DE69307932T2

DE69307932T2 - Dideoxyfructonukleotide und deoxyfructonukleotide als dna polymerase-substrate

Info

Publication number: DE69307932T2
Application number: DE69307932T
Authority: DE
Inventors: Subramaniam Sabesan; George Leonard Trainor
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: Revvity Health Sciences Inc
Priority date: 1993-07-09
Filing date: 1993-07-09
Publication date: 1997-06-12
Anticipated expiration: 2013-07-10
Also published as: EP0707590A1; WO1995001986A1; JPH08512317A; DE69307932D1; AU4770493A; EP0707590B1

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf Desoxyfructonucleotide und Didesoxyfructonucleotide und 1Hre Verwendung in DNA-Verlängerungsreaktionen.

Hintergrund

Die DNA-Sequenzierung ist einer der grundlegenden analytischen Techniken der modernen Molekularbiologle. Die Entwicklung zuverlässiger Sequenzierungsverfahren führte zu großen Fortschritten im Verständnis genetischer Information und ermöglichte die Manipulation von genetischem Material (d.h. die Gentechnik).
Es gibt zur Zeit zwei Verfahren zum Sequenzieren von DNA: das Maxam-Gilbert-Verfahren des chemischen Abbaus [Maxam et al., Meth. in Enzym., Vol 65, 499-559 (1980)] und das Didesoxykettenabbruchverfahren nach Sanger [Sanger et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vol 74, 5463-5467 (1977)]. Ein gemeinsames Merkmal dieser beiden Techniken ist die Herstellung einer Menge von DNA- Fragmenten, die durch Elektrophorese analysiert werden. Die Techniken unterscheiden sich hinsichtlich der Verfahren, die zur Herstellung dieser Fragmente verwendet werden.
Mit Sangers Technik werden DNA-Fragmente durch partielles enzymatisches Kopieren (d.h. Synthese) des zu sequenzierenden DNA-Stücks hergestellt. In der häufigsten Version wird das zu sequenzierende DNA-Stück unter Verwendung von Standardtechniken in einen "Sequenzierungsvektor", ein großes zirkuläres einzelstrangiges DNA-Stück, wie den Bakteriophagen M13, eingesetzt. Dieser wird zur Matrize für den Kopiervorgang. Ein kurzes DNA- Stück, dessen Sequenz zu einem Bereich der Matrize unmittelbar stromaufwärts von dem Einschub komplementär ist, wird an die Matrize assoziiert, so daß es als Primer für die Synthese dient. In Gegenwart der vier natürlichen Desoxyribonucleosidtriphosphate (dNTPs) verlängert eine DNA-Polymerase den Primer vom 3'-Ende her unter Bildung einer komplementären Kopie der Matrize im Bereich des Einschubs. Zur Herstellung einer vollständigen Menge von Sequenzierungsfragmenten werden vier Reaktionen parallel durchgeführt, von denen jede die vier dNTPs zusammen mit einem einzigen Didesoxyribonucleosidtriphosphat (ddNTP) als Terminator, einen für jede Base, enthält. (³²P-markiertes dNTP wird hinzugefügt, so daß man markierte Fragmente erhält.) Wenn ein dNTP von der Polymerase eingebaut wird, kann die Kettenverlängerung weitergehen. Wenn das entsprechende ddNTP gewählt wird, wird die Kette abgebrochen. Das Verhältnis von ddNTP zu dNTP wird so eingestellt, daß DNA-Fragmente geeigneter Länge entstehen. Jedes der vier Reaktionsgemische enthält also eine Verteilung von Fragmenten mit demselben Didesoxynucleotidrest am 3'-Terminus und einem primerdefinierten 5'-Terminus.
Der Schlüssel zum Erfolg des Sanger-Verfahrens ist die Fähigkeit der ddNTPS, als kettenabbrechende Substrate zu fungieren, die nach dem Einbau eine weitere Kettenverlängerung verhindern. Die Zahl der verfügbaren kettenabbrechenden Substrate ist beschränkt. Neue kettenabbrechende Substrate wären nützlich und wertvoll, da sie die Verwendbarkeit des Sanger-Verfahrens vergrößern würden.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Didesoxyfructonucleotiden als kettenabbrechende Substrate und von Desoxyfructonucleotiden als kettenfortpflanzende Substrate in DNA-Kettenverlängerungsreaktionen. Insbesondere unterscheiden sich diese neuen Verbindungen insofern von den Desoxynucleotiden und Didesoxynucleotiden, die im allgemeinen in Verlängerungs- oder Abbruchreaktionen verwendet werden, als sie eine Methyleneinheit, die eine funktionelle Gruppe trägt, am Anomeriekohlenstoffatom des Zuckerrestes besitzen. Diese Verlängerung um ein Kohlenstoffatom ist eine potentielle Stelle für die Befestigung von Reportern (nachweisbaren Gruppen), wie Fluoreszenzfarbstoffen oder Biotin. Reportermarkierte Kettenterminatoren haben sich bei der Nicht-Radioisotopen-Sequenzierung als nützlich erwiesen; Prober et al., Science, 238, 336-341 (1987). Reportermarkierte Kettenpropagatoren sind nützlich bei der Markierung und Detektion von DNA-Fragmenten; Langer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 6633-6637 (1981). Bei den Verbindungen, die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden, kann der Reporter im Zuckerteil anstelle des Purin- oder Pyrimidinteils des Moleküls enthalten sein, wie bei der zuvor entwickelten Methodologie. Da also der Zuckerteil der Nucleotidbase allen Nucleotiden gemeinsam ist, würde ein einziges Fructozuckerderivat ein zweckmäßiges und universell geeignetes Mittel ergeben, durch das alle in Nucleotidverlängerungs- oder -abbruchreaktionen zu verwendenden Nucleotide über ein gemeinsames Zwischenprodukt hergestellt werden könnten.
Zu den Literaturstellen, die strukturell verwandte Verbindungen offenbaren, gehören: Sturm et al., J. Org. Chem., Vol 47, 4367- 4370 (1982), das ein cyclisches 4',6'-Monophosphat von Psicofuranin offenbart; Tatsuoka et al., Heterocycles, Vol 24, Nr. 8, 2133-2136 (1986), das die Synthese von 1'-Desoxy-1'-phosphono-1- β-D-fructofuranosyluracil und 1',3,-Didesoxy-1'-phosphono-1-β-D- fructofuranosyluracil offenbart; Tatsuoka et al., Heterocycles, Vol 24, Nr. 3, 617-620 (1986), das die Synthese von 2,3'- Anhydro-1'-phosphono-1-β-D-fructofuranosyluracil offenbart; sowie Tatsuoka et al., Japanisches Patent 61-275290.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Diese Erfindung stellt Verbindungen, die als Terminatoren in DNA- Verlängerungsreaktionen verwendbar sind, sowie Verbindungen, die als Propagatoren in DNA-Verlängerungsreaktionen verwendbar sind, bereit. Die von dieser Erfindung bereitgestellten Verbindungen umfassen solche der Formel I
wobei:
R¹ H&sub2;PO&sub3;, H&sub3;P&sub2;O&sub5;, H&sub4;P&sub3;O&sub7; oder die Salze davon oder H ist;
B eine natürlich vorkommende Nucleinsäurebase oder eine synthetisch modifizierte Nucleinsäurebase ist;
R² OR³, N&sub3;, Y-Biotinoyl oder NHC=O(CH&sub2;)nY-Biotinoyl ist, wobei:
R³ H, Alkyl, Aralkyl, Acyl oder Aroyl ist, wobei
das Alkyl 1 bis 5 Kohlenstoffatome enthalten kann,
die Aralkylgruppe Benzyl sein kann,
das Acyl 1 bis 5 Kohlenstoffatome enthalten kann,
die Arylgruppe des Aroyls Benzol oder ein mit wenigstens einer Alkylgruppe (C&sub1;-C&sub5;), einem Halogenatom oder einer Methoxygruppe substituiertes Benzol sein kann;
Y NH oder O ist;
n = 1-10 ist; und
A H oder OH ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform würde die Verbindung der Formel I bereitgestellt, bei der:
R¹ H&sub2;PO&sub3;, H&sub3;P&sub2;O&sub5;, H&sub4;P&sub3;O&sub7; oder die Salze davon oder H ist;
B eine natürlich vorkommende Nucleinsäurebase ist;
R² OH, N&sub3; oder Y-Biotinoyl ist; und
A H ist.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform würde die Verbindung der Formel I bereitgestellt, bei der:
R¹ H&sub4;P&sub3;O&sub7; ist;
B Thymin ist;
R² OH, N&sub3; oder Y-Biotinoyl ist; und
A H ist.
Diese Erfindung stellt auch Nucleinsäureketten bereit, die irgendeine der Verbindungen der Formel I enthalten können.
Diese Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Synthese einer Nucleinsäurekette bereit, wobei die Verbindungen der Erfindung mit einer oder mehreren natürlich vorkommenden oder synthetisch modifizierten Nucleinsäurebasen unter Bildung einer Nucleinsäurekette kombiniert werden können.
