DE69315842T2 - Peptidverbindungen - Google Patents

Peptidverbindungen

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Peptidverbindungen, umfassend einen lipophilen Ankerabschnitt, der aus nilndestens einer Fettaminosäureeinheit gebildet ist, und einen Matrix-Kernabschnitt, der mindestens vier Aminosäurefunktionalitäten aufweist, die identisch sind und aus -NH&sub2;, -COOH, -SH, -OH und Derivaten davon ausgewählt sind. Zur Verwendung als beispielsweise Vakzine und Diagnostika können pharmazeutisch aktive Gruppierungen, insbesondere Peptid-Antigene, an die Amiosäurefimktionalitäten gebunden sem. Der lipophile Anker erlaubt der Verbindung die Inkorporation in Lipid-Vesikel und/oder Zelhnembranen. Die Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindung durch übliche Peptidsynthese, gewöhnlich auf einer festen Matrix.
  • Es ist wohlbekannt, daß synthetische Peptide Antikörper induzieren können, welche mit deren verwandten Sequenzen m den nativen Proteinen reagieren können, d.h., das synthetische Peptid und das native Protein umfassen dasselbe Epitop. Spezifische Antikörper smd als Reagenzien bei verschiedenen Untersuchungen nützlich. Ferner sind Peptid-Antigene, hergestellt durch verfligbare Peptidsynthese-Techniken, nützlich zur Herstellung von Immunogenen und zur Immunprophylaxe und bei der Affinitätsreinigung von Proteinen, Antikörpern oder anderen Molekülen.
  • Kleine Peptidinoleküle können allein ein nicht ausreichendes Molekulargewicht aufweisen, um überhaupt immunogen oder in ausreichendem Maß iminunogen zu sein, können jedoch durch Konjugation mit einem Trägermolekül, z.B. einem Protein oder einem synthetischen Polymer, immunogen oder stärker immunogen gemacht werden. Die Verwendung von Proteinen, z.B. Rinderserumalbumin (135A), wurde beschrieben. Obwohl das konjugierte Produkt antigen ist, umfaßt es eine große Anzahl anderer Epitope als den mit dem synthetischen Peptid von Interesse assoziierten. Di Marchi et al. beschreiben in Science (1986) 232, 639-641, ein synthetisches Peptid, umfassend zwei durch einen Spacer verbundene immunologisch bedeutsame Regionen eines Virus-Hüllproteins, welches ein ausreichendes Molekulargewicht aufweist, um eine Immunantwort zu mduzieren. Wiederum kann die Spacer-Region als Epitop wirken, was unerwünscht ist.
  • James P. Tam beschreibt in Pröc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5409-5413, einen neuen Weg, als Mehrfachantigen-Peptid-System (MAP) bezeichnet, um das Molekulargewicht von synthetischen Peptid-Antigenen zu erhöhen. Das MAP umfaßt eine Kernmatrix, die aus einer kleinen Zahl (n) aufeinanderfolgender Ebenen dendritisch verknüpfter trifunktioneller Aminosäuren, in der Praxis Lysinmolekülen, gebildet ist. Die Kernmatrix besitzt 2n terminale Funktionalitäten, in der Praxis Aminfunktionalitäten, von denen jede mit einem synthetischen Peptid konjugiert sein kann. Das MAP wurde synthetisiert, indem die Kernmatrix unter Anwendung eines üblichen stufenweisen Festphasenverfahrens durch Kontaktieren eines Überschusses an symmetrischem Anhydfid von Nα, Nε-Boc-Lys(Boc) mit (Boc)-β-Ala-OCH&sub2;-Pam-Harz (Phenylacetamidomethyl- Harz) gebildet wurde. Anschließende Kernebenen wurden durch ähnliche Schritte gebildet. Mit jeder terminalen Aminfunktionalität wurde ein vorgeformtes synthetisches Peptid- Antigenmolekül über einen Triglycyl-Linker verknüpft, anschließend die Abspaltung von dem Harz auf bekannte Weise vorgenommen. In einem MAP, in dem der Matrixkern drei Lysin-Ebenen und somit 2³ Amingruppen umfaßt, werden 8 Peptidgruppen pro Molekül vorliegen und wenn die Peptid-Antigen-Gruppen jeweils ein Molekulargewicht von z.B. 1200 anlweisen, macht das Peptid-Antigen mehr als 80% des Gesamtgewichts des MAP aus. Das MAP war antigen und induzierte Antikörper, die mit nativen Proteinen, welche dieselbe Peptidsequenz (p60src) enthielten, reagieren konnten.
  • Versionen von F-moc-geschützten, dendritisch verknüpften Polylysin-Kernen mit 4 Zweigen und 8 Zweigen, die mit Peptidsynthese-Harzen über einen β-Maninrest verknüpft sind, sind im Handel von Applied Biosystems, Inc., erhältlich.
  • Beim 12. American Peptide Symposium in Boston, 1991, beschrieben Defoort et al. ein MAP mit einem damit konjugierten vorgebildeten Lipid-Anker, um die inkorporation in Liposomen zu erlauben. Der Lipid-Anker umfaßt insgesamt 3 hydrophobe Ketten pro Molekül. Die Lipid-Enden umfassen Fettsäuren (Palmitoylgruppen), die durch Veresterungsreaktionen mit den beiden freien Hydroxylgruppen von Glycerin verknüpft sind, das als Polyhydroxy-Linkerverbindung wirkt, welche wiederum mit dem MAP- Kern durch Reaktion der dritten Hydroxygruppe mit der Thiolgruppe von Cystein unter Bildung einer Thioesterverknüpfung verbunden ist, wobei das Cystein über seine Carbonsäuregruppe mit der Seitenketten-Aminogruppe eines Lysinrests verbunden ist und eine dritte Palmitoylgruppe aufweist, die mit der Aminfunktionalität des Cysteinrests verknüpft ist.
  • Der Lysinrest ist dann über einen Linker von zwei Serinresten mit dem dendritischen Poly(lysin)-Kern verknüpft. Das Peptid-Antigen (4 Ketten pro Molekül) war mit den vier Aminfünktionalitäten des Kerns verknüpft.
  • Die Vorschläge von Defoort et al. sind insofern problematisch, als die Verbindung kompliziert herzustellen ist, da sie andere chemische Reaktionen als Peptidsyntheseschritte erfordert, um die Esterverknüpfungen der Palmitoylgruppen mit den Glycerinhydroxylgruppen und die Thioetherverknüpfimg zwischen Cystein und Glycerin zu erzeugen.
  • Obwohl der Lipid-Anker die erfolgreiche Inkorporation in Liposomen oder in eine Zellmembran erlaubt, ist sein Herstellungsverfahren aufwendig, da es eine Nachreaktion des MAP-Kernpeptid-Konjugats mit dem Lipid-Anker durch eine Veresterungsreaktion umfaßt, und darüber hinaus ist die Esterverknüpfungsgruppe einer Hydrolyse in vivo ausgesetzt und das gesamte Molekül könnte deshalb eine begrenzte Lebenszeit besitzen.
  • Auf demselben Symposium beschreiben Huang et al. ein weiteres MAP mit einem eingebauten Adjuvans. Der dendritisch verknüpfte Poly(lysin)-Kern war über einen Ser- Ser-Spacer mit drei Lysinresten und einem Alaninrest (vom Ausgangsmaterial der Peptidsynthese) verknüpft. Mit den Amin-Seitenkettenfunktionalitäten der Lysinreste werden Palmitoylreste in einer anschließenden Amidbildungsreaktion verknüpft. Huang et al. beschreiben eine Adaption des Tam-Homopoly(lysin)-MAP-Kerns, worin die beiden Aminoenden der Lysinreste im MAP gleiche Längen aufweisen, indem vor der nachfolgenden Reaktion ein β-Maninrest mit der Aminosäure-Amingruppe verknüpft wird. Das Produktinolekül soll Angaben zufolge eine freie Rotation der Peptide erlauben und die Oberflächen-Wechselwirkung mit einem Liposom, in welches das Molekül inkorporiert ist, minimieren.
  • Obwohl das Produkt durch Festphasen-Peptidsynthese allein hergestellt werden kann, erhöht die Umsetzung der Palmitoylgruppen in einem separaten Schritt die Länge des Gesamtverfahrens. Ferner kann die Schwierigkeit beim Lösen des Ausgangsmaterials Probleme verursachen.
  • Es ist auch bekannt, daß die Abgabe von Arzneimittelmolekülen an der gewünschten Wirkungsstelle im Körper erhöht werden kann durch Erhöhung der Größe der Einheit und/oder durch deren Verbindung mit einem Arzneimittel-Abgabe-System (AAS). Das AAS kann ein teilchenförmiges AAS sein, einschließlich Liposomen, in welche das Arzneimittel inkorporiert ist, z.B. durch Dispersion im intravesikulären Raum oder durch Verankerung an die Liposomenwand.
  • Liposomen als AAS können auf ihrer Oberfläche Komponenten einschließen, welche das Schicksal oder die Bestimmung des Liposoms beeinflussen sollen, z.B. die Zirkulationszeit im Blut verlängern, die Aufliahme durch bestimmte Gewebe verhindern oder beschleunigen, oder die Ansteuerung bestimmter Rezeptoren auf einer Zelloberfläche, z.B. durch Verwendung hydrophiler Überzüge und/oder Verknüpfling von Antikörpern. Es wäre wünschenswert, die Verankerung dieser verschiedenen aktiven Agentien an Liposomenoberflächen zu verbessern oder zu erleichtern.
  • In WO-A-89110348 (Gibbons), Tetrahedron (1992) 48, 923-930 (Toth et al.) und Liebigs Ann. Chem. (1990) 1175-1183 (Gibbons et al.) beschreiben Gibbons et al. die Synthese von Lipidaminosäuren und daraus gebildeten Homo- und Hetero-Oligöpeptiden. Die Fettaminosäuren weisen eine Seitenkette auf, gewöhnlich eine C&sub6;&submin;&sub2;&sub4;-Alkyl- oder -Alkenylgruppe, die gegebenenfalls substituiert sein kann. Die Peptide der Fettaminosauren smd hydrophob, wasserunlöslich, jedoch löslich in hydrophoben Lösungsmitteln und sollen Angaben zufolge in natürlichen Membranen löslich und damit kompatibel sein. Eine Konjugation mit pharmazeutischen Agentien wird vorgeschlagen zur Erhöhung der Membranlöslichkeit oder Translokation, zur Erhöhung der Aktivität von Arzneimitteln, welche an Zellinembranen wirken oder durch Zellmembranen absorbiert werden und als Träger für Vakzine eingesetzt werden können.
