DE69221498T2

DE69221498T2 - Herstellungsverfahren von nanokapseln mit auf vernetzten proteinen basierenden wänden; derart hergestellte nanokapseln und diese enthaltende kosmetika, pharmazeutika und lebensmittel

Info

Publication number: DE69221498T2
Application number: DE69221498T
Authority: DE
Inventors: Alain Huc; Eric Perrier
Original assignee: Coletica SA
Current assignee: BASF Beauty Care Solutions France SAS
Priority date: 1991-10-31
Filing date: 1992-10-27
Publication date: 1998-02-05
Anticipated expiration: 2012-10-28
Also published as: ATE156386T1; US6303150B1; FR2683159B1; EP0611326A1; ES2108272T3; CA2122260A1; JPH07504115A; FR2683159A1; DE69221498D1; EP0611326B1; WO1993008908A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im wesentlichen ein Verfahren zur Herstellung von Nanokapseln mit einer Wand auf der Basis von vernetztem Protein sowie so erhaltene Nanokapseln und diese enthaltende kosmetische, pharmazeutische oder alimentäre Zusammensetzungen.
Es ist bekannt, daß die Einkapselung aktiver Substanzen entweder zum Schutz des aktiven Bestandteus oder zur langsamen oder differenzierten Freisetzung des aktiven Bestandteils im Organismus sehr wichtig ist.
Es wurde vorgeschlagen, aktive Bestandteile in Liposomen einzukapseln, wobei die Liposomen eine galenische Form darstellen, die wegen ihrer sehr guten Affinität für Zellmembranen, ihrer guten Bioverträglichkeit und ihrer Submikron-Größe bevorzugt wird.
Diese Strukturen weisen jedoch zahlreiche Einschränkungen und sogar große Nachteile auf, die in den folgenden vier Punkten zusammengefaßt werden können.
- eine schlechte Einkapselungsausbeute: die Liposomen können verschiedenen Typen von Molekülen enthalten oder tragen: hydrophile, lipophile und amphiphile. Diese Einkapselungsausbeuten sind jedoch in allen Fällen sehr gering, was, gekoppelt mit dem Problem der Diffusion der aktiven Bestandteile, die Effizienz der Lipösomen weiter senkt und in den meisten Fällen ihre Verwendung in therapeutischen Anwendungen nicht ermöglicht;
- eine schlechte Reproduzierbarkeit von Liposomen-Zubereitungen, wenn industrielle Produktionen durchzuführen sind;
- eine Instabilität in vitro: sie kann sich auf unterschiedliche Weise manifestieren: chemische Instabilität von Lipiden, Instabilität der Größe von Liposomen, Instabilität ihrer Struktur, Bildung von Aggregaten, Aussalzen der eingekapselten aktiven Stoffe, etc.;
- eine Instabilität in vivo: der Einfluß biologischer Flüssigkeiten auf die Liposomen erhöht sehr häufig die Membranpermeabilitäten derselben. Gemäß dem verwendeten Verabreichungsweg können die Liposomen mit so verschiedenen biologischen Flüssigkeiten in Kontakt stehen wie Blut, Verdauungssäften, Interstitialflüssigkeiten, ..., und müssen daher zahlreichen Wechselwirkungen standhalten können. Außerdem führt der Kontakt mit der Mehrzahl biologischer Flüssigkeiten zu einer deutlichen Erhöhung der Membranpermeabilität der Liposomen. Durch unvollständige Fusion mit den Zellen, oder durch Kontakt mit Salzen, Enzymen - Lipasen, Phospholipasen, Acyltransferasen -, Plasma- Bestandteilen, Gallensalzen, Verdauungssäften, oder durch einfache pH-Variationen können die Liposomen nahezu umgehend ihre aktiven Stoffe in das Umgebungsmedium abgeben.
Es wurde auch vorgeschlagen, aktive Bestandteile in Teilchen oder Kapseln mit Abmessungen in der Größenordnung einiger Mikron einzukapseln. In der FR-2 642 329-A hat die Anmelderin beispielsweise die Herstellung von Mikrokapseln mit gemischten Wänden aus Atelokollagen und Glykosaminoglykanen zur Einkapselung des aktiven Bestandteils vorgeschlagen. Dieses Verfahren ist äußerst zufriedenstellend, es ermöglicht jedoch nicht die Herstellung von Kapseln mit Submikron-Abmessungen, d.h. Kapseln mit Nanometer-Abmessungen, die als Nanoteilchen bezeichnet werden.
Außerdem wurden insbesondere von Couvreur et al. in Febs. Letters (1977), 84, 323-326, Nanokapseln mit einer Wand aus Polyacrylamid und von denselben Autoren in J. Pharm. Pharmacol. (1979), 31, 331-332, Nanokapseln mit einer Wand aus Polymethylund Polyethylcyanoacrylat vorgeschlagen. Ebenso wurde in der EP-0 274 961-A vorgeschlagen, Kolloid-Systeme bildende Nanokapseln auf der Basis von Vinylchlorid-Vinylacetat-Copolymer, Polyisobutylcyanoacrylat, Poly-(d,1)-milchsäure herzustellen; Beestman et al. haben in der US-4 640 709-A durch Polykondensation die Herstellung von Sphären mit kleiner Größe vorgeschlagen, deren Membranen aus einem Polymer-Material, wie Polyharnstoff, Polyamid, Polysulfonamid, Polyester, Polycarbonat und Polyurethan, bestehen.
Aus dem Dokument "Journal of Controlled Release" 14 (1990), 111-113, sind auch ein Verfahren zur Herstellung von Albumin- Nanokapseln, das die Bildung einer Nanoemulsion und die thermische Vernetzung derselben bei einer Temperatur zwischen 80 und 160ºC umfaßt, sowie ein modifiziertes Verfahren, das eine chemische Vernetzung mit 2,3-Butandion umfaßt, bekannt.
Aus dem Dokument AU-84714/75 sind auch Nanoteilchen, die eine vernetzte Matrix von Makromolekülen natürlichen Ursprungs, insbesondere Proteinen, umfassen, sowie ihr Herstellungsverfahren bekannt.
