DE69231967T2

DE69231967T2 - Vorbereitung eines knochens für eine transplantation

Info

Publication number: DE69231967T2
Application number: DE69231967T
Authority: DE
Inventors: Brenda Morse; Edward Shanbrom
Original assignee: Osteotech Inc
Current assignee: Osteotech Inc
Priority date: 1991-12-31
Filing date: 1992-12-22
Publication date: 2002-04-04
Anticipated expiration: 2012-12-23
Also published as: NO942449L; EP0619722A4; WO1993012731A1; KR940703635A; NO942449D0; CA2126866A1; BR9207002A; AU3330693A; ES2162811T3; ATE203419T1; MX9207627A; CA2126866C; EP0619722B1; EP0619722A1; HK1011605A1; DE69231967D1; JPH07502442A; US5333626A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufbereitung von Knochen für eine mögliche Transplantation. Das Verfahren der Erfindung stellt eine einfache, sichere und wirksame Art und Weise dar, einen reinen, dekontaminierten Knochen für die Transplantation herzustellen. Insbesondere stellt die Erfindung ein wirksames Verfahren zur Reinigung von Knochen bereit, umfassend das Inkontaktbringen des Knochens mit einem Detergens unter Hochdruckwaschbedingungen und erhöhten Temperaturen. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Erfindung das Inkontaktbringen des Knochens mit einem globalen Dekontaminierungsmittel, das wirksam ist, um eine Vielzahl von infektiösen Agentien, umfassend Bakterien, Viren, Pilze und Parasiten, zu inaktivieren; das Reinigen des Knochens; und das abschliessende Dekontaminieren des Knochens mit einem globalen Dekontaminierungsmittel, dass wirksam ist, um eine Vielzahl von infektiösen Agentien, umfassend Bakterien, Viren, Pilze und Parasiten, zu inaktivieren.