  • Gemaß der vorliegenden Erfindung wird eine neue Peptidverbindung bereitgestellt, umfassend mindestens zwei Aminosaureemheiten, die miteinander durch Peptidbindungen verknüpft sind, wobei die Verbindung einen lipophilen Anker umfaßt, der mit einer Aminosäureeinheit der Verbindung durch eine Peptidbindung verknüpft ist und welcher mindestens zwei Aniosäureeinheiten umfaßt, jeweils mit der Formel I
  • worin jedes R¹ unabhängig eine lineare oder verzweigtkettige Alkyl- oder Alkenylgruppe mit 6-24 Kohlenstoffatomen ist, die beiden Aminosäureeinheiten direkt miteinander durch Peptidbindungen verknüpft sind, die Verbindung auch einen Matrix-Kemabschnltt umfaßt, der n-Ebenen dendritisch und durch Peptidbindungen verknüpfter trifunktioneller Aminosäureeinheiten umfaßt, wobei n eine ganze Zahl von 1 oder größer ist, die oder jede trifunktionelle Aminosäureeinheit entweder zwei Carbonsäuregruppen oder zwei Aminogruppen umfaßt, und der Matrix-Kernabschnitt ferner nilndestens zwei terininale Funktionalitäten aufweist, die aus -NH&sub2;, -COOH, -OH, -SH und Derivaten davon ausgewählt sind.
  • Die Gruppe R¹ kann Substituenten einschließen, vorausgesetzt, daß diese die lipophile Natur der Gruppe nicht signifikant beeinträchtigen. Geeignete Substituenten umfassen Halogen-, Hydroxyl- und Thiolgruppen. Es kann günstig sein, Substituenten einzuschließen, z.B. um der Aminosäure geeignete Lösungsmittel-Solubilisierungseigenschaften zu verleihen, um ihr die Einsetzbarkeit bei der Peptidsynthese (z.B. wie von Toth et al. (op. cit.) beschrieben) zu ermöglichen.
  • Die terminalen Funktionalitäten, welche verschieden sein können, jedoch oft identisch sind, sind gewöhnlich aus Anün- und Carbonsäuregruppen und Derivaten davon ausgewählt, gewöhnlich Derivaten, welche entfernbare Schutzgruppen des üblicherweise bei der Peptidsynthese eingesetzten Typs aufweisen. Die Schutzgruppen in einem einzelnen Molekül können gleich oder verschiedene Typen sein. Besonders bevorzugt sind die terminalen Funktionalitäten jeweils eine Amingruppe oder ein geschütztes Derivat davon.
  • Der lipophile Ankerabschnitt der neuen Verbindung kann zwei Fettaminosäureeinheiten der Formel I oder, vorzugsweise, 3 oder sogar mehr solcher Einheiten, mit R¹-Gruppen, welche gleich oder verschieden sind, umfassen, die durch Peptidbindungen, vorzugsweise direkt, mitelnander verknüpft sind. Es kann optimal sein, daß die Verbindung drei solche Einheiten umfaßt, um Lipid-Verbindungen biologischer Membranen nachzubilden.
  • Der Matrix-Kernabschnitt umfaßt n Ebenen dendritisch verknüpfter trifunktioneller Aminosäureeinheiten, wobei n eine ganze Zahi von 1 oder größer ist, vorzugsweise 2, 3 oder 4, wobei die trifunktionellen Aminosäureeinheiten entweder zwei Carbonsäuregruppen oder zwei Amingruppen umfassen. In dieser Beschreibung bedeutet "dendritisch verknüpft", daß die Einheiten in einer verzweigten Struktur verknüpft sind, wobei mindestens eine der Aminosäureeinheiten auf einer Ebene durch eine der beiden ähnlichen Funktionalitäten mit zwei trifunktionellen Aminosäureeinheiten in der nächsten Ebene verknüpft ist, gegebenenfalls mit Spacer-Aminosäureresten in einem oder beiden der Zweige zwischen den beiden Funktionalitäten einer Ebene und der jeweiligen Aminosäure der nächsten Ebene. Beispielsweise ist die einzelne zentrale trifunktionelle Aminosäure der ersten Ebene mit einer oder zwei trifunktionellen Aminosäure(n) in der zweiten Ebene verknüpft. Wenn es drei oder mehr Ebenen gibt, sind einige oder alle des Maximums von vier Funktionalitäten der Aminosäuren der zweiten Ebene mit einer weiteren trifunktionellen Aminosäureeinheit verknüpft, usw. Die Kernmatrix weist so ein Maximum von 2n terininalen Funktionalitäten auf. n ist vorzugsweise mindestens 2 und ist gewöhnlich 3 oder 4, in welchem Fall die maximale Zahl der terminalen Funktionalitäten 4, 8 bzw. 16 beträgt.
  • Die Aminosäureeinheit, auf der eine dendritische Struktur basiert, ist vorzugsweise Lysin. Die Zweige können Spacer-Einheiten, wie z.B. von Huang et al. (op. cit.) beschrieben, umfassen, um die Amino-Enden eines terminalen Restes oder einer Zwischenebene der dendritischen Struktur im wesentlichen auf gleiche Länge zu bringen. Die Spacer- Einheiten umfassen geeigneterweise β-Alaninreste.
  • Die dendritische Struktur braucht nicht symmetrisch zu sein, d.h., es muß nicht jede Ebene der Struktur vollständig sem.
  • In der Erfindung müssen mindestens zwei der genannten terminalen Funktionalitäten pro Molekül vorliegen. Die Erfindung ist am nützlichsten, wenn mindestens 4 der genannten teralen Funktionalitäten vorliegen, und es ist oft vorteilhaft, daß mindestens 8 oder mehr vorliegen.
  • Die zentrale trifunktionelle Aminosäureeinheit eines dendritischen Matrix-Kernabschnitts kann über lhre dritte Funktionalität (welche die von den beiden anderen verschiedene ist) mit einer weiteren Aminosäureeinheit durch eine Peptidverbindung verknüpft sein.
  • Der lipophile Anker ist vorzugsweise mit der zentralen Aminosäure des dendritischen Matrix-Kerns verknüpft, gegebenenfalls über eine Linkergruppe, obwohl es in einigen Fällen bevorzugt sein kann, daß der lipophile Anker mit dem Matrix-Kern über einen oder mehrere Zweig(e) verknüpft ist. Ist der lipophile Anker über die zentrale Aminosäure verknüpft, kann eine Einheit der Formel I direkt durch eine Peptidbindung mit der zentralen Aminosäure verknüpft sein, oder es kann ein Zwischen-Linker vorliegen, der eine oder mehrere Aminosäureeinheiten umfaßt, die miteinander durch Peptidbindungen verknüpft sind und mit der Fettaminosäure und dem Matrix-Kern durch Peptidbindungen verknüpft sind. Beispielsweise können solche Linker-Aminosäureeinheiten einen gewünschten Abstand der Kernmatrix vom lipophilen Anker ergeben.
  • Wenn der Matrix-Kernabschnitt eine dendritische Struktlir aufweist, bei der der lipophile Anker direkt oder indirekt über einen seiner (C- oder N-) Enden mit der zentralen Aminosäure verknüpft ist, kann das entgegengesetzte Ende des lipophilen Ankers eine oder mehrere weitere Aminosäuren umfassen, die miteinander durch Peptidbindungen verknüpft sind. Beispielsweise können solche Aminosäuren als Ergebnis des Peptidsyntheseverfahrens anwesend sein, wobei eine spezielle Aminosäure als erste Einheit einer Peptidkette bei einer Festphasen-Peptidsynthese unter Verwendung eines im Handel erhältlichen beladenen Harzes, z.B. Boc-Aminoacyl-Pam-Harz oder Aminoacyl-BHA- Harz, eingesetzt wurde.
  • Die terminalen Funktionalitäten der Peptidverbindungen können in Form geschützter Gruppen vorliegen, wobei solche Derivate gewöhnlich vorübergehende Schutzgruppen des bei der Peptidsynthese verwendeten Typs sind, welche anschließend entfernt werden können. Beispielsweise können Amingruppen als terininale Funktionalitäten durch eine Carbobenzoxygruppe oder, vorzugsweise, durch t-Butoxycarbonyl (Boc) oder 9- Fluorenylmethyloxy (Fmoc) geschützt sein. Hydroxyl- und Thiolgruppen können durch Benzylgruppen geschützt sein. Carbonsäuregruppen können durch verschiedene Estergruppen geschützt sein.
  • In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine pharmazeutisch aktive Verbindung bereitgestellt, die aus einer neuen Peptidverbindung wie oben defmiert gebildet wird, welche einen pharmazeutisch aktiven Substituenten mit jeder der terminalen Funktionalitäten verknüpft aufweist.
  • Obwohl es bei diesem Aspekt der Erfindung günstig sein kann, daß jedes Molekül zwei oder mehr verschiedene pharmazeutisch aktive Substituenten m Verknüpfung mit termmalen Funktionalitäten umfaßt, ist die Erfindung am nützlichsten, wenn jeder pharmazeutisch aktive Substituent in einem einzelnen Molekül gleich ist. Die Erfindung ist besonders wertvoll, wenn jeder der pharmazeutisch aktiven Substituenten ein Peptid- Antigen ist, d.h., wenn die pharmazeutisch aktive Verbindung ein mehrfach antigenes Peptid ist. Wir haben dieses neue Produkt ein Lipid-Kern-Peptid (LKP) genannt. Vorzugsweise ist der pharmazeutisch aktive Substituent mit der Peptidverbindung über Peptidverknüpffingen mit den terminalen Funktionalitäten verbunden, welche dementsprechend Carbonsäure- oder Aminogruppen oder Derivate davon sind. Alternativ kann der pharmazeutisch aktive Substituent mit der Peptidverbindung über Linkergruppen, wie z.B. eine Aminosäuregnippe oder Oligopeptidgruppe, z.B. ein Triglycyl-Linker wie von Tam in PNAS (op. cit.) beschrieben, verknüpft sein.
  • Die Erfindung ist besonders wertvoll beim Einsatz als synthetisches Peptid-Vakzin und in einem weiteren Aspekt der Erfindung umfaßt ein Vakzin, z.B. für die Immunprophylaxe, eine pharmazeutisch aktive Verbindung gemäß der Erfindung und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, z.B. einschließlich eines Adjuvans, z.B. CFA (vollständiges Freunds-Adjuvans) oder NAGO (Neuraininidase und Galactoseoxidase).
  • Alternativ kann der aktive Bestandteil ein Arzneimittelmolekül sein, welches zur optimalen Wirkung die Assozuerung mit einem Arzneimittel-Abgabe-System benötigt.
  • In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, zwei verschiedene aktive Substituenten in ein einziges Molekül einzuschließen. Wenn durch Induktion von Ahtikörpern gegen mehr als ein Epitop eine verbesserte Prophylaxe erreicht wird, wie von Di Marchi et al. (op. cit.) beschrieben, kann es z.B. vorteilhaft sein, zur Prophylaxe oder Behandlung einer einzelnen Erkrankung oder zur gleichzeitigen Prophylaxe oder Behandlung von mehr als einer Erkrankung ein Molekül bereitzustellen, welches eine multivalente Antigenizität aufweist.
