DE69219331T2

DE69219331T2 - Verbesserungen im bezug auf kontrastmittel

Info

Publication number: DE69219331T2
Application number: DE69219331T
Authority: DE
Inventors: Jo Klaveness; Pal Rongved; Per Strande
Original assignee: Nycomed Imaging AS
Current assignee: GE Healthcare AS
Priority date: 1991-06-03
Filing date: 1992-06-03
Publication date: 1997-09-04
Anticipated expiration: 2012-06-04
Also published as: DK0586524T3; EP0586524A1; ATE151992T1; NO934366L; FI935394A; ES2103947T3; AU1929192A; FI935394A0; AU665198B2; WO1992021382A1; JPH06509065A; JP3319754B2; EP0586524B2; US5569449A; EP0586524B1; IE921797A1; US5558857A; ES2103947T5; HK1006946A1; DE69219331T3

Description

Die Erfindung betrifft neue Kontrastmittel, insbesondere neue mikropartikelförmige Kontrastmittel zur Verwendung in diagnostischen Ultraschallbildgebungsverfahren.
Es ist bekannt, dass die Ultraschallbildgebung eine potentiell wertvolle diagnostische Methode, z. B. für Untersuchungen des Gefäßsystems, insbesondere in der Kardiographie, und des mikrovaskulären Systems von Gewebe, darstellt. Zur Verbesserung der so erhaltenen akustischen Abbildungen wurden verschiedene Kontrastinittel vorgeschlagen, einschließlich Suspensionen fester Partikel, emulgierter Flüssigkeitströpfchen, Mikrogasbläschen und eingekapselter Gase oder Flüssigkeiten. Es wird allgemein akzeptiert, dass Kontrastmittel mit niedriger Dichte, die leicht komprimierbar sind, in Bezug auf die von ihnen erzeugte akustische Rückstreuung besonders wirksam sind und daher bestand erhebliches Interesse an der Herstellung gashaltiger und gaserzeugender Systeme.
Erste Untersuchungen bezüglich in vivo durch intrakardiale Injektion physiologisch annehmbarer Substanzen erzeugter, freier Gasmikrobläschen haben die potentielle Wirksamkeit solcher Bläschen als Kontrastmittel in der Echokardiographie gezeigt; diese Techniken werden jedoch in der Praxis durch die kurze Lebensdauer der freien Bläschen stark eingeschränkt. Demgemäß bestand Interesse an Verfahren zur Erzeugung und/oder Stabilisierung von Gasmikrobläschen für die Echokardiographie und andere Ultraschalluntersuchungen, z. B. durch Verwendung von Emulgatoren, Ölen, Verdickungsmitteln oder Zuckern.
Verfahren zur Verwendung von Zuckern in Ultraschallkontrastmitteln sind z. B. in US-A-4,681,119, US-A-4,442,843 und US-A-4,657,756 beschrieben, die die Verwendung partikelförmiger Feststoffe mit vielen gasgefüllten Kammern und vorzugsweise auch vielen Mikrobläschen bildenden Keimen offenbaren. In EP-A- 0322350, WO 88/03388, EP-A-0123235, EP-A-0122624 und DE-A- 3834705 werden Ultraschallkontrastmittel vorgeschlagen, die aus fettsäureumhüllten, gasenthaltenden Mikropartikeln bestehen, die Zucker wie Cyclodextrine, Monosaccharide, Disaccharide oder Trisaccharide enthalten können. In der US-A-4,832,941 werden Ultraschallkontrastmittel beansprucht, die aus einer Mischung von drei Komponenten, nämlich (1) Makromolekülen wie Polysacchariden, (2) pflanzlichen Ölen und (3) löslichen Eisen(III)salzen, bestehen. In der EP-A-0077752 werden Ultraschallkontrastmittel vorgeschlagen, die aus Gasblasen, oberflächenaktiven Verbindungen (einschließlich Fettsäuresalzen und Derivaten) und viskositätssteigernden Stoffen (einschließlich Mono- oder Polysacchariden) bestehen. In der EP-A-0327490 werden gashaltige Amylosepartikel beschrieben, die mit Polymeren umhüllt sind.
Schlief, R. gibt in "International Symposium on Contrast Media", Tokyo (1988), S. 323-328 einen Überblick über Ultraschallkontrastmittel, wobei SHU 454 (Echovist ), das ein auf Saccharose basierendes Produkt in der Entwicklung durch Schering AG ist, im Mittelpunkt steht. Derselbe Autor beschreibt in "Contrast Media from past to the future", Symposium Berlin (1987), S. 179-187 SHU 454 genauer. Loughery, E.J. et al. haben in "Echocardiography" (Elsevier) (1990), S. 279-292 einen Übersichtsartikel über Kreislaufuntersuchungen mittels myokardialer Kontrastechokardiographie veröffentlicht, wobei SHU 454, SHU 508 (Levovist ) und das auf Proteinen basierende Albunex im Mittelpunkt stehen.
Schlief, R. hat in Radiology (1991) 178, S. 213-215 die klinische Verwendung von SHU 454 bei der Hysterosalpingo-Kontrastsonographie des Uterus und der Eileiter beschrieben. SHU 454 wurde auch in folgenden Veröffentlichungen beschrieben: Rovia, D. et al., Circulation Supplement III (1990) 82, S. 26; Barzilai, B. et al., Circulation Supplement III (1990) 82, S. 96; Vorwerk, D. et al., Ultraschall in Med. (1990) 11, S. 146-149; Von Bibra, H. et al., Eur. Heart J. (1990) 11, S. s 112; Wilkenshoff, U. et al., Eur. Heart J. (1990) 11, S. 5 113; El Mouaaouy, A. et al., Surg. Endosc. (1990) 4, S. 114-117; Smith N.D. et al., JACC (1984) 3, S. 992-998; Lange L. et al., Arzneim.-Forsch./Drug Res. (1986) 36(II), S. 1037-1040; Fritzsch, Th. et al., Invest. Radiol. (1988) 23 (Suppl 1), S. 302-305; Arisawa, J. et al., International Symposium on Contrast Media, Tokyo (1988), S. 331-332; Rovai, D. et al., JACC (1987) 10, S. 125-134; Heidelmeyer, C.F. et al., J. Cardiothoracic Anesthesia (1990) 4, S. 60-67; Grube, E. et al., Z. Kardiol. (1986) 75, S. 335-362; Meyer-Schwickerath et al., Ultraschall (1986) 7, S. 34-36; und Becker, H. et al., Am.J. Cardiol. (1989) 64, S. 374- 377.
SHU 508 wurde in folgenden Veröffentlichungen beschrieben: Schlief, R. et al., Circulation Supplement III (1990) 82, S. 28; Schartl, M. et al., Circulation Supplement III (1990) 82, S. 261; Fritzsch, T. et al., Invest. Radiol. (1990) 25 (Suppl), S. 160-161; Schlief, R. et al., Echocardiography (1990) 7, pp. 61-64; and Smith, M.D. et al., JACC (1989) 13, S. 1622-1628.
Die Verwendung von wässrigen Suspensionen von Methylcellulose als orale Ultraschallkontrastmittel wurde von Warren, P.S. et al. in J. Clin. Ultrasound (1978) 6, S. 315-320 bewertet.
Mit Calciumalginat eingekapselte Mikrobläschen wurden kürzlich von Wheatley, M.A. et al. in Biomaterials (1990) 11, S. 713-717 und Polymeric Materials Science and Engineering (1990) 63, S. 144-147 als potentielle Ultraschallkontastmittel beschrieben.
Ein allgemeiner Nachteil der vorhandenen, partikelförmigen Ultraschallkontrastmittel, wie auf Zuckern basierenden Mitteln, die oben diskutiert wurden, ist das Fehlen von Stabilität in vivo. Dies ist ein besonderes Problem bei Anwendungen wie der Echokardiographie, wo Bedarf an verbesserten Kontrastmitteln besteht, die ausreichende Stabilität mit kleiner Mikrobläschengröße (typischerweise weniger als 10 µm, vorzugsweise weniger als 7 µm) vereinen, so dass die Passage durch die Pulmonalkapillaren ermöglicht wird und auf diese Weise die linke Seite des Herzens besser dargestellt werden kann, vorzugsweise für mehr als einen Zirkulationsdurchgang des Blutes.