Das beschriebene Herstellungsverfahren sieht jedoch das Lösen, in einem Lösungsmittel, des Makromoleküls, das anschließend mit einem Lösungsmittel unter Bedingungen zur Bildung von Teilchen behandelt wird, und anschließend die Behandlung der Teilchenmit einem Vernetzungsmittel (hardening agent) vor, siehe S.4 und 7. Die Vernetzungsmittel sind auf S. 10, letzter Absatz, genauer ausgeführt und bestehen aus Aldehyden, die zur Bildung instabiler Bindungen vom Imin-Typ führen, während im Fall der vorliegenden Erfindung die Vernetzung mit einem Säuredichlorid oder einem Säureanhydrid stattfindet.
Auch wenn mit diesen letzteren Dokumenten Kapseln mit Nanometer-Größe erhalten werden, liegt ein Hauptproblem in der Tatsache, daß diese Teilchen allgemein eine schlechte Bioverträglichkeit sowie einen schlechten Bioabbau in vitro und in vivo aufweisen, was zu einer Ablagerung einer hohen Konzentration von Teilchen in bestimmten Organen, einer Toxizität bestimmter Monomere oder bestimmter Neben-Polymerisationsprodukte oder bestimmter Neben-Abbauprodukte und zu einem schlechten Schutz der aktiven Bestandteile führen kann, wenn sie nur an der Oberfläche der Nanoteilchen absorbiert werden, wodurch ein unzureichender Retard-Effekt erhalten wird.
So hat die vorliegende Erfindung das Ziel, das neue technische Problem zu lösen, welches darin besteht, daß eine Lösung vorgesehen wird, die die Herstellung von Teilchen mit Nanometer- Abmessungen ermöglicht, die als Nanoteilchen bezeichnet werden, insbesondere in Form von Nanokapseln oder Nanosphären mit guter Bioverträglichkeit, einem guten Bioabbau in vivo, einem Fehlen von Toxizität oder einer seht geringen Toxizität sowie einem sehr guten Schutz der aktiven Bestandteile und einem signifikanten Retard-Effekt.
Die vorliegende Erfindunq hat auch das Ziel, das oben angegebene technische Problem auf einfache, kostengünstige und im industriellen Maßstab verwendbare Weise zu lösen.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht erstmals das Lösen dieser technischen Probleme auf einfache, kostengünstige, durchführbare, im industriellen Maßstab und auf dem kosmetischen, pharmazeutischen oder agroalimentären Gebiet verwendbare Weise, indem Teilchen oder Kapseln mit Submikron-Abmessungen erhalten werden, deren Größe weniger als 1 µm und insbesondere zwischen etwa 100 und 800 nm beträgt.
So sieht die vorliegende Erfindung gemäß einem ersten Aspekt Teilchen oder Kapseln mit Abmessungen von weniger als 1 µm vor, welche als Nanoteilchen oder Nanokapseln bezeichnet werden, mit einer Wand aus vernetzten Proteinen, dadurch gekennzeichnet,. daß sie durch eine Grenzflächen-Vernetzungsreaktion zwischen einem Protein und einem Vernetzungsmittel erhalten werden, das zumindest zwei Acylierungsgruppen umfaßt, die mit den acylierbaren reaktiven Gruppen des Proteins reagieren, wobei so das Nanoteilchen oder die Nanokapsel mit der Wand auf der Basis von vernetztem Protein erhalten wird.
Andere Charakteristika dieser Nanoteilchen oder Nanokapseln sind in den Unteransprüchen angegeben, die hier durch Bezugnahme gänzlich eingeschlossen sind.
Gemäß einem zweiten Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Teilchen oder Kapseln mit Abmessungen von weniger als 1 µm vor, die als Nanoteilchen oder Nanokapseln bezeichnet werden, mit einer Wand auf der Basis vernetzter Proteine, dadurch gekennzeichnet, daß es die Erzeugung einer Nanoemulsion umfaßt, umfassend eine wässerige Phase, die ein Protein enthält, und eine ölphase, die ein Grenzflächen-Vernetzungsmittel enthält, das zumindest zwei Acylierungsgruppen umfaßt, die mit den acylierbaren Gruppen des Proteins reagieren, wobei so Mikroteilchen oder Mikrokapseln gebildet werden, deren Wand auf durch das Vernetzungsmittel vernetzten Proteinen basiert.
Gemäß einer Ausführungsvariante wird ein Viskositätsmodifikator einer der beiden Phasen zugesetzt, um die Viskositätsdifferenz zwischen den vorliegenden flüssigen Phasen zu verringern, wobei die Nanoemulsion erhalten wird.
Andere Varianten gehen aus den Verfahrensunteransprüchen und der folgenden Beschreibung hervor.
Gemäß noch einer weiteren Ausführungsvariante ist dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß der Viskositätsmodifikator die Viskosität zumindest 4-fach und vorzugsweise 10-fach in bezug auf die Phase modifizieren kann, der er zugesetzt wird.
Gemäß noch einer weiteren Variante ist dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß im Fall der Bildung einer Wasser-in- Öl-Emulsion der Viskositätsmodifikator der Ölphase zugesetzt wird oder diese ersetzt, um die Viskosität zumindest 4-fach in bezug auf die Viskosität der klassisch verwendeten Ölphase zu erhöhen (FR-2 642 329-A).
Gemäß noch einer weiteren Variante ist dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß im Fall einer Öl-in-Wasser-Emulsion die Viskosität der wässerigen Phase entweder durch die Verminderung der Protein-Menge oder durch den Zusatz eines Viskositätsmodifikators zur wässerigen Phase (Viskositätsverflüssiger) zur Verringerung ihrer Viskosität, vorzugsweise zumindest um das 4-fache, in bezug auf die Viskosität der klassisch verwendeten wässerigen Phase verringert wird (FR-2 642 329-A).