  • Es wird angenommen, daß hier zum ersten Mal vorgeschlagen wurde, das MAP-System zur Herstellung eines multivalenten Vakzins einzusetzen, und gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine multivalente Verbindung bereitgestellt, umfassend einen dendritisch verknüpften Polypeptid-Kern, der mindestens zwei Ebenen und mindestens drei terminale Zweige aufweist, einen Anker, der lipophile Komponenten in kovalenter Verknüpfung mit einem Gerüstkettenabschnitt umfaßt, der direkt oder indirekt kovalent mit dem Kern verknüpft ist, und zwei oder mehr aktive Substituenten, die kovalent mit den terminalen Zweigen des Kerns verknüpft sind. Die multivalente Verbindung wird von einer Peptidverbindung des ersten Aspekts dieser Erfindung gebildet.
  • Werden zwei oder mehr aktive Substituenten in der Verbindung eingeschlossen, kann dies erreicht werden durch die Verwendung einer Ausgangspeptidverbindung, bei der die terminalen Funktionalitäten, mit denen die verschiedenen Substituenten verknüpft werden, verschieden oder gleich sind, jedoch verschiedene Schutzgruppen aufweisen, die unter unterschiedlichen Bedingungen entfernt werden können. Wenn die terminalen Funktionalitäten beispielsweise beide Anüngruppen sind, können die Schutzgruppen Boc und Fmoc umfassen.
  • Die neue Peptidverbindung der Erfindung oder die neue pharmazeutisch aktive Verbindung kann in Form einer Liposom-Zusammensetzung dargeboten werden, welche die neue Verbindung in einem Lipid-Vesikel über den lipophilen Ankerabschnitt verankert umfaßt. Es kann ein beliebiger pharmazeutisch aktiver Substituent auf der Oberfläche der Lipid- Vesikel oder im intra-vesikulären Raum vorliegen.
  • In einem noch weiteren Aspekt der Erfindung wird ein neues Verfahren zur Herstellung der erfmdungsgemäßen Peptidverbindung bereitgestellt, worin der liphile Anker und der Matrix-Kernabschnitt durch die Reaktion des Amin- oder Carbonsäüre-Äquivalents des lipophilen Ankers mit dem Carbonsäure bzw. Amin-Äquivalent der Aminosäureeinheit der Verbindung verknüpft werden, um die Peptidbindung zu bilden. Vorzugsweise wird die Bildung der Peptidbindung als Festphasen-Peptidsyntheseschritt durchgeführt, worin die sich bildende Peptidverbindung mit einem Harz verknüpft ist. Vorzugsweise wird das gesamte Polypeptid durch ein stufenweises Peptidsyntheseverfahren aus den jeweiligen Aminosäuren aufgebaut, d.h., das Verfahren umfaßt die Bildung von Peptidbindungen zwischen den Einheiten der Formel I und von Peptidbindungen zwischen den Aminosäureeinheiten des Matrix-Kernabschnitts in sequentieller Weise und oline Abspaltung der sich bildenden Peptidverbindung von dem Harz. Erforderlichenfalls werden die C- und N-Gruppen und funktionellen Gruppen der terminalen Funktionalitäten in geeigneter Weise geschützt, um die Matrix-Kernabsclmitte und Ankerabschnitte zu bilden. Wenn die Peptidverbindung eine pharmazeutisch aktive Verbindung ist, in der jede terminale Funktionalität eine Amin- oder Carbonsäuregruppe oder ein Derivat davon ist, wird vorzugsweise jede Peptidbindung, welche einen pharmazeutisch aktiven Substituenten mit einer terminalen Funktionalität verknüpft, durch die Reaktion einer Amin- oder Carbonsäureeinheit oder eines Derivats davon des pharmazeutisch aktiven Substituenten mit der terminalen Funktionalität gebildet, während die sich bildende Peptidverbindung mit dem Harz verknüpft ist.
  • Obwohl das Verfahren in einer Flüssigphasenreaktion durchgeführt werden kann, ist eine Festphasenreaktion im allgemeinen weit bequemer. Ein geeignetes Verfahren ist eine stufenweise Festphasenreaktion, basierend auf dem von Merrifield in J. Am. Chem. Soc. (1963) 85, 2149-2154 beschriebenen Verfahren oder vorzugsweise der Weiterentwicklung dieses Verfahrens, die von Mitchell et al. in J. Org. Chem. (1978) 43, 2845-2852 beschrieben wurde, unter Verwendung eines Harzes mit einer Phenylacetamidomethyl (Pam)-Brücke zwischen dem Poly(styroldivinylbenzol)harz und der Aminosäure. Vorzugsweise weist das Ausgangsharz einen relativ geringen Aminosäuregehalt auf.
  • Bei dem Verfahren wird die oder jede Fettaminosäureeinheit vorzugsweise in Schritten vor der Umsetzung der Aminosäuren zur Bildung des Matrix-Kernabschnitts verknüpft, obwohl sie in Schritten nach der Bildung des Matrix-Kernabschnitts verknüpft werden kann. Linker-Aminosäuren können in Schritten vor und/oder nach den Schritten der Hinzufügung der Fettaminosäureeinheiten und/oder der Matrix-Kerneinheiten inkorporiert werden.
  • Die Schritte zur Bildung der Peptidverknüpfung können beliebige der üblicherweise in der Peptidsynthese eingesetzten sein. Beispielsweise kann das ursprünglich von Bodansky in Nature (1955)175, 685 beschriebene p-Nitrophenylester-Verfahren oder, bequemer, das zuerst von Sheehan et al. in J. Am. Chem. Soc. (1955) 77, 1067, beschriebene N,N'- Dicyclohexylcarbodiimid-Verfahren eingesetzt werden.
  • Besonders bequem umfaßt das Verfahren zuerst die Kopplung der einen oder mehreren N-geschützten Fettaminosäureeinheit(en) an das Harz unter geeigneten zwischengeschalteten Verfahrensschritten zur Beseitigung der Schutzgruppen, gefolgt von der Bildung einer Matrix-Kerneinheit, welche z.B. eine dendritische Struktur umfaßt, durch sequentielle Bildung der Kern-Matrix-Ebenen unter Verwendung N-geschützter trifunktioneller Aminosäuren, wiederum mit geeigneten Schritten zur Beseitigung von Schutzgruppen, die bei der Bildung der Ebenen der dendritischen Struktur zwischengeschaltet sind.
  • Falls die dendritische Struktur Spacer-Einheiten nur in einem, jedoch nicht im anderen Zweig einer Einheit in einer bestimmten Ebene umfaßt, z.B. zur Einfürung eines β- Maninrestes, um die Zweiglängen eines Lysinrests anzugleichen, werden die beiden ähnlichen funktionellen Gruppen mit verschiedenen Schutzgruppen versehen. Beispielsweise ist im Handel ein Lysin-Derivat erhältlich, bei dem eine seiner Aminogruppen mit einer Boc-Gruppe und die andere durch eine Fmoc-Gruppe geschützt ist. Dies ermöglicht es, den Spacer-Rest an eine, jedoch nicht an die andere Amingruppe zu addieren. Falls es keinen Spacer gibt oder einen Spacer für jeden Zweig, sollten die beiden ähnlichen Funktionalitäten dieselbe Schutzgruppe aufweisen. Soll die pharmazeutisch aktive Verbindung mehr als einen Typ eines aktiven Substituenten einschließen, sollten die terminalen Funktionalitäten der Peptidverbindung so gewählt werden, daß sie gleich oder verschieden sind, jedoch verschiedene Schutzgruppen aufweisen, um eine sequentielle Reaktion der unterschiedlichen aktiven Substituenten zu ermöglichen.
  • Anschließend können die terminalen Funktionalitäten nach einer etwaigen erforderlichen Schutzgruppenentfernung mit einer pharmazeutisch aktiven Gruppierung umgesetzt werden, während das Oligopeptid noch mit dem festen Träger verknüpft ist, wobei erforderlichenfalls eine optionale Linker-Aminosäure oder mehrere Linker-Aminosäuren in aufeinanderfolgenden Schritten inkorporiert werden. Eine pharmazeutisch aktive Gruppierung, die selbst ein Peptid ist, kann vorgebildet und dann an die terminalen Funktionalitäten addiert werden, oder kann in situ durch schrittweise Bildung unter Anwendung derselben Peptidsyntheseschritte synthetisiert werden. Das Oligopeptid kann von dem festen Träger nach bekannten Verfahren entfernt undje nach Erfordernis gereinigt und gewonnen werden. Beispiele sind die von Merrifield (op. cit.) beschriebenen Verseiflingsverfahren unter Verwendung von ethanolischem Natriumhydroxid nach der Schutzgruppenentfernung in HBr/Essigsäure oder üblicher, unter Anwendung des u.a. von Tam et al. in Tetrahedron Lett. (1982)23, 2939-2942 beschriebenen HF-Verfahrens oder unter Anwendung der von Tam et al. in J. Am. Chem. Soc. (1986)108, 5242-5251 beschriebenen Trifluormethansulfonsäure-Trifluoressigsäure-Dimethylsulfid-Technik.
  • Die Fettaminosäuren, von denen sich der lipophile Anker ableitet, konnen irgendwelche der Fettaminosauren sem, welche in WO-A-89110348, Toth et al. (op. cit.) und Gibbons et al. (op. cit.) beschrieben werden. Die Fettaminosäuren können in der D- oder L- Form vorliegen oder ein Racemat sein. Es kann vorteilhaft sein, alternierende D- und L- Fettaminosäuren in einer Peptidverbindung einzusetzen, die zwei oder mehr benachbarte Reste einschließt, wie von Huang et al. erläutert.
  • Es ist festgestellt worden, daß trotz der lipophilen Natur der Fettaminosäure-Verbindungen Festphasen-Peptidsyntheseverfahren eingesetzt werden können, um die Verbindungen der Erfindung zu bilden, da die monomeren Fettaminosäuren in den üblicherweise eingesetzten flüssigen Vehikeln löslich sind.
  • Obwohl für das Verfahren der Erfindung die Festphasen-Peptidsynthese bevorzugt ist, ist es alternativ möglich, Flüssigphasen-Verfahren für einige oder alle der Schritte zur Bildung der Peptidverbindungen der Erfindung einzusetzen.
  • Die Peptidverbindung der vorliegenden Erfindung kann mit einem festen Träger als Handelsartikel verknüpft sein. Beispielsweise kann es günstig sein, die Verbindung bereitzustellen in Form eines Harz-Trägers des allgemein zur Festphasen-Peptidsynthese eingesetzten Typs, mit dem die Peptidverbindung verknüpft ist, welche das direkte Ergebnis eines Festphasenreaktionsverfahrens ist. In der am meisten bevorzugten Form der Erfindung umfaßt die Verbindung den Harz-Träger, der direkt oder über eine Linker- Peptideinheit mit dem lipophilen Anker verknüpft ist, welcher wiederum direkt oder über einen Peptid-Linker mit der Kern-Matrix verknüpft ist, welche eine dendritische Struktur umfaßt, deren zentrale Aminosäure direkt oder indirekt mit dem lipophilen Anker verknüpft ist. In dieser Form der Verbindung sind die terminalen Funktionalitäten im allgemeinen Amingruppen oder Carbonsäuregruppen in geschützter Form, wobei die Schutzgruppen diejenigen sind, welche normalerweise in der Peptidsynthese für einen vorübergehenden Schutz eingesetzt werden, und welche im allgemeinen die direkten Produkte der Peptidsyntheseschritte sind. Die Verbindung in dieser Form ist relativ stabil und kann als Handelsartikel vertrieben werden für eme nachfolgende Umsetzung mit pharmazeutisch aktiven Substituenten, insbesondere antigenen Peptiden, oder zur in situ Synthese von antigenen Peptiden, auf Wunsch gefolgt von einer Abspaltung der Produktverbindung von dem festen Träger.