Die vorliegende Erfindung beruht auf dem Befund, dass die in vivo-Stabilität und/oder das Reflektionsvermögen von mikropartikelförmigen Ultraschallkontrastmitteln durch kovalente Veränderung der Struktur der Mikropartikelmatrix, z. B. durch Einführung stabilisierender, vernetzender Gruppen oder einer lipophilen Umhüllung, bedeutend verbessert werden kann. Die kovalent gebundenen, stabilisierenden Anteile können außerdem so gewählt werden, dass sie biologisch abbaubare Verbindungen enthalten, so dass die Kontrastmittel die wichtige Eigenschaft zeigen, kurz nach der Verwendung schnell aus dem Organismus eliminierbar zu sein, z. B. mit einer bevorzugten Halbwertszeit von nicht mehr als 48 Stunden in vivo, z. B. von ein bis zwölf Stunden.
So stellt die vorliegende Erfindung zum einen Ultraschallkontrastmittel in Form von Mikropartikeln, umfassend eine biologisch verträgliche Matrix, die mit einem Gas oder einem Präkursor dafür assoziiert ist, zur Verfügung, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Mikropartikel durch kovalente Bindung an die Matrix stabilisiert sind.
Es ist erkennbar, dass das Material der biologisch verträglichen Matrix passende funktionelle Gruppen besitzen muss, die kovalente Bindungen mit, z. B., Reagenzien, wie vernetzenden Agenzien (einschließlich sogenannter Zerovernetzungsmittel) und/oder reaktiver Derivate von Fetten, wie z. B. im folgenden genauer beschrieben, bilden können müssen. Hinsichtlich dieser Anforderung kann eine große Vielfalt biologisch verträglicher Materialien erfindungsgemäß verwendet werden. Beispiele umfassen Kohlenhydrate (z. B. Hexosen, wie Glucose, Fructose oder Galactose; Disaccharide, wie Sucrose, Lactose oder Maltose; Pentosen, wie Arabinose, Xylose oder Ribose; α-, β- und γ-Cyclodextrine; Polysaccharide, wie Stärke, Hydroxyethylstärke, Hydroxypropylstärke, Amylose, Amylopektin, Glycogen, Inulin, Pulullan, Dextran, Carboxymethyldextran, Dextranphosphat, Ketodextran oder ein Alginat; und Kohlenhydrate, die Amino- oder Amidogruppen enthalten, wie Aminoethyldextran, Chitin, Chitosan, Hyaluronsäure oder Heparin - der Name "Kohlenhydrat", wie er hier verwendet wird, umfasst auch Zuckeralkohole, z. B. Alditole, wie Mannitol oder Sorbitol); abbildende Stoffe (z. B. Röntgenkontrastmittel, wie irgendwelche kommerziell erhältlichen Carbonsäure- und nichtionische Amid-Röntgenkontrastmittel, die typischerweise wenigstens eine 2,4,6-Triiodphenyl-Gruppe enthalten, die in der 3- und/oder 5-Position Substituenten, wie Carboxyl, Carbamoyl, N-Alkylcarbamoyl, N-Hydroxyalkylcarbamoyl, Acylamino, N-alkylacylamino oder Acylaminomethyl trägt, wie in Metrizoesäure, Diatrizoesäure, Iothalamsäure, Ioxaglinsäure, lohexol, Iopentol, Iopamidol, Iodixanol, Iopromid, Metrizamid, Iodipamid, Meglumin Iodipamid, Meglumin Acetrizoat oder Meglumin Diatrizoat); und Polypeptide und Proteine (z. B. Gelatine oder Albumin, wie Humanserumalbumin).
Beispiele von erfindungsgemäßen Kontrastmitteln umfassen Suspensionen und Lösungen von biologisch verträglichen Mikropartikeln, die Gas als Einschlüsse in den Hohlräumen ihrer Kristallstrukturen und/oder an ihrer Oberfläche absorbiert haben; und Mikrobläschen, die durch biologisch verträgliche Materialien umhüllt sind, z. B. durch unlösliche Polysaccharide, wie Calciumalginat.
In einer Anwendungsform der Erfindung wird die mikropartikelförmige, biologisch verträgliche Matrix in Aggregatform ausgeführt (z. B. haben die Aggregate Größen von 20 - 125 µm, beispielsweise 30 bis 50 µm), wobei die Partikel eine Größe von z. B. 1 bis 50 µm, beispielsweise 5 bis 10 µm, haben. Solche Aggregate, die z. B. durch bekannte Verkleinerungsmethoden, wie Reiben oder Mahlen, z. B. Vermahlen in einer Kugelmühle, hergestellt werden, neigen dazu, beträchtliche Luftvolumina auf ihren Oberflächen zu adsorbieren und in Hohlräumen, wie Zwischenräumen zwischen Partikeln, oder an Korngrenzflächen zwischen Kristalliten mitzureißen. Die Partikelgröße kann z. B. so gewählt werden, dass sie im wesentlichen genau so groß wie die gewünschte Mikrobläschengröße ist. In Anwendungen, wie der Echokardiographie, wird dies typischerweise kleiner als 10 µm sein, um die Passage durch die Pulmonalkapillaren zu erlauben und so eine verbesserte Ultraschallbildgebung der linken Seite des Herzens, vorzugsweise für mehr als einen Zirkulationsdurchgang des, zu ermöglichen.
Stabilisation kann erfindungsgemäß z. B. durch kovalente Vernetzung der biologisch verträglichen Matrix vor, während oder nach Einschluss eines Gases oder Gaspräkursors unter Verwendung eines vernetzenden Agenz mit wenigstens zwei funktionellen Gruppen, die mit funktionellen Gruppen der biologisch verträglichen Matrix reagieren können, bewirkt werden. In der Technik sind viele solche Paare interagierender, funktioneller Gruppen bekannt, wie z. B. von Beaumert et al. in "Crosslinking techniques" (Meth. Enzymol. 172 (1989), S. 584-609) oder in Pierce Handbook and General Catalogue (1989), S. 284-311 beschrieben.
So können z. B. Hydroxylgruppen in biologisch verträglichen Matrizen, wie Kohlehydraten, vernetzt werden, wie in "Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry", Ed. R. Stuart Tipsen und D. Horton, (1976) Vol 33, S. 11-109 (Academic Press, New York) beschrieben. Beispiele geeigneter, funktioneller Gruppen für diesen Zweck umfassen Halogenatome, wie Chlor oder Brom, z. B. als Säurehalogenide, wie Alkansäureoder Sulfonsäurehalogenide; Sulfonsäureestergruppen, z. B. Alkylsulfonsäureester, wie Mesyloxygruppen und aromatische Sulfonsäureester wie Tosyloxygruppen; α-Halogenmethylester- und Ketogruppen; aktivierte Carboxylgruppen, z. B. symmetrische oder gemischte Anhydride; aktivierte Hydroxylgruppen; aktivierte Alkene, wie z. B. α, β-ungesättigte Ketone, Amide und Ester, z. B. Acrylsäure- und Methacrylasäureester; konjugierte Dunund Eninsysteme; Epoxygruppen; und acetalbildende Aldehyd- und Ketongruppen und ihre Derivate, wie Enolether oder Acetal- oder Ketalgruppen. Beispiele vernetzender Agenzien, die zur Stabilisierung von Kohlenhydratmatrizen verwendbar sind, umfassen Epichlorhydrin (wie z. B. von Kartha, K.P.R. et al. in "Stärke" (1985) 37, S. 297-306 beschrieben) und andere Epoxidderivate (wie z. B. in US-A-4,126,669 beschrieben) und Natriumtrimetaphosphat (wie z. B. in WO 89/03674 beschrieben).
Biologisch verträgliche Matrizen, die Carboxylgruppen ent halten, können z. B. durch Reaktion mit funktionellen Gruppen, wie Hydroxyl-, Mercapto-, Amino- oder Diazogruppen, vernetzt werden.