Gemäß noch einer weiteren Variante ist dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß als Protein ein Protein mit einer Filmbildnerwirkung, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus tierischem Protein, wie Elastin, Keratin, Seide, Albumin, Milchproteinen, Proteinen mit einer Struktur wie Kollagen, insbesondere Kollagen ohne Telopeptid oder Atebkollagen oder Glykosaminoglykan; pflanzuchem Protein, wie Weizen-, Mais-, Hafer-, Mandeiprotein; und Protein, das aus einer marinen Umgebung stammt, insbesondere von Fischen oder Algen oder auch Plankton oder Mikroplankton, verwendet wird.
Gemäß noch einer weiteren Variante ist dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß das Protein eine Molmasse von zumindest 50 000 Dalton aufweist, wobei dieses Protein allein oder in Mischung verwendet wird.
Gemäß noch einer weiteren Variante ist dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß die Menge des Proteins in der Emulsionslösung zwischen 0,1 und 5 Masse-%, bezogen auf die Gesamtmasse der Emulsion, variiert.
Gemäß noch einer weiteren Variante ist dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß zuerst das Protein in einer wässerigen Puffer-Lösung mit einem schwach basischen pH, vorzugsweise zwischen etwa 7,5 und etwa 10,5, gelöst wird.
Gemäß noch einer weiteren Variante ist dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß der Viskositätsmodifikator ein viskoses Öl, insbesondere ausgewählt aus viskosem Vaselineöl, dessen Viskosität vorzugsweise zumindest 80 cp, bevorzugter zumindest 200 cp, beträgt, oder ein Viskositätsmodifikator von Ölen, wie Magnesiumstearat, ist.
Gemäß noch einer weiteren Variante ist dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß im Emulsionsschritt ein grenzflächenaktiver Stoff oder ein Emulgator verwendet wird, der eine Nanoemulsion bilden kann, vorzugsweise Glycerinsorbitanhydroxyisostearat
Gemäß noch einer weiteren Variante ist dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß der Emulsionsschritt unter Rühren mit einer Scherwirkung, vorzugsweise bei zumindest 20 000 UpM, oder mit einer Kavitationswirkung durchgeführt wird.
Gemäß noch einer weiteren Variante ist dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß eine sehr feine Emulsion erzeugt wird, indem die Emulsion in einen Homogenisator unter einem Druck von zumindest 400 bar geführt wird, wobei dieser Homogenisator vorzugsweise eine French-Presse ist.
Gemäß noch eine weiteren Variante ist dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß das Protein Kollagen umfaßt.
Gemäß noch einer weiteren Variante ist dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß das Protein Atelokollagen umfaßt.
Gemäß noch einer weiteren Variante ist dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß das Protein eine Mischung von Atebkollagen und Glykosaminoglykan umfaßt.
Gemäß noch einer weiteren Variante ist dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß eine der Phasen einen kosmetischen, pharmazeutischen, alimentären, wasserlöslichen, fettlöslichen oder unlöslichen aktiven Bestandteil enthält.
Gemäß noch einer weiteren Ausführungsvariante wird im Fall der Verwendung einer wasserlöslichen aktiven Substanz ein Öl/Wasser-Emulsionsverhältnis von etwa 6 verwendet.
Gemäß noch einer weiteren Ausführungsvariante wird im Fall der Verwendung eines fettlöslichen aktiven Bestandteils ein Protein mit hoher oder sehr hoher Molmasse, d.h. zumindest 50 000 Dalton, bei einer derartigen Konzentration verwendet, daß die Viskosität der erhaltenen Lösung gering ist, d.h. weniger als 20 cp (mPa.s) betr.gt.
Andererseits wird in diesem Fall die Verwendung eines Wasser/Öl-Emulsionsverhältnisses von etwa 20 bevorzugt.
Außerdem wird im Rahmen des Verfahrens jedes Fachleuten wohlbekannte Vernetzungsmittel verwendet, wie insbesondere in der FR-2 642 329-A beschrieben.
Das in der FR-2 642 329-A beschriebene Vernetzungsmittel ist ein Säuredichlorid oder Säureanhydrid oder eine zwei- oder polybasige Carbonsäure.
Gemäß einem bevorzugten Merkmal wird das Vernetzungsmittel ausgewählt aus Terephthaloylchlorid, Phthalsäurechlorid, Sebacinsäurechlorid, Bernsteinsäurechlorid, einem Chlorid einer Tricarbonsäure, wie Citronensäure, oder einem Säureanhydrid, wie Bernsteinsäureanhydrid.
Gemäß einem dritten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch eine kosmetische, pharmazeutische oder alimentäre Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie Nanokapseln mit einer Wand auf der Basis von vernetzten Proteinen, wie vorstehend definiert, umfaßt, die vorzugsweise durch das definierte Verfahren erhalten werden. Vorzugsweise enthalten diese Nanokapseln zumindest teilweise einen aktiven Bestandteil, insbesondere einen kosmetischen, pharmazeutischen oder alimentären, wasserlöslichen, fettlöslichen oder unlöslichen aktiven Bestandteil.
Andere Ziele, Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen klar aus der folgenden erläuternden Beschreibung mit Bezugnahme auf verschiedene Ausführungsbeispiele der Erfindung hervor, die nur der Erläuterung dienen und daher den Umfang der Erfindung in keiner Weise einschränken sollen. In den Beispielen beziehen sich alle Prozentsätze auf die Masse, wenn nichts anderes angegeben ist.