  • Eine besonders bevorzugte Ausfühungsform der Erfindung wird dargestellt durch die Formel
  • worin Z, Z¹ und Z² unabhängig ausgewählt sind aus einer Bindung, einem Aminosäurerest und einem Oligopeptidrest, R³ und R&sup4; unabhängig ausgewählt sind aus H, einer Aminschützenden Gruppe, einer pharmazeutisch aktiven Gruppierung und einer Gruppe III
  • worin R³', R&sup4;', Z¹' und Z²' ausgewählt sind aus denselben Gruppen, die durch R³, R&sup4;, Z¹ bzw. Z² dargestellt werden,
  • p 0 oder eine ganze Zahl ist,
  • das oder jedes R² unabhängig aus linearen und verzweigtkettigen Alkyl- und Alkenylgruppen mit 6 bis 24 Kohlenstoffatomen und in der Natur vorkommenden Aminosäureseitenketten ausgewählt ist,
  • q eine ganze Zahl von mindestens list,
  • das oder jedes R¹ unabhängig aus linearen und verzweigtkettigen Alkyl- und Alkenyl- Gruppen mit 6 bis 24 Kohlenstoffatomen ausgewählt ist,
  • Y OH, NH&sub2;, eine Carbonsäure-schützende Gruppe darstellt oder eine Aminosäure- oder Oligopeptideinheit umfaßt und/oder ein Harz, auf dem das Peptid synthetisiert worden ist.
  • Vorzugsweise ist p 0 oder 1. Falls p 1 ist, ist -NHCHR²COZ- vorzugsweise eine Oligopeptideinheit von 2 oder 3 Aminosäureeinheiten.
  • Vorzugsweise ist q 2 oder 3.
  • Vorzugsweise sind R³ und R&sup4; jeweils eine Gruppe der Formel III.
  • In einer bevorzugten Auslhrungsform, in der R³ und R&sup4; jeweils eine Gruppe der Formel III sind, worin R³' und R&sup4;' ebenfalls Gruppen der Formel III sind, ist es in den letzteren Gruppen bevorzugt, daß R³' und R&sup4;' unabhangig aus H, Amin-schützenden Gruppen und einer pharmazeutisch aktiven Gruppierung ausgewählt sind, wobei vorzugsweise jedes R³' die gleiche Gruppe ist und jedes R&sup4;' die gleiche Gruppe ist, welche gleich der R³'-Gruppe oder davon verschieden ist.
  • In der Verbindung sind etwaige Amin-schützende Gruppen vorzugsweise aus Boc und Fmoc ausgewählt.
  • Z² und Z²' sind vorzugsweise Bindungen.
  • Z² und etwaige Z¹'-Gruppen sind jeweils vorzugsweise aus einer Bindung und einem β- Alanylrest ausgewählt.
  • In einer bevorzugten Ausfwinmgsform umfaßt Y eine Harz-Gruppierung, bedeuten R³ und/oder R&sup4; eine Gruppe der Formel III, und bedeuten etwaige R³'- und/oder R&sup4;'-Gruppen eine Amin-schützende Gruppe oder eine Gruppe der Formel III, worin etwaige R³'- und R&sup4;'-Gruppen eine Amin-schützende Gruppe darstellen.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist Y OH, NH&sub2;, eine Carbonsäure schützende Gruppe oder eine Aminosäure- oder Oligopeptideinheit, welche eine Carbonsäure-schützende Gruppe aufweisen kann, bedeuten R³ und/oder R&sup4; eine Gruppe der Formel III, worin etwaige R³'- und R&sup4;'-Gruppen eine pharmazeutisch aktive Gruppierung oder eine Gruppe der Formel III darstellen, worin etwaige R³'- und R&sup4;'- Gruppen eine pharmazeutische aktive Gruppierung darstellen.
  • Die pharmazeutisch aktive Gruppierung ist im allgemeinen mit dem Stickstoffatom der Amingruppe durch eine Peptidbindung verknüpft. Die pharmazeutisch aktive Gruppierung ist im allgemeinen eine Peptidgruppe, vorzugsweise eine antigene Peptideinheit. Als Alternative kann sie ein Arzneimittelmolekül sein.
  • Die Erfindung wird schematisch in den Begleitzeiclinungen erläutert, worin:
  • Fig. 1 eine Ausführungsform der Erfindung veranschaulicht, welche einen Kern aufweist, der dendritisch verknüpfte Lysinreste in zwei Ebenen umfaßt und vier Zweige aufweist, wobei jeder Zweig mit einem Peptid-Antigen verknüpft ist und der Kern über einen Linker-Bereich mit drei verknüpften Fettaminosäure-(FAA)-Resten verknüpft ist, welche wiederum über einen ß-Alaninrest mit einem Harz verknüpft sind, welches das bei der Festphasen-Synthese des Peptids verwendete Harz ist. Die Peptid-Antigen-Einheiten können gleich oder verschieden sein. Der β-Ala-Rest kann fehlen.
  • Fig. 2 zeigt die Verbindung von Figur 1 in ein Lipid-Vesikel (ein Liposom) inkorporiert, wobei der Lipid-Anker der lipophilen Seitenketten der Fettaminosäuren in die Lipid- Doppeischicht-Wand des Liposoms inkorporiert ist. In beiden Figuren 1 und 2 können die Peptideinheiten alternativ Arzneimittel-Gruppierungen sein.
  • Fig. 3 zeigt ein multivalentes Vakzin, welches einen Kern von dendritisch verknüpften Lysinresten umfaßt, wobei auf jeder Ebene ein Zweig über die terminale -NH&sub2;-Gruppe mit einem Peptid verknüpft ist und ein Zweig mit einem weiteren Lysin verknüpft ist. So umfaßt jede Ebene des Kerns einen einzelnen Lysinrest und es gibt um eines mehr verschiedene Peptide als Ebenen.
  • Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung:
    • BEISPIEL 1 Synthese von (Peptid)&sub8;Lys&sub4;Lys&sub2;Lys{HNCH[(CH&sub2;)&sub1;&sub3;CO}&sub3;NH&sub2; [LKP] Techniken
  • Boc-NH-CH[(CH&sub2;)&sub1;&sub3;CH&sub3;]COOH wurde aus 1-Bromdodecan synthetisiert (Gibbons et al., Liebigs Ann. Chem. 1990, 1175-1183).
    • Peptid-Synthese
  • Die Peptide P1 bis P5 (siehe unten) und die LKP wurden stufenweise auffester Phase unter Verwendung von Novabiochem-MBHA-Harz synthetisiert.
  • Es wurde ein Applied Biosystems 430A Automated Synthesizer unter Anwendung der SPPS-Techniken von Merrifield oder einer Modifikation davon eingesetzt. Grundsätzlich wird die wachsende Peptidkette über ihren C-Terminus an den unlöslichen festen Träger, nämlich das 4-Methylbenzhydrylamin (MBHA)-Harz, kovalent gebunden. Die Synthese erfolgte durch die sukzessive Zugabe blockierter Aminosäuren in der gewünschten Sequenz. Es wurde eine Standard-HF-Spaltung durchgeflührt, um die Peptide vom Harz freizusetzen. Die Kopplungseffizienz der Synthese wurde mit einem quantitativen Ninhydrin-Assay überprüft.
  • Das Peptid H1 (siehe unten) wurde unter Anwendung von Fast-MOC-HBTU/NMP- Chemie synthetisiert.
    • Reinigung und Charakterisierung der Peptide
  • Alle vom Harz abgespaltenen Peptide wurden durch FPLC/HPLC-Standardtechniken, die Ionenaustausch (z.B. DEAE)- und Gelfiltrations (Sephadex G-25 oder G-50)-Chromatographie beinhalteten, gereinigt. C4- oder C18-Umkehrphasen-HPLC wurde für eine Reinigung in großem Maßstab eingesetzt. Die Qualitätskontrolle hinsichtlich Reinheit und korrekter Sequenz der Peptide wurde durch HPLC-Analyse und Fast-Gelelektrophorese durchgeführt. Weitere Kriterien waren FAB-MS, NMR, IEF. Für "große" Proteine wurde eine Gasphasenmikrosequenzierung zur Bestätigung der korrekten Sequenz eingesetzt.
  • Infrarotspektren wurden mit einem Perkin Eliner 841-Spektrophotometer aufgezeichnet. Die ¹H-NMR-Spektren wurden mit Varian ZL-300- und Bruker AM500-Instrumenten erhalten, die bei Feldern von 300 bzw. 500 MHz betrieben wurden; die Massenspektren wurden mit einem VG-Analytical ZAB-SE-Instrument unter Verwendung von "Fast Atom Bombardinent" (FAB)-Ionisierung erstellt. Der Fortschritt der Reaktion wurde mit einem Ninhydrin-Test überprüft.
  • Peptidremigung: Die analytische HPLC-Auftrennung wurde mit einer Vydac-C&sub1;&sub8;-5-RAC- Säule durchgefürt. Acetonitril mit einem HPLC-Reinheitsgrad (Aldrich) und Wasser wurden durch einen 25 µm-Membranfilter filtriert und vor der Verwendung mit einem Heliumstrom entgast. Die analytische Trennung wurde mit einem Lösungsmittelgradienten erreicht, der mit 0% Acetonitril begann, konstant auf 60% Acetonitril nach 30 Minuten anstieg, bei dieser Konzentration 20 Minuten lang blieb und dann stetig im Verlauf von 10 Minuten auf 0% Acetonitril bei einer konstanten Durchflußmenge von 0,7 m/Min. abfiel. Für die präparative Trennung wurde eine semipraparative TSK-Gel-C&sub1;&sub8;-Säule eingesetzt, die Trennung wurde mit einem Lösungsmittelgradienten erreicht, der mit 0% Acetonitril begann, konstant auf 60% Acetonitril nach 180 Minuten anstieg, bei dieser Konzentration 60 Minuten lang blieb und dann stetig im Verlauf von 30 Minuten auf 0% Acetonitril bei einer konstanten Durchflußmenge von 7 milmin. abfiel. Der Gradient wurde mittels zweier Mikroprozessor-kontrollierter Gilson 302-Einzelkolbenpumpen bewirkt. Die Verbindungen wurden mit einem Holochrom UV-VIS-Detektor bei 218 nm (analytisch) und 230 um (präparativ) nachgewiesen. Die Chromatographien wurden mit einem LKB 2210 Einzelkanal-Aufzeichnungsgerät aufgezeichnet.