Diese Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Abbruch von DNA- Polymerase-Verlängerungsreaktionen bereit, das das Hinzufügen einer Didesoxyfructonucleotidverbindung der Formel I (wenn A H ist) zu einer DNA-Polymerase-Verlängerungsreaktion umfaßt.
Diese Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Fortpflanzung von DNA-Polymerase-Verlängerungsreaktionen bereit, das die Zugabe einer Desoxyfructonucleotidverbindung der Formel I (wenn A OH ist) zu einer DNA-Polymerase-Verlängerungsreaktion umfaßt.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Der Ausdruck "Nucleosid" wird stets so verwendet, daß er eine Einheit aus einer heterocyclischen Base und einem Zucker bezeichnet, die aus einem Molekül Pyrimidin oder Purin und einem Molekül eines Ribosezuckers besteht. Der Ausdruck "Nucleotid" wird stets so verwendet, daß er dessen phosphoryliertes Derivat bezeichnet.
Der Ausdruck "Fructonucleosid" wird stets so verwendet, daß er eine Einheit aus einer heterocyclischen Base und einem Zucker bezeichnet, die aus einem Molekül Pyrimidin oder Purin und einem Molekül eines Fructosezuckers besteht. Der Ausdruck "Fructonucleotid" wird stets so verwendet, daß er dessen phosphoryliertes Derivat bezeichnet.
Der Ausdruck "natürlich vorkommende Nucleinsäurebase" wird so verwendet, daß er die heterocyclische Base bezeichnet, die an das C-1 jeder Zuckereinheit in einem Nucleosid oder Nucleotid gebunden ist, wie Adenin, Thymin, Cytosin, Guanin oder Uracil.
Der Ausdruck "synthetisch modifizierte Nucleinsäurebase" wird so verwendet, daß er eine chemisch synthetisierte oder eine chemisch modifizierte natürlich vorkommende Nucleinsäurebase bezeichnet, wie Inosin oder Desazaadenosin.
Die Ausdrücke "Terminator", "Kettenterminator" und "kettenabbrechendes Substrat" werden austauschbar stets so verwendet, daß sie ein Substrat bezeichnen, das von einem Enzym, das matrizengesteuert Nucleinsäuren repliziert, an das 3'-Ende einer DNA-Kette angebaut werden kann, das aber, wenn es einmal angebaut ist, eine weitere Kettenverlängerung verhindert. Die Didesoxyfructonucleotidverbindungen der vorliegenden Erfindung, wobei A H ist, sind Beispiele für kettenabbrechende Substrate. Dagegen werden die natürlichen Desoxynucleotide und analoge synthetisch modifizierte Desoxynucleotidsubstrate als "kettenfortpflanzende Substrate" (oder "Propagatoren") angesehen, die nicht so wirken, daß sie nach 1Hrem Einbau durch die Polymerase die Weiterbildung der Nucleinsäurekette abbrechen. Die Desoxyfructonucleotide der vorliegenden Erfindung, bei denen A OH ist, sind Beispiele für kettenfortpflanzende Substrate.
Die Ausdrücke "Nucleotid-Polymerase-Verlängerungsreaktion" oder "Polymerase-Verlängerungsreaktion" beziehen sich auf ein Verfahren zur enzymatischen Synthese spezieller Bereiche eines Nucleinsäuremoleküls, wie es in Sanger et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vol 74, 5463-5467 (1977), auf das hier ausdrücklich Bezug genommen wird, ausgearbeitet wurde. Das Verfahren beruht auf Techniken, bei denen ein Oligonucleotidprimer mit einer gewünschten Stelle einer Matrizennucleinsäure assoziiert wird und in Gegenwart überschüssiger Desoxynucleotide eine Polymerase verwendet wird, um den Primer vom 3'-Ende her zu verlängern, wobei eine komplementäre Kopie der Matrizennucleinsäure entsteht. Die Polymerase-Verlängerungsreaktion wurde weiter ausgearbeitet, so daß man ein Mittel zur Nucleinsäuresequenzierung durch Verwendung von Didesoxynucleotiden, die als Kettenterminatoren wirken, erhielt (Sanger et al., oben).
Verbindungen der Formel I (wenn A H ist), bei denen es sich um die beanspruchten Didesoxyfructonucleotidverbindungen handelt, können aus Verbindungen der Formel II (unten) hergestellt werden.
Eine Verbindung der Formel II, die als gemeinsames Zwischenprodukt für die Herstellung der beanspruchten Verbindungen dient, kann in einem sechsstufigen Verfahren aus Fructose hergestellt werden.
In Schritt eins wird Fructose durch Reaktion in Methanol unter Verwendung von Schwefelsäure als Katalysator zu Methylfructofuranosid umgesetzt; diese Reaktion ergibt ein Anomerengemisch von Methyl-α,β-fructofuranosiden. In Schritt zwei werden die 1- und die 3-Hydroxygruppe des Produkts von Schritt eins durch Umsetzung zu einem Benzylidenderivat geschützt. Zum Beispiel ergibt die Reaktion des beschriebenen Anomerengemischs von Methyl-α,ß-fructofuranosiden mit Benzaldehyddimethylacetal und einer Protonenquelle, wie p-Toluolsulfonsäure, Methyl-1,3-O-benzyliden-αβ-D-fructofuranosid. In Schritt drei wird die 6-Hydroxygruppe des Produkts von Schritt zwei durch Umsetzung zu einem Trialkylsilylether geschützt. Zum Beispiel ergibt die Reaktion von 1,3-O-Benzyliden- α-D-fructofuranosid mit t-Butyldimethylsilylchlorid und Imidazol das t-Butyldimethylsilyletherderivat Methyl-1,3-O-benzyliden-6-O- t-butyldimethylsilyl-α-D-fructofuranosid. In Schritt vier wird die 4-Hydroxygruppe des Produkts von Schritt drei durch ein Wasserstoffatom ersetzt. Zum Beispiel liefert die Reaktion von 1,3-O-Benzyliden-6-O-t-butyldimethylsilyl-α-D-fructofuranosid mit Thiocarbonyldiimidazol ein Zwischenprodukt, das dann mit Tri-n- butylzinnhydrid und Azobis(isobutyronitril) (AIBN) umgesetzt wird, so daß das Desoxyderivat Methyl-1,3-O-benzyliden-6-O-t- butyldimethylsilyl-4-desoxy-α-D-fructofuranosid entsteht. In Schritt fünf wird die Trialkylsilylgruppe von dem 6-O-Trialkylsilylether des Produkts von Schritt vier entfernt, und die resultierende 6-Hydroxygruppe wird verestert. Zum Beispiel liefert die Reaktionvonmethyl-1,3-O-benzyliden-6-O-t-butyldimethylsilyl-4- desoxy-α-D-fructofuranosid mit Tetrabutylammoniumfluorid das 6-Hydroxyderivat Methyl-1,3-O-benzyliden-4-desoxy-α-D-fructofuranosid, das dann mit Benzoylchlorid umgesetzt wird, so daß das O- Esterderivat Methyl-6-O-benzoyl-1,3-O-benzyliden-4-desoxy-α-D- fructofuranosid entsteht. Verbindungen der Formel II, die als Zwischenprodukte für Verbindungen der Formel I dienen (wenn A H ist), werden in Schritt sechs hergestellt, in dem die 1,3-O- Benzylidengruppe entfernt wird, was ein Derivat mit 1,3-Dihydroxygruppen ergibt. Zum Beispiel ergibt die Reaktion von 6-O- Benzoyl-1,3-O-benzyliden-4-desoxy-α-D-fructofuranosid in einem sauren Medium, wie einem Alkohol, der p-Toluolsulfonsäure enthält, das Methyl-6-O-benzoyl-4-desoxy-α,ß-D-fructofuranosid. Das α-Anomer, Methyl-6-O-benzoyl-4-desoxy-α-D-fructofuranosid, und das ß-Anomer, Methyl-6-O-benzoyl-4-desoxy-β-D-fructofuranosid, des in Schritt sechs erhaltenen Anomerengemischs können dann durch Chromatographie voneinander getrennt und in Form der reinen Anomeren isoliert werden.
Verbindungen der Formel I (wenn A H ist) können aus Verbindungen der Formel II synthetisiert werden, indem man mit Verbindungen der Formel II eine Re1He von Reaktionen durchführt. Zum Beispiel kann 1-N-(3,4-Didesoxy-D-glycero-ß-D-hex-2-ulofuranosyl)thymin in vier Schritten aus Methyl-6-O-benzoyl-4-desoxy-α,ß-D-fructofuranosid hergestellt werden. In Schritt eins dieser Reaktionssequenz wird Methyl-6-O-benzoyl-4-desoxy-α,ß-D-fructofuranosid in Gegenwart einer milden Base mit einem Benzoylhalogenid umgesetzt, was das 1,6-Di-O-benzoylderivat Methyl-4-desoxy-1,6- di-O-benzoyl-α,ß-D-fructofuranosid ergibt. In Schritt zwei wird die 3-Position des Produkts von Schritt eins unter Bildung von Methyl-1,6-di-O-benzoyl-3,4-didesoxy-α,β-D-fructofuranosid desoxygeniert, indem man das Produkt des ersten Schritts mit 1,1'-Thiocarbonyldiimidazol und Tri-n-butylzinnhydrid umsetzt; weiterhin werden die Anomeren durch Chromatographie voneinander getrennt und gereinigt. In Schritt drei wird das β-Anomer aus Schritt zwei durch Reaktion mit 2,4-Di-O-trimethylsilylthymin zum Didesoxyfructonucleosidderivat 1-N-(1,6-Di-O-benzoyl-3,4-didesoxy-D-glycero-β-D-hex-2-ulofuranosyl)thymin umgesetzt. In Schritt vier werden die 1,6-Di-O-benzoylgruppen aus dem Produkt von Schritt drei unter Bildung des 1,6-D1Hydroxyderivats 1-N-(3,4- Didesoxy-D-glycero-ß-D-hex-2-ulofuranosyl)thymin entfernt, indem man das Produkt von Schritt drei nach Zemplens Verfahren umsetzt, A. Thompson, M.L. Wolfrom, Methods in Carbohydrate Chemistry, R.L. Whistler und M.L. Wolfrom (Hrsg.); Associated Press, 1963, Vol II, S. 215, auf das hier ausdrücklich Bezug genommen wird.