Vernetzende Agenzien zur Verwendung bei proteinhaltigen oder anderen Aminogruppen enthaltenden, biologisch verträglichen Matrizen fassen z. B. Aldehyde, Verbindungen mit aktivierten Carboxylgruppen wie N-Hydroxysuccinimidyl, Imidoester, Nitroarylhalogenide, Verbindungen mit Nitrenvorläufergruppen, wie Phenylazido, Carbenvorläufer (z. B. Diazoverbindungen und Diazinne), Ketone, Isocyanate, Isothiocyanate, Semicarbazide und Thiosemicarbazide, Epoxide, Phenolester (z. B. Nitrophenolester), Acylazide und Hydrazine, Halogenameisensäureester und Acylhalogenide (z. B. Alkanoylchloride oder Sulfonsäurechloride, wie Mesyl- oder Tosylchlorid). Dialdehyde sind eine bevorzugte Substanzklasse von vernetzenden Agenzien zur Verwendung bei proteinhaltigen Matrizen.
Mercaptogruppen können z. B. mit funktionllen Gruppen wie, Maleimiden, sulphonierten Maleimiden, α-Halogenmethylcarbonylderivaten (z. B. Estern, Amiden oder Ketonen), Alkyl- oder Aralkylhalogeniden, Nitrosohamstoffen, s-Triazinen, Aziridinen und Pyridyldisulfiden, umgesetzt werden.
Wie oben angedeutet, können auch Zerovernetzungsmittel verwendet werden. So können z. B. aminosäureenthaltende Sub strate mit kondensierenden Agenzien (z. B. einem Carbodiimid, wie Dicyclohexylcarbodiimid) behandelt werden, um eine intramolekulare Reaktion der Carboxyl- und Aminogruppen zu Amidgruppen zu begünstigen.
Vernetzungsmittel können so gewählt werden, dass sie eine oder mehrere biologisch abbaubare Bindungen mit einer geeigneten Stabilität enthalten oder mit der biologisch verträglichen Matrix ausbilden, besonders in Fällen, in denen die Matrix selber nicht leicht biologisch abgebaut wird. Geeignete biologisch abbaubare Verbindungen umfassen z.B. Amid-, Imid-, Imin-, Ester-, Anhydrid-, Acetal-, Carbamat-, Carbonat-, Carbonatester- und Disulfidgruppen. Mindestens eine solche Gruppe ist vorteilhafterweise in der vernetzenden Gruppierung vorhanden. Generell sind alle Ester biologisch abbaubar, besonders solche, die die Gruppierung -CO.O- oder -O.CO.O- enthalten.
Eine besonders zweckmäßige Klasse biologisch abbaubarer Estergruppen, die eine herkömmlichen, aliphatischen Estern vergleichbare hydrolytische Stabilität zeigt, jedoch in vivo sehr gut enzymatisch spaltbar ist, hat die Struktur
[worin jeder der Reste X, die gleich oder verschieden sein können, ausgewählt ist unter -O-, -S- und -NR-, worin R für ein Wasserstoffatom oder eine organische Gruppe steht; jeder der Reste Y, die gleich oder verschieden sein können, für eine Carbonyl-, Thiocarbonyl-, Sulfonyl- oder Phosphoryl- (d. h. eine Gruppe der Formel
worin R³ ein Wasserstoffatom oder eine organische Gruppe ist) oder eine ähnliche säurebildende Gruppe steht; jeder der Reste Z, die gleich oder verschieden sein können, ausgewählt ist unter -O-, -S- und -NR-, worin R für ein Wasserstoffatom oder eine organische Gruppe steht; m und n, die gleich oder verschieden sein können, jeweils für 0 oder 1 stehen; und R¹ und R², die gleich oder verschieden sein können, jeweils ausgewählt sind unter Wasserstoffatomen, monovalenten organischen Gruppen, Gruppen der Formel -X.Y.(Z)m- gemäß obiger Definition, oder R¹ und R² zusammen eine divalenten organische Gruppe bilden].
Die durch R, R¹, R² und R³ wiedergegebenen organischen Gruppen können z. B. jeweils eine Kohlenwasserstoff- oder heterocyclische Gruppe sein, z. B. mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, wie z. B. eine aliphatische Gruppe, wie eine Alkyl- oder Alken ylgruppe (vorzugsweise mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen), eine Cycloalkylgruppe (vorzugsweise mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen), eine araliphatische Gruppe, wie eine Aralkylgruppe (vorzugweise mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen), eine Arylgruppe (vorzugsweise mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen) oder eine hete rocyclische Gruppe mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen und einem oder mehreren Heteroatomen, ausgewählt unter O, S und N; solch eine Kohlenwasserstoff- oder heterocyclische Gruppierung kann einen oder mehrere Substituenten aufweisen, wie Halogenatome oder Gruppen der Formel -NR&sup4;R&sup5;, -CONR&sup4;R&sup5;, -OR&sup6;, -SR&sup6; und -COOR&sup7; (worin R&sup4; und R&sup5;, die gleich oder verschieden sein können, wie für R, R¹, R² und R³ definiert, für Wasserstoffatome, Acylgruppen oder Kohlenwasserstoffgruppen stehen; R&sup6; für ein Wasserstoffatom oder eine Acylgruppe oder eine wie für R, R¹, R² und R³ definierte Gruppe steht; und R&sup7; für ein Wasserstoff atom oder eine wie für R, R¹, R² und R³ definierte Gruppe steht). Wo R¹ und R² eine divalente Gruppierung darstellen, kann diese eine Alkylen-, Alkenylen-, Alkyliden- oder Alkenylidengruppe (vorzugsweise mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen) sein, die einen oder mehrere wie oben definierte Substituenten tragen kann. Generell stehen R, R¹, R² und R³ vorzugsweise für H oder kleine Gruppen, wie C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylgruppen.
Aliphatische Gruppen R, R¹, R² und R³ können gerade oder verzweigt, gesättigt oder ungesättigt sein und umfassen z. B. Alkyl- und Alkenylgruppen, wie Methyl, Ehtyl, Isopropyl, Butyl und Allyl. Araliphatische Gruppen umfassen (monocarbocyclisches Aryl) Alkylgruppen, wie Benzyl. Arylgruppen umfassen mono- und bicyclische Gruppen, wie Phenyl, Toluyl und Naphtyl. Heterocydische Gruppen umfassen fünf- und sechsgliedrige Ringe, die vorzugsweise ein einzelnes Heteroatom enthalten, wie Furyl, Thienyl und Pyridyl.
Mögliche Substituenten in Kohlenwasserstoffgruppen R, R¹, R² und R³ umfassen Hydroxyl, verethertes Hydroxyl (z. B. C&sub1;&submin;&sub5;- Alkoxy wie Methoxy), verestertes Hydroxyl (z. B. C&sub1;&submin;&sub6;-Acyloxy wie Acetoxy), verethertes Thiol, N-(C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl)amino, N-(C&sub1;&submin;&sub6;- acyl) amino, N-(C&sub1;&submin;&sub6;-Acyl)-N-(C&sub1;&submin;&sub6;-alkyl) amino, Carbamoyl, N-(C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl)carbamoyl und Halogen. Aromatische Ringe können C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylgruppen tragen, wie z. B. in Toluylgruppen. Substituenten können zusammen vorkommen, so dass z. B. N-Acyl- und N- Alkylgruppen Hydroxyl- oder veretherte oder veresterte Hydroxylgruppen tragen können.
Geeignete Vernetzungsmittel zur Stabilisierung erfindungsgemäßer biologisch verträglicher Matrizen umfassen Verbindungen mit der Formel
A-M-B,
worin M eine vernetzende, divalente Gruppierung und die Gruppen A und B, die gleich oder verschieden sein können, gegebenenfalls in Verbindung mit der Gruppe, an die sie gebunden sind, gegenüber der biologisch verträglichen Matrix reaktive, funktionelle Gruppen sind, z. B. wie die zuvor beschrieben.
Die Gruppe M kann weitere Gruppen tragen, die gegenüber der Matrix reaktiv sind, so dass ein noch größerer Vernetzungsgrad entsteht.