    • Syntheseverfahren
  • Die Synthese von (Peptid)&sub8;Lys&sub4;Lys&sub2;Lys{HNCH[(CH&sub2;)&sub1;&sub3;CH&sub3;]CO}&sub3;NH&sub2; wurde automatisch mit Hilfe eines stufenweisen Festphasenverfahrens auf MBHA-Novabiochem-Harz (Substitution 0,48 inmolil g Harz) durchgeführt. Die Synthese der ersten und jeder folgenden Ebene (d.h. der Fettaminosäuren, des dendritischen Poly(lysin)-Kerns und des antigenen Peptids) der Peptidkonstruktion wurde erreicht unter Verwendung eines 4 M Überschusses an vorgebildetem symmetrischem Anhydrid von N-Boc-Aminosäuren in Dichlormethan (15 ml), gefolgt von einer zweiten Kopplung in Dichlormethan (20 ml)IN- Methylpyrrolidon (5 ml). Die Schutzgruppen für die Synthese der Peptidkonstruktion waren Boc-Gruppen für die α-Aminotermini, Bzl (Benzyl), Tos (Tosyl), Br-Z, (2- Brombenzyl-p-nitrophenylcarbonat), OBzl, CHO, Cl-Z (2-Chlorbenzylocycarbonyl), DNP, (2,4-Dinitrophenyl), 4MeBzl, (4-Methylbenzyl), Acm (Acetamidomethyl) und Bom (Benzvloxymethyl) für die Aminosäuren. Für alle Reste erfolgte die Kopplung, überwacht durch einen quantitativen Ninhydrin-Test, mit dem vorgebildeten (DCC) symmetrischen Anhydrid oder mit Hilfe von Hydroxybenzotriazol in CH&sub2;Cl&sub2;, eine zweite Kopplung in Dichlormethan, DMF oder Dichlormethan/N-Methylpyrrolidon. Nach der zweiten Kopplung wurde eine Schutzgruppenbeseitigung der N-Terinini in 65% TFA in Dichlormethan durchgeführt. Das von Schutzgruppen befreite Harz-Peptid wurde mit 10% Dusopropylethylamin in Dichlormethan neutralisiert. Die Peptid-Konstruktion wurde von dem Harz-Träger mit einem Hoch- (1,5 ml Kresol, 1,5 ml Thiokresol, 20 ml HF) oder Niedrig-Hoch-HF-Verfahren (1,5 ml Kresol, 1,5 ml Thiokresol, 20 ml Methylsulfid, 10 ml HF - 1,5 ml Kresol, 1,5 ml Thiokresol, 20 ml HF) entfernt, um die Rohpeptid- Konstruktion zu ergeben, welche mit Ether oder Ethylacetat gefällt und erneut in 90 %iger Essigsäure (20 ml) gelöst wurde. Die Rohpeptid-Konstruktion wurde durch ein semipräparatives HPLC-Verfahren gereimgt.
  • Analyse des Lipid-Kerns (MS):
  • Die Figuren 4 bis 6 stellen Massenspektren der drei Lipid-Kern-Zwischenprodukte dar.
  • Lys-{HNCH[(CH&sub2;)&sub1;&sub3;CH&sub3;]CO}&sub3;NH&sub2; Fig. 4
  • Lys&sub3;-{HNCH[(CH&sub2;)&sub1;&sub3;CH&sub3;]CO}&sub3;NH&sub2; Fig. 5
  • Lys&sub7;-{HNCH[(CH&sub2;)&sub1;&sub3;CH&sub3;]CO}&sub3;NH&sub2; Fig. 6
    • Produktion von Antikörpern gegen die Peptide. Konjugation von Trägerprotein mit Peptiden zum Vergleich mit dem LKP-System:
  • Zur Erhöhung der Immunogenizität der Peptide und Erfüllung der Anforderungen von ELISA für den Antikörper-Assay wurden die Trägerproteine mit den Peptiden konjugiert. KLH wurde als Immunogen-Träger gewählt und BSA in den ELISA-Versuchen. Es wurde das Glutaraldehyd-Verfahren angewandt, aber andere Konjugationsmittel wie SPDP, wasserlösliches Carbodiimid etc., können erforderlichenfalls eingesetzt werden. Das nicht verbrauchte Kopplungsmittel wurde durch Leiten über eine Sephadex G-25-Säule entfernt. Die konjugierten Proben wurden lyophilisiert und bei -18ºC gelagert.
    • Produktion von Antikörpern
  • Das LKP-System wurde direkt injiziert. Zur Produktion von polyklonalen Antikörpern wurden Kaninchen unter Anwendung des Immunisierungsprotokolls 1-21-35-60 eingesetzt.
    • Antiserum-Test
  • In den indirekten ELISA-Tests für stellenspezifische Antikörper wurden ELISA-Platten verwendet, die mit dem Peptid beschichtet waren. Analoge Experimente wurden ausgeführt unter Verwendung von ELISA-Platten, die mit in Kultur erhaltenen RBL-2H3-Zellen beschichtet waren.
    • Isolierung von Antikörpern durch Ionenaustausch- und Affinitätschromatographie
  • Erforderlichenfalls wurde Affinitätschromatographie mit Protein A-Säulen oder Peptidgekoppelten Sepharose CL-4B-Säulen eingesetzt, um Antikörper gegen jedes Peptid zu isolieren. Die Reinheit der Antikörper wurde mittels SDS-PAGE analysiert.
    • Immunogenizität von Peptiden des Haupt-Außenmembranproteins (MOMP) von Chlamydia trachomatis
  • Die B-Zell-Antigenizität von 7 MOMP-Sequenzen wurde mit Hilfe synthetischer Peptide (Pepscan) und polyklonaler Antiseren von Kaninchen und Mäusen und monoklonaler Antikörper von Mäusen bewertet. Die VDW aller MOMP enthielt mehrfache kreuzreaktive immundonimante Oberflächen-exponierte Epitope. Bei den MOMP der Serogruppe C war VDI ebenfalls immundominant. Die T-Zell-Antigenizität wurde für Serovar B-MOMP in einem Lymphozytenproliferations-Assay unter Verwendung eines klonierten Fragments bestimmt, das 61 Aminosäuren von B-MOMP-VDIV (RASFDADTIRIAQPKSAE- TIFDVTTLNPTIAGAGDVKTSAEGQLGDTMQIVSLQLNKMKSR³³³) enthielt. Dieses klonierte Polypeptid, fusioniert mit Flutathion-S-transferase, war imstande, eine antigenspezifische T-Zellproliferationsantwort zu stimulieren. Fünfteilweise überlappende Peptide (als Pl bis P5 bezeichnet) wurden mit einer Länge von 16 bis 22 Resten synthetisiert, um dieses Fragment abzudecken. Drei Inzucht-Stämme von Mäusen mit verschiedenen H2- Haplotypen wurden in einem in vitro-T-Zellproliferations-Assay eingesetzt. Pl (mit der Sequenz ²&sup7;³RASFDADTIRIAQPKSAETIFDG) und P5 (³¹&sup9;TMQIVSLQLNKMKSRG) wurden von dem H-2d-Stamm BALB/c erkannt und P2 (²&sup8;&sup9;AETIFDVTTLNPTIAG) sowohl von dem H-2k-Stamm CBA als auch von dem H-2b-Stamm C575BL/10. Bei einem in vivo Antikörperpromotions-Assay rief P5 eine IgG-Antikörperproduktion mit hohem Titer nur bei BALB/c hervor, P2 sowohl bei CBA als auch C57BL/10, während P1, P3 und P4 nicht in der Lage waren, eine Antikörperproduktion bei irgendeinem der Stämme zu stimulieren. Somit ist P2 ein potentielles Peptid zur Inkorporation in ein Kandidaten- Chlamydia-Vakzin, da dessen T-Zell-Stelle die geringste genetische Wirtsbeschränkung aufweist und die Antikörperproduktion gegen Oberflächen-exponierte B-Zell-Epitope innerhalb des Peptids fördern kann.
  • Die Immunogenizität der P2-Sequenz wurde weiter untersucht unter Verwendung des achtfach verzweigten und mit 8 P2-Peptidresten verknüpften Lysin-Kerns (bezeichnet als LKP-1). LKP-1 wurde zur Immunisierung von 5 kongenen Mausstammen eingesetzt. Es rief Antikörper mit hohem Titer bei den Stämmen B10.A(H-2d) und B10.BR(H-2k) hervor und Antikörper mit niedrigem Titer bei dem Stamm B10.(H-2b). Die Stämme B10.D2(H.2d) und B10.A(3R) (H.2¹³) waren nicht in der Lage, Antikörper gegen LKP-1 zu produzieren. Die durch LKP-1 induzierten Antikörper der Stämme H-2k und H-2d waren imstande, native Epitope auf Chlamydia-EB zu erkennen und zeigten älinliche Epitop-Spezifitäten bei Pepscan wie Antiseren, die mit vollständigen EB induziert worden waren. Diese Beobachtungen legen nahe, daß das LKP-1-Präparat die Immunogenizität des P2-Peptids maximal verstärkte; jedoch waren die LKP-1-Peptid-Antikörperantworten auf H-2 beschränkt.
    • Vergleich
  • Zur Inkorporation von Oberflächen-exponierten Epitopen aus Serovaren der Serumgruppe C und zur Änderung der H-2-Beschränkungsmuster wurde ein kolineares 30 mer-Peptid (als H1 bezeichnet) konstruiert, welches das Serogruppe C-MOMP-VDI-Epitop als B- Zell-Epitop (für die Serogruppe C) und die P2-Sequenz als sowohl B-Zell-Epitop (für die Serogruppe B) als auch T-Zell-Epitop inkorporiert hatte. Die Sequenz von H1 ist SAETIFDVTTLNPTIAGSDVAGLQNDPTTN. Das H1-Peptid war imstande, mit Gesamt- EB der Chlamydia-Serovare A, B und C reaktive Antikörper bei allen getesteten 5 Mäusestammen hervorzurufen, wobei die höchsten Antikörpertiter bei B10.A (H-2d) und B10.BR(H-2k) vorlagen. Jedoch ist das kolineare H1-Peptid weniger immunogen als LKP-1, wie durch Antikörpertiter bestimmt.
    • BEISPIEL 2
  • Weitere Experimente wurden unter Verwendung der Peptide P1 bis P5 und H1 durchgeführt, um die Ergebnisse von Beispiel 1 zu bestätigen.
    • Organismen und Tiere:
  • C. trachomatis-Serovar A(G17/OT), B(TWS/OT) und C(TW3/OT) wurden in Hela 229-Zellen gezüchtet und EB aus infizierten Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation gereinigt. Die folgenden Stämme weiblicher Mäuse wurden von Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) bezogen und im Alter von 7-9 Wochen eingesetzt: C57BL/10snj (H-2b); B10.A/sgsnj (H-2a); B10.D2/j (H-2d); B10.BR/sgsnj (H- 2k); SJL/j (H-2s); Balb/cj (H-2d); und CBA/j (H-2k).