Erfindungsgemäßes Beispiel 1: Herstellung von Nanokapseln mit einer Wand aus Proteinen auf der Basis einer Mischung von Atelokollagen/Glykosaminoglykanen

a) Erzeugung der zur Herstellung der Nanokapseln erforderlichen Mischung

Diese Mischung wird gemäß einem in der FR-2 642 329-A, Beispiel 1, Schritte a) bis c), beschriebenen Verfahren hergestellt.
- Aus der Haut frisch geschlachteter Kälber wird Kollagen extrahiert, dann Werden die Telopeptide eliminiert, um Atelokollagen zu erhalten.
- Aus den Nasenscheidewänden von Kälbern wird Chondroitin-4-sulfat extrahiert, dialysiert, dann lyophilisiert.
- Die beiden obigen Zubereitungen werden vorteilhaft in einen basischen Puffer gegeben, wie Carbonat oder Phosphat oder jede andere Substanz, die das Erhalten eines Puffervermögens zwischen 7,5 und 10,5 ermöglicht. Dann werden die Lösungen gemischt, um beispielsweise die folgenden Endkonzentrationen zu erhalten:
Atelokollagen: 1,6 %
Chondroitin-4-sulfat: 0,6 %
wasserfreies Natriumcarbonat: 4,8 %
Methyl-p-hydroxybenzoat: 0,4 %
permutiertes Wasser: qsp
Der pH der gesamten Lösung wird durch den Zustz von 6N HCl oder 6N NaOH auf zwischen 7,5 und 10,5, beispielsweise 8,5, gebracht.
1 kg dieser so hergestellten Lösung wird in der weiteren Herstellung verwendet.

b) Herstellung des Vernetzungsmittels

400 g Terephthaloylchlorid werden in einem Mörser zerkleinert und zu 1 l viskosem Vaseline CODEX zugesetzt. Das Ganze wird durch mechanisches Rühren bewegt.

c) Emulgierung

In eine gekühlte rostfreie Küvette werden 6 l viskoses Vaselineöl CODEX mit einem Viskositätsindex von 250 cp (mPa.s) und vorzugsweise 320 ml eines grenzflächenaktiven Stoffes, beispielsweise Glycerinsorbitanhydroxyisostearat (Arlacel 780, ICI), eingebracht. Das Ganze wird einige Minuten lang gerührt.
Die hergestellte Lösung von Atelokollagen und Chondroitinsulfat wird dann zugesetzt und die Emulgierung während einiger Minuten bei 20 000 UpM mit Hilfe einer Ultra-Turax durchgeführt.

d) Vernetzung

Die Lösung, die das in Schritt b) hergestellte Vernetzungsmittel enthält, wird dann in die Emulsion eingebracht. Die in dieser vorliegenden festen Teilchen werden auch zugesetzt und lösen sich im Laufe der Zeit.
Nach 5 min Rühren bei 20 000 UpM in der Ultra-Turax wird die Lösung bei reduzierter Drehzahl zumindest 18 h lang mechanisch gerührt.
Die Nanokapseln werden diskontinuierlich abzentrifugiert, und der Überstand wird eliminiert (4000 UpM während 15 min).