Die Gruppe M sollte vorzugsweise keine Kettenlänge von mehr als 50, besonders bevorzugt von nicht mehr als 30 Atomen haben und kann z. B. eine Alkylen- oder Alkenylengruppe (z. B. bis zu 30, beispielsweise bis zu 10 Kohlenstoffatome, wie Methylen oder Ethylen, enthaltend), eine Cycloalkylengruppe (z. B. bis zu 30, beispielsweise bis zu 10 Kohlenstoffatome enthaltend), eine Arylengruppe (z. B. bis zu 30, beispielsweise bis zu 20 Kohlenstoffatome enthaltend), eine Aralkylengruppe (z. B. bis zu 20 Kohlenstoffatome enthaltend) oder eine heterocyclische Gruppe (z. B. bis zu 30, beispielsweise bis zu 20, Kohlenstoffatome und mindestens ein Heteroatom ausgewählt unter O, N und S enthaltend) sein.
Biologisch abbaubare Gruppen M können z. B. die Form
-R&sup8;-E-R&sup9;-
besitzen, worin R&sup8; und R&sup9;, die gleich oder verschieden sein können, divalente, organische Gruppen darstellen, die gegebe nenfalls durch ein oder mehrere Heteroatome unterbrochen sind und/oder einen oder mehrere Substituenten tragen, die solche Heteroatome enthalten (z. B. Gruppen tragen, die gegenüber der Matrix reaktiv sind, und/oder weitere inerte Gruppen), und die Gruppe E eine Estergruppierung z. B. der Formel -O.CO- oder -O.CO.O- ist, oder eine Diester- oder Diamidgruppe nach Formel (I) gemäß obiger Definition.
Eine nützliche Klasse von Vernetzungsmitteln kann durch die Formel
wiedergegeben werden (worin A, B, R&sup8;, R&sup9;, X, Y, Z, m und n wie oben definiert sind; R1a und R2a wie R¹ und R² definiert sind, außer dass sie Gruppen X.Y.(Z)m.R&sup8;.A oder -X.Y.(Z) n.R&sup9;.B darstellen anstelle von Gruppen -X.Y.(Z)m-)
Eine zweite nützliche Klasse von Vernetzungsmitteln kann durch die Formel
dargestellt werden (worin X, Y, Z, m, R1a, R2a, R&sup8; und A die oben definierten Bedeutungen besitzen und L eine Abgangsgruppe ist). Solche Verbindungen können mit Verbindungen der Formel
R¹&sup0;.(Z)n.Y.X.H (IV)
umgesetzt werden (worin X, Y, Z und n wie zuvor definiert sind und R¹&sup0; für ein Wasserstoffatom oder eine organische Gruppe steht, oder mit geeigneten, reaktiven Derivaten davon (z. B. Alkalimetallsalze von Verbindungen der Formel (IV), die Säuren sind), um die biologisch abbaubaren Bindungen nach Formel (I) zu erzeugen.
Es ist erkennbar, dass R¹&sup0; eine organische Gruppe darstellen kann, so dass z. B. die Verbindung (III) zu einer Verbindung der Formel (II) oder einem Präkursor dafür reagieren kann. Alternativ kann die Gruppe R¹&sup0; ein Substrat, das vernetzt werden soll, darstellen; zusätzlich zu dem -(Z)n.Y.X.H Substituenten oder seinem reaktiven Derivat besitzt ein solches Substrat eine bezüglich -A oder -R&sup8;A in Formel (III) reaktive, funktionelle Gruppierung.
Die divalenten organischen Gruppen R&sup8; und R&sup9; in den obigen Formeln können z. B. ausgewählt werden unter Alkylen- und Alkenylengruppen (z. B. bis zu 20 oder vorzugsweise bis zu 10 Kohlenstoffatome enthaltend), Cycloalkylengruppen (vorzugsweise mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen), Arylengruppen (einen oder mehrere aromatische Ringe enthaltend und vorzugsweise mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen), Aralkylengruppen (vorzugsweise mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen, die über die Aryl- und/oder Alkylteile gebunden sein können - solche Aralkylengruppen umfassen z. B. zwei Arylgruppen, die über eine Alkylenkette verbunden sind) und heterocyclische Gruppen (mit einem oder mehreren He teroatomen, vorzugsweise ausgewählt unter O, N und S und vorzugsweise mit bis zu 20 Kohlenstoffatomen). Die Gruppen können Substituenten tragen, z. B. wie oben für R, R¹, R² und R³ beschrieben und/oder Substituenten wie Oxo- oder Thiogruppen. Die Kohlenstoffketten können durch Heteroatome wie O, N, S oder P unterbrochen sein, z. B. in Verbindung mit Oxosubstituenten, zur Bildung von Verbindungen, wie Ester-, Thioester- oder Amidgruppen. Die Anwesenheit von Disulfidbrücken kann auch aufgrund ihrer inhärenten, biologischen Abbaubarkeit vorteilhaft sein.
Es ist erkennbar, dass die Gruppen R&sup8; und/oder R&sup9; so ausgewählt werden können, dass sie eine oder mehrere Gruppen nach Formel (I) umfassen und dass die Gruppe -R&sup8;.A in Formel (III) so beschaffen sein kann, dass sie in der Gruppierung
endet (worin X, Y, Z, m, R1a, R2a und L wie oben definiert sind), die biologisch abbaubare Bindungen nach Formel (I) erzeugen kann.
Abgangsgruppen L in Verbindungen gemäß Formel (III) umfassen Halogenatome, wie Chlor oder Brom und Sulfonyloxygruppen, wie Mesyloxy oder Tosyloxy.
Vernetzungsmittel gemäß den Formeln (II) und (III) können nach jedem geeigneten Verfahren hergestellt werden. So können z. B. ein oder zwei Mol einer Verbindung der Formel
A.R&sup8;.(Z)mY.X.H (V)
(worin X, Y, Z, m, R&sup8; und A wie zuvor definiert sind, wenn nötig und/oder gewünscht, kann A und jede andere reaktive Gruppe geschützt werden), oder eines funktionellen Derivats davon (z. B. ein Salz, beispielsweise ein Alkalimetallsalz, wie ein Kalium oder Cäsiumsalz, einer Verbindung (V), die eine Säure ist), mit einem Mol einer Verbindung der Formel
umgesetzt werden (worin R1a, R2a und L wie zuvor definiert sind), um Verbindungen gemäß Formel (III) und symmetrische Verbindungen gemäß Formel (II) zu erhalten. Wenn eine unsymmetrische Verbindung gemäß Formel (II) benötigt wird, können alternativ z. B. äquimolare Mengen einer Verbindung gemäß Formel (V) oder funktioneller Derivate davon und einer Verbindung der Formel
(worin X, Y, Z, n, R1a, R2a, R&sup9;, B und L wie oben definiert sind, wobei wenn nötig und/oder gewünscht, B und jede andere reaktive Gruppe geschützt werden kann) miteinander umgesetzt werden. Solche Reaktionen werden normalerweise in Lösung durchgeführt, z. B. in polaren Lösungsmitteln, wie Dimethylformamid.
Symmetrische Verbindungen gemäß Formel (II), in denen R2a ein Wasserstoffatom ist, m und n für 0 stehen, jedes Y eine Carbonylgruppe ist und jedes X für -O- steht, kann auch durch Umsetzung einer Verbindung der Formel
A.R&sup8;.CO.OH (VIII)
(worin A und R&sup8; wie zuvor definiert sind, wobei, wenn nötig und/oder gewünscht, A und jede andere reaktive Gruppe geschützt werden kann) mit einem Aldehyd der Formel
R1a.CHO (IX)
(worin R1a wie zuvor definiert ist) in Gegenwart eines sauren Katalysators, wie Salzsäure, hergestellt werden; Wasser kann, falls gewünscht, durch azeotrope Destillation aus der Reaktionsmischung entfernt werden.
Verbindungen gemäß Formel (III), in denen L ein Halogenatom ist, können auch durch Reaktion einer Verbindung gemäß obiger Formel (V), besonders einer Verbindung, in der Y für eine Carbonylgruppe und X für -O- steht, mit einem Arylthioether der Formel