  • Festphasen-Peptidsynthese: Ein Satz von fünf teilweise überlappenden Peptiden mit einer Länge zwischen 15 und 20 Resten, die eine Sequenz von 61 Resten der B ompl VD IV- Region abdeckten, wurden unter Einsatz von t-Boc-Chemie (wie beschrieben in "Solid Phase Peptide Synthesis", 2. Auflage, Stewart und Young, Hrsg.) synthetisiert und als P1 bis P5 bezeichnet. Die Sequenzen der fünf Peptide sind wie folgt: VDIV von B omp&sub1;
  • Das P2-Peptid wurde anschließend synthetisiert als eine mit zwei Lipidaminosäuren verlängerte Peptidkette, wobei das P2-Lipidaminosäuremonomer ("P2-Dimer") die Formel H[HNCH{(CH&sub2;)&sub1;&sub3;CH&sub3;}&sub3;CO]&sub2;-P2 aufwies, und als ein Lipid-Poly-L-lysin-LKP derselben Formel wie das in Beispiel 1 beschriebene LKP-1. Ein chimäres 30-mer-Peptid, das eine 13-mer-Sequenz von C ompl VD I neben P2 enthielt, wurde unter Einsatz von Fast- Moc-HBTU/NMP-Chemie (oben erwähnte "Solid Phase Peptide Synthesis") synthetisiert. Das chimäre Peptid wurde als H1 bezeichnet und als dimere Lipidaminosäure H1 und als Lipid-Poly-L-lysin LKB-H1 synthetisiert, welche dem P2-Dimer bzw. LKP entsprechende Formeln aufwiesen.
    • Immunisierung von Mäusen:
  • Ahtiseren wurden gegen EB der Serovare B oder C bei Mäusen induziert wie von Zhong und Brunham, Infect. Iminun. 60:3143, 1992 (Publikation A) beschrieben. Anti-Peptid-Antiseren wurden in Gruppen von 4-6 Mäusen von jedem Stamm induziert, denen 50 µg jeder Peptidpräparation ip. (P1 bis P5, 25x LKP-P2, H1 und LKP-H1), emulgiert in CFA (vollständiges Freunds-Adjuvans), am Tag 0 injiziert worden waren, und die eine Aufftischung mit 50 µg desselben Antigens in IFA (unvollständiges Freunds-Adjuvans) an den Tagen 14 und 28 erhielten. Seren wurden 14 Tage nach der letzten Injektion gewonnen. Die Seren von jeder Gruppe wurden vereinigt, in Aliquots aufgeteilt und bis zur Verwendung bei -20ºC gelagert. Die Wirksamkeit des Adjuvans NAGO (Neuraminidase und Galactoseoxidase) wurde bei BiO- Mäusen getestet. Das NAGO-Adjuvans wurde wie folgt hergestellt: 1 Einheit NA (Kat.# N-2133, Sigma Chemical) und 5 Einheiten GO (Kat.# G3385, Sigma Chemical) in 100 µl PBS, die 50 µg MAP-H1-Peptid enthielten, wurden unmittelbar vor der Injektion gemischt. Die Mischung wurde subkutan (Basis des Schwanzes) mit 50 µg Peptid pro Injektion pro Maus verabreicht. Die Injektion wurde zweimal in 14-tägigen Intervallen wiederholt. Die Seren wurden am 14. Tag nach jeder Injektion gewonnen. Normale Mausseren wurden von jedem Stamm gewonnen und zur Kontrolle verwendet.
    • Lymphozytenproliferations-Assay:
  • Der Lymphozytenproliferations-Assay wurde durchgeführt wie von Zhong und Brunham in Infect. Immun. 60:1221, 1992 (Publikation B) beschrieben. Jede Maus wurde mit 5x10&sup5; einschlußbildenden Einheiten (IFU) von Serovar B-EB, die mit einem gleichen Volumen von CFA emulgiert worden waren, durch Fußballen-Injektion immunisiert. Zwei Wochen nach der Injektion wurden popliteale Lymphknoten von sowohl spezifisch Ahtigen-immunisierten Mäusen als auch Kontrolimäusen, denen eine PBS (pH 7,4)-CFA-Emulsion injiziert worden war, entnommen und Zellsuspensionen hergestellt. T-Zellen wurden angereichert durch Leiten der Zellsuspensionen durch eine Nylonwolle-Säule. 4x10&sup5; T-Zellen und 10&sup5; bestrahlte (Kobalt&sup8;&sup0;, 2000 Rad) peritoneale syngene Makrophagen wurden mit einer Reihenverdünnung von Peptid-Antigenen in einem Gesamtvolumen von 0,2 ml Medium in Mikrotiterplatten bei 37ºC in 5 % CO&sub2; 5 Tage lang kultiviert. Die Kulturen wurden einem Puls ausgesetzt, indem 1 µCi pro Vertiefung (³H]-Thymidin (6,7 Ci/mMol; New England Nudear) für die letzten 16 Stunden zugegeben wurde. Die Zellen wurden auf Glasfaserfilter gebracht und die Inkorporation von [³H]-Thymidin in DNA gezählt. Die Ergebnisse wurden als SI (Stimulationsindex, dpm der Versuchskulturen geteilt durch dpm der Kontrollkulturen) angegeben.
    • Immunoblot und Immunodotblot:
  • Der Immunoblot-Assay zum Nachweis von Ahtikörperbindung an Membran-immobilisiertes Protein aus Chlamydia-Organismen wurde durchgeführt wie in Publikation A beschrieben. Der Dotblot-Assay wurde durchgeführt wie beschrieben von Zhang et al. (J. Immunol. 138: 575, 1987) mit Ausnahme der folgenden Modifikationen: 2x10&sup5; IFU Serovar A-, B- oder C-EB wurden auf die Nitrocellulosemembran in 50 µl Succrose-Phosphat-Glutamat (SPG) aufgetupft. Die Membran wurde mit 4% Rinderserumalbumin und 0,05 % Tween-20 in PBS (pH 7,4) (Blockierungslösung) blockiert. Sowohl die Antiseren als auch die jodierten Konjugate wurden mit 2% Rinderserumalbumin und 0,05 % Tween-20 in PBS (Inkubationslösung) verdünnt. Eine Mischung von Antimaus-Ziegen-IgG, konjugiert mit ¹²&sup5;I (Kat.# 68075, ICN Biochemicals, CA) und ¹²&sup5;I-Protein G (Kat.#68089, ICN Biochemicals, CA) wurde zur Sichtbarmachung der Ahtikörperbindung eingesetzt.
    • ELISA:
  • Mikrotiter-Platten (Immulon 2,96 runde U-Vertiefüngen, Dynatech Laboratories, Alexandria, VA) wurden über Nacht bei 4ºC mit 10&sup6; IFU/Vertiefung von nativen EB in 100 µl SPG oder 1 µg/vertiefung von Peptiden von 100 µl PBS beschichtet. Die Platten wurden mit 200 µl SPG oder PBS einmal gewaschen und mit 200 µl/Vertiefung Blockierungslösung bei 37ºC 90 Minuten lang blockiert. Es wurden Reihenverdünnungen von Antiseren in Inkubationslösung hergestellt und den Platten mit 100 µl/Vertiefung zugegeben. Die Platten wurden 60 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Nach viermaligem Waschen mit 200 µl/Vertiefung Waschlösung (0,05% Tween-20 in PBS, pH 7,4) wurde Antimaus-Ziegen-IgG-Peroxidase-Konjugat (Pierce, IL) in einer 1:4000-Verdünnung in Inkubationslösung mit 100 µl/Vertiefüng zugegeben und die Platten wie zuvor inkubiert. Nach einem Waschschritt wie zuvor wurden 100 µl Substrat [2.2-Mino-bis-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonat) in Citratpuffer (pH 4,5) in Gegenwart von H&sub2;O&sub2;] jeder Vertiefung zugegeben. Die enzymatische Reaktion wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur entwickelt und die Extinktion bei 405 nm mit einem automatischen Titertek Multiskan plus Version 1.43 ELISA-Ablesegerät (EFLAB, Finnland) gemessen.
  • In vitro-Neutralisationsassay: Die Neutralisation wurde in einem HAK-Zell (Hamsternieren-Zellinie von NIH)-in vitro-Neutralisationsassay bestimmt wie von Su et al. (Infect. Immun. 59:2843 und 59:3811, 1991) beschrieben. Kurz gesagt, wurden die Neutralisationsassays ausgefuhrt, indem zweifache Reihenverdünnungen von Antiseren in SPG hergestellt wurden. Ein vereinigtes normales Mausserum wurde gleichermaßen verdünnt und als Kontrolle eingesetzt. Ein gleiches Volumen von EB (die EB wurden titriert und auf 2x10&sup4; IFU/ml in SPG eingestellt) wurde mit einem gleichen Volumen von Antiserenverdünnungen gemischt und 30 Minuten lang bei 37ºC inkübiert. Mit einem 50 µl-Volumen der Mischungen wurden in dreifacher Ausführung Monoschichten von HAK-Zellen beimpft, die 24 Stunden lang in flachbödigen Platten mit 96 Vertiefungen (Nundon, Dänemark) gezüchtet worden waren, und 2 Stunden lang bei 37ºC inkubiert. Das lmpfgut wurde entfernt und die Monoschichten mit vorgewärmtem HBSS gewaschen. Die Zellen wurden mit 200 µl MEM, enthaltend 10% fötales Kalbsserum und 1 µg Cyclohexamid pro ml, ernährt und 48 Stunden lang bei 37ºC inkubiert. Nach der Fixierung der Monoschichten mit Methanol wurden Chlamydia-Einschlüsse nachgewiesen durch Anfärbung mit einem polyklonalen Kaninchenantiserum gegen die Chlamydia-Serovare A, B und C (1:1000) als erstem Antikörper, Meerrettichperoxidase-konjugierten Antikaninchen-Ziegenantikörpern als sekundärem Antikörper und 1-Chlomaphthartol (Sigma Chemicals) als Substrat. Die IFU wurden mengenmäßig bestimint durch Auszählung von 5 Feldern bei einer Vergrößerung von 200X unter Verwendung eines umgekehrten Mikroskops. Eine durchschnittliche IFU-Zahl pro Feld wurde von 3 Platten berechnet und die Ergebnisse als prozentuale Verringerung der IFU-Zahlen im Vergleich zu Kontrollvertiefungen angegeben.