Hintergrund der Erfindung

Die Beschaffung und Aufbereitung von humanem Knochen zur Transplantation hat sich seit den 1950ern nicht wesentlich verändert. Sie verbleibt eine komplizierte Aufgabe, welche koordinierte Anstrengungen von mehreren Gruppen, umfassend die Spender-Familie, das Krankenhauspersonal, die örtliche Beschaffungsgruppe, das Blutprobenuntersuchungslabor, das Knochenaufbereitungslabor, den Transplantationspatienten und das Transplantationsteam, benötigt.
Ein Hauptanliegen stellt die Risikominimierung des Übertragens von potentiell gefährlichen Krankheiten auf Gewebeempfänger dar. Es ist heutzutage bekannt, dass Viren und Bakterien sowohl über den Knochen als auch über das Knochenmark übertragen werden können. Siehe Kakaiya et al., "Tissue transplant-transmitted infections", Transfusion 31 (3), 1277-284, 1991; Shutkin, "Homologous-serum hepatitis following use of refrigerated bone-bank bones, report of a case", J. Bone Joint Surg. 36-A160, 1954. Über die Übertragung von humanem Immundefekt-Virus (HIV) über den Knochen als auch über das Knochenmark wurde ebenfalls berichtet. "Transmission of HIV through bone transplantation, case report and public health recommendations", Novbid. Mortal Weekly Rep. 37: 597-599, 1988. Furlini et al., "Antibody response to human immunodeficiency virus after infected bone marrow transplant", Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 7 (5), 554-665, 1988. Desweiteren wurde HIV sowohl aus frischem als auch aus tiefgekühltem und gefriergetrocknetem Knochen kultiviert. Buck et al., "Human immunodeficiency virus cultured from bone. Implications for transplantation.", Clin. Ortho. 251: 249-253, 1990. Der Schutz des knochenaufbereitenden Laboranten stellt einen anderen Gesichtspunkt dar, der in den letzten Jahren aufgrund der Möglichkeit von HIV- und Hepatitis B-Übertragungen wichtiger wurde.
Um diese Risiken zu minimieren, wurden die gegenwärtigen Knochenbeschaffungs- und Aufbereitungsverfahren entwickelt. Üblicherweise prüft das Krankenhaus und eine örtliche Beschaffungsstelle zuerst die Krankenhausdokumente hinsichtlich der potentiellen Serologie und des Erkrankungsstatus des Spenders, um zu bestimmen, ob der Spender die zulässigen medizinischen Kriterien erfüllt. Wenn alles in Ordnung ist und die benötigten Einwilligungen erhalten wurden, beginnen Techniker von der örtlichen Beschaffungsstelle innerhalb Stunden nach dem Tod des Spenders mit dem Sammeln von Blutproben und dem Entfernen von bestimmten Organen, Geweben und Knochen. Während dem Beschaffungsablauf, können die Knochen in einen antibiotischen Cocktail (üblicherweise eine Bacitracin/Polymixin-Lösung) eingetaucht werden. Üblicherweise werden die Knochen dann auf Eis gekühlt oder eingefroren und an ein Aufbereitungslabor verschickt.
Am Aufbereitungslabor können die Blutproben auf eine Vielzahl von bekannten infektiösen Agenzien hin analysiert werden, umfassend:
Humanes Immundefekt-Virus (HIV-1)
Humanes Immundefekt-Virus (HIV-2)
Humanes T-Zefl Iymphotropes Virus (HTLV-1)
Hepatitis B
Hepatitis C
Cytomegalus-Virus (CMV)
Treponema pallidum (Syphilis)
Üblicherweise fahren die Techniker damit fort, den Knochen aufzutauen und die Stücke in einen antibiotischen Cocktail zu überführen. Sie säubern dann die Knochen mit sterilem Wasser, Nach dem Entfernen von externem Fett und Gewebe mit sterilem Wasser können die Knochen in bestimmte Grössen geschnitten werden. Die Techniker entfernen unter Verwendung von sterilem Wasser, zu dem Wasserstoffperoxid zugegeben werden kann, das Knochenmark, um den Knochen weiter von Fett zu befreien und weiss zu machen. Schlussendlich kann der Knochen, wenn erwünscht, für wenigstens eine Stunde in Ethanol inkubiert werden. Ausgewählte Knochenstücke werden auf eine solche Art und Weise verpackt, dass die Sterilität und das biologische Potential erhalten bleiben. Eine gebräuchliche und praktische Methode der Aufbereitungslabore ist es, den Knochen bis zur Trockenheit zu Iyophilisieren, hinsichtlich der Grösse zu zerkleinern und die ausgewählten Knochenstücke zu verpacken. Andere Methoden umfassen die Kryokonservierung und das Frischfrieren. Um die Sterilität am Ende des Verfahrens sicherzustellen, werden Proben der Packungen hinsichtlich Mikroorganismen kultiviert.
Die gegenwärtig angewendete Kombination aus Screenen von Spendern und antibiotischen Behandlungen während der Aufbereitung verringert das Übertragungsrisiko von bekannten viralen kontaminierenden Substanzen und einer Vielzahl von Bakterien. Die gegenwärtigen Verfahren bieten jedoch keinen vorbeugenden Schutz gegen Viren, ausgewählte Bakterien und Pilze, die eine häufige Flora im Menschen und in einer Krankenhausumgebung darstellen. Erstens sind die Screeningtests nicht absolut sicher. Obwohl die Empfindlichkeit und Spezifität der Screeningtests hoch ist, können falschnegative Ergebnisse beispielsweise auf geringe Antikörper- oder Antigenkonzentrationen (z. B. aufgrund einer kürzliche Infektion oder eines Immundefekt) oder sogar einen Fehler des Technikers zurückzuführen sein. Desweiteren können die Screeningtests nur für einen Nachweis von bekannten infektiösen Agenzien geeignet sein. Zweitens töten die zur Zeit verwendeten antibiotischen Cocktails nicht sofort alle Arten von Bakterien ab. Die herkömmlich verwendete Polymixin/Bacitracin-Lösung vermag beispielsweise Proteus-Species nicht zu inaktivieren. Desweiteren üben die antibiotischen Cocktails keinen signifikanten Effekt auf Viren oder Pilze aus.