hergestellt werden (worin R1a und R2a wie zuvor definiert sind und R¹¹ eine Arylgruppe, wie Phenyl, darstellt), z. B. in einem polaren Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, in Gegenwart einer Base, wie Pyridin, um eine Verbindung der Formel
zu erhalten (worin alle Symbole wie zuvor definiert sind), und Halogenierung dieses Thioethers, z. B. durch Reaktion mit Sulfurylchlorid in einem Lösungsmittel, wie Dichlormethan, oder mit Brom in einem Lösungsmittel, wie Tetrachlorkohlenstoff, um eine Verbindung (III) in der L für Chlor oder Brom steht, zu erhalten.
Alternativ können Verbindungen gemäß Formel (III) durch Reaktion von Verbindungen gemäß obiger Formel (V), mit einem Chlorsulfat gemäß Formel
hergestellt werden (worin R1a, R2a und L wie zuvor definiert sind, wobei L vorzugsweise für Chlor steht) z. B. unter Verwendung des von Binderup et al. in Synth. Comm. 14(9) (1984), S. 857-864 beschriebenen Verfahrens.
Als Schutzgruppen, die in Verbindung mit A und B und anderen anwesenden, reaktiven Gruppen verwendbar sind, können z. B. die in der Technik herkömmlich verwendeten sein. So können z. B. Carboxylgruppen unter Verwendung reduktiv spaltbarer Estergruppen, wie Benzyl und Hydroxylgruppen, können unter Verwendung säurespaltbarer, etherbildender Gruppen, wie Triphenylmethyl, geschützt werden.
Man kann auch Verbindungen gemäß den Formeln (II) und (III) herstellen, die Vorstufen für die A.R&sup8;-Gruppen (und/oder -R&sup9;.B-Gruppen, wo es zweckmäßig ist) enthalten und solche Präkursorgruppen anschließend zu den gewünschten reaktiven Gruppierungen umsetzen. So können z. B. Verbindungen, in denen A und/oder B Epoxidgruppen darstellen, durch Oxidation von Präkursoren hergestellt werden, die an geeigneter Position (z. B. terminal) ethylenartig ungesättigte Bindungen enthalten (z. B. unter Verwendung eines Oxidationsmittels, wie Metachlorperbenzoesäure), oder durch Umsetzung von Verbindungen, die an geeigneter Position Hydroxylgruppen (z. B. phenolische Hydroxylgruppen) enthalten, mit Reagenzien, wie Epichlorhydrin; Verbindungen, in denen A.R&sup8;- und/oder -R&sup9;.B Enolethergruppen darstellen, können z. B. durch säurekatalysierte Eliminierung entsprechender Acetale oder Ketale hergestellt werden. Hydroxylgruppen enthaltende Präkursoren können auch z. B. durch Reaktion mit Sulfonylhalogeniden, wie Mesyl- oder Tosylchlorid aktiviert werden, um reaktive Abgangsgruppe, wie Mesylat oder Tosylat, zu erhalten oder durch Reaktion mit α,β-ungesättigten Alkenoylhalogeniden, wie Acryloylchlorid, zu α,β-ungesättigten Estern umgesetzt werden.
Verbindungen gemäß Formel (VII), in denen L ein Halogenatom darstellt, können z. B. durch Umsetzen von Verbindungen der Formeln
und
Hal.Y.(Z)n.R&sup9;.B (XIII)
(worin Hal ein Halogenatom ist und die restlichen Symbole die oben definierten Bedeutungen besitzen) hergestellt werden, z. B. in Gegenwart einer Base, wie Pyridin.
Die Herstellung einer Reihe von Vernetzungsmitteln der Formeln (II) und (III) wird in unserer internationalen Patentanmeldung No. PCT/EP92/00717 genauer beschrieben, auf deren Inhalt hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung haben die Ultraschallkontrastmittel lipophile Gruppen und/oder Moleküle kovalent an die biologisch verträgliche Matrix gebunden, falls gewünscht, in Form einer Umhüllung. So können z. B. Fette kovalent an Produkte, wie gasenthaltende Partikel von Kohlenhydraten, wie Galactose, Galactose/Stärkemischungen oder Xylose, oder Röntgenkontrastmittel wie Iohexol, Iodixanol oder Metrizamid gebunden werden, so dass ihre Stabilität auf kontrollierte Weise gesteigert wird, z. B. durch Verminderung ihrer Löslichkeit.
Für diesen Zweck nützliche Fette umfassen Derivate von Fettsäuren (z. B. langkettige Alkan- oder Alkensäuren, vorzugsweise mit 10 bis 50, z. B. mit 10 bis 30 Kohlenstoffatomen, wie Caprinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Linolensäure, Behensäure, Docosandicarbonsäure oder Melissensäure), Aralkansäuren (z. B. Phenylsubstituierte niedere Alkansäuren wie, 2-Phenylbuttersäure), Cholesterolderivate (z. B. Cholansäuren, wie 5β- Cholansäure) und andere biologisch verträgliche Fette, die eine oder mehrere funktionelle Gruppen, wie Säurechlorid oder Anhydridgruppen, oder aktivierte Alkengruppe besitzen, die kovalent an Substituenten, wie Hydroxylgruppen, gebunden werden können. So können z. B. oberflächenaktive Substanzen, wie Poloxamere ("Pluronics"), verestert werden, um eine a,β-ungesättigte niedere Alkenoylgruppe, wie eine Acryloylgruppe, einzuführen, die mit Hydroxylgruppen in biologisch verträglichen Matrizen, wie Kohlenhydraten, kovalente Bindungen bildet.
Die lipophilen Gruppen und/oder Moleküle können so beschaffen sein, dass sie auch als Vernetzungsmittel wirken; solche Gruppen können z. B. durch Reaktion mit geeigneten bi- oder polyfunktionellen Lipidderivaten eingeführt werden.
Zusätzlich zu oder alternativ zu Luft kann jedes biologisch verträglich Gas in den erfindungsgemäßen Kontrastmitteln verwendet werden, z. B. Stickstoff, Sauerstoff, Wasserstoff, Distickstoffoxid, Kohlendioxid, Hehum, Argon, Schwefelhexafluorid und gegenbenenfalls fluorierte Kohlenwasserstoffe mit niedrigem Molekulargewicht, wie Methan, Acetylen oder Kohlenstofftetrafluorid. Der Begriff "Gas", wie er hier verwendet wird, umfasst jede Substanz, die bei 37 ºC gasförmig ist. Das Gas kann in dem Kontrastmittel so enthalten sein, dass es vor der Verwendung des Produkts keinen Kontrast ergibt, aber bei Verabreichung wirksam wird, z. B. wenn das Gas beim Auflösen der löslichen Matrix Mikrobläschen erzeugt. Die Geschwindigkeit der Erzeugung von Mikrobläschen kann so z. B. durch Auswahl eines geeigneten Grades der Vernetzung oder Lipid-Bindung kontrolliert werden.
Gaspräkursoren, die in erfindungsgemäßen Kontrastmitteln zweckmäßig sind, umfassen Carbonate und Dicarbonate (z. B. Natrium- oder Ammoniumcarbonat) und Aminomalonsäureester.
Für Anwendungen in der Echokardiographie kann es günstig sein, Mikrobläschen und Mikropartikel mit einer durchschnittlichen Größe von 0,1 - 10 µm, z. B. 1 - 7 µm zu verwenden, um eine freie Passage durch das Pulmonalsystem und Resonanz mit der bevorzugten Abbildungsfrequenz von etwa 0,1 - 15 MHz zu erreichen; die Verwendung von Mikropartikeln mit einer durchschnittlichen Größe von 1 - 2 µm zur Erzeugung von Mikrobläschen mit einer durchschnittlichen Größe von 4 - 7 µm ist im Allgemeinen vorteilhaft. Wesentlich größere Bläschen und Partikel, z. B. mit durchschnittlichen Größen von bis zu 500 µm, können jedoch bei anderen Anwendungen, z. B. bei Abbildungen des Gastrointestinaltraktes günstig sein.
Die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der Erfindung:

Präparat 1

Gemahlene D-(+)-Galactose

20 g kommerziell erhältliche D-(+)-Galactose (Reinst pH.Ned.Merck) wurden in einer Aluminiumkugelmühle mit Aluminiumkugeln (3 x 1,5 cm Durchmesser) zwei Stunden lang vermahlen. Die erhaltene Pulvermischung bestand aus Kristallen und Aggregaten von Galactose mit Partikelgrößen im Bereich von 1 - 100 µm (gemessen durch Lichtstreuung, Malvern Mastersizer).

Präparat 2

Gemahlene D-(+)-Galactose/Stärke

5 g kommerziell erhältliche D-(+)-Galactose (Reinst Ph.Ned, Merck) wurden mit 5 g kommerziell erhältlicher Stärke (Reppal PSM 70, Reppe glykos, Schweden) gemischt und in einer Edelstahlkugelmühle (Retsch Zentrifugenkugelmühle, S 1) in einem 50 ml Mahlbecher und mit 3 x 20 mm Kugeln 10 Minuten lang zermahlen.

Präparat 3

Gemahlene Xylose

10 g kommerziell erhältliche D-(+)-Xylose (BHD) wurde in einer Edelstahlkugelmühle in einem 50 ml Mahlbecher mit 3 x 20 mm Kugeln 10 Minuten lang zermahlen.