  • Identifizierung von T-Heifer-Stellen bei ompl-Peptiden: Bei einem Vorversuch wurde festgestellt, daß ein kloniertes Fusionsfragment, das eine 61 Aminosäuren lange Sequenz von Position 273 bis 333 des Serovars B omp 1 enthielt, eine antigenspezifische Proliferationsantwort von T-Zellen, welche in vivo mit Chlamydia-EB geprimt worden waren, bei Balblcj (H2d)-Mäusen hervorrief. Die 61-Aminosäurensequenz umfaßt die gesamte VD W-Region des Serovars B omp 1. Fünf teilweise überlappende Peptide (als P&sub1; bis P&sub5; bezeichnet), welche die gesamte 61-Aminosäurensequenz abdecken, wurden synthetisiert und zur Lokalisierung potentieller T-Zell-Stellen eingesetzt. Drei Inzuchtstämme von Mäusen, die jeweils einen unterschiedlichen H-2-Haplotyp repräsentieren, wurden bei der Studie eingesetzt. Wie in Tabelle 1 unten gezeigt, stimulierten P&sub1; und P&sub5; signifikante Proliferationsantworten bei Balbic (H-2d)-Mäusen, jedoch nicht bei C57BL/10 (H-2b)- oder CBA (H-2k)-Mäusen; P&sub2; stimulierte signifikante Proliferationsantworten sowohl bei CBA (H-2k)-als auch C57BL/10 (H-2b)-Mäusen, jedoch nicht bei Balb/c (H-2d)-Mäusen; P&sub3; und P&sub4; waren nicht in der Lage, die Proliferation bei irgendeinem der drei Mäusestämme zu stimulieren. So kann die T-Zell-Stelle in P&sub2; von H-2b und H-2k prasentiert werden, jedoch nicht von H-2d. TABELLE 1
  • Es ist die Auffassung vertreten worden, daß die Induktion von IgG-Antworten auf ein kleines Peptid-Antigen einen in vivo-Assay der Aktivität von Th2-Zell-Subpopulationen darstellt, da nur ein Peptid, das sowohl T-Helfer- als auch B-Zell-Stellen enthält, imstande ist, eine IgG-Antwort zu induzieren. Wie in Tabelle 1 gezeigt, war P&sub5; imstande, einen für Serovar B spezifischen Antikörper bei Balb/C (H-2d)-Mäusen hervorzurufen; P&sub2; rief einen für Serovar B spezifischen Antikörper bei beiden Stainmen C57/BL. 10 (H-2b) und CBA (H-2k) hervor, was dessen T-Zell-Stellenaktivitäten bei diesen beiden Stämmen bestätigt; P&sub1; war nicht in der Lage, Serovar B-Antikörper bei irgendeinem Stamm hervorzurufen, obwohl es eine T-Zell-Stellenaktivität bei Balb/c (H-2d)-Mäusen aufwies.
  • Zusamtnen zeigen die Beobachtungen, daß T-Zell-Stellen variable H-2-Beschränknngsmuster aufweisen. Die 11-2-Beschränkung auf T-Zell-Stellen kann zu H-2-abhängigen Antikörperantworten beitragen. Von den 5 Peptiden wies P2 die geringste 11-2- Beschränkung auf (erkannt von H-2b und H-2k, jedoch nicht von H-2d) und förderte die Serovar B-EB-Antikörper-Produktion. Ferner wurde eine Bewertung des Lipidaminosäuredimer-P&sub2;-Monomers ("P2-Dimer") und des Lipidaminosäure-Polylysin-LKP-P&sub2; vorgenommen.
    • Wirkungen der Inkorporation in LKP auf die Immunogenizität des P2-Peptids:
  • Da P2 sowohl die B-Zell-Epitope als auch die T-Helfer-Stellen enthält, wurden die Wirkungen der Polymer-Konstruktion auf die Immunogenizität der synthetischen Peptide beurteilt. LKP-P2 wurde mit einer Kette von drei Fettaminosäuren konstruiert, die mit dem C- Terminus des ersten Lysins verknüpft war. Die Immunogenizität von LKP-P2 wurde mit dem P2-Peptid verglichen, das an zwei Fettaminosäuren (P2-Dimer) synthetisiert war.
  • P2-Dimer und LKP-P2 wurden zur Immunisierung von vier kongenen Mäusestämmen eingesetzt. Die Antiseren wurden einem ELISA-Assay gegen Serovar B EB ganzer Organismen unterzogen, dessen Ergebnisse in Tabelle 2 unten gezeigt sind. TABELLE 2
  • P2 rief Anti-EB-Antikörper mit relativ niedrigen Titern hervor, wohingegen LKP-P2 imstande war, Antikörper mit hohem Titer bei B10.A und B10.BR und dazwischenliegenden Titern bei B10 hervorzurufen. B10.D2 (H-2d) zeigte die Beschränkung der Immunantwort, die mit dem P2-Peptid beobachtet wurde (Tabelle 1). Bei einem Pepscan-Assay zeigten Antiseren, die mit LKP-P2 bei zwei stark ansprechenden Stämmen induziert worden waren, ähnliche Epitop-Spezifitäten wie Antiseren, die mit vollständigen Serovar B-EB induziert worden waren, mit der Ausnahme, daß mit LKP-P2-Antiseren mehr Epitope kartiert wurden (Figur 7). Die LKP-P2-Antiseren wurden bei einer 1:500- Verdünnung getestet und die Anti-EB-Antiseren bei 1:200.
  • Die beiden Hauptepitope, die sowohl von Serovar B-EB- als auch LKP-P2-Antiseren erkannt wurden, waren die Serogruppe-B-spezifischen und Spezies-spezifischen Determinanten, die zuvor mit Kaninchen-Antiseren identifiziert worden waren (Zhang et al., Infect. Immun. 58:1450). Diese Beobachtungen legen nahe, daß das P2-Peptid eine potentielle Kandidatensequenz zur Bereitstellung einer Th2-Zell-Stelle und einer B-Zell- Stelle, welche die Serogruppe-B-Serovare abdeckt, darstellt und daß die LKP-Präparation die Immunogenizität der P2-Sequenz signifikant erhöhte.
    • Immunogenizität eines chimären 30-mer-Peptids:
  • MAb gegen eme Serovar C omp 1 VD I-Sequenz sind imstande, an native Organismen verschiedener Stamme in der Serogruppe C zu binden und Chlamydia-Infektivität bei einem in vitro-Neutralisationsassay zu neutralisieren. So wurde ein chimäres 30-mer-Peptid, welches die P&sub2;-Peptidsequenz und eine 13 Aminosäuren lange Sequenz von BD I von C omp 1 enthielt, als LKP der Formel (H&sub1;)&sub8;Lys&sub4;Lys&sub2;Lys(NHCH{(CH&sub2;)&sub1;&sub3;CH&sub3;}CO)&sub3;NH&sub2; konstruiert. Das chimere 30mer-Peptid nüt der Bezeichnung H1 (SAETIFDVTTLNPTIAGSDVAGLQNDPTTN) wurde sowohl als H1-Lipid-Monomer als auch als LKP-H1 konstruiert, und diese wurden zur Immunisierung verschiedener Inzuchtstämme von Mäusen eingesetzt.
  • Sowohl das H1-Lipid-Monomer als auch LKP-H1 induzierten Peptid-reaktive und EBreaktive Antikörper. Der Stamm B10. D2 (H-2d) zeigte die geringste Antikörperantwort auf die H1-Sequenz, konsistent mit der H-2d-Haplotypen-Beschränkung von Immunantworten auf die P2-Peptidsequenz, wie in Tabelle 1 gezeigt. Die Antipeptid- Antikörpertiter in Seren, die mit dem LKP-H1 induziert wurden, sind 10-3200-fach höher als die mit dem H&sub1;-Lipid-Monomer induzierten. Antiseren waren imstande, gegen vollständige EB der Serovare A, B und C zu binden, mit denen ELISA-Platten beschichtet worden waren. Alle drei Serovare wurden von jedem Serum gleichermaßen gut erkannt.
  • Die Anti-EB-Antikörpertiter waren 20-40-fach geringer als die Anti-Peptid-Antikörpertiter.
    • Immunoblot und Dotbiot-Analyse von H-1-Octamer-Antikörpern:
  • LKP-H 1-Antikörper wurden bewertet, indem Antiseren von jedem der fünf kongenen Mausstämmen mit Chlamydia-omp 1-Molekülen in einem Immunoblot und mit nativen EB in einem Dotbiot umgesetzt wurden. Antiseren aus vier Stainmen banden sowohl an omp 1-Moleküle als auch an native EB der drei getesteten Serovare A, B und C. Das B10.D2 (H-2d)-Antiserum war zu einer Bindung nicht imstande.
    • Epitop-Spezffität von Antiseren, die init LKP-H1 induziert worden waren:
  • Die Epitop- Spezifität von LKP-H1-Antiseren (1:2000 Verdünnung) wurde kartiert mit Hilfe eines Satzes vollständig überlappender Hexapeptide, welche die gesamte chimäre 30-mer- Peptidsequenz abdeckten, siehe Tabelle 3 unten. Zwischen den ersten 19 und den letzten 12 Hexapeptiden liegt eine Lücke von zwei Plätzen vor. TABELLE 3
  • Drei antigene Abschnitte wurden von den 4 Mausstämmen erkannt. Die drei antigenen Bereiche repräsentieren die spezifischen Epitope für die Chlamydia-Serogruppe B, die Spezies und die Serogruppe C. Antikörper, welche an die N-terminale Serognippenspezifische und zentrale Spezies-spezifische antigene Stelle binden, wurden am wahrscheinlichsten durch die P2-Sequenz des chimären Peptids induziert. Antikörper, welche an die C4erminale, für die Serogruppe C spezifische antigene Stelle banden, wurden wahrscheinlich durch die 13-mer-Sequenz induziert, welche von Serovar C omp 1 staannt. Alle vier Stämme produzierten konsistenterweise Antikörper gegen zwei aufeinanderfolgende Hexapeptide mit der Spezies-spezifischen Sequenz. Es wurde eine Variation in der Antikörpererkennung von Hexapeptiden in den für die Serogruppe B bzw. C spezifischen Determinanten beobachtet. Diese war für die Determinante der Serogruppe C größer als für die Determinante der Serogruppe B. Die B10 (H-2b) und SJL (H-2s) Antiseren fallen in ein Muster und erkennen zwei aufeinanderfolgende Hexapeptide in der Serogruppen C-Sequenz (SDVAGL, DVAGLQ); das B10.BR (H-2k)-Antiserum zeigte ein zweites Muster durch Bindung an ein einzelnes Hexapeptid (DVAGLQ): ein drittes Muster wurde mit dem B10.A (H-2a)-Serum beobachtet, welches extensiv an multiple Hexapeptide im Detertninantenbereich mit verschiedenen Titern band. Antiseren des B10.D2-Stammes zeigten keinerlei Bindung an irgendein Peptid. Die drei antigenen Determinanten, die mit LKP-H1-Antiseren kartiert wurden, waren ähnlich denjenigen, welche mit Serovar B- und C-EB-Antiseren (1:200 Verdünnung) kartiert worden waren (Tabelle 4). Die zur Reaktion mit den ersten 19 Hexapeptiden eingesetzten Anti-EB-Antiseren wurden mit Serovar- EB induziert und diejenigen zur Reaktion mit den letzten 12 Hexapeptiden wurden mit EB des Serovars C induziert. TABELLE 4
    • Wirkung von NAGO und CGA auf die Immunogenizität der LKP-H1 bei B10- Mäusen:
  • Die Wirkung des NAGO-Adjuvans auf die Immunogenizität von LKP-H1 bei B10-Mäusen wurden bestimmt und mit CFA verglichen (Tabelle 5). Antiseren, welche nach der zweiten oder dritten Immunisierung gewonnen wurden, zeigten signifikant höhere Antikörpertiter als die primären Antikörper (Daten nicht gezeigt). LKP-H1-Antikörper unter Verwendung von NAGO und CFA wurden hinsichtlich der ELISA-Titer (Tabelle 5), Pepscan-Spezifität (Tabelle 6) (Antiseren wurden bei einer 1:2000-Verdünnung eingesetzt, in B10 (H-2b)-Mäusen induziert) und in vitro-Neutralisation (Tabelle 5) verglichen. Wie aus Tabelle 5 ersichtlich, induzierten NAGO und CFA Antikörper mit vergleichbarem ELISA-Titer. Die Feinspezifität der Epitopenbindung war auch vergleichbar mit der, welche durch LKP-H1 mit CFA bei B10 (H-2b)-Mäusen hervorgerufen wurde, Tabelle 5. TABELLE 5
  • ¹ Der ELISA-Titer wurde angegeben als höchste Antiserenverdünnung, welche einen OD-Wert ergab, der 4-fach über dem Hintergrund lag. Die Titration wurde zweimal in doppelter Ausführung durchgeführt
  • ² Die höchste Antiserenverdünnung, welche in einer 50%-igen Infektivtätsverringerung bei einem in vitro-Neutralisationsassay resultierte. TABELLE 6
    • In vitro-Neutralisationsaktivität von LKP-H1-Antikörpern:
  • Die funktionelle Aktivität von LKP-H1-Antikörpern wurde durch einen in vitro-HAK-Zell-Neutralisationsassay bestürimt. LKP-H1-Antiseren von ansprechenden Mäusen, die mit dem CFA-Adjuvans immunisiert worden waren, besaßen Neutralisationsaktivität gegen die getesteten drei C. trachomatis-Serovare. Der Neutralisationstiter war niedrig im Vergleich zu deren Bindungsaktivität an vollständige EB in den ELISA-Assays (etwa 500-fach geringer).