Bei einem anderen Beispiel für die Herstellung einer Verbindung der Formel I (wenn A H ist) aus einer Verbindung der Formel II wurde das Didesoxyfructonucleosidderivat 1-N-(1-Azido-1,3,4- tridesoxy-D-glycero-ß-D-hex-2-ulofuranosyl)thymin in fünf Schritten aus Methyl-6-O-benzoyl-4-desoxy-β-D-fructofuranosid hergestellt. In Schritt eins wird Methyl-6-O-benzoyl-4-desoxy-α,β-D- fructofuranosid mit t-Butyldimethylsilylhalogenid und Imidazol umgesetzt, was das 1-O-t-Butyldimethylsilyletherderivat Methyl-6- O-benzoyl-1-O-t-butyldimethylsilyl-4-desoxy-ß-D-fructofuranosid ergibt. In Schritt zwei wird das Produkt der Reaktion von Schritt eins durch Reaktion mit Thiocarbonyldiimidazol und anschließende Reaktion mit AIBN und Tri-n-butylzinnhydrid zum 3-desoxygenierten Produkt Methyl-6-O-benzoyl-1-O-t-butyldimethylsilyl-3,4-didesoxy- β-D-fructofuranosid umsetzt. In Schritt drei wird das Produkt von Schritt zwei durch Reaktion mit Tetrabutylammoniumfluorid zur Entfernung der t-Butyldimethylsilyl-Schutzgruppe, anschließende Reaktion mit Sulfurylhalogenid und Imidazol unter Bildung des Imidazolids und anschließende Reaktion mit Natriumazid unter Bildung des 1-Azidoderivats zum 1-Azidoderivat Methyl-1-azido-6- O-benzoyl-1,3,4-tridesoxy-ß-D-fructofuranosid umgesetzt. In Schritt vier wird das Produkt von Schritt drei durch Reaktion mit 2,4-Di-O-trimethylsilylthymin zum Fructonucleosidderivat 1-N-(1- Azido-6-O-benzoyl-1,3,4-tridesoxy-D-glycero-ß-D-hex-2-ulofuranosyl)thymin umgesetzt. In Schritt fünf wird das Produkt von Schritt vier durch Reaktion mit Natriummethoxid in Methanol unter Entfernung der Benzoylgruppe zum 6-Hydroxyfructonucleosidderivat 1-N-(1-Azido-1,3,4-tridesoxy-D-glycero-β-D-hex-2-ulofuranosyl)thymin umgesetzt.
Verbindungen der Formel I (wobei A = OH) werden aus einem Ausgangsstoff wie dem oben beschriebenen Methyl-1,3-O-benzyliden-α- D-fructofuranosid hergestellt. In Schritt 1 werden die ungeschützten Hydroxygruppen des Ausgangsstoffs geschützt. Zum Beispiel ergibt die Reaktion dieses Ausgangsstoffs mit einem Säurehalogenid, wie Benzoylchlorid, und einer katalytischen Menge einer gehinderten Base, wie 4-N,N-Dimethylaminopyridin, in einem chlorierten Lösungsmittel, wie Methylenchlorid, das Pyridin enthält, Methyl-1,3-O-benzyliden-4,6-di-O-benzoyl-α-D-fructofuranosid. In Schritt 2 wird die Schutzgruppe von den 1,3-Hydroxygruppen entfernt, und die 1-Hydroxygruppe wird mit einer anderen Schutzgruppe geschützt, während die 3-Hydroxygruppe ungeschützt bleibt. Zum Beispiel wird bei der Reaktion des Produkts von Schritt 1 mit einem sauren Katalysator, wie p-Toluolsulfonsäure, in unter Rückfluß siedendem wasserfreiem Methanol die Benzyliden- Schutzgruppe entfernt. Dann ergibt die Reaktion der resultierenden D1Hydroxyverbindung mit Imidazol und einem Trialkylsilylhalogenid, wie t-Butyldimethylsilylchlorid, in einem polaren aprotischen Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, Methyl-4,6-di-O- benzoyl-1-O-(t-butyldimethylsilyl)-α,β-D-fructofuranosid. Schließlich werden das durch die Reaktion von Schritt 2 gebildete α- und β-Anomer durch Chromatographie getrennt. In Schritt 3 wird eines der Anomere von Schritt 2 zum 3-Desoxyderivat umgesetzt. Zum Beispiel liefert die Reaktion von 4,6-Di-O-benzoyl-1-O-(t- butyldimethylsilyl)-ß-D-fructofuranosid mit Thiocarbonyldiimidazol in einem chlorierten Lösungsmittel, wie 1,2-Dichlorethan, ein Zwischenprodukt, das dann in einem Kohlenwasserstoff- Lösungsmittel, wie Toluol, mit Tri-n-butylzinnhydrid umgesetzt wird, wasmethyl-3-desoxy-4,6-di-O-benzoyl-1-O-(t-butyldimethylsilyl)-ß-D-fructofuranosid ergibt. In Schritt 4 wird das Produkt von Schritt 3 durch Reaktion mit Tetrabutylammoniumfluorid zur Entfernung der t-Butyldimethylsilyl-Schutzgruppe, anschließende Reaktion mit Sulfurylchlorid und Imidazol unter Bildung des Imidazolids und anschließende Reaktion mit Natriumazid in wasserfreiem Dimethylformamid zum 1-Azidoderivat Methyl-1-azido- 1,3-didesoxy-4,6-di-O-benzoyl-β-D-fructofuranosid umgesetzt. In Schritt 5 wird das Produkt von Schritt 4 durch Reaktion mit 2,4- Di-O-trimethylsilylthymin zu 1-N-(1-Azido-3,6-dibenzoyl-1,3- didesoxy-D-erythro-β-D-hex-2-ulofuranosyl)thymin umgesetzt. In Schritt 6 wird das Produkt von Schritt 5 durch Reaktion mit Natriummethoxid in Methanol zum Endprodukt 1-N-(1-Azido-1,3- didesoxy-D-erythro-ß-D-hex-2-ulofuranosyl)thymin umgesetzt.
Verbindungen der Formel I, bei denen R¹ H&sub4;P&sub3;O&sub7; ist, werden aus Verbindungen der Formel I hergestellt, bei denen R¹ H ist. Zum Beispiel wird 1-N (3,4-Didesoxy-D-glycero-β-D-hex-2-ulofuranosyl)thymin-6-triphosphat hergestellt, indem man Phosphoroxidchlorid zu einer Suspension von 1-N (3,4-Didesoxy-D-glycero-ß-D- 2-ulofuranosyl)thymin und Cytosin in Trimethylphosphat gibt und das resultierende Gemisch vierzig Minuten unter Argon rührt; anschließend gibt man das resultierende Gemisch zu einer Lösung von Tris(tri-n-butylammonium)pyrophosphat in Dimethylformamid.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch eine Nucleinsäurekette mit einer Länge von wenigstens zwei Nucleinsäurebasen, wobei es sich bei einer oder mehreren dieser Nucleinsäurebasen um eine Verbindung der Formel I handelt.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Synthese solcher Nucleinsäureketten bereit, wobei während DNA-Synthesereaktionen dem Reaktionsgemisch eine oder mehrere der Verbindungen der Formel I zum Einbau in eine Nucleinsäurekette zugeführt werden. Solche Nucleinssäureketten können zum Beispiel hergestellt werden, indem man eine oder mehrere der Verbindungen der Formel I mit einer oder mehreren diskreten, natürlich vorkommenden oder synthetisch modifizierten Nucleinsäurebasen kombiniert, wobei jedes der in der Technik wohlbekannten Standardverfahren zur Synthese von Oligonucleotiden verwendet werden kann.
Die vorliegende Erfindung umfaßt weiterhin ein Verfahren zum Abbruch von DNA-Polymerase-Verlängerungsreaktionen, das das Hinzufügen einer oder mehrerer der Verbindungen der Formel I, wenn A H ist, mit anderen Worten, wenn die Verbindung der Formel I in der Didesoxyform vorliegt, zu einem DNA-Polymerase-Verlängerungsreaktionsgemisch umfaßt.
Wenn das Didesoxynucleotid in einer DNA-Kettenverlängerungsreaktion von einer DNA-Polymerase eingebaut wird, wird die Kettenverlängerung nicht fortgesetzt, und die Verlängerung ist beendet. Das Sanger-Verfahren der DNA-Sequenzierung beruht auf einem Didesoxy-Kettenabbruch unter Bildung einer Re1He von Nucleinsäurefragmenten, die dann analysiert werden, um die DNA-Sequenz aufzuklären; siehe Sanger et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vol 74, 5463-5467 (1977), auf das hier ausdrücklich Bezug genommen wird.
Die vorliegende Erfindung umfaßt weiterhin ein Verfahren zur Fortpflanzung von DNA- Polymerase-Verlängerungsreaktionen, das das Hinzufügen einer oder mehrerer der Verbindungen der Formel I, wenn A OH ist, mit anderen Worten, wenn die Verbindung der Formel I in der Desoxyform vorliegt, zu einem DNA-Polymerase-Verlängerungsreaktionsgemisch umfaßt. Desoxynucleotide erlauben nach dem Einbau in eine Nucleinsäurekette während einer Polymerase- Kettenverlängerungsreaktion eine Fortsetzung der Kettenverlängerung (Sanger et al., oben).