e) Wäschen

Die Nanokapseln werden mit fünf aufeinanderfolgenden Lösungen einer organischen Phase gewaschen, die mit Vaselineöl mischbar ist. Als Beispiele werden DRAGOXAT (DRAGOCO), ISOPROPYLMYRISTAT (STEARINIERIE DUBOIS), Triglyceride (STEARINIERIE DUBOIS), etc., angegeben.
Während jeder Wäsche werden 100 ml Nanokapseln zu 500 ml organischer Phase zugesetzt. Das Ganze wird einige Minuten lang gerührt, dann zentrifugiert (4000 UpM während 15 min).
Die erhaltenen Nanokapseln können beispielsweise in Protein- oder Polysaccharid-Gelen oder in einer Ölphase suspendiert werden.

Beispiel 2 der Erfindung: Herstellung von Nanokapseln, die einen wasserlöslichen oder unlöslichen aktiven Bestandteil enthalten

Es wird wie in Beispiel 1 beschrieben vorgegangen, außer daß der in a) hergestellten Lösung zahlreiche aktive Bestandteile zugesetzt werden können, wie beispielsweise:
Bsp. 2A: 64 g GLYCENTANE (Bioetica)
Bsp. 28: 64 g GINKGO BILOBA (Alban Muller Int.)
Bsp. 2C: 32 g GLUCOSE (MERCK)
Bsp. 2D: 32 g Aminosäure, wie L-Glutamin
Bsp. 2E: 32 g COFFEIN (SIGMA)

Beispiel 3 der Erfindung: Herstellung von Nanokapseln mit einer Wand aus Proteinen auf der Basis von Atelokollagen

Es wird wie in Beispiel 1 beschrieben vorgegangen. Als einziges makromolekulares Protein wird jedoch Atelokollagen in einer Konzentration von 2 % verwendet.

Beispiel 4 der Erfindung: Nanokapseln aus Elastin

Es wird wie in Beispiel 1 beschrieben vorgegangen, außer daß als Protein Elastin verwendet wird.
Es kann auch ein Protein ausgewählt werden aus tierischen Proteinen, wie Elastin, Keratin, Seide, Albumin, Milchproteinen, pflanzlichen Proteinen, wie Weizen-, Mais-, Hafer-, Mandelproteinen, oder Proteinen die aus einer marinen Umgebung stammen, wie Kollagen, oder anderen Proteinen, die von Fischen stammen, Algenproteinen, Mikroplankton.

Beispiel 5 der Erfindung:

Alle oben beschriebenen Beispiele können unter Verwendung anderer Emulgierverfahren modifiziert werden.
So wird in Beispiel 1 insbesondere der Emulgierschritt c) modifiziert, und nach einer langsamen Bewegung durch mechanisches Rühren wird das Ganze ein- oder mehrmals in einen Hochdruck-Homogenisator geführt.
Die verwendeten Drücke können zwischen 400 und 1000 bar betragen, liegen jedoch vorzugsweise etwa bei 700 bar. Einzeloder Doppelhomogenisatoren können austauschbar verwendet werden, es werden jedoch Einzelhomogenisatoren für starke Filmbildner-Proteine bevorzugt.
Die Beispiele von Hochdruck-Homogenisatoren, die verwendet wurden, sind Lab 60 (APV), SHL 05 (ALPHA-LAVAL) oder SODEXIM 2720 oder 2735 (SODEXIM). Nach einer Homogenisationsbehandlung bei beispielsweise 700 bar werden Nanokapseln mit Abmessungen von weniger als 1 µm, zwischen 200 und 800 nm, erhalten.
Ebenso können auch andere Vorrichtungen unter Verwendung anderer Bestandteile das Erhalten erhöhter Kavitationskräfte ermöglichen. Mit Hilfe derselben ist es daher möglich, Nanoemulsionen zu erhalten (Beispiele: SONICATEUR BRANDSON, SONOLATOR von SONIC Corp.).

Beispiel 6 der Erfindung:

Im Emulgierschritt von Beispiel 1 wird ein Viskositätsmittel von Ölen zur Erhöhung der Viskosität der Emulgier-Lösung verwendet, beispielsweise Magnesiumstearat in einer Menge von 2 Masse-%. Es werden Nanokapseln mit Abmessungen zwischen 200 und 800 nm erhalten.

Beispiel 7: Herstellung von Nanokapseln, die fettlösliche aktive Stoffe enthalten

a) Zu 250 ml der in Beispiel 1, a), beschriebenen Lösung werden 750 ml entmineralisiertes Wasser zugesetzt.
b) Zu 25 ml Gurkenkrautöl werden 5 ml Sebacoyldichlorid zugesetzt, und das Ganze wird durch mechanisches Rühren gemischt.
c) Die Lösungen a) und b) werden kontinuierlich zugesetzt und in einen Hochdruck-Homogenisator vom Typ Lab 60 (APV) gegeben. Die verwendeten Homogenisationsdrücke liegen zwischen 300 und 1000 bar, beispielsweise bei 800 bar, und mehrere aufeinanderfolgende Homogenisationen wurden mit Einzel- und Doppelventilen durchgeführt. Die erhaltenen Sphären haben eine Größe von weniger als 1 µm, sind bemerkenswert stabil und trennen sich trotz ihrer geringen Größe nicht aus einem verdünnten Lagermedium ab.