Während die Reinheit des Knochens als ein wichtiger Faktor bei der Vermeidung von Transplantat-vermittelten Infektionen und der Antigenizität angesehen wird, ist es schwierig, die Knochenstücke mittels der herkömmlichen Methoden wirksam zu reinigen. Zellen und Gewebereste beherbergen infektiöse Agenzien und können eine antigene Antwort auslösen.
Andere bekannte Verfahren zur Reinigung oder Sterilisierung von Knochen sind in GB-A-0964545, GB-A-2175507 und EP-A-0141004 beschrieben. GB-A- 0964545 beschreibt die Aufbereitung von Knochen unter Verwendung von β- Propiolacton zur Sterilisierung, gefolgt vom Inkontaktbringen mit organischen Lösungsmitteln, um Fett aus der Gewebestruktur zu lösen. GB-A-2175507 beschreibt ein Verfahren zur Aufbereitung von Knochen, um kontaminierende Substanzen auf der Oberfläche zu entfernen, gefolgt von einer Sterilisation mit Glutaraldehyd und gegebenenfalls einer weiteren Behandlung mit Ethanol oder einer bakteriziden Lösung. EP-A-0141004 beschreibt die Verwendung von Polyvinylpyrrolidoniod und Wasserstoffperoxid zur Reinigung und Sterilisation des Knochens vor der Transplantation.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Aufbereitung von Knochen zur Transplantation bereit, das einen vorbeugenden Schutz vor einer Vielzahl von infektiösen Agenzien bietet, die durch die gegenwärtigen Methoden nicht leicht inaktiviert oder gescreent werden können. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung nicht nur ein einfaches Verfahren zur Dekontaminierung von Knochen von einer Vielzahl von infektiösen Agenzien, sondern auch zur wirksamen Reinigung des Knochens bereit, um jegliche Zellen oder Gewebereste, die solche infektiöse Agenzien beherbergen können, zu eliminieren.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Reinigung und Dekontaminierung von humanen Knochen für die Transplantation bereit, das für den Laboranten sicher ist.
Diese und andere Gegenstände, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden nach der Durchsicht der folgenden detaillierten Beschreibung der offenbarten Ausführungsformen und den angehängten Ansprüchen klarer werden.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäss der Erfindung wird ein Verfahren zur Reinigung von Knochen bereitgestellt, welches das Inkontaktbringen der Innenmatrix des Knochens mit einer Detergenslösung unter Hochdruckwaschbedingungen umfasst, wobei der Hochdruck eine Kraft bereitstellt, die ausreichend ist, um die Detergenslösung in die Innenmatrix des Knochens einzubringen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Knochen vor und nach dem Hochdruckwaschen mit Detergenslösung mit einem globalen Dekontaminierungsmittel in Kontakt gebracht, das wirksam ist, Bakterien, Pilze, Viren und Parasiten zu inaktivieren.
Zur Veranschaulichung der Erfindung wird auf Fig. 1 Bezug genommen, die eine Fotographie darstellt, welche Femurköpfe, die wie in Beispiel 5 beschrieben gereinigt wurden, vergleicht. Der Femurkopf auf der linken Seite wurde mittels Standardmethoden gereinigt, während derjenige auf der rechten Seite gemäss der Detergensreinigungsmethode mit hohem Drucker/höhter Temperatur gereinigt wurde. Die Femurköpfe wurden gespalten, um die Gründlichkeit des erfindungsgemässen Verfahrens aufzuzeigen.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Zum Zweck dieser Offenbarung wird der Ausdruck "Knochen" in der allgemeinsten Bedeutung verwendet und umfasst alle Arten von humanen oder tierischen Knochengeweben, umfassend ganze Knochen, Knochenstücke, Knochenblöcke mit daran gebundenem Bindegewebe, wie Bänder und Sehnen, sowie zermahlene Knochenpräparate und zermahlene demineralisierte Knochenpräparate.
Eine anfängliche oder primäre Dekontaminierung kann erreicht werden durch Inkontaktbringen des Knochens mit einem globalen Dekontaminierungsmittel, das wirksam ist, Bakterien, Viren, Pilze und Parasiten zu inaktivieren.
Die Kontaktzeit sollte ausreichend sein, um infektiöse Agenzien wirksam zu inaktivieren. Der Knochen wird vorzugsweise für wenigstens 2 oder mehr Minuten, vorzugsweise 10 oder mehr Minuten und am meisten bevorzugt wenigstens eine oder mehrere Stunden, in die globale Dekontaminierungslösung eingelegt. Während diesem primären Dekontaminierungseintauchen, kann der Knochen zur Entfernung von dickem äusserem Gewebe und Fett aus der Lösung entnommen werden und dann zum weiteren Einlegen in die Lösung zurückgegeben werden.
Das globale Dekontaminierungsmittel sollte wirksam sein, um Bakterien, Viren, Pilze und Parasiten zu inaktivieren. Bevorzugte Dekontaminierungsmittel stellen die Iodophore dar. Geeignete lodophore sind Polyvinylpyrrolidoniod- (PVP-I- oder Povidoniod-) präparate, die kommerziell von Purdue-Frederick Company, ISP, ehemals GAF und BASF erhältlich sind. Bevorzugte PVP-I-Präparationen sind diejenigen mit einem Molekulargewicht von weniger als 20000, wie PVP- lod 17/12 von BASF. Von diesen sind diejenigen PVP-I-Präparationen am meisten bevorzugt, die Molekulargewichte von weniger als 10000 aufweisen. Geeignete lodophorlösungen können alternativ hergestellt werden durch das Zusammenmischen einer Lösung des Komplexierungsmittels (Polyvinylpyrrolidon im Fall von PVP-I) des gewünschten Molekulargewichtes und molekularem lod in Mengen, die ausreichen, um die erwünschte verfügbare Iodkonzentration zu ergeben. Eine verfügbare lodkonzentration von etwa 1 Gew.-% kann beispielsweise erhalten werden durch das Auflösen von 100 g PVP in Wasser, anschliessende Zugabe von 10 g lod unter Rühren und schliesslich der Zugabe von ausreichend Wasser, um das Gesamtvolumen auf einen Liter zu bringen. Andere Verhältnisse von PVP zu bd können verwendet werden, um eine PVP-I-Lösung zu erhalten, die das gewünschte verfügbare lod aufweist. Geeignete verfügbare bodkonzentrationen betragen 0,03 bis 1 Gew.- %, vorzugsweise 0,1 Gew.-% bis 0,5 Gew.-% bod, bezogen auf das Gewicht der Lösung.