Präparat 4

Gemischtes Anhydrid aus Palmitinsäure und Kohlensäuremonoisobutylester

Palmitinsäure (5,0 g, 19,5 mmol) wurde mit Triethylamin (1,97 g, 19,5 mmol) unter Stickstoff in trockenem Acetonitril suspendiert. Die Suspension wurde nach einstündigem Rühren zu einem dicken Brei. Chlorameisensäureisobutylester (2,66 g, 19,5 mmol) wurde unter Kühlung im Eisbad auf einmal zugegeben. Nach 30 Minuten wurde die Reaktion noch unter Rühren bei Zimmertemperatur über Nacht fortgeführt. Die resultierende Suspension wurde filtriert und das rosafarbene Filtrat bei 30 ºC bis zur Trockne eingedampft, wobei 7,8 g eines rosa/weißen Feststoffs erhalten wurden. Ein ¹³C-NMR bestätigte die Strukur des gemischten Anhydrids.

Präparat 5

Gemischtes Anhydrid aus 5-β-Cholansäure und Kohlensäuremonoisobutylester

5-β-Cholansäure (Sigma, 3,6 g, 10 mmol) wurde in Diethylether (100 ml) gelöst. Triethylamin (1,38 ml, 10 mmol) wurde zugefügt und die Reaktionsmischung auf 0 ºC abgekühlt. Chlorameisensäureisobutyl- ester (1,37 g, 10 mmol) wurde unter starkem Rühren innerhalb von 2 Minuten tropfenweise zugegeben. Nach der Bildung eines voluminösen Niederschlags wurde Diethylether (100 ml) zugegeben. Es wurde noch 40 Minuten bei 0º C gerührt, dann das Eisbad entfernt und weitere 60 Minuten gerührt.
Der Niederschlag wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat in einen Scheidetrichter überführt und mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung (25 ml) und Wasser (2 x 25 ml) extrahiert und über MgSO&sub4; getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, wobei eine halbfeste, wachsartige Substanz in 80 %iger Ausbeute erhalten wurde. Das Produkt wurde durch ¹³C- NMR charakterisiert: Säure-CO:168,37 ppm, Kohlensäure-CO:149,36 ppm.

Präparat 6

Gemischtes Anhydrid aus Melissensäure und Kohlensäuremonoisobutylester

Melissensäure (Sigma, 0,5 g, 1,1 mmol) wurde in Diethylether (25 ml) gelöst. Triethylamin (151 µl, 1,1 mmol) wurde zugefügt und die Reaktionsmischung auf 0 ºC abgekühlt. Chlorameisensäureisobutylester (151 µl, 1,1 mmol) wurde unter starkem Rühren innerhalb von 2 Minuten tropfenweise zugefügt. Die Reaktionsmischung wurde wie in Präparat 5 beschrieben behandelt und das Produkt mittels ¹³C-NMR charakterisiert: Säure-CO:168,596 ppm, Kohlensäure-CO: 149,728 ppm.

Präparat 7

Gemischtes Anhydrid aus Docosandicarbonsäure und Kohlensäuremono-isobutylester

Docosandicarbonsäure (Fluka, 1 g, 2,7 mmol) wurde in Diethylether (25 ml) gelöst. Triethylamin (747 µl, 2,7 mmol) wurde zugefügt und die Reaktionsmischung auf 0 ºC gekühlt. Chlorameisensäureisobutylester (743 µl, 2,7 mmol) wurde unter starkem Rühren innerhalb von 2 Minuten tropfenweise zugefügt. Die Reaktionsmischung wurde wie bei Präparat 5 beschrieben behandelt und das Produkt durch ¹³C-NMR charakterisiert: Säure-CO:168,049 ppm, Kohlensäure-CO: 149,359 ppm.

Präparat 8

Bis(acryloyl)pluronic F68

Pluronic F68 (Fluka, 8,35 g, 1 mmol) wurde in Toluol (50 ml) gelöst und unter Stickstoff auf 50 º C erhitzt. Triethylamin (1,4 ml, 10 mmol) wurde zugefügt. Acryloylchlorid (Fluka, 0,94 g, 10 mmol) in Toluol (10 ml) wurde unter Rühren innerhalb von 10 Minuten zugefügt. Das Rühren wurde bei 50 ºC fortgeführt; Bestimmung mit TLC zeigte nach 2 Stunden den vollständigen Verbrauch des Eduktes an. Der Niederschlag wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat unter starkem Rühren in Diethylether (750 ml) eingegossen. Der Niederschlag wird filtriert, in Toluol (30 ml) unter Erhitzen wieder gelöst und tropfenweise zu einer 1:1 Mischung von Diethylether und Pentan (500 ml) unter starkem Rühren zugefügt. Die erhaltene Mischung wurde über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt, wonach das ausgefallene Produkt filtrie und im Vakuum getrocknet wurde. Ausbeute: 7 g. Das Produkt wurde mittels FT-IR charakterisiert: CO 1724 cm&supmin;¹, verschwinden von OH bei 3500 cm&supmin;¹.

Beispiel 1

Gemahlene D-(+)-Galactose kovalent an Palmitinsäure gebunden

In einem verschließbaren 25 ml Kolben wurden 1,00 g gemahlene Galactose, die wie in Präparat 1 beschrieben hergestellt wurde, unter Stickstoff eingefüllt und mit 6 mg Palmitinsäure-Kohlensäure-monoisobutylesteranhydrid, hergestellt wie in Präparat 4, gelöst in 10 ml trockenem Methylenchlorid, unter Stickstoff versetzt. Der verschlossene Kolben wurde 18 Stunden bei Zimmertemperatur sanft geschüttelt. Der feste Inhalt wurde filtriert, mehrere Male mit Methylenchlorid gewaschen und 24 Stunden bei Zimmertemperatur und 50 mbar in einem Exsikkator über Calciumchlorid getrocknet. Das erhaltene Produkt war ein weißer Feststoff mit demselben Aussehen wie das Edukt. Gewicht: etwa 1 g.

Beispiele 2 - 21

Die Prozedur des Beispiels 1 wurde unter Verwendung der Säurederivate, die in Tabelle 1 aufgelistet sind, in der angegebenen Menge wiederholt. Tabelle 1

Beispiele 22-24

Gemahlene D-(+)-Galactose/Stärke (1:1), die wie in Präparat 2 beschrieben hergestellt wurde, wurde mit den in Tabelle 2 angegebenen Stoffen in den angegebenen Mengen unter Verwendung der Prozedur von Beispiel 1 umgesetzt. Tabelle 2

Beispiel 25

Gemahlene Xylose, die wie in Präparat 3 beschrieben hergestellt wurde, wurde unter Verwendung der Prozedur des Beispiels 1 mit 0,2 % Gew./Gew. Behensäureanhydrid (Sigma) umgesetzt.