Beispiel 8: andere fettlösliche aktive Stoffe

In Beispiel 7 können die 25 ml Gurkenkrautöl ersetzt werden durch:
Bsp. 8a: 25 ml Ethylmyristat
Bsp. 8b: 25 ml Isopropylmyristat
Bsp. 8c: 25 ml flüssiges Vaselineöl
Bsp. 8d: 25 ml Ethyloleat
Bsp. 8e: 25 ml Vitamin E-acetat
Bsp. 8f: 25 ml Benzylbenzoat

Beispiel 9: Objektivierungstest

Aussalzen in vivo einer in erfindungsgemäßen Nanokapseln eingekapselten Substanz verglichen mit Mikrokapseln.
Die überzeugendsten Ergebnisse von Objektivierungstests, die durch die Nanokapseln erhalten werden, sind unbestreitbar jene, die mit einer Modifikation der spatiotemporalen Verteilung der aktiven Substanz in Zusammehang stehen. Diese Modifikation kann mit der Größe der Teilchen verbunden sein, die dann spezifisch zu bestimmten Teilen des Organismus (Retikubendothelsystem, hepatischen Geweben) getragen werden, aber sie kann auch mit der Rolle eines Reservoirs aktiver Stoffe in Verbindung stehen, die die Nanokapseln spielen können. Im letzteren Fall kann ein verzögertes Aussalzen des aktiven Stoffs das Erzielen einer starken Bioverfügbarkeit des aktiven Bestandteils, einer intensiveren Assimilation sowie einer viel progressiveren Eliminierung von Ausscheidungsprodukten der Metabolisierung des aktiven Bestandteils ermöglichen.
Durch die nachstehend beschriebene Vergleichsuntersuchung konnten die Erfinder das Vorliegen und die Intensität des Retard-Effekts prüfen, der mit den Kapseln mit Mikrometer-Größe und mit den erfindungsgemäßen Kapseln mit Nanometer-Größe erhalten wurde.

a) Materialien und Methoden

Die Rückenhaut von Ratten (männliche WISTAR-Ratten, etwa 300 g) wurde mit Hilfe einer Wasser-in-Öl-Emulsion behandelt, wobei die Ölphase viskoses Vaselineöl CODEX mit einem Viskositätsindex von etwa 250 cp (mPa.s) (TISCO) und die wässerige Phase eine der folgenden Lösungen war:
- eine Kollagen/Glykosaminoglykan-Mischung (abgekürzt Koll/GAG), die radioaktive p-Aminobenzoesäure (PABA*) enthält;
- Mikrokapseln vom Typ A, die PABA* enthalten (mittlere Größe 50 µm), wie gemäß dem in Beispiel 1 der FR-2 642 329-A beschriebenen Verfahren hergestellt;
- Nanokapseln, die PABA* enthalten (Größe zwischen 100 und 800 nm), hergestellt gemäß dem obigen Beispiel 1.
Nach dem Aufbringen des zu testenden Produkts auf eine konstante Oberfläche wurde die Freisetzung der Säure durch die Messung der im täglich von jedem Tier gesammelten Urin enthaltenen Radioaktivität verfolgt.
Für jede von drei oben beschriebenen Lösungen wurden zwei Ratten mit 0,3 g Emulsion behandelt, die eine spezifische Radioaktivität von etwa 3 X 10&sup6; cpm/g im Fall der Kollagen/GAG-Lösung und der Mikrokapseln, und etwa 6 x 10&sup5; cpm/g im Fall der Nanokapseln der Erfindung aufwies.

b) Ergebnisse

Nach dem Aufbringen der gegebenenfalls eingekapselten radioaktiven Verbindung wurde die Radioaktivität jeden Tag im Urin der Ratten gemessen. Die Kurven, welche die Entwicklung dieser Radioaktivität als Funktion der Zeit (in Tagen) zeigen, sind in Fig.1 dargestellt.
Die in dieser grafischen Darstellung eingetragenen Werte repräsentieren die im Urin gemessene Radioaktivität dividiert durch die gesamte Radioaktivität im Urin und in der Haut. Diese gesamte Radioaktivität wird nach 17-tägigen Messungen und nach dem Töten der Tiere berechnet.
Diese grafische Darstellung beschreibt den Retard-Effekt, der mit den Mikrokapseln und den Nanokapseln beim Aussalzen von PABA* festgestellt wurde. Dieses starke Aussalzen der ersten Tage, das bei der Kollagen/GAG-Lösung beobachtet wurde, ist weniger intensiv bei den Mikrokapseln und sehr schwach mit den Nanokapseln. PABA* wird viel langsamer eliminiert, wenn es in den Mikrokapseln eingekapselt ist, und noch weniger rasch, wenn es in den Nanokapseln eingekapselt ist.
17 Tage nach der Behandlung werden die Ratten getötet, wobei die behandelte Haut hydrolysiert und dann die Radioaktivität gemessen wird. Die erhaltenen Ergebnisse wurden in Fig.2 zusammengefaßt und zeigen, daß die im Hautgewebe enthaltene Radioaktivität schwach ist (etwa 4 %), wenn PABA* nicht eingekapselt wurde, viel stärker ist (etwa 10 %), wenn Mikrokapseln verwendet werden, und noch viel intensiver ist (> 20 %), wenn die radioaktive Substanz in den Nanokapseln eingekapselt wurde.
Dieser sehr deutliche Unterschied wurde in einem weiteren durchgeführten Versuch bestätigt, in dem männliche Nacktratten mit 300 g im gleichen Versuchstyp verwendet wurden.