Beispiele

Beispiel 1

Synthese einer Verbindung der Formel I, bei der R¹ H ist, R² OR³ ist, R³ H ist, B Thymin ist und A H ist; 1-N-(3,4-Didesoxy-D- glycero-β-D-hex-2-ulofuranosyl)thymin
Schritt 1 (Methyl-α,ß-fructofuranoside): Zur Herstellung dieser Verbindung wurde das Verfahren von R.D. Guthrie et al., J. Chem. Soc. Perkin 1, 46, 4843 (1981), befolgt. Zu einer Suspension von 100 g Fructose in wasserfreiem Methanol (1 1) wurden 15 ml konz. Schwefelsäure hinzugetropft, und es wurde 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die Lösung mit AG1-X8-Harz (OH-Form) neutralisiert und dann filtriert. Dann wurde die Lösung zur Trockne eingedampft. Das Produkt enthielt ein Gemisch von Methyl- α,ß-fructofuranosiden und kleineren Mengen Pyranosid sowie Spuren nicht umgesetzter Fructose. Dieses Gemisch wurde in den folgenden Reaktionen verwendet.
Schritt 2 (Methyl-1,3-O-benzyliden-α-D-fructofuranosid): Das Anomerengemisch des Methylfructosidsirups aus Schritt 1 wurde in wasserfreiem Methanol, das 4-Å-Molekularsieb enthielt, gelöst und über Nacht stehen gelassen. Dann wurde die Lösung filtriert und zu einem Sirup eingedampft, das man unter Hochvakuum ließ, um das restliche Lösungsmittel zu entfernen. Dieses wurde dann in 700 ml wasserfreiem Acetonitril suspendiert. Eine Lösung von Acetonitril (348 ml), die Benzaldehyddimethylacetal (87 ml) und p-Toluolsulfonsäure (1,00 g) enthielt, wurde zu der obigen Methylfructosidsuspension getropft, die 24 h unter kräftigem Rühren auf 60ºC und dann 24 Stunden auf Raumtemperatur gehalten wurde. Dann wurde die Lösung mit Triethylamin neutralisiert und zur Trockne eingedampft. Das gewünschte Produkt wurde durch Chromatographie auf einer Säule mit Silicagel unter Verwendung von Ethylacetat/Hexan/Ethanol (10:10:1) als Eluent daraus abgetrennt. Ausbeute
44.27 g. ¹H NMR d (CDCl&sub3; + D&sub2;O ca. 1%): 7.55 - 7.3 (m, 5H, C&sub6;H&sub5;) , 5.49 (s, 1H, Acetal-CH), 4.45 (H-1a, 1H, J1a,1b = 11.7 Hz), 4.23 (m, 1H, H-5), 4.19 (s, 1H, H-3), 4.09 (d, 1H, H-4, J4,5 2.5 Hz), 3.98 (d, 1H, H-1b), 3.65 (m, 2H, H,6a,b) . ¹³C NMR d: 136.7, 129.4, 128.4, 126.0 (C&sub6;H&sub5;), 100.5 (C-2), 100.0 (benzylisches Acetal-C). 88. 9 (C-3), 84.6 (C-5), 77.0 (C-4), 68. (C-1), 62.9 (C-6), 49.1 (OCH&sub3;).
Die Verbindung war mit Produkten verunreinigt, die bei der Untersuchung mit Silicagel-Dünnschichtchromatographie fast identische Mobilität hatten. Sie ließen sich jedoch leicht entfernen, indem man das Produkt wie unten beschrieben zum t-Butyldimethylsilyl- Derivat umsetzte.
Schritt 3 (Methyl-1,3-O-benzyliden-6-O-t-butyldimethylsilyl-α-D- fructofuranosid): Das Produkt aus Schritt 2 (44,27 g) wurde in wasserfreiem Dimethylformamid (250 ml), das Imidazol (12,1 g) enthielt, gelöst und auf 0ºC abgekühlt. Eine Lösung von t-Butyldimethylsilylchlorid (24,2 g) in DMF (50 ml) wurde langsam hinzugefügt, und die Lösung wurde 2 h lang gerührt. Dann wurde das Lösungsmittel im Vakuum verdampft und der Rückstand in Dichlormethan gelöst. Die Dichlormethanschicht wurde mit Wasser, eiskalter 1 M Salzsäure und dann mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Das gewünschte Produkt wurde durch Reinigung auf einer Säule mit Silicagel unter Verwendung von Ethylacetat/Hexan (3:8) als Eluent erhalten. Gewicht des reinen Produkts 29,4 g. Leicht (< 10%) verunreinigtes Produkt 10,2 g.
¹H nmr (CDCl&sub3;) d: 7.35 - 7.5 (m, 5H, C&sub6;H&sub5;), 5.45 (s, 1H, PhCH), 4.4 (d, 1H, H-1a, J 1a,1b = 12.0 Hz), 4.16 (m, 2H, H-5, H-3), 4.07 (d, 1H, H-4, J4-OH 11.0 Hz), 3.97 (d, 1H, H-1b), 3.87 (dd, 1H, H-6a, J 5,6 = 6.0 Hz, J 6a,6b 10.6 Hz), 3.76 (dd, 1H, H-6b, J 5,6b = 8 Hz), 3.37 (s, 3H, OCH&sub3;), 2.66 (d, 1H, OH), 0.88 (s, 9H, C&sub4;H&sub9;-Si), 0.08 (broad s, 6H, 2 x CH&sub3; -Si). ¹³C NMR d: 137.1, 129.1, 128.2, 126.1 (C&sub6;H&sub5;), 100.5 (C-1), 99.8 (benzylisches Acetal-C) , 89.1 (C-3), 84.5 (C-5), 77.53 (C-4), 68.0 (C-1), 64.0 (C-6), 48.9 (OCH&sub3;), 25.9 (CH&sub3;)&sub3;), 18.3 {(CH&sub3;)&sub3;-C), -5.3, -5.2 (2 x CH&sub3;).
Schritt 4 (Methyl-1,3-O-benzyliden-6-O-t-butyldimethylsilyl-4- desoxy-α-D-fructofuranosid): Eine Lösung des Produkts von Schritt 3 (5,6 g) in wasserfreiem 1,2-Dichlorethan (100 ml), das Thiocarbonyldiimidazol (6,8 g) enthielt, wurde 16 h lang unter Stickstoffatmosphäre am Rückfluß gehalten. Dann wurde die Lösung abgekühlt und mit Dichlormethan verdünnt. Die organische Schicht wurde mit Wasser, eiskalter 0,5 M Salzsäure und dann mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen.
Verdampfen des Lösungsmittels nach Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat lieferte einen Schaum, der zweimal mit wasserfreiem Toluol abgedampft und dann in wasserfreiem Toluol (200 ml) gelöst wurde. Die Lösung wurde 30 min mit trockenem Stickstoff entgast. Dann wurde AIBN (Vazo 64, 25 mg) hinzugefügt, und die Lösung wurde unter Rückfluß erhitzt, während Lösungen von Tri-nbutylzinnhydrid (4,5 ml) in Toluol (21,5 ml) und von AIBN (60 mg) in Toluol (25 ml) hinzugefügt wurden. Nachdem die Zugabe nach 1 h beendet war, wurde die Lösung weitere 30 min am Rückfluß gehalten; danach war der ganze Ausgangsstoff verschwunden. Die Lösung wurde abgekühlt und dann mit Wasser, 10%iger wäßriger Kaliumfluoridlösung, eiskalter 0,5 M Salzsäure und dann mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Abdampfen lieferte ein farbloses öl, aus dem das gewünschte Produkt durch Chromatographie auf einer Säule mit Silicagel, die mit Ethylacetat/Hexan (1:8) äquilibriert und eluiert wurde, erhalten wurde. Ausbeute des Sirups 4,0 g.
¹H NMR (CDCl&sub3;) d: 7.5 - 7.34 (m, 5 H, C&sub6;H&sub5;), 5.44 (s, 1 H, PhCH), 4.41 (d, 1 H, H-1a, J1a,b 12.5 Hz), 4.27 (m, 1 H, H-5), 4.19 (d, 1 H, H-3, J3,4a = 5.8 Hz), 3.93 (d, 1 H, H-1b), 3.92 (dd, 1 H, H-6a, Ja,b 11.6 Hz, J6a,5 = 6.5 Hz), 3.72 (dd, 1 H, H-6b, J6b,5 = 8.7 Hz), 3.29 (s, 3 H, OCH&sub3;), 2.44 (m, 1 H, H-4a, J4a,3 5.8 Hz, J4a,5 = 9.6 Hz, J4a,b = 14.5 Hz), 1.90 (dd, 1 H, H-4b, J4b,5 = 3.8 Hz), 0.90 (s, 9 H, (CH&sub3;)3-C), 0.07 (broad s, 6 H, 2 x CH&sub3;). ¹³C NMR d: 137.7, 129.0, 128.2, 126.2 (C&sub6;H&sub5;), 100.2 (C-2), 100.0 (PhCH), 80.3 (C-3), 79.8 (C-5), 69.9 (C-1), 66.7 (C-6), 48.7 (OMe), 33.2 (C-4), 25.9 (3 x CH&sub3; der t-Butylgruppe), 18.4 { (CH&sub3;)&sub3;-C), -5.1, -5.3 (2 x (CH&sub3;)&sub2;-Si}.
Schritt 5 (Methyl-6-O-benzoyl-1,3-O-benzyliden-4-desoxy-α-D- fructofuranosid): Zu einer Lösung des Produkts von Schritt 4 (6,4 g) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (THF, 100 ml) gab man eine 1 N Tetrabutylammoniumfluoridlösung (23 ml) in THF, und es wurde 1,5 h bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde die Lösung zur Trockne eingedampft, in Dichlormethan wieder aufgelöst und dann mit Wasser, 0,5 M HCl und gesättigter NaHCO&sub3;-Lösung gewaschen. Nach dem Abdampfen wurde der Rückstand in wasserfreiem Pyridin (50 ml) aufgenommen und auf 0ºC abgekühlt. Benzoylchlorid (4,2 ml) wurde hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde bis auf Raumtemperatur erwärmt und 16 h gerührt. Dann wurde die Lösung auf Eis gegossen, und das Produkt wurde mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Schicht wurde dann mit 1 M HCl und wäßriger gesättigter NaHCO&sub3;-Lösung gewaschen. Der nach dem Abdampfen erhaltene Rückstand wurde durch Filtration über eine Säule mit Silicagel, die mit Ethylacetat/Hexan (1:6) äquilibriert und eluiert wurde, gereinigt. Die Ausbeute des farblosen Feststoffs betrug 5,63 g. Die Probe wurde aus Ethylacetatlhexan umkristallisiert, wobei man farblose Nadeln erhielt.
¹H NMR (CDCl&sub3;) d: 8.0, 7.5, 7.37) (m, 5 H, C&sub6;H&sub5;), 5.49 (s, 1 H, PhCH), 4.45 - 4.62 (m, 4 H, H-5, H-6a,b H-1a), 4.26 (d, 1 H, H-3, J3,4a = 5.0 Hz), 3.97 (d, 1 H, H-1b, J1a,b Hz), 3.32 (s, OMe), 2.57 (m, 1 H, H-4a, J4a,3 = 5.0 Hz, J4a,5 = 8.5 Hz, J4a,b = 14.2 Hz), 1.99 (dd, 1 H, H-4b, J4b,5 = 2.8 Hz).