  • Die obigen Ergebnisse zeigen, daß die Polymerisation des Peptids durch Inkorporation in eine LKP-Struktur die Immunogenizität signifikant erhöhte (etwa 100-fach) im Vergleich zu monomerem Peptid allein. Ferner konnte das NAGO-Adjuvans CFA ersetzen und zu vergleichbarer Peptid-Immunogenizität führen. Dies ist ein signifikanter Vorteil, da die intensive Entzündungsreaktion, welche durch CFA hervorgerufen wird, dessen Anwendung beim Menschen verbietet. So ist LKP-H1 im NAGO-Adjuvans ein geeignetes Peptid- Konstrukt der ersten Generation zur Immunogenizitätsbestümnung.
    • BEISPIEL 3 (Peptid)&sub8;Lys&sub4;Lys&sub2;Lys{HNCH(CH&sub2;)&sub1;&sub3;CH&sub3;CO}&sub3;NH&sub2;
  • Das Peptid ist eine Aminosäuresequenz, die vom Maul- und Klauenseuchevirus (FMDV) erhalten wurde. Das Peptid wurde als P6 bezeichnet und weist die folgende Sequenz auf: PLRAVRPALSGFDGRVGSG.
  • Die Immunogenizität der LKP-P6-Konstruktion wurde bestimmt wie für die LKP- Konstrtiktion in Beispiel 2 beschrieben, mit der Ausnalime, daß Kühe anstelle von Mäusen eingesetzt wurden. 100 µg LKP-P6 wurden jeder Kuh injiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 unten dargestellt. TABELLE 7 Neutralisierende Antikörperantwort unter Verwendung von 1/100-verdünntem Serum
  • Die obigen Ergebnisse sind etwa 10-fach höher als mit einem üblichen KHL- oder BSA- konjugierten FMDV zu erwarten wären.

Claims (16)

1. Peptidverbindung, umfassend mindestens zwei Aminosäureeinheiten, die miteinander durch Peptidbindungen verknüpft sind, wobei die Verbindung einen lipophilen Anker umfaßt, der mit einer Aminosäureeinheit der Verbindung durch eine Peptidbindung verknüpft ist und welcher mindestens zwei Aminosäureeinheiten umfaßt, jeweils mit der Formel (I)
worin jedes R¹ unabhängig eine lineare oder verzweigtkettige Alkyl- oder Alkenylgruppe mit 6-24 Kohlenstoffatomen ist, die beiden Aminosäuren der Formel 1 direkt miteinander durch Peptidbindungen verknüpft sind, die Verbindung auch einen Matrix-Kernabschnitt umfaßt, der n Ebenen dendritisch und durch Peptidbindungen verknüpfter trifunktioneller Aminosäureeinheiten umfaßt, wobei n eine ganze Zahl von 1 oder größer ist, die oder jede trifunktionelle Aminosäureeinheit entweder zwei Carbonsäuregruppen oder zwei Aminogruppen umfaßt, und der Matrix-Kern ferner mindestens zwei terminale Funktionalitäten aufweist, die aus -NH&sub2;, -COOH, -OH, -SH und Derivaten davon ausgewählt sind.
2. Peptidverbindung nach Anspruch 1, worin n 2, 3 oder 4 ist.
3. Peptidverbindung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin der lipophile Ankerabschnitt mit der zentralen Aminosäure des Matrix-Kernabschnitts direkt oder über eine Linkergruppe verbunden ist.
4. Pharmazeutisch aktive Verbindung, umfassend eine Peptidverbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, worin ein pharmazeutisch aktiver Substituent mit jeder der terminalen Funktionalitäten verknüpft ist, wobei die Substituenten in der Verbindung vorzugsweise gleich sind und vorzugsweise mit teminalen -NH&sub2;- oder -COOH-Funktionalitäten durch Peptidbindungen verknüpft sind.
5. Pharmazeutisch aktive Verbindung nach Anspruch 4, worin jeder der pharmazeutisch aktiven Substituenten ein Peptid-Antigen ist.
6. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine pharmazeutisch aktive Verbindung nach Anspruch 4 oder Anspruchs und einen pharmazeutisch aktiven Träger.
7. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, die ein Vakzin ist.
8. Liposom-Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, die in einem Lipid-Vesikel über den lipophilen Ankerabschnitt verankert ist.
9. Liposom-Zusammensetzung nach Anspruch 8, die ein Vakzin ist.
10. Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, welche weiter einen Harz-Träger umfaßt, der direkt über eine Peptidbindung oder indirekt über eine Linkerpeptideinheit mit dem lipophilen Ankerabschnitt verknüpft ist.
11. Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 welche die Formel
aufweist, worin Z, Z¹ und Z² unabhängig ausgewählt sind aus einer Bindung, einem Aminosäurerest und einem Oligopeptidrest, R³ und R&sup4; un-abhängig ausgewählt sind aus H, einer Amin-schützenden Gruppe, einer pharmazeutisch aktiven Einheit und einer Gruppe III
worin R³', R&sup4;', Z¹ und Z²' ausgewählt sind aus denselben Gruppen, die durch R³, R&sup4;, Z¹ bzw. Z² dargestellt werden,
p 0 oder eine ganze Zahl ist,
das oder jedes R² unabhängig aus linearen und verzweigtkettigen Alkyl- und Alkenylgruppen mit 6 bis 24 Kohlenstoffatomen und in der Natur vorkommenden Aminosäureseitenketten ausgewählt ist, q eine ganze Zahl von mindestens 1 ist,
das oder jedes R¹ unabhängig aus linearen und verzweigtkettigen Alkylund Alkenylgruppen mit 6 bis 24 Kohlenstoffatomen ausgewählt ist, Y OH, NH&sub2;, eine Carbonsäure-schützende Gruppe darstellt oder eine Anünosäure- oder Oligopeptideinheit umfaßt und/oder ein Harz, auf dem das Peptid synthetisiert worden ist.
12. Verfahren zur Herstellung einer Peptidverbindung, die einen lipophilen Anker umfaßt, der mit einer Aminosäureeinheit der Verbindung durch eine Peptidbindung verknüpft ist und welcher mindestens zwei Aminosäureeinheiten umfaßt, jeweils mit der Formel I
worin jedes R¹ unabhangig eine lineare oder verzweigtkettige Alkyl- oder Alkenylgruppe mit 6-24 Kohlenstoffatomen ist, die beiden Aminosäuren der Formel I direkt miteinander durch Peptidbindungen verknüpft sind, die Verbindung auch einen Matrix-Kernabschnitt umfaßt, der n Ebenen dendritisch und durch Peptidbindungen verknüpfter trifunktioneller Aminosäureeinheiten umfaßt, wobei n eine ganze Zahl von 1 oder größer ist, die oder jede trfunktionelle Aminosäureeinheit entweder zwei Carbonsäure gruppen oder zwei Aminogruppen umfaßt, und der Matrix-Kern ferner mindestens zwei terminale Funktionalitäten aufweist, die aus -NH&sub2;, -COOH, -OH, -SH und Derivaten davon ausgewählt sind, wobei das Verfahren umfaßt die Umsetzung des Amin- oder Carbonsäure Äquivalents des lipophilen Ankers mit dem Carbonsäure- bzw. Amin- Äquivalent der Aminosäureeinheit der Verbindung, um die Peptidbindung zu bilden.
13. Verfahren nach Anspruch 12, worin die Bildung der Peptidverbindung als Festphasen-Peptidsyntheseschritt durchgeführt wird, bei dem die sich bil dende Peptidverbindung mit einem Harz verknüpft ist.
14. Verfahren nach Anspruch 13, worin das Verfahren umfaßt die Bildung von Peptidbindungen zwischen den Einheiten der Formel 1 und von Peptidbindungen zwischen den Aminosäureeinheiten des Matrix-Kernabscbnitts in sequentieller Weise und ohne Abspaltung der sich bildenden Peptidverbindung von dem Harz.
15. Verfahren nach Anspruch 14, worin die Peptidverbindung eine pharmazeutisch aktive Verbindung nach Anspruch 8 ist, und worin jede terminale Funktionalitat eme Amin- oder Carbonsäuregruppe oder ein Derivat davon ist, und worin jede Peptidbindung, die einen pharmazeutisch aktiven Substituenten mit einer terminalen Funktionalität verknüpft, durch die Umsetzung einer Amin- oder Carbonsaureemheit oder eines Derivats davon des pharmazeutisch aktiven Substituenten mit der terminalen Funktionalität gebildet wird, während die sich bildende Peptidverbindung mit dem Harz verknüpft ist.
16. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 12 bis 15, worin die Peptidverbindung irgendeines der in den Ansprüchen 2 bis 5, 10 und 11 angegebenen weiteren Merkmale aufweist.
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