c) Schußfolgerungen

- Da die Geschwindigkeit der Eliminierung der im Urin vorliegenden Radioaktivität direkt mit der Geschwindigkeit der Hautabsorption zusammenhängt, kann angenommen werden, daß jede Verzögerung der Eliminierung auf den Retard-Effekt der das radioaktive Element einkapselnden Sphären zurückzuführen ist. Dieser in vivo bei Ratten festgestellte Retard-Effekt ist mit den 50 µm Mikrokapseln sehr deutlich, jedoch mit den Nanokapseln (deren Größe zwischen 800 nm und 100 nm variiert) noch intensiver.
- Die auf der Ebene des Hautgewebes gemessene Radioaktivität nach dem Aufbringen eines gegebenenfalls eingekapselten radioaktiven Elements ist ein Maß der Bioverfügbarkiet dieses Elements, d.h. seiner Fähigkeit, in den Hautmetabolismus integriert zu werden. Nach der Verwendung einer zu starken PABA*- Menge ist die Eliminierung sehr rasch, wobei das Hautgewebe nur eine aliguote Fraktion des verwendeten Produkts aufnehmen kann.
Wenn die Mikrokapseln oder Nanokapseln verwendet werden, erfolgt eine verzögerte Freisetzung von PABA*, das dann in viel größeren Mengen im Hautgewebe metabolisiert werden kann.
Dies wurde mit den Nanokapseln der Erfindung und in geringerem Ausmaß mit den Mikrokapseln festgestellt.
Wenn die Größe der Kapseln ausreichend klein ist, so daß es zu keinem Zerbrechen beim Aufbringen kommt (Durchmesser kleiner als 100 µm), ist es daher möglich, mit den Nanokapseln eine Verbesserung der Bioverfügbarkeit kosmetischer aktiver Stoffe zu erhalten.
Die vorliegende Erfindung schließt alle Mittel ein, die technische Äquivalente der beschriebenen Mittel darstellen. Insbesondere ist in der Beschreibung und in den Ansprüchen das Wort "Nanokapsel" nicht nur auf eigentliche Kapseln beschränkt, sondern betrifft auch Sphären oder Teilchen, deren Abmessungen im Nanometer-Bereich liegen.

Claims

1. Teilchen oder Kapsel mit einer Abmessung von weniger als 1 µm, welches bzw. welche als Nanoteilchen oder Nanokapsel bezeichnet wird, mit einer Wand aus vernetztem Protein, dadurch gekennzeichnet, daß es bzw. sie durch eine Grenzflächen-Vernetzungsreaktion zwischen einem Protein und einem Vernetzungsmittel erhalten wird, das zumindest zwei Acylierungsgruppen umfaßt, die mit den acylierbaren reaktiven Gruppen des Proteins reagieren, wobei so das Nanoteilchen oder die Nanokapsel mit der Wand auf der Basis von vernetztem Protein erhalten wird.

2. Nanoteilchen oder Nanokapsel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein eine Molmasse von zumindest 50 000 Dalton aufweist, wobei dieses Protein allein oder in Mischung verwendet wird.

3. Nanoteilchen oder Nanokapsel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus tierischem Protein, wie Elastin, Keratin, Seide, Albumin, Milchprotein, Protein mit einer Struktur wie Kollagen, insbesondere Kollagen ohne Telopeptid oder Atelokollagen; pflanzlichem Protein, wie Weizen-, Mais-, Hafer-, Mandelprotein; und Protein, das aus einer marinen Umgebung stammt, insbesondere von Fischen oder Algen oder auch Plankton oder Mikroplankton.

4. Nanoteilchen oder Nanokapsel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein Kollagen, Atelokollagen oder eine Mischung von Atelokollagen und Glykosaminoglykan umfaßt.

5. Nanoteilchen oder Nanokapsel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es bzw. sie einen kosmetischen, pharmazeutischen oder alimentären, wasserlöslichen, fettlöslichen oder unlöslichen aktiven Bestandteil enthält.

6. Nanoteilchen oder Nanokapsel nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Glykosaminoglykan Chondroitin-4- sulfat ist.

7. Nanoteilchen oder Nanokapsel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Vernetzungsmittel, das zumindest zwei Acylierungsgruppen umfaßt, die mit den acylierbaren Gruppen des Proteins reagieren können, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Säuredichlorid, insbesondere Terephthaloylchlorid, Phthalsäurechlorid, Sebacinsäurechlorid, Bemsteinsäurechlorid, einem Chlorid einer Tricarbonsäure, wie Citronensäure, oder einem Säureanhydrid, wie Bernsteinsäureanhydrid.