Schritt 6 (Verbindung der Formel II, Methyl-6-O-benzoyl-4-desoxyα,ß-D-fructofuranosid): Eine Lösung des Produkts von Schritt 5 (5,6 g) in wasserfreiem Methanol (140 ml), das p-Toluolsulfonsäure (374 mg) enthielt, wurde 30 min am Rückfluß gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde abgekühlt und mit Triethylamin neutralisiert. Die Lösung wurde zur Trockne eingedampft und auf eine Säule mit Silicagel aufgetragen, die mit Ethylacetat/Ethanol/Hexan (10:1:10) äquilibriert und eluiert wurde. Zwei Fraktionen wurdenerhalten, Methyl-6-O-benzoyl-4-desoxy-α-D-fructofuranosid und Methyl-6-O-benzoyl-4-desoxy-ß-D-fructofuranosid; Methyl-6-O- benzoyl-4-desoxy-β-D-fructofuranosid war das polarere der beiden. Die Ausbeute an Methyl-6-O-benzoyl-4-desoxy-β-D-fructofuranosid betrug 2,45 g (Sirup). Die Ausbeute an Methyl-6-O-benzoyl-4-desoxy-β-D-fructofuranosid betrug 1,47 g. Die Strukturen von Methyl- 6-O-benzoyl-4-desoxy-α-D-fructofuranosidundmethyl-6-O-benzoyl- 4-desoxy-β-D-fructofuranosid wurden durch ¹H- und ¹³C-NMR ermittelt.
¹H NMR (CDCl&sub3; + D&sub2;O ca. 1%) d (α-Anomer): 8.05, 7.59, 7.47 (d, 2 H, t, 1 H, t, 2 H ortho-, meta- bzw. para-Wasserstoffatom von C&sub5;H&sub5;), 4.52 (dd, 1 H, H-6a), 4,45 (m, 1 H, H-5), 4.35 (dd, 1 H, H-6b), 4.25 (dd, 1 H, H-3), 3.85 (t, 2 H, H-1a,b), 3.35 (s, 3 H, OMe), 2.55 (m, 1H, H-4ß), 2.78 (m, 1 H, H-4a). ¹³C NMR (CDCl&sub3;) d: 166.6 (COPh), 133.1, 129.6, 128.4 (C&sub6;H&sub5;CO), 109.1 (C-2), 76.5 (2 x C, C-5, C-3), 66.7 (C-6), 58.9 (C-1), 48.7 (OMe), 35.5 (C-4).
¹H NMR (CDCl&sub3; + D&sub2;O ca. 1%) d (β-Anomer): 8.08, 7.57, 7.46 (d 2 H, t , 1 H, & t, 2 H, ortho-, meta- bzw. para-Wasserstoffatom des Benzoats), 4.35 (m, 4 H, H-5, H-3, H-6a,b), 3.70 (dd, 2 H, H-1a,b), 3.34 (s, 3 H, OMe), 2.41 (m, 1 H, H-4ß), 1.82 (m, 1 H, H-4a). ¹³C NMR (CDCl&sub3;) d: 166.4 (COPh), 133.1, 129.6, 128.4 (C&sub6;H&sub5;), 103.3 (C-2), 74.9 (C-5), 73.5 (C-3), 66.9 (C-6), 60.4 (C-1), 49.1 (OMe), 34.2 (C-4)
Schritt 7 (Methyl-4-desoxy-1,6-di-O-benzoyl-α,ß-D-fructofuranosid): Zu etwa 1 g rohem Methyl-6-O-benzoyl-4-desoxy-α,ß-D-fructofuranosid (hergestellt wie in Beispiel 1, Schritt 6, beschrieben) in Dichlormethan (25 ml), das 4-Å-Molekularsieb und Pyridin (0,28 ml) enthielt und auf -40ºC gehalten wurde, gab man Benzoylchlorid (0,4 ml), und die Lösung wurde 5 h zwischen -30 und -20ºC gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde futriert, mit Dichlormethan verdünnt und mit eiskalter 0,5 M HCl und gesättigter wäßriger NaHCO&sub3;-Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und abgedampft. Die Endreinigung erfolgte über Chromatographie auf einer Säule mit Silicagel. Die Ausbeuten der getrennten Anomeren betrugen 0,582 g Methyl-4-desoxy-1,6-di-O-benzoyl-α-D-fructofuranosid und 0,200 g Methyl-4-desoxy-1,6-di-O-benzoyl-β-D- fructofuranosid.
¹H NMR (CDCl&sub3;) d (α-Anomer): 8.07 (m, 4 H), 7.58 (m, 2 H), 7.45 (m, 4 H) (ortho-, meta- und para-H-Atom des 1- und 6-O-Benzoats), 4.77 (d, 1 H, H-1a, J1a,1b Hz), 4.51 (d, 1 H, H-1b), 4.44 (m, 3 H. H-5, H-6a,b), 4.05 ( breites Triplett, kollabiert bei D&sub2;O-Austausch zu einem Dublett, 1 H, H-3, J3,4 = 5.5 Hz), 3.68 (dd, 1 H, OH-3, J 4.2, 1.5 Hz), 3.35 Cs, 3 H, OMe), 2.59 (m, 1 H, H-4a), 1.88 (dd, 1.H, H-4ß).
β-Anomer (CDCl&sub3;) d: 8.06 (m, 4 H), 7.57 (m, 2 H) & 7.45 (m, 4 H) ortho-, meta- und para-H-Atom des 1- bzw. 6-O-Benzoats), 4.52 und 4.47 (H-1a & H- 1b, J = 11.8 Hz), 4.48 - 4.32 (4 H, H-5, H-6a und H-6b, H-3), 3.45 (s, 3 H, OMe), 2.57 (d, 1 H, 3-OH, J = 9.7 Hz), 2.47 (m, 1 H, H-4a, J = 6.3, 7.3, 12.2 Hz), 1.97 (m, 1 H, H-4ß, J = 9.9.6, 12.2 Hz).
Schritt 8A (Methyl-1,6-di-O-benzoyl-3,4-didesoxy-α-D-fructofuranosid): Eine Lösung von 574 mg Methyl-4-desoxy-1,6-di-O- benzoyl-α-D-fructofuranosid (aus Schritt 7) in trockenem Toluol (25 ml), das 1,1'-Thiocarbonyldiimidazol (843 mg) enthielt, wurde am Rückfluß gehalten, bis der ganze Ausgangsstoff verschwunden war (1 bis 2 Tage). Das Reaktionsgemisch wurde aufgearbeitet, und das Produkt wurde mit Tri-n-butylzinnhydrid (0,48 ml) desoxygeniert, wie es für die Herstellung von Methyl-1,3-O-benzyliden-6- O-t-butyldimethylsilyl-4-desoxy-α-D-fructofuranosid in Beispiel 1, Schritt 4, beschrieben ist. Reinigung durch Chromatographie auf einer Säule mit Silicagel (Ethylacetat/Hexan = 2:9) lieferte reines Produkt (265 mg) und leicht verunreinigtes Produkt (53 mg).
Schritt 88 (Methyl-1,6-di-O-benzoyl-3,4-didesoxy-ß-D-fructofuranosid): Dieses wurde aus 2,24 g Methyl-4-desoxy-1,6-di-O- benzoyl-β-D-fructofuranosid (aus Schritt 7) hergestellt, wie es in Schritt 8A beschrieben ist. Die Ausbeute des Produkts betrug 1,1 g reines und 339 mg leicht verunreinigtes Produkt.
Schritt 9 (1-N-(1,6-Di-O-benzoyl-3,4-didesoxy-D-glycero-α,ß-D- hex-2-ulofuranosyl)thymin): Das Didesoxyglycosid aus Schritt 8A (505 mg; 1,36 mmol) und 2,4-Di-O-trimethylsilylthymin (1,09 g; 4,03 mmol) wurden in einem Gemisch von Nitromethan/Dichlormethan (2:1, 11,5 ml) gelöst, das 4-Å-Molekularsieb enthielt, 30 min bei Raumtemperatur gerührt und dann auf -30ºC abgekühlt. Trimethylsilyltriflat (0,86 ml, 4,43 mmol) wurde hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde 3 h auf -5ºC gehalten. Triethylamin (2 ml) und Dichlormethan (50 ml) wurden hinzugefügt, und die Lösung wurde durch ein Celitefilter filtriert, und das Filtrat wurde mit Wasser, 0,5 M HCl und wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Das α- und das ß-Anomer wurden durch HPLC auf einer Säule mit Silicagel unter Verwendung von Ethylacetat/Hexan/Acetonitril (25:25:4) als Eluent getrennt. Ausbeute ß-Anomer (1-N- (1,6-Di-O-benzoyl-3,4-didesoxy-D-glycero-ß-D-hex-2-ulofuranosyl)thymin) = 137 mg; Ausbeute des α-Anomers (1-N-(1,6-Di-O-benzoyl- 3,4-didesoxy-D-glycero-α-D-hex-2-ulofuranosyl)thymin) = 197 mg. ¹H-NMR (β-Anomer) (CD&sub3;COCD&sub3;), d: 9.95 (breites Singulett, 1 H, N-3H), 7.97, 7.63 und 7.49 (m, insgesamt 10 H, 1',6'-O-Benzoat- Wasserstoffatome), 7.87 (Quartett,
1 H, H-6), 4.81 (d, 1 H, H- 1'a, J1'a,b = 11.3 Hz), 4.78 (m, 1 H, H-5'), 4.63 (m, 2 H, H-6'a, H-1'b), 4.48 (dd, 1 H, H-6'b, J6'b,5' = 4.8 Hz, J6'b,6'a = 12.1 Hz), 3.11 (m, 1 H, H-3t , J = 4.6, 7.9, 14.2 Hz), 2.60 (Sextett, 1 H, H-3'a, J = 8.4, 14.2 Hz), 2.33 und 2.16 (m, 2 H, H-Atome an C-4'), 1.58 (d, 3 H, C-5 Me).
¹H NMR (α-Anomer) (CD&sub3;COCD&sub3;) d: 10.04 (breites Singulett, 1 H, N-3 H), 8.04, 7.95, 7.64 und 7.48 (m, 10 H, 1',6'-O-Benzoate ), 7.82 (Quartett, 1 H, H-6), 4.90 (d, 1 H, H-1'a, J1'a,b = 11.2 Hz), 4.68 (m, 1 H, H-5'), 4.64 (d, 1 H, H-1'b), 4.55 (dd, 1 H, H-6'a, J6'a,5' = 3.8 Hz, J6'a,b = 11.3 Hz), 4.45 (dd, 1 H, H-6'b, J6'b,5' = 5.5 Hz), 2.94 (Septett, 1 H, H-3'a, J = 6.3, 7.8, 13.8 Hz), 2.65 (Oktett, 1 H, H-3t , J = 6.7, 8.4, 13.8 Hz), 2.25 und 2.13 (m, 2 H, H-4 α und β), 1.82 (d, 3 H, C-5 Me). ¹³C NMR (Aceton -d6)) d: 166.5, 166.0, 152.6, 151.4, 136.8, 134.1, 134.0, 130.2, 129.4, 109.5, 99.9 (C-2'), 79.8 (C-5'), 66.6, 66.3 (C-6' und C-1'), 35.0 (C-3'), 27.5 (C-4'), 12.6, 0.0.
Schritt 10 (1-N-(3,4-Didesoxy-D-glycero-ß-D-hex-2-ulofuranosyl)thvmin) : Dieses wurde nach dem Verfahren von Zemplen (Thompson et al., Methods Carbohydrate Chem., 1962, II, 215) quantitativ aus 136 mg des Dibenzoats (1-N-(1,6-Di-O-benzoyl-3,4-didesoxy-D- glycero-ß-D-hex-2-ulofuranosyl)thymin aus Schritt 9) unter Verwendung von Natriummethoxid in Methanol hergestellt, was einen farblosen Feststoff ergab (70 mg).
¹H NMR (D&sub2;O) d: 7.98 (br s, 1 H, H-5), 4.34 (m, 1 H, H-5'), 3.97 (d, 1 H, H-1'a), 3.71 (m, 2 H, H-1'b, H-6'a), 3.58 (dd, 1 H, H-6'b), 2.68 (m, 1 H, H-3t ), 2.25 (m, 1 H, H-3'a), 2.02 (m, 1 H, H-4'a), 1.84 (br. s, 3 H, C-5 Me), 1.65 (m, 1 H, H-4'β).

Beispiel 2

Synthese einer Verbindung der Formel I, bei der R¹ H ist, R² N&sub3; ist, B Thymin ist und A H ist; 1-N-(1-Azido-1,3,4-tridesoxy-D- glycero-β-D-hex-2-ulofuranosyl)thymin

Schritt 1a (Methyl-6-O-benzoyl-1-O-t-butyldimethylsilyl-4-desoxyα-D-fructofuranosid): Zu einer Lösung von 2,4 g Methyl-6-O- benzoyl-4-desoxy-α-D-fructofuranosid (aus Beispiel 1, Schritt 6) in wasserfreiem Dimethylformamid (20 ml) gab man eine Lösung von t-Butyldimethylsilylchlorid (1,40 g) in DMF (5 ml) sowie Imidazol (517 mg), und es wurde 3,5 h bei 0ºC gerührt. Dann wurde die Lösung zur Trockne eingedampft, und der Rückstand wurde in Dichlormethan gelöst. Es wurde mit Wasser, eiskalter HCl und gesattigter wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Reinigung auf einer Säule mit Silicagel lieferte 2,6 g der Titelverbindung als Sirup (90 mg des Ausgangsstoffs wurde zurückgewonnen).
¹H NMR (CDCl&sub3;) d: 8.06, 7.55, und 7.43 (5 H von 6-O-Benzoaten), 4.420 und 4.25 (4 H, H-6a,b, H-5, H-3), 3.95 (d, 1 H, H-1a, J = 11.4 Hz), 3.84 (d, 1 H, H-1b), 3.23 (3, 3 H, OMe), 2.49 und 1.76 (m, 2 H, H-4a,b), 0.89, 0.09, 0.08 (3 9 H).
Schritt 1B (Methyl-6-O-benzoyl-1-O-t-butyldimethylsilyl-4-desoxy- ß-D-fructofuranosid) : Dieses wurde nach demselben Verfahren, wie es in Schritt 1a beschrieben ist, aus 1,47 g Methyl-6-O-benzoyl- 4-desoxy-β-D-fructofuranosid hergestellt. Ausbeute 1,37 g.
¹H NMR β-Anomer (CDCl&sub3;) d: 8.06 (d, 1 H, 2 H), 7.58 (t, 1 H), 7.46 (t, 2 H) (ortho-, meta- und para-H-Atom des 6-O-Benzoats), 4.35 ( m, 4 H, H-5, H-3, H-6a,b), 3.77 (d, 1 H, H-1a, J 1a,b = 11.0 Hz), 3.66 (d, 1 H, H-1b), 3.33 (s, 3 H, OMe), 2.53 (d, 1 H, 3-OH, J = 8.4 Hz), 2.38 (m, 1 H, H-4a), 1.91 (m, 1 H, H-4ß), 0.91 (s, 9 H, (Me)&sub3;-), 0.08 {s, 6 H, (Me)2-Si).
Schritt 2A (Methyl-6-O-benzoyl-1-O-t-butyldimethylsilyl-3,4-didesoxy-α-D-fructofuranosid): Eine Lösung von 3, 8 g der Verbindung von Schritt 1a und Thiocarbonyldiimidazol (7,0 g) in 1,2-Dichlorethan (75 ml) wurde 3 Tage am Rückfluß gehalten und dann wie oben beschrieben (Schritt 8A, Beispiel 1) aufgearbeitet und desoxygeniert. Die Ausbeute des Produkts betrug 1,2 g.
¹H NMR (CDCl&sub3;) d: 8.05 (dm, 2 H), 7.56 (m, 1 H), & 7.44 (m, 1 H, 2 H) (6-O-Benzoat- H-Atome), 4.48 (m, 1 H, H-5), 4.36 (dd, 1 H, H-6a, J6a,5 Hz, J6a,b Hz), 4.27 (dd, 1 H, H-6b, J6b,5 = Hz), 3.75 (d,. 1 H, H-1a, J1a,b = 11.0 Hz), 3.57 (d, 1 H, H-1b), 3.28 (s, 3 H. OMe), 2.17 (m, 2 H, H-3a, H-4a), 1.95 (m, 1 H, H-3ß), 1.70 (m, 1 H, H-4β), 0.90 {s, 9 H, (Me)&sub3;-), 0.06 (2 x s, 6 H, (Me)&sub2;-Si).
Schritt 2B (Methyl-6-O-benzoyl-1-O-t-butyldimethylsilyl-3,4-didesoxy-ß-D-fructofuranosid) : Dieses wurde aus 2,6 g der Verbindung von Schritt 1B hergestellt. Das in Schritt 2A beschriebene Verfahren wurde verwendet, und die Ausbeute des Produkts betrug 1,5 g.
Schritt 3A (Methyl-1-azido-6-O-benzoyl-1,3,4-tridesoxy-α-D- fructofuranosid) Eine Lösung von 860 mg des Didesoxyderivats von Schritt 2A in trockenem Tetrahydrofuran (20 ml) wurde mit 1 M Tetrabutylammoniumfluoridlösung in THF (2,4 ml) behandelt und 40 min bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Lösungsmittel verdampft, der Rückstand wurde in Dichlormethan gelöst, mit Wasser und gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, und das Lösungsmittel wurde verdampft, was einen Sirup ergab. Dieser wurde in trockenem DMF (20 ml), das Imidazol (1,47 g) enthielt, gelöst und auf -20ºC abgekühlt. Sulfurylchlorid (0,452 ml) wurde hinzugefügt, und nach 30 min wurde die Lösung bis auf Raumtemperatur gebracht und 4 h gerührt. Die Lösung wurde zur Trockne eingedampft, in Dichlormethan gelöst und mit Wasser, eiskalter 1 M HCl und Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Der nach dem Verdampfen des Lösungsmittels erhaltene Rückstand wurde in trockenem DMF (20 ml), das Natriumazid (300 mg) enthielt, gelöst und 1 h auf 70ºC und dann 16 h auf 60ºC erhitzt. Das DMF wurde dann verdampft, und der Rückstand wurde aufgearbeitet. Die endgültige Reinigung auf einer Säule mit Silicagel (Ethylacetat/Hexan = 1:6 als Eluent) lieferte die Titelverbindung als farblosen Sirup (358 mg). Die Gegenwart der Azidgruppe wurde anhand des IR-Spektrums identifiziert (starke Bande bei 2108 cm&supmin;¹). Die vollständige Struktur des Produkts wurde durch ¹H-NMR bestätigt.
¹H--
NMR (CDCl&sub3;) d: 8.05 (m, 2 H), 7.57 (m, 2 H), 7.45 (m, 2 H) (o, m, para-H-Atome des 6-Benzoats), 4.51 (m, 1 H, H-5), 4.43 (dd, 1 H, H-6a, J6a,5= 3.3 Hz, J6a,b = 11.9 Hz), 4.33 (dd, 1 H, H-6b, J6b,5 = 5.7 Hz), 3.40 & 3.34 C=(2 x verzerrte Dubletts, 2 H, H-1a, H-1b, J1a,b = 12.4 Hz), 3.30 (s, 3 H, OMe), 2.27, 2.14, 2.04 & 1.88 (m, H-Atome an C-3 und C-4).
Schritt 3B (Methyl-1-azido-6-O-benzoyl-1,3,4-tridesoxy-ß-D- fructofuranosid): 542 mg des Produkts von Schritt 2B wurden in THF (20 ml) gelöst, und dann wurde eine 1 M Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid (1,5 ml) in THF hinzugefügt, und es wurde 3 h bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch zur Trockne eingedampft und auf eine Säule mit Silicagel aufgetragen, die mit Ethylacetat/Hexan (1:1) äquilibriert und eluiert wurde. Die Ausbeute an sirupösem Produkt betrug 340 mg.
Die 340 mg des erhaltenen Produkts wurden in DMF (10 ml) gelöst und dann in Gegenwart von Imidazol (741 mg) mit Sulfurylchlorid (255 ml) umgesetzt; anschließend wurde mit Natriumazid (500 mg) umgesetzt, wie es in Schritt 3A beschrieben ist. Nach der Reinigung wurde das Produkt als Sirup erhalten (227 mg).
¹H NMR (CDCl&sub3;) d: 8.08 (m, 2 H), 7.57 (m, 1 H), 7.45 (m, 2 H) (o-, m- und p-H-Atom des 6- O-Benzoats), 4.49 (m, 1 H, H-5), 4.46 (dd, 1 H, H-6a, J6ab,5 - 3.2 Hz, J6a,b = 12.0 Hz), 4.35 (dd, 1 H, H-6b, J6b,5 = 6.1 Hz), 3.41 und 3.35 (verzerrte Dubletts, 2 H, H-1a,b), 3.29 (3, 3 H, OMe), 2.13 (m, 4 H, H-Atome an C-3 und C-4).
Schritt4 (1-N-(1-Azido-6-O-benzoyl-1,3,4-tridesoxy-D-glycero-ß- D-hex-2-ulofuranosyl)thymin): Das Azidoglycosid aus Schritt 3A (350 mg) und 2,4-Di-O-trimethylsilylthymin (620 ml) wurden in einem Gemisch von Nitromethan/Dichlormethan (2:1; 15 ml) unter Verwendung von Trimethylsilyltriflat miteinander gekoppelt, wie es in Schritt 9, Beispiel 1, beschrieben ist. Die Endreinigung durch HPLC lieferte das gewünschte Produkt sowie das α-Anomer. Ausbeute β = 52 mg, α = 107 mg. Hydrolysiertes Produkt = 102 mg. ¹H NHR (β-Anomer, CDCl&sub3;) d: 9.1 (br s, 1 H, N3-H), 7.96, 7.57, 7.43 (m, 5 H, 6'-O- Benzoat-H-Atome), 7.71 (Quartett, 1 H, H-6), 4.69 (m, 1 H, H-5'), 4.62 (dd, 1 H, H-6'a, J = 3.3, 12.4 Hz), 4.41 (dd, 1 H, H-6'b, J = 4.8, 12.4 Hz), 3.74 und 3.62 ( 2 x d, 2 H, H-1'a,b, J = 12.8 Hz), 2.96 (m, 1 H, H-3'β, J = 4.8, 8.0, 14.5 Hz), 2.50 (m, 1 H, H-3'a, J = 8.0, 9.2, 14.5 Hz), 2.21 (m, 1 H, H-4'a), 1.99 (m, 1 H, H- 4t ), 1.68 (d, 3 H, C-5-Methylgruppe).
α-Anomers (CDCl&sub3;) d: 9.24 (br. s, 1 H, N3-H), 8.08, 7.60, 7.47 (m, 5 H, 6'-O-Benzoat-H-Atome), 7.55 (m, 1 H, H-6), 4.60 bis 4.40 (m, 3 H, H-5', H-6'a,b), 3.80 und 3.70 (2 x d, 2 H, H-1'a,b, J 12.9 Hz), 2.77 (m, 1 H, H-3'a, J = 5.8, 6.9, 14.4 Hz), 2.54 (m, 1 H, H- 3t , J = 6.8, 8.0, 14.4 Hz), 2.06 (m, 2 H, H-4' α und β), 1.93 (d, 3 H, C-5-Methylgruppe).
Schritt 5A (1-N-(1-Azido-1,3,4-tridesoxy-D-glycero-ß-D-hex-2-ulofuranosyl)thymin): De-O-benzoylierung des in Schritt 4 erhaltenen α-Anomers (52 mg) mit Natriummethoxid in Methanol lieferte das Produkt als farblosen Feststoff (37 mg)
¹H NMR (D&sub2;O) d: 8.04 (Quartett, 1 H, H-5), 4.34 (m, 1 H, H-5'), 3.80 (d, 1 H, H-1'a, J = 13.0 Hz), 3.75 (dd, 1 H, H-6'a, J = 3.4, 12.4 Hz), 3.59 (d, 1 H, H-1'b), 3.58 (dd, 1 H, H-6'b, J = 5.5, 12.4 Hz), 2.76 (m, 1 H, H-3t , J = 4.1, 7.8, 14.5 Hz), 2.32 (m, 1 H, H-3'a, J = 8.3, 10.3, 14.5 Hz), 1.99 (m, 1 H, H-4'a), 1.87 (d, 3 H, C-5 Me), 1.79 (m, 1 H, H-4'β).
Schritt 5B (1-N-(1-Azido-1.3,4-tridesoxy-D-glycero-α-D-hex-2-ulofuranosyl)thymin): das α-Anomer wurde aus dem β-Anomer von Schritt 4 hergestellt, wie es in Schritt 5A beschrieben ist.
α-Anomer (D&sub2;O) d: 7.76 (br. d, 1 H, H-5), 4.23 (ml 1 H, H-5'), 3.81 (d, 1 H, H-1'a, J = 13.3 Hz), 3.71 (dd, 1 H, H-6'a, J = 4.0, 11.8 Hz), 3.63 (dd, 1 H, H-6'b, J = 5.9, 11.8 Hz), 3.58 (d, 1 H, H-1'b), 2.58 (m, 1 H, H-3'a, J 7.4, 14.4 Hz), 2.39 (m, 1 H, H-3t , J = 5.7, 9.0, 14.4 Hz), 1.93 und 1.81 (m, 2 H, H-4'a und β), 1.87 (br. s, 3 H, C-5 Me).

Beispiel 3

Synthese einer Verbindung der Formel I, bei der R¹ H&sub4;P&sub3;O&sub7; ist, R² OR³ ist, R³ H ist, B Thymin ist und A H ist; 1-N-(3',4'-Didesoxy-D-glycero-β-D-hex-2-ulofuranosyl)thymin-6-triphosphat

Die Verbindung von Beispiel 1, Schritt 10, 1-N-(3,4-Didesoxy-D- glycero-β-D-hex-2-ulofuranosyl)thymin (23,3 mg; 90,9 µmol), und Cytosin (10,4 mg; 94 µmol) wurden in Trimethylphosphat (0,20 ml) suspendiert. Phosphoroxidchlorid (14 µl; 150 µmol) wurde hinzugefügt, und das Gemisch wurde 40 Minuten unter Argon bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde zu einer Lösung von Tris(tri-n-butyl)ammoniumpyrophosphat (1,0 M in DMF; 1,2 ml) getropft. Die Lösung wurde 30 Minuten unter Argon bei Raumtemperatur gerührt und dann zu einer vorgekühlten (0ºC) Lösung von Triethylamin (140 µl) in Wasser (2,0 ml) getropft. Nachdem man sie über Nacht bei 2ºC stehen gelassen hatte, wurde die Lösung zur Trockne eingeengt, in Wasser (10 ml) aufgenommen ünd auf eine Säule (1 x 30 cm Bett) mit DEAE-Sephadex A-25-120 aufgetragen, die mit wäßrigem Triethylammoniumhydrogencarbonat (TEAB; pH 7,6) (1,0 T 0,1 M) voräquilibriert worden war. Die Säule wurde mit einem linearen Gradienten von TEAB [0,1 M (150 ml) T 1,0 M (150 ml)] eluiert. Die Elution wurde anhand der Extinktion bei 270 nm überwacht. Die Fraktionen, die dem Hauptpeak entsprachen, der bei ungefähr 0,6 M eluiert wurde, wurden gesammelt, vom Lösungsmittel befreit und mit Ethanol abgedampft (2x). Die Ausbeute betrug 9,8 µmol (11%) (unter der Annahme eines Extinktionskoeffizienten von 9600 bei 267,5 nm (max)) des Triethylammoniumsalzes. HPLC (Zorbax SAX, 0,2 M wäßriges Kaliumphosphat, pH 6,5) zeigte, daß das Material zu ungefähr 85% rein war. Die Hauptkomponente zeigte:
³¹P NMR (D&sub2;O) : -21.82 Cb, beta-P), -9.90 (d, 20 Hz, alpha-P), -9.02 Cb, gamma-P); ¹H NMR (D&sub2;O): ppm 1.7 - 1.9 und 2.20 - 2.35 (m's, H-3'a,3'b,4'a,4'b), 1.91 (s, 5-CH&sub3;), 3.76 (d, 12 Hz, H-1'a), 3.99 (d, 12 Hz, H-1'b), 3.99 (m, H-6'a), 4.18 (m, H-6'b), 4.52 (m, H-51), und 8.02 (s, H-6).

Beispiel 4

Synthese einer Verbindung der Formel I, bei der R¹ H&sub4;P&sub3;O&sub7; ist, R² N&sub3; ist, B Thymin ist und A H ist; 1-N-(1-Azido-1,3,4-tridesoxy-D-glycero-β-D-hex-2-ulouranosyl)thymin-6'-triphosphat

Die Verbindung von Beispiel 2, 1-N-(1-Azido-1,3,4-tridesoxy-D- glycero-ß-D-hex-2-ulofuranosyl)thymin (37 mg; 132 µmol), und Cytosin (13,7 mg; 123 µmol) wurden in Trimethylphosphat (0,30 ml) suspendiert. Phosphoroxidchlorid (28 µl; 300 µmol) wurde hinzugefügt, und das Gemisch wurde 30 Minuten unter Argon bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde zu einer Lösung von Tris(tri-n-butyl)ammoniumpyrophosphat (1,0 M in DMF; 0,9 ml) getropft. Die Lösung wurde 5 Minuten unter Argon bei Raumtemperatur gerührt und dann zu einer vorgekühlten (0ºC) Lösung von Triethylamin (210 µl) in Wasser (3,0 ml) getropft. Nachdem man sie über Nacht bei 2ºC stehen gelassen hatte, wurde die Lösung zur Trockne eingeengt, in Wasser (15 ml) aufgenommen und auf eine Säule (1 x 30 cm Bett) mit DEAE-Sephadex A-25-120 aufgetragen, die mit wäßrigem Triethylammoniumhydrogencarbonat (TEAB; pH 7,6) (1,0 0,1 M) voräquilibriert worden war. Die Säule wurde mit einem linearen Gradienten von TEAB [0,1 M (150 ml) 1,0 M (150 ml)] eluiert. Die Elution wurde anhand der Extinktion bei 270 nm überwacht. Die Fraktionen, die dem Hauptpeak entsprachen, der bei ungefähr 0,5 M eluiert wurde, wurden gesammelt, vom Lösungsmittel befreit und mit Ethanol abgedampft (2x). Die Ausbeute betrug 59 µmol (45%) (unter der Annahme eines Extinktionskoeffizienten von 10 000 bei 270 nm (max)) des Triethylammoniumsalzes. HPLC (Zorbax SAX, 0,2 M wäßriges Kaliumphosphat, pH 6,5) zeigte, daß das Material zu 99% rein war.
³¹P NMR (D&sub2;O): ppm -21.06 (t, 20 Hz, beta- P), -9.80 (d, 20 Hz, alpha-P), -4.0 (d, 21 Hz, gamma-P).

Beispiel 5

Synthese einer Verbindung der Formel I, bei der R¹ H&sub4;P&sub3;O&sub7; ist, R² NH&sub2; ist, B Thymin ist und A H ist; 1-N-(1-Amino-1,3,4-tridesoxy-D-glycero-ß-D-hex-2-ulofuranosyl)thymin-6'-triphosphat

1-N-(1-Azido-1,3,4-tridesoxy-D-glycero-β-D-hex-2-ulofuranosyl)thymintriphosphat (20 µmol) wurde in Wasser (1 ml) gelöst, und 10% Palladium auf Kohle (2 mg) wurde hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde 75 Minuten unter einer Wasserstoffatmosphäre gerührt. Der Katalysator wurde durch Filtration entfernt, und 110 M wäßriges TEAB (pH 7,6; 100 µl) wurde hinzugefügt. Die Lösung wurde auf eine Säule (1 x 30 cm Bett) mit DEAE-Sephadex A-25-120 aufgetragen, die mit wäßrigem Triethylammoniumhydrogencarbonat (TEAB; pH 7,6) (1,0 T 0,1 M) voräquilibriert worden war. Die Säule wurde mit einem linearen Gradienten von TEAB [0,1 M (150 ml) T 1,0 M (150 ml)] eluiert. Die Elution wurde anhand der Extinktion bei 270 nm überwacht. Die Fraktionen, die dem Hauptpeak entsprachen, wurden gesammelt, vom Lösungsmittel befreit und mit Ethanol abgedampft (2x). Die Ausbeute betrug 12,8 µmol (64%) (unter der Annahme eines Extinktionskoeffizienten von 10 000 bei 268,5 nm (max)) des Triethylammoniumsalzes. HPLC (Zorbax SAX, 0,2 M wäßriges Kaliumphosphat, pH 6,5) zeigte, daß das Material zu > 98% rein war.

Beispiel 6

Synthese einer Verbindung der Formel I, bei der R¹ H&sub4;P&sub3;O&sub7; ist, R² NHBiotin ist, B Thymin ist und A H ist; 1-N-(1-(6-biotinamido)hexanoamido)-1,3,4-tridesoxy-D-glycero-ß-D-hex-2-ulofuranosyl) thymin-6'-triphosphat

1-N-(1-Amino-1,3,4-tridesoxy-D-glycero-ß-D-hex-2-ulofuranosyl)thymintriphosphat (20 µmol) wurde in 1,0 M wäßrigem TEAB (pH 7,6; 100 µl) gelöst, und Sulfosuccinimidyl-6-(biotinamido)hexanoat- Natriumsalz (5,2 mg; 9 µmol) wurde hinzugefügt. Nachdem man sie 2 Stunden bei 50ºC stehen gelassen hatte, wurde die Lösung mit Wasser auf 1 ml verdünnt und auf eine Säule (1 x 19 cm Bett) mit DEAE-Sephadex A-25-120 aufgetragen, die mit wäßrigem Triethylammoniumhydrogencarbonat (TEAB; pH 7,6) (1,0 T 0,1 M) voräquilibriert worden war. Die Säule wurde mit einem linearen Gradienten von TEAB [0,1 M (150 ml) T 1,0 M (150 ml)] eluiert. Die Elution wurde anhand der Extinktion bei 270 nm überwacht. Die Fraktionen, die dem ersten Hauptproduktpeak (nach dem großen N- Hydroxysulfosuccinimid-Peak) entsprachen, wurden gesammelt, vom Lösungsmittel befreit und mit Ethanol abgedampft (2x). Die Ausbeute betrug 1,3 µmol (26%) (unter der Annahme eines Extinktionskoeffizienten von 10 000 bei 272 nm (max)) des Triethylammoniumsalzes. HPLC (C-18, T 0 30% Acetonitril in 0,1 M TEAA) zeigte nur einen einzigen Peak.

Beispiel 7

Synthese einer Verbindung der Formel I, bei der R¹ H ist, R² N&sub3; ist, B Thymin ist und A OH ist; 1-N-(1-Azido-1,3-didesoxy-D- erythro-ß-D-hex-2-ulofuranosyl)thymin

Schritt 1 (Methyl-1,3-O-benzyliden-4,6-di-O-benzoyl-α-D-fructofuranosid): Eine Lösung des Produkts aus Schritt 2 von Beispiel 1 (21,0 g) in Dichlormethan (500 ml), das Pyridin (18,0 ml) enthielt, wurde abgekühlt, und Benzoylchlorid (21,5 ml) wurde hinzugetropft. Nachdem die Zugabe beendet war, wurde eine katalytische Menge (etwa 10 mg) 4-N,N-Dimethylaminopyridin hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde 20 h bei Raumtemperatur unter einer Stickstoffatmosphäre gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 1 M eiskalter Salzsäure (bis die wäßrige Schicht sauer war), Wasser und gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Verdampfen des Lösungsmittels ergab einen Sirup. Reinigung des Sirups auf einer Säule mit Silicagel unter Verwendung von Ethylacetat/Hexan (1:5) als Eluent ergab ein homogenes Produkt (23,5 g).
Schritt 2 (Methyl-4,6-di-O-benzoyl-1-O-(t-butyldimethylsilyl)αβ-D-fructofuranosid): Das Produkt aus Schritt 1 (23,5 g) wurde in wasserfreiem Methanol gelöst, das p-Toluolsulfonsäure (827 mg) enthielt, und 1 h unter Stickstoff am Rückfluß gehalten. Die Lösung wurde abgekühlt und mit Triethylamin neutralisiert, und die Lösung wurde zur Trockne eingedampft, wobei man einen Sirup erhielt (25,0 g). Dieser Sirup wurde in 100 ml DMF gelöst und abgedampft, bevor man zum nächsten Schritt überging. Dies gewährleistete die Entfernung von Methanolspuren aus dem Produkt.
Ein Teil des obigen Sirups (5,0 g) wurde in wasserfreiem DMF (100 ml) gelöst und auf 0ºC abgekühlt. Imidazol (1,0 g) und t-Butyldimethylsilylchlorid (2,2 g) wurden hinzugefügt, und die Lösung wurde 3 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde wiederum abgekühlt, und zusätzliche Portionen Imidazol (1,0 g) und t-Butyldimethylsilylchlorid wurden hinzugefügt. Nach 20 h bei Raumtemperatur wurde nachgewiesen, daß die Reaktion zu Ende war. Das Reaktionsgemisch wurde zur Trockne eingedampft, und der Rückstand wurde mit Dichlormethan extrahiert. Dann wurde mit Wasser, eiskalter 1 M Salzsäure und gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Schließlich wurde die organische Schicht über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert, und das Lösungsmittel wurde verdampft, wobei man einen Sirup erhielt, der zwei Produkte enthielt. Diese wurden durch Chromatographie auf einer Säule mit Silicagel unter Verwendung von Ethylacetat/Hexan (1:6) als Eluent getrennt. Der weniger polare Stoff (2,54 g) wurde durch 1H-NMR als das α-Anomer identifiziert, und das zweite Produkt (2,11 g) war das entsprechende β-Anomer.
¹H-NMR des α-Anomers (CDCl&sub3; δ: 8.08, 7.57 und 7.42 (m, Benzoat-H-Atome), 5.32 (dd, 1H, H-4), 4.71 (dd, H-6a), 4.59 (dd, 1H, H-6b), 4.43 (m, 2H, H-5 und H-3), 3.98 (d, 1H, H-1a) , 3.84 (d, 1H, H-1b) , 3.59 (d, 1H, OH), 3.35 (s, 3H, OCH&sub3;).
1H-NMR des β-Anomers (CDCl&sub3;) δ: 8.07, 7.58 und 7.45 (m, Benzoat-H-Atome), 5.55 (t, 1H, H-4), 4.68 (dd, 1H, H-6a), 4.58 (m, 1H, H-3), 4.52 (dd, 1H, H-6b), 4.38 (m, 1H, H-5), 3.8 (dd, 2H, H-1a und H-1b), 3.38 (s, 3H, OCH&sub3;). ¹³C NMR (CDCl3) δ: 166.3, 166.2, 133.4, 133.0, 129.8, 129.7, 128.4, 128.3, 104.5, 80.0, 78.6, 77.0, 65.2, 61.5, 49.4, 25.8, 18.3, -5.4, -5.5.
Schritt 3a (Methyl-3-desoxy-4.6-di-O-benzoyl-1-O-(t-butyldimethylsilyl)-αβ-D-fructofuranosid): Das α-Anomer aus Schritt 2 (2,54 g) wurde in 1,2-Dichlorethan (50 ml) gelöst, das Thiocarbonyldumidazol (12,0 g) enthielt, und 4 Tage unter Stickstoff am Rückfluß gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde aufgearbeitet, wie es in Schritt 4 von Beispiel 1 beschrieben ist. Das Produkt wurde durch Reaktion mit Tri-n-butylzinnhydrid (3,5 ml) in Toluol zur Titelverbindung umgesetzt, wie es in Schritt 4 von Beispiel 1 beschrieben ist. Das Produkt wurde durch chromatographie auf einer Säule mit Silicagel unter Verwendung von Ethylacetat/Hexan (1:18) als Eluent gereinigt, wobei man 1,3 g eines Sirups erhielt.
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ: 8.06, 7.58 und 7.44 (m, Benzoat-H-Atome), 5.48 (m, 1H, H-4), 4.63 - 4.48 (m, 3H, H-6a, H-6b, H-5), 3.79 (d, 1H, H-1a), 3.61 (d, 1H, H-1b), 3.48 (s, 3H, OCH&sub3;), 2.69 (dd, 1H, H-3a), 2.26 (dd, 1H, H-3b). ¹³C NMR: 166.2, 166.1, 133.3, 133.0, 129.8, 129.7, 128.4, 128.3, 108.2, 81.9, 81.0, 79.8, 64.4, 61.0, 48.7, 25.7, 18.1, -5.5, -5.6.
Schritt 3b (Methyl-3-desoxy-4,6-di-O-benzoyl-1-O-(t-butyldimethylsilyl)-ß-D-fructofuranosid): Dieses wurde aus 2,11 g des ß-Anomers aus Schritt 2 hergestellt, wie es in Schritt 3a beschrieben ist. Das Gewicht des Produkts betrug 1,21 g. 1H NMR (CDCl&sub3;) δ: 8.06, 7.57 und 7.44 (m, Benzoat-H-Atome), 5.61 (m, 1H, H-4), 4.65 - 4.48 (m, 3H, H-6a wnd H-6b, H-5), 3.7 (d, 1H, H-1a), 3.61 (d, 1H, H-1b), 3.31 (s, 3H, OCH&sub3;), 2.65 (dd, 1H, H-3a), 2.48(dd, 1H, H-3b).
Schritt 4a (Methyl-1-azido-1,3-didesoxy-4,6-di-O-benzoyl-α-D- fructofuranosid): Das Produkt aus Schritt 3a (1,9 g) wurde in THF (100 ml) gelöst. Tetrabutylammoniumfluoridlösung (1 M) in THF (4,75 ml) wurde hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde 20 min bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde zur Trockne eingedampft, und der Rückstand wurde in Dichlormethan -gelöst. Dann wurde mit Wasser, eiskalter 0,5 M Salzsäure, Wasser und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Verdampfen des Lösungsmittels ergab einen Sirup (2,15 g), der in wasserfreiem DMF (50 ml) wieder aufgelöst und auf -20ºC abgekühlt wurde. Sulfurylchlorid (0,9 ml) und Imidazol (0,75 g) wurden hinzugefügt, und die Reaktion wurde unter Rühren vorsichtig auf Raumtemperatur erwärmt. Nach 1 h wurde das Lösungsmittel bis zur Trockne abgedampft, und der Rückstand wurde in Dichlormethan gelöst. Die Lösung wurde mit Wasser, eiskalter 1 M Salzsäure und gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Verdampfen des Lösungsmittels ergab einen Sirup, der in wasserfreiem DMF (50 ml), das Natriumazid (1,0 g) enthielt, gelöst wurde. Nach 24 h Rühren bei 50ºC wurde das Lösungsmittel bis zur Trockne abgedampft, und der Rückstand wurde in Dichlormethan gelöst. Die Lösung wurde mit Wasser, eiskalter 1 M Salzsäure und gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Verdampfen des Lösungsmittels ergab einen Sirup, der durch Chromatographie auf einer Säule mit Silicagel unter Verwendung von Ethylacetat/Hexan (1:10) als Eluent gereinigt wurde. Die Struktur des Produkts (1,08 g) wurde durch ¹H-NMR bestätigt.
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ: 8.08, 7.6, und 7.47 (m, Benzoat-H-Atome), 5.54 (m, 1H, H-4), 4.53 - 4.70 (m, 3H, H-6a und H-6b, H-5), 3.42 (dd, 2H, H-1a und H-1b), 3.4 (s, 3H, OCH&sub3;), 2.67 (dd, 1H, H-3a), 2.34 (dd, 1H, H-3b).
Schritt 4b (Methyl-1-azido-1,3-didesoxy-4,6-di-O-benzoyl-ß-D- fructofuranosid): Das Produkt aus Schritt 3b (500 mg) wurde zur Titelverbindung (258 mg) umgesetzt, wie es in Schritt 4a beschrieben ist.
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ: 8.07, 7.60, 7.46 (m, Benzoat-Hatome), 5.66 (m, 1H, H-4), 4.63 (m, 2H, H-5 und H-6a), 4.53 (dd, 1H, H-6b), 3.49 (dd, 2H, H-1a und H-1b), 3.33 (s, 3H, OCH&sub3;), 2.72 (dd, 1H, H-3a), 2.46 (dd, 1H, H-3b).
Schritts (1-N-(1-Azido-3,6-dibenzoyl)-1,3-didesoxy-D-erythro-ß- D-hex-2-ulo(furanosyl)thymin): Das Produkt aus Schritt 4b wird zum Produkt von Schritt 5 umgesetzt, wobei das Verfahren und die Reagentien verwendet werden, die in Schritt 4 von Beispiel 2 beschrieben sind.
Schritt 6 (1-N-(1-Azido-1,3-didesoxy-D-erythro-ß-D-hex-2-ulo(furanosyl)thymin): Das Produkt aus Schritt 5 wird durch Reaktion mit Natriummethoxid in Methanol, wie es in Schritt 10 von Beispiel 1 beschrieben ist, zur Titelverbindung umgesetzt.

Beispiel 8

Dieses Beispiel zeigt ein Verfahren zur Verwendung der Verbindung von Beispiel 6 (bei der es sich um eine Verbindung der Formel I handelt, bei der R¹ H&sub4;P&sub3;O&sub7; ist, R² NHBiotin ist, B Thymin ist und A H ist; 1-N-(1-(6-biotinamido)hexanoamido)-1,3,4-tridesoxy-D-glycero-ß-D-hex-2-ulofuranosyl)thymin-6'-triphosphat) als Terminator bei einer Taq-Polymerase-DNA-Kettenverlängerungsreaktion.
Ein Reaktionsgemisch wurde hergestellt, das 12 µl M13mpDNA mit 0,25 µg/µl (New England Biolabs), 3 µl des markierten Universalprimers SF 505 mit 0,0001 OD/µl, 3 µl Taq-10x-Puffer (166 mM Ammoniumsulfat, 670 mM Tris, pH 8,8, 67 mM MgCl&sub2;, 100 mM ß-Mercaptoethanol, 67 µM EDTA, 1700 µg/ml Rinderserumalbumin; New England Biolabs) und 5 µl dh&sub2;0 enthielt. Dies wurde 2 Minuten gekocht, und dann wurden 5 µl eines Verlängerungsgemischs (hergestellt aus: dATP, 250 µM; dCTP, 250 µM; dGTP, 250 µl; dGTP, 250 µl; dTTP, 25 µM; und dem Produkt von Beispiel 6, 500 µM) und 1 µl Taq-Polymerase (Cetus, Emeryville, CA) hinzugefügt. Dies wurde gemischt und dann 30 Minuten bei 70ºC inkubiert. Dann wurde das Reaktionsgemisch durch eine vorgewaschene G-50-Schleudersäule gegeben und dann 45 Minuten in einem Speed-Vac getrocknet. Der Rückstand wurde in 5 µl Formamid suspendiert und 5 Minuten auf 68ºC erhitzt. 3 µl davon wurden auf ein Genesis 2000 DNA Analysis System (Du Pont) aufgetragen und 8 h einer Elektrophorese unterzogen. Das Ergebnis der Elektrophorese wurde mit dem eines Kontrollexperiments verglichen, bei dem eine identische Reaktion durchgeführt wurde, außer daß 2',3'-Didesoxy-ß-D-glyceropentofuranosylthymin, ein natürlicher Terminator, anstelle des Produkts von Beispiel 6 verwendet wurde. Der Vergleich zeigte, daß eine ähnliche Verteilung von Verlängerungsprodukten erhalten wurde, wenn man entweder den natürlichen Terminator oder die Verbindung von Beispiel 6 als Kettenterminator verwendete. Dieses Beispiel zeigt die Eignung von Verbindungen der Formel I als Substrate bei Verlängerungsreaktionen unter Verwendung von DNA-Polymerase von Thermus aquaticus (Taq- Polymerase).

Claims

1. Verbindung der Formel I

wobei:

R¹ H&sub2;PO&sub3;, H&sub3;P&sub2;O&sub5;, H&sub4;P&sub3;O&sub7; oder die Salze davon oder H ist;

B eine natürlich vorkommende Nucleinsäurebase oder eine synthetisch modifizierte Nucleinsäurebase ist;

R² OR³, N&sub3;, Y-Biotinoyl oder NHC=O(CH&sub2;)nY-Biotinoyl ist, wobei:

R³ H, Alkyl, Aralkyl, Acyl oder Aroyl ist;

Y NH oder O ist;

n = 1-10 ist; und

A H oder OH ist.

2. Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei für R³ gilt:

die Alkylgruppe enthält 1 bis 5 Kohlenstoffatome;

die Aralkylgruppe ist Benzyl;

die Acylgruppe enthält 1 bis 5 Kohlenstoffatome; und

die Arylgruppe des Aroyls ist Benzol oder ein mit wenigstens einer Alkylgruppe (C&sub1;-C&sub4;), einem Halogenatom oder einer Methoxygruppe substituiertes Benzol.

3. Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei:

B eine natürlich vorkommende Nucleinsäurebase ist;

R² OH, N&sub3; oder Y-Biotinoyl ist; und

A H ist.

4. Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei:

R¹ H&sub4;P&sub3;O&sub7; ist;

B Thymin ist;

R² OH, N&sub3; oder Y-Biotinoyl ist; und

A H ist.

5. Nucleinsäurekette mit wenigstens zwei Nucleinsäurebasen, die eine oder mehrere der Verbindungen gemäß Anspruch 1 enthält.

6. Verfahren zur Synthese einer Nucleinsäurekette mit wenigstens zwei Nucleinsäurebasen, umfassend das Kombinieren einer oder mehrerer der Verbindungen gemäß Anspruch 1 mit einer oder mehreren diskreten, natürlich vorkommenden oder synthetisch modifizierten Nucleinsäurebasen.

7. Verfahren zum Abbruch von DNA-Polymerase-Kettenreaktionen, umfassend:

Hinzufügen einer oder mehrerer der Verbindungen der Formel I:

wobei:

R¹ H&sub4;P&sub3;O&sub7; oder ein Salz davon ist;

R² OR³, N&sub3;, Y-Biotinoyl oder NHC=O(CH&sub2;)nY-Biotinoyl ist,

wobei:

R³ H, Alkyl, Aralkyl, Acyl oder Aroyl ist;

Y NH oder O ist;

n 1-10 ist; und

A H ist,

zu einem DNA-Polymerase-Kettenverlängerungsreaktionsgemisch.

8. Verfahren gemäß Anspruch 71 wobei für R³ gilt:

die Alkylgruppe enthält 1 bis 5 Kohlenstoffatome;

die Aralkylgruppe ist Benzyl;

die Acylgruppe enthält 1 bis 5 Kohlenstoffatome; und

9. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei R² NH-Biotinoyl ist.

10. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die DNA-Polymerase Taq-Polymerase ist.

11. Verfahren zur Fortpflanzung von DNA-Polymerase-Kettenverlängerungsreaktionen, umfassend:

Zugabe einer oder mehrerer der Verbindungen der Formel I

wobei:

R¹ H&sub4;P&sub3;O&sub7; oder ein Salz davon ist;

R² OR³, N&sub3;, Y-Biotinoyl oder NHC=O(CH&sub2;)nY-Biotinoyl ist,

wobei:

R³ H, Alkyl, Aralkyl, Acyl oder Aroyl ist;

Y NH oder O ist;

n 1-10 ist; und

A OH ist,

zu einem DNA-Polymerase-Kettenverlängerungsreaktionsgemisch.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei für R³ gilt:

die Alkylgruppe enthält 1 bis 5 Kohlenstoffatome;

die Aralkylgruppe ist Benzyl;

die Acylgruppe enthält 1 bis 5 Kohlenstoffatome; und