III für die zwei Flüssigkeiten gezeigt. Tabelle III
Beschichtung F, die eine gehärtete Gelschicht zwischen der Unterlageschicht und der Pyruvatoxidaseschicht enthielt, ergab einen beträchtlich niedrigeren Variationskoeffizienten für beide Kontrollflüssigkeiten im Vergleich mit der Kontrollbeschichtung E. Überdies hatte die Beschichtung F keine physikalischen Fehler in der Spreitschicht, wie sie mit Beschichtung E auftraten.
Die Beschichtungen G und H, die eine höhere Menge Unterlagepolymer als Kontrollbeschichtung E enthalten, zeigen auch niedrige Variationskoeffizienten für eine oder beide Kontrollflüssigkeiten. Die Beschichtungen G und H zeigten auch keine physikalischen Fehler in der Spreitschicht.
Diese Beschichtungen zeigen, daß ein Verstärken der trockenen Bedeckung der Unterlageschicht die Beschichtungsfehler ausräumt und die Genauigkeit wenigstens der hochkonzentrierten Kontrollflüssigkeit verbessert. Verwenden einer gehärteten Gelschicht räumt die Beschichtungsfehler aus und verbessert die Genauigkeit. Weder die Zugabe der gehärteten Gelschicht noch die verstärkte Bedeckung des Unterlagenschichtpolymers erforderte eine Erhöhung der Pyruvatoxidase in der Reagenzschicht, um diese Ergebnisse zu erhalten.

Beispiel 4:

Fig. 4 zeigt den Aufbau und die Zusammensetzung eines mehrschichtigen Dünnschichtelementes zur Messung von Aspartataminotransferase (AST) auf klaren Polyester geschichtet, der mit Farbstoffen beschichtet war, um einen Ausschlußfilter für niedere Wellenlängen, wie in Beispiel 1, bereitzustellen. Fig. 4
Die Analyse von AST wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, erzielt. Tabelle IV zeigt die Änderungsgeschwindigkeit der Reflexion als Funktion der Zeit für Flüssigkeiten auf Basis menschlichen Serums, die AST in Konzentration von 3,5 bis 893,8 U/L enthalten. Die Ergebnisse zeigen an, daß die Geschwindigkeiten über den gemessenen Konzentrationsbereich meßbar und deutlich sind.

Tabelle IV

AST Konz. Geschwindigkeiten
U/L Beschichtung I
3,5 0.0034
28,1 0.0484
66,7 0,0990
525,5 0,5000
763,2 0,6191
893,8 0,7015

Beispiel 5:

Fig. 5 zeigt den Aufbau und die Zusammensetzung eines mehrschichtigen Dünnschichtelementes zur Messung von ALT unter Verwendung einer TiO&sub2;-Spreitschicht, die auf Polyester geschichtet war, das mit Farbstoffen beschichtet war, um einen Ausschlußfilter für niedere Wellenlängen, wie in Beispiel 1, zu ergeben. Fig. 5
Analyse von ALT wurde, wie in Beispiel 1 beschreiben, erzielt, außer daß die maximale Geschwindigkeit aus der Kurve dDr/dt gegen die Zeit errechnet wurde.
Tabelle V zeigt die Änderungsgeschwindigkeit der Reflexion als Funktion der Zeit für Kalibrationsflüssigkeiten, die ALT-Konzentrationen von 34 bis 864 U/L enthalten. Die Ergebnisse zeigen, daß dieses Element ALT über diesen Konzentrationsbereich messen kann.

Tabelle V

ALT Konz., U/L Vmax, Dr/min
34 0,02
225 0,07
864 0,27

Claims

1. Trockenes mehrschichtiges Analysenelement zum Analysieren von Transaminasen, das in der folgenden Abfolge eine Spreitschicht, eine Reagenzschicht und einen Träger aufweist und das Element umfaßt:

a) ein Transaminasesubstrat;

b) Reagenzien, die Pyruvat in Gegenwart einer Transaminase und des Transaminasesubstrates erzeugen;

c) Pyruvatoxidase und Cofaktoren für Pyruvatoxidase;

d) Reagenzien, die Farbe im Verhältnis zu einer Konzentration an Wasserstoffperoxid erzeugen; dadurch gekennzeichnet, daß:

e) die Spreitschicht das Transaminasesubstrat und ein Material enthält, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Polymerkügelchen, Bariumsulfat, Titandioxid und Mischungen daraus besteht;

f) die Reagenzschicht die Pyruvatoxidase enthält; und

g) wenigstens eine Schicht die Spreitschicht von der Reagenzschicht trennt.