Beispiel 26

Reaktion von Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) mit gemahlener D-(+)-Galactose

Gemahlene D-(+)-Galactose (6,0 g), die wie in Präparat 1 beschrieben hergestellt wurde, wurde in trockenem Aceton suspendiert und Carbonyldiimidazol (Fluka, 7,32 g, 45,1 mmol) wurde zugefügt. Nach 30-minütigem Rühren bei Zimmertemperatur wurde der Feststoff abfiltriert und mit trockenem Aceton (3 x 50 mml) auf dem Filter gewaschen. Der Feststoff wurde in trockenem Methylenchlorid (50 ml) resuspendiert und eine Lösung von Dioleoylphosphatidylethanolamin (zur Verfügung gestellt von Hafslund Nycomed Pharma, Österreich, 1,00 g, 1,43 mmol) in trockenem Methylenchlorid (30 ml) wurde zugefügt. Der verschlossene Reaktionskolben wurde bei Zimmertemperatur 72 Stunden geschüttelt. Der Feststoff wurde abfiltriert und auf dem Filter mit Methylenchlorid (3 x 50 ml) gewaschen. Der leicht gelbe Feststoff (5,5 g) wurde in einem Exsikkator über Calciumchlorid aufbewahrt.

Beispiel 27

6-O-Palmitoyl-D-galactopyranose

(A) 6-O-Palmitoyl-1,2,3,4-diisoproyliden-D-galactopyranose

1,2,3,4-Diisoproyliden-D-galactopyranose (Sigma, 13,4 g, 51,3 mmol) und Triethylamin (7,15 ml, 51,3 mmol) wurden in Methylenchlorid (150 ml) gelöst und auf 0 ºC abgekühlt. Palmitinsäurechlorid (Aldrich, 14,1 g, 51,3 mmol) gelöst in Methylenchlorid (100 ml) wurde unter Rühren innerhalb einer Stunde tropfenweise zugefügt. Das Kältebad wurde entfernt und die Reaktionsmischung über Nacht gerührt. Der Niederschlag wurde abfiltriert, das Filtrat in einen Scheidetrichter überführt und mit Wasser (3 x 50 ml) extrahiert, über MgSO&sub4; getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand war ein leicht braunes Öl, das unter Bildung wachsartiger Kristalle fest wurde. Rohausbeute: 23 g. Das Rohprodukt wurde ohne weitere Reinigung eingesetzt. Ein kleiner Anteil wurde für die Charakterisierung umkristallisiert. FT-IR: CO 1734 cm&supmin;¹. ¹³C-NMR: Ester CO-172,79 ppm. Smp.:124-127 ºC.

(B) 6-O-Palmitoyl-D-galactopyranose

6-O-Palmitoyl-1,2,3,4,-diisopropyliden-D-galactopyranose (6 g) wurde in Essigsäure (25 ml) gelöst und unter Stickstoff 6 Stunden auf 100 ºC erwärmt. Während des anschließenden Abkühlens auf Zimmertemperatur fiel das Produkt aus und wurde bei Zimmertemperatur über Nacht stehen gelassen. Die Kristalle wurden abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 3,3 g. Das Produkt wurde durch FT-IR charakterisiert: CO 1734 cm&supmin;¹, OH 3464 cm&supmin;¹.

Beispiel 28

6-O-Palmitoyl-D-galactopyranose/Galactosemischung

(A) D-(+)-Galactose (2 g) wurde in gereinigtem Wasser (2,87 g) gelöst und steril filtriert. 6-O-Palmitoyl-D-galactopyranose (0,25 g), die wie in Beispiel 27 beschrieben hergestellt wurde, wurde in Ethanol (3 g) gelöst und steril filtriert. Die Lösung der Palmitoyl-galactopyranose wurde zu der Galactoselösung un ter Rühren zugefügt und die ganze Mischung im Vakuum (10 Torr, 50 ºC) zur Trockne eingedampft. Das Produkt wurde über Nacht im Exsikkator getrocknet.

(B) Die Prozedur (A) wurde unter Verwendung von 6-O-Palmitoyl- D-galactopyranose (0,50 g) gelöst in Ethanol (6 g) wiederholt.

Beispiel 29

Iohexol funktionalisiert mit Palmitinsäure

Ein verschließbarer 25 ml Kolben wurde mit 1,00 g Iohexol (NY- COMED, das wie in Präparat 1 beschrieben in einer Kugelmühle gemahlen wurde, unter Stickstoff befüllt. In den Kolben wurden 35 mg Palmitinsäure-Kohlensäure-monoisobutylester-Anhydrid (hergestellt wie in Präparat 4 beschrieben), gelöst in 10 ml trockenem Methylenchiond unter Stickstoff, zugegeben und der verschlossene Kolben wurde 18 Stunden bei Zimmertemperatur sanft geschüttelt. Der Feststoff wurde abfiltriert und mehrere Male mit Methylenchlorid gewaschen und über Calciumchlorid bei Zimmertemperatur und 50 mbar 24 Stunden im Exsikkator getrocknet. Das erhaltene Produkt war ein weißer Feststoff mit dem gleichen Aussehen wie das Edukt. Gewicht: etwa 1 g. Eine Probe des Produkts wurde unter einem Mikroskop in Wasser gegeben und dabei wurden einige Gasblasen beobachtet.

Beispiel 30

Iodixanol funktionalisiert mit Palmitinsäure

1,00 g Iodixanol, in einer Kugelmühle wie in Präparat 1 beschrieben gemahlen, wurde mit 12 mg Palmitinsäure-Kohlensäuremonoisobutylester-Anhydrid (hergestellt wie in Präparat 4 beschrieben) unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 29 umgesetzt. Etwa 1 g weißer Feststoff mit demselben Aussehen wie das Edukt wurde zurückerhalten. Wie in Beispiel 29 konnte unter dem Mikroskop die Entwicklung von Gasbläschen beobachtet werden, wenn das Produkt in Wasser gegeben wurde.

Beispiel 31

Metrizamid funktionalisiert mit Palmitinsäure

1,00 g Amipaque, wie in Präparat 1 beschrieben in einer Kugelmühle gemahlen, wurden mit 15 mg Palmitinsäure-Kohlensäuremonoisobutylester-Anhydrid (hergestellt wie in Präparat 4 beschrieben) unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 29 umgesetzt. Etwa 1 g weißer Feststoff mit demselben Aussehen wie das Edukt wurden zurückgewonnen. Unter dem Mikroskop konnte die Entwicklung von vielen Gasbläschen beobachtet werden, wenn das Produkt in Wasser gegeben wurde.

Beispiel 32

D-(+)-Galactose vernetzt mit Methylendiacrylat

(A) Methylendiacrylat

Eine Kaliumhydroxidlösung (1,00 M, 40,00 ml) wurde zu Acrylsäure (2,88 g, 40,00 mmol) bei 0 ºC gegeben und die Lösung 16 Stunden lang gefriergetrocknet. Trockenes DMF (200 ml) wurde zugefügt und die Suspension in einer trockenen N&sub2;-Atmosphäre auf 60 ºC erhitzt. Diiodmethan (1,61 ml, 20,00 mmol) wurde während 10 Minuten in zwei Portionen zugefügt und die Reaktionsmischung 4 Tage bei 60 ºC stehen gelassen. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck (0,05 mm Hg) entfernt und Diethylether (140 ml), gesättigte wässrige