8. Kosmetische, pharmazeutische oder alimentäre Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Nanoteilchen oder eine Nanokapsel, wie in einem der vorhergehenden Ansprüche definiert, umfaßt.

9. Verfahren zur Herstellung eines Teilchens oder einer Kapsel mit einer Abmessung von weniger als 1 µm, das bzw. die als Nanoteilchen oder Nanokapsel bezeichnet wird, mit einer Wand auf der Basis von vernetztem Protein, dadurch gekennzeichnet, daß es die Erzeugung einer Nanoemulsion umfaßt, umfassend eine wässerige Phase, die ein Protein enthält, und eine Ölphase, die ein Grenzflächen-Vernetzungsmittel enthält, das zumindest zwei Acylierungsgruppen umfaßt, die mit den acylierbaren Gruppen des Proteins reagieren, wobei so Mikroteilchen oder Mikrokapseln gebildet werden, deren Wand auf durch das Vernetzungsmittel vernetztem Protein basiert.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß ein Viskositätsmodifikator einer der beiden Phasen zugesetzt wird, um die Viskositätsdifferenz zwischen den vorliegenden flüssigen Phasen zu verringern, wobei die Nanoemulsion erhalten wird.

11. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Nanoemulsion erzeugt wird, indem eine Emulsion der wässengen Phase und der Ölphase in einen Homogenisator unter einem Druck von zumindest 400 bar geführt wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Nanoemulsion unter Rühren mit einer Scherwirkung, vorzugsweise bei zumindest 20 000 UpM, oder mit einer Kavitationswirkung erzeugt wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein eine Molmasse von zumindest 50 000 Dalton aufweist, wobei dieses Protein allein oder in Mischung verwendet wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Viskositätsmodifikator die Viskosität zumindest 4-fach und vorzugsweise 10-fach in bezug auf die Phase modifizieren kann, der er zugesetzt wird.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß im Fall der Bildung einer Wasser-in-Öl- Emulsion der Viskositätsmodifikator der Ölphase zugesetzt wird oder diese bildet, um die Viskosität zumindest 4-fach in bezug auf die Viskosität der klassisch verwendeten Ölphase zu erhöhen.

16. Verfahren nach einem der Ansprüöhe 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß im Fall einer Öl-in-Wasser-Emulsion die Viskosität der wässerigen Phase entweder durch die Verminderung der Protein-Menge oder durch den Zusatz eines Viskositätsmodifikators zur Verringerung ihrer Viskosität, vorzugsweise zumindest um das 4-fache, in bezug auf die Viskosität der üblicherweise verwendeten wässerigen Phase verringert wird.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß als Protein ein Protein mit einer Filmbildnerwirkung, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus tierischem Protein, wie Elastin, Keratin, Seide, Albumin, Milchproteinen, Proteinen mit einer Struktur wie Kollagen, insbesondere Kollagen ohne Telopeptid oder Atelokollagen oder Glykosaminoglykan; pflanzlichem Protein, wie Weizen-, Mais-, Hafer-, Mandelprotein; und Protein, das aus einer marinen Umgebung stammt, insbesondere von Fischen oder Algen oder auch Plankton oder Mikroplankton, verwendet wird.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge des Proteins in der Emulsionslösung zwischen 0,1 und 5 Masse-%, bezogen auf die Gesamtmasse der Emulsion, variiert.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß der Viskositätsmodifikator ein viskoses Öl, insbesondere ausgewählt aus viskosem Vaselineöl, dessen Viskosität vorzugsweise zumindest 80 cp, bevorzugter zumindest 200 cp, beträgt, oder ein Viskositätsmodifikator von Ölen, wie Magnesiumstearat, ist.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß im Emulsionsschritt ein grenzflächenaktiver Stoff oder ein Emulgator verwendet wird, der eine Nanoemulsion bilden kann, vorzugsweise Glycerinsorbitanhydroxyisostearat.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein Kollagen, Atelokollagen, eine Mischung von Atelokollagen und Glykosaminoglykan umfaßt.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß eine der Phasen einen kosmetischen, pharmazeutischen oder alimentären, wasserlöslichen, fettlöslichen oder unlöslichen aktiven Bestandteil enthält.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß, wenn der aktive Bestandteil wasserlöslich ist, ein Öl/Wasser-Emulsionsverhältnis von etwa 6 verwendet wird.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß, wenn der aktive Bestandteil fettlöslich ist, ein Wasser/Öl- Emulsionsverhältnis von etwa 20 verwendet wird.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß, wenn der aktive Bestandteil fettlöslich ist, ein Protein mit hoher Molmasse von zumindest 50 000 Dalton verwendet wird, wobei die Protein-Konzentration derart ist, daß die Viskosität der erhaltenen wässerigen Lösung weniger als 20 cp (mPa.s) beträgt.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Vernetzungsmittel wie in Anspruch 7 definiert ist.