2. Element nach Anspruch 1, bei dem die Schicht, die die Reagenzschicht von der Spreitschicht trennt, eine Unterlageschicht ist.

3. Element nach Anspruch 2, bei dem sowohl eine Gelatineschicht als auch eine Unterlageschicht die Reagenzschicht von der Spreitschicht trennen.

4. Element nach Anspruch 2 oder 3, bei dem die Unterlageschicht Polyvinylpyrrolidon umfaßt.

5. Element nach Anspruch 4, bei dem Polyvinylpyrrolidon ein Molekulargewicht von 10.000 bis 360.000 aufweist.

6. Element nach Anspruch 5. bei dem Polyvinylpyrrolidon ein Molekulargewicht von 40.000 aufweist.

7. Element nach Anspruch 2, bei dem eine gehärtete Gelatineschicht die Spreitschicht von der Reagenzschicht trennt.

8. Element nach Anspruch 1, 2, 3, 6 oder 7, bei dem die Reagenzschicht 1.000 bis 4.500 Einheiten Pyruvatoxidase umfaßt.

9. Element nach Anspruch 1, 2, 3, 6 oder 7, bei dem Reagenzien, die eine Farbe im Verhältnis zu der Konzentration an Wasserstoffperoxid erzeugen, ein Leukofarbstoff und Meerrettichperoxidase sind.

10. Trockenes mehrschichtiges Element zum Analysieren von Aspartataminotransaminase, das in der folgenden Abfolge eine Spreitschicht, eine Reagenzschicht und einen Träger aufweist und das Element umfaßt:

a) Aspartat;

b) Reagenzien, die Pyruvat in Gegenwart von Aspartataminotransaminase und Aspartat erzeugen;

c) Pyruvatoxidase und Cofaktoren für Pyruvatoxidase;

d) Reagenzien, die eine Farbe im Verhältnis zu einer Konzentration an Wasserstoffperoxid erzeugen; dadurch gekennzeichnet, daß:

f) die Reagenzschicht die Pyruvatoxidase enthält; und

g) wenigstens eine Schicht die Spreitschicht von der Reagenzschicht trennt.

11. Trockenes mehrschichtiges Element zum Analysieren von Alaninaminotransaminase, das in der folgenden Abfolge eine Spreitschicht, eine Reagenzschicht und einen Träger aufweist und das Element umfaßt:

a) Alanin;

b) Reagenzien, die Pyruvat in Gegenwart von Alaninaminotransaminase und Alanin erzeugen;

c) Pyruvatoxidase und Cofaktoren für Pyruvatoxidase;

f) die Reagenzschicht die Pyruvatoxidase enthält; und

g) wenigstens eine Schicht die Spreitschicht von der Reagenzschicht trennt.

12. Element nach Anspruch 10 oder 11, bei dem die Schicht, die die Reagenz- und Spreitschicht trennt, eine Unterlageschicht ist.

13. Element nach Anspruch 10 oder 11, bei dem sowohl eine Gelatineschicht als auch eine Unterlageschicht die Reagenzschicht von der Spreitschicht trennen.

14. Element nach Anspruch 12, bei dem die Unterlageschicht Polyvinylpyrrolidon ist.

15. Element nach Anspruch 14, bei dem Polyvinylpyrrolidon ein Molekulargewicht von 10.000 bis 360.000 aufweist.

16. Element nach Anspruch 15, bei dem Polyvinylpyrrolidon ein Molekulargewicht von 40.000 aufweist.

17. Element nach Anspruch 10 oder 11, bei dem die Reagenzschicht 1.000 bis 4.500 Einheiten Pyruvatoxidase umfaßt.

18. Element nach Anspruch 10 oder 11, bei dem die Reagenzien, die eine Farbe im Verhältnis zur Konzentration an Wasserstoffperoxid erzeugen, ein Leukofarbstoff und Meerrettichperoxidase sind.

19. Element nach Anspruch 1, 10 oder 11, bei dem die Spreitschicht Bariumsulfat oder Titandioxid umfaßt.

20. Element nach Anspruch 2 oder 13, bei dem die Gelatine gehärtet ist.