Andere Dekontaminierungsmittel die bekannt sind, um eine Vielzahl von infektiösen Agenzien, umfassend Bakterien, Pilze, Parasiten und Viren, zu inaktivieren, sind Wasserstoffperoxid, Ethanol, Ozon, Ethylenoxid, Strahlung und Mischungen daraus und mit PVP-I.
Die globale Dekontaminierungsmittellösung sollte eine Konzentration aufweisen, die ausreichend ist, um wirksam Bakterien, Viren, Pilze und Parasiten zu inaktivieren. Die Iodophorkonzentration der primären Dekontaminierungslösung liegt vorzugsweise im Bereich von 0,5 bis 10 Gew.- % und am meisten bevorzugt im Bereich von 1 bis 5 Gew.-%, wobei die verfügbare lodkonzentration 0,05 bis 1 Gew.-%, vorzugsweise 0,1 bis 0,5 Gew.-%, beträgt. Die PVP-I-Konzentration liegt vorzugsweise im Bereich von 0,5 bis 10 Gew.-% und am meisten bevorzugt 1 bis 5 Gew.-% PVP-I, mit einer verfügbaren lodkonzentration von 0,05 bis 1 Gew.-%, vorzugsweise 0,1 bis 0,5 Gew.-%.
Die primäre Dekontaminierungslösung kann ein Detergens, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,1 bis 5% der Lösung und am meisten bevorzugt 1 bis 3 Gew.-% oder Vol.-%, umfassen. Anionische, kationische, amphotere und nicht-ionische Detergentien sind geeignet. Bevorzugte Detergentien sind nichtionische Detergentien, wie Polyethoxyethylenether (beispielsweise diejenigen, die unter dem Warenzeichen Triton von Rhom & Haas durch Union Carbide vertrieben werden) oder Polyoxyethylensorbitanfettsäureester (Tween-Serie, die unter anderen von ICI und Sigma vertrieben wird). Das am meisten bevorzugte Detergens ist Octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100TM, Rhom & Haas). Von den Polyoxyethylensorbitanen, ist Polyoxyethylen (20) sorbitanmonooleat (Tween 80) am meisten bevorzugt.
Am vorteilhaftesten wird die primäre Dekontaminierung durch Einlegen des Knochens für wenigstens 2 oder mehr Minuten, vorzugsweise für 10 oder mehr Minuten und am meisten bevorzugt für wenigstens eine oder mehrere Stunden, in 0,1 bis 5% PVP-I, 1% (pro Volumen) Triton X-100TM-Lösung durchgeführt.
Wie Beispiel 1 zeigt, ist der primäre Dekontaminierungsschritt der Erfindung wirksamer als der antibiotische Cocktail des Standes der Technik. PVP-I stellt aufgrund seiner schnellen Wirkung, dem breiten Spektrum von infektiösen Agenzien, die es inaktivieren kann (sowohl Viren als auch Bakterien, Pilze und Parasiten) und seiner verhältnismässig geringen Toxizität gegenüber humanem Gewebe das bevorzugte Dekontaminierungsmittel dar. Desweiteren wurde gezeigt, dass PVP-I HIV inaktivieren kann. Der vorläufige Dekontaminierungsschritt schützt durch die wesentliche Verringerung des Infektionsrisikos durch den Knochen nicht nur den Knochenempfänger, sondern schützt auch die Laboranten. Die primäre Dekontaminierungslösung, die entweder PVP-I oder PVP-I und Detergens enthält, bewirkt desweiteren, dass der Knochen durch das anfängliche Ablösen und Weichmachen von Weichteilen, Lipiden und Blutprodukten leichter zu reinigen ist.
Das Reinigen nach der primären Dekontaminierung gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren wird durch das lnkontaktbringen des Knochens mit einem Detergens in einer solchen Art und Weise durchgeführt, um Fett, Knochenmark und andere Gewebereste zu entfernen. Das Detergens lysiert Zellen (z. B. Blutzellen), löst Fett und solubilisiert Proteine, die im Knochenmark enthalten sind. Das Reinigungsverfahren kann Schütteln und/oder erhöhte Temperaturen einschliessen. Das Schütteln kann durch eine Drehschüttelvorrichtung erreicht werden, heftiges Schütteln ist jedoch am meisten bevorzugt. Solche Waschverfahren erzeugen Knochen, die vernachlässigbare Mengen an Knochenmark, Zellen, Fett und Gewebereste aufweisen und können so durch das Entfernen von Zellen, die infektiöse Agenzien beherbergen können, einen zusätzlichen Sicherheitsspielraum für den Transplantatempfänger schaffen.
Geeignete, bevorzugte und am meisten bevorzugte Detergentien sind dieselben, wie die oben für den primären Dekontaminierungsschritt beschriebenen. Die Detergenskonzentration beträgt ungefähr 0,1% bis 5%, vorzugsweise ungefähr 1 bis 3 Gew.-% oder Vol.-%. Vorzugsweise wird der Iodophor in einer Konzentration von 0,1 bis 10% zu der Detergenslösung gegeben. Der am meisten bevorzugte lodophor ist Polyvinylpyrrolidoniod. Am vorteilhaftesten wird der Knochen mit einer Detergenslösung unter Hochdruckwaschbedingungen bei erhöhten Temperaturen gereinigt.
Hochdruckwaschbedingungen sollten eine Kraft bereitstellen, die ausreichend ist, um die Reinigungslösung in die Innenmatrix des Knochens einzubringen. Solche Hochdruckwaschbedingungen schliessen beispielsweise heftiges Schütteln, wie mit einer Schüttelvorrichtung für Farbdosen oder Hochdruckwaschen, wie mit einem Hochdruckflüssigkeitsstrahl, ein. Geeignete Schüttelvorrichtungen für Farbdosen stellen diejenigen dar, die durch Red Devil hergestellt werden, vorzugsweise das bei 615 rpm und 190 W (0,25 PS) betriebene Modell #0-5400-OM. Der Druck des Flüssigkeitsstrahls beträgt vorzugsweise 690 bis 21000 kPa (100 bis 3000 psi) und am meisten bevorzugt 3450 bis 10500 kPa (500 bis 1500 psi). Am meisten bevorzugt ist der Flüssigkeitsstrahl steril und enthält ein Detergens. Das Reinigen wird deutlich beschleunigt und ist gründlicher, wenn dieses bei Temperaturen im Bereich von 0ºC bis 80ºC, vorzugsweise 37ºC bis 80ºC, am meisten bevorzugt 37ºC bis 60ºC, ausgeführt wird. Das Hochdruckwaschen löst Knochenmark wirksam ab und entfernt nach und nach Gewebereste innerhalb der schwammartigen Matrix des Knochens. Nach diesem Hochdruckwaschverfahren ist der Knochen auffallend reiner und weisser als ein Knochen, der mittels Standardmethoden aufbereitet wurde (siehe Fig. 1).
Um das Reinigen zu beschleunigen, kann die Lösung während dem Reinigungsvorgang gewechselt werden, beispielsweise durch das Überführen des Knochens in eine frische Lösung. Die Lösung wird vorzugsweise wenigstens zweimal gewechselt. Nach dem Reinigen kann das Detergens durch wiederholtes Waschen mit sterilem Wasser abschliessend entfernt werden. Ein biologisch verträglicher Alkohol, wie Ethanol, kann auch verwendet werden, um das Detergens zu entfernen. Wenn ein Alkohol verwendet wird, muss dieser durch Abspülen mit sterilem Wasser entfernt werden.
Wenn Knochenblöcke mit daran gebundenem Bindegewebe zu reinigen sind, sollte das Bindegewebe - beispielsweise Sehnen, Bänder, Menisken - während dem Reinigungsverfahren mit einer sterilen Abdeckung, wie einer Plastikhülle oder einem sterilen Tuch, bedeckt sein.
Der Knochen kann durch Aussetzen gegenüber Wasserstoffperoxid, das auch bakterizide Eigenschaften aufweist, weiter gereinigt und dekontaminiert werden. Nach dem Waschen mit Detergens wird der Knochen für eine Zeitspanne, die ausreichend ist, um ein zusätzliches Bleichen und Entfernen von Fettspuren zu ermöglichen, in eine 0,5 bis 10%, vorzugsweise 3%, Wasserstoffperoxidlösung überführt. Es kann geschüttelt werden. Die Inkubationsdauer beträgt geeigneterweise 5 bis 120 Minuten, vorzugsweise 5 bis 60 Minuten und am meisten bevorzugt 15 bis 30 Minuten. Nach der Behandlung wird überschüssiges Wasserstoffperoxid durch ausgiebiges Waschen mit sterilem Wasser entfernt.
Nach dem Reinigen kann der Knochen vor dem Verpacken abschliessend dekontaminiert werden. Diese Enddekontaminierung wird erreicht durch das lnkontaktbringen des Knochens mit einem globalen Dekontaminierungsmittel für wenigstens etwa 2 oder mehr Minuten, vorzugsweise wenigstens etwa 10 oder mehr Minuten und am meisten bevorzugt 30 bis 60 oder mehr Minuten. Geeignete, bevorzugte und am meisten bevorzugte globale Dekontaminierungsmittel und Konzentrationen entsprechen denen der oben beschriebenen Anfangsdekontaminierung.
Wenn Knorpel- oder Bindegewebe vorliegen, enthalten die Dekontaminierungs- und Reinigungslösungen vorzugsweise Natriumchlorid oder ein anderes biologisch verträgliches Salz in einer Menge, die ausreichend ist, um zu verhindern, dass PVP-I sich im Knorpel- oder Bindegewebe ansammelt. Vorzugsweise wird 0,01 bis 0,75 M NaCl und am meisten bevorzugt 0,15 M NaCl verwendet.
Das für die Enddekontaminierung verwendete globale Dekontaminierung kann durch Waschen mit sterilem Wasser aus dem Knochen entfernt werden oder als dünne Schicht belassen werden, um den Knochen weiter vor infektiösen Agenzien zu schützen. Der so beschichtete Knochen kann lyophilisiert werden.
Es ist am meisten bevorzugt, dass sich eine PVP-I-Schicht bildet. Eine an den Knochen adhärierende PVP-I-Lösung verleiht diesem eine satte goldgelbe Farbe, die als Indikator, das der Knochen behandelt wurde, dienen kann. Wenn erwünscht, kann der gelbe Knochen direkt lyophilisiert, verpackt und bei Raumtemperatur, vorzugsweise in Bernsteingefässen, gelagert werden. Während dem Stand der Technik mehrere Methoden für das Lyophilisieren von Gewebe bekannt sind, umfasst ein Verfahren, das sich als geeignet für das Lyophilisieren von Knochen herausgestellt hat das Gefriertrocknen für etwa 10 bis 168 Stunden, vorzugsweise etwa 20 bis 28 Stunden. Überschüssiges PVP- I auf den Iyophilisierten Knochen verleiht einen fortwährenden Schutz bis es durch Waschen oder durch Körperflüssigkeiten nach der Implantation entfernt wird. Ebenso kann der Knochen auch mit anderen geeigneten globalen Dekontaminierungsmitteln, PVP oder Mischungen daraus beschichtet sein.
Alternativ kann das überschüssige globale Dekontaminierungsmittel durch Abspülen mit sterilem Wasser entfernt oder durch eine chemische Reaktion inaktiviert werden. Die ursprüngliche nicht-weisse Farbe des Knochens kann somit wiederhergestellt werden. Iodophore können durch Zugabe eines Reduktionsmittels, wie Natriumascorbat oder Thiosulfat, zu der Einleglösung chemisch inaktiviert werden, nachdem die benötigte Einlegzeitspanne verstrichen war. Die Reduktionslösung sollte von einer Molarität und einer Menge sein, die ausreichen, um das verbleibende molekulare lod zu inaktivieren. Beispielsweise sollten 50 bis 100 Mikroliter einer 1 M Natriumascorbatlösung ausreichend sein, um 10 ml 1% PVP-I zu inaktivieren. Diese Behandlung wandelt die Lösung von dunkelbraun nach farblos um und verleiht dem Knochen wieder seine natürliche Farbe.
Nach dem Enddekontaminierungsschritt kann der Knochen zur Lagerung lyophilisiert oder kryokonserviert oder frisch eingefroren werden.
Es sollte dem Fachmann bewusst sein, dass der auf die hierin offenbarte Art und Weise aufbereitete Knochen für alle therapeutischen Verwendungen geeignet ist, für die Knochen benötigt werden, beispielsweise für Knochentransplantate, Kiefer- und Gesichtschirurgie und Zahnchirurgie.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung und detaillierteren Beschreibung der Erfindung, sind jedoch nicht als die Erfindung limitierend aufzufassen.

Beispiel 1

Schritt 1: Primäre Dekontaminierung

Ein humaner Knochen wurde beschafft, kultiviert und es hat sich gezeigt, dass dieser mit einer Vielzahl von Bakterien und Pilzen, umfassend:
Staphylococcus-Species (Coagulase negativ)
Enterococcus-Species
Candida albicans
Acinetobacter anitratus
Klebstella pneumoniae
kontaminiert war.
Das Darmbein wurde in eine Lösung von 5% PVP-I (Polyvinylpyrrolidoniod, C15-Komplex von GAF) eingelegt. Das dicke äussere Gewebe und Fett wurden entfernt, der Knochen für eine Gesamtzeit von einer (1) Stunde wieder in 5% PVP-I überführt und der Knochen auf Restkontaminierung (bei fünf Wiederholungsversuchen) untersucht. Die folgende Tabelle zeigt einen Vergleich der vorliegenden Methode mit Inkubationen in Salzlösung, der positiven Kontrolle und mit dem Bacitracin/Polymixin-Cocktail.

Gesamtanzahl

Lösung Mikroorganismen/Knochen

Vor der Aufbereitung 8700
Nach der Aufbereitung
Salzlösung 1 1000
Antibiotischer Cocktail 4300
5% PVP-I 330
Die Ergebnisse zeigen, dass 5% PVP-I bezüglich der Verringerung der Anzahl von infektiösen Organismen besser ist als die antibiotische Behandlung.

Schritt 2: Reinigung

Der Knochen wurde in ein Schneckengefässoberteil (screw top jar) überführt, das 1% (pro Volumen) Octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100TM bei 37 ºC) enthielt und wurde in einer Schüttelvorrichtung für Farbdosen (Modell Nr. 0-5400-OM, hergestellt durch Red Devil) für 10 Minuten heftig geschüttelt. Nach Überführen des Knochens in eine saubere Lösung von warmem 1% Triton X-100TM, wurde der Knochen über Nacht inkubiert (etwa 15 bis 18 Stunden bei 37-42ºC) und für 10 Minuten heftig geschüttelt. Der Knochen wurde in frisches 1% Triton X-100TM überführt und wieder heftig für 10 Minuten geschüttelt. Jegliches verbleibendes Knochenmark wurde durch Waschen mit sterilem Wasser entfernt.
Als nächstes wurde der Knochen in 3% Wasserstoffperoxid überführt, für 10 Minuten geschüttelt und für eine Gesamtdauer von 60 Minuten inkubiert.
Der gereinigte Knochen wurde gründlich mit sterilem Wasser gewaschen durch Spülen und wiederholtes Abspülen bis keine Spuren von Detergensschaum auftraten.

Schritt 3: Enddekontaminierung

Der gereinigte Knochen wurde in 1% PVP-I bei Raumtemperatur gegeben, für 10 Minuten heftig geschüttelt und für eine Gesamtdauer von 30 Minuten inkubiert und aus der Lösung entnommen.

Schritt 4: Lagerung

Wenn gewünscht, kann man das PVP-I am Knochen trocknen lassen, was dem Knochen eine satte goldgelbe Farbe und einen zusätzlichen Schutz gegenüber infektiösen Agenzien verleiht. Der beschichtete Knochen kann dann lyophilisiert werden. Ebenso kann der Knochen, wenn erwünscht, durch das Trocknen von PVP auf dem Knochen mit PVP beschichtet werden.

Beispiel 2

Schritt 1. Primäre Dekontaminierung

Ein humanes Knie als Ganzes wird durch die örtliche Beschaffungsstelle entnommen, verpackt und auf nassem Eis an ein Knochenaufbereitungslabor verschickt.
Im Knochenaufbereitungslabor wird das Knie für 10 bis 60 Minuten in 1-5% PVP-I, 0,15 M Natriumchlorid gegeben.

Schritt 2. Gewebepräparation und Reinigun

Die folgenden Kniegewebe mit angrenzenden Knochenblöcken wurden entfernt:
- Patella-Sehne
- Posteriores Kreuzband
- Anteriores Kreuzband
- Menisken
Die Stücke wurden geputzt, um überschüssiges Gewebe und Fett zu entfernen. Während die Knochenblöcke durch Spülen mit warmem (40-65ºC) 1% Triton Xi-100TM, gefolgt von gründlichem Abspülen mit sterilem Wasser, gereinigt werden, wird das Band oder die Sehne in eine sterile Hülle (z. B. eine Plastikhülle oder sterile Tücher) eingeschlagen.

Schritt 3. Endsterilisation

Die Gewebe werden in 1% PVP-I, 0,15 M Natriumchlorid eingelegt, bei Raumtemperatur für 1 Stunde leicht geschüttelt und gründlich mit sterilem Wasser abgespült. Jedes Stück wird kryokonserviert, verpackt und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.

Beispiel 3

Schritt 1. Primäre Dekontaminierung

Humane diaphysäre Knochen wurden durch die örtliche Beschaffungsstelle entnommen, verpackt und auf nassem Eis an ein Knochenaufbereitungslabor verschickt.
Im Knochenaufbereitungslabor wurden die Knochen für 10 bis 60 Minuten in 5% PVP-I, 1% Triton X-100TM gegeben.

Schritt 2. Gewebepräparation und Reinigung

Die Knochen wurden gereinigt, um überschüssiges Gewebe und Fett zu entfernen und in 1% PVP-I, 1% Triton X-100TM gegeben. Als nächstes wurden die Knochen durch Spülen und Inkubieren in warmem (40-65ºC) 1% Triton X-100TM, gefolgt von gründlichem Abspülen mit sterilem Wasser, weiter gereinigt.
Die Knochen wurden in einer Knochenmühle zu Splitter zerkleinert, mit sterilem Wasser gespült und lyophilisiert. Die Splitter wurden in einer Tekmar-Mühle zu einer feineren Grösse zermahlen.

Schritt 3. Demineralisation

Das Knochenpulver wurde mit kalter 0,6 N Salzsäure demineralisiert und mit sterilem Wasser gespült.

Schritt 4. Endsterilisation

Das entmineralisierte Pulver wurde für 1 Stunde in 1% PVP-I gegeben und gründlich mit sterilem Wasser gespült. Das Pulver wurde in Vials überführt, lyophilisiert, verpackt und bei Raumtemperatur aufbewahrt.

Beispiel 4

Endsterilisation mit Inaktivierung von PVP-I

Ein Knochen, der ähnlich dem Knochen aus Beispiel 1 behandelt wurde, wurde in 20 ml 1% PVP-I gegeben und für 1 Stunde inkubiert. Nach der Inkubation wurden 0,132 ml 0,91 Natriumascorbat zugegeben. Die Lösung wurde beinahe sofort klar und nach 10 Minuten erlangte der Knochen seine natürliche nicht- weisse Farbe wieder.

Beispiel 5

Dieses Beispiel vergleicht die Ergebnisse, die erhalten wurden durch das Detergensreinigungsverfahren bei hohem Druckerhöhter Temperatur mit denjenigen, die durch Standardverfahren erhalten wurden. Nach dem Reinigen wurden die Femurköpfe gespalten, um den Reinigungsgrad besser zeigen zu können.
Der rechts gezeigte Femurkopf wurde für 2 Tage bei 60ºC in 1% (pro Volumen) Tween 80 unter Verwendung einer Schüttelvorrichtung für Farbdosen (Modell Nr. 0-5400-OM, hergestellt durch Red Devil) mit periodischen 10-minütigen Schüttelbewegungen inkubiert. Der Femurkopf wurde dann mit warmem Wasser gewaschen, für 20 Minuten in 3% Wasserstoffperoxid inkubiert und nochmals mit warmem Wasser gewaschen, um das Wasserstoffperoxid zu entfernen.
Der links gezeigte Femurkopf wurde gemäss Standardmethoden gereinigt. Er wurde für 15 Minuten mit 60ºC warmem Wasser gewaschen; für 15-20 Minuten in 3% Wasserstoffperoxid inkubiert; nochmals mit 60ºC warmem Wasser gewaschen, um das Wasserstoffperoxid zu entfernen; in 70% Ethanol für 1 Stunde inkubiert; und nochmals mit 60ºC warmem Wasser gewaschen, um das Ethanol zu entfernen. Die Fig. 2 stellt eine Fotographie des so gereinigten Knochens dar.

Claims

1. Verfahren zur Reinigung von Knochen umfassend das Inkontaktbringen der Innenmatrix des Knochen mit einer Detergenslösung unter Hochdruckwaschbedingungen, wobei der Hochdruck eine Kraft bereitstellt, die ausreichend ist, um die Detergenslösung in die Innenmatrix des Knochens einzubringen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Hochdruckwaschbedingungen kräftiges Rühren bzw. Schütteln beinhalten.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Hochdruckwaschbedingungen das Inkontaktbringen des Knochens mit einem Hochdruckflüssigkeitsjetstrahl beinhalten.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Hochdruckflüssigkeitsjetstrahl 690 kPa bis 21000 kPa (100 bis 300 psi) besitzt.

5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Hochdruckflüssigkeitsjetstrahl 3450 kPa bis 10500 kPa (500 bis 1500 psi) besitzt.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Reinigung bei einer erhöhten Temperatur durchgeführt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Reinigung bei einer Temperatur zwischen 37ºC und 80ºC durchgeführt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Temperatur zwischen 37ºC und 60ºC beträgt.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Detergens ein nicht-ionisches Detergens ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das nicht-ionische Detergens Octylphenoxypolyethoxyethanol ist.

11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das nicht-ionische Detergens Polyoxyethylen(20)sorbitanmonooleat ist.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansrüche, wobei die Detergenslösung auch ein globales Dekontaminierungsmittel umfasst, das wirksam ist, Bakterien, Viren, Pilze und Parasiten zu inaktivieren.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das globale Dekontaminierungsmittel ein lodophor ist.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der lodophor Polyvinylpyrolidoniod ist.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Knochen zusätzlich mit Wasserstoffperoxid in Kontakt gebracht wird.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Knochen nach der Reinigung abschließend durch lnkontaktbringen desselben mit einem globalen Dekontaminierungsmittel, das wirksam ist, Bakterien, Viren, Pilze und Parasiten zu inaktivieren, dekontaminiert wird.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Knochen vor der Reinigung durch ein globales Dekontaminierungsmittel, das wirksam ist, Bakterien, Viren, Pilze und Parasiten zu inaktivieren, dekontaminiert wird.

18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, wobei das globale Dekontaminierungsmittel ein lodophor ist.

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei der lodophor nach der abschließenden Dekontamination durch Reaktion mit einem Reduktionsmittel inaktiviert wird.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Reduktionsmittel Ascorbinsäure oder ein Salz davon ist.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Salz der Ascorbinsäure Natriumascorbat ist.

22. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das globale Dekontaminierungsmittel, das für die abschließende Dekontamination verwendet wird, auf dem Knochen gelassen wird, um den Knochen zu beschichten.

23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei das globale Dekontaminierungsmittel ein lodophor ist.

24. Verfahren nach Anspruch 17 bis 22, wobei das globale Dekontaminierungsmittel Polyvinylpyrolidoniod, ist.

25. Knochen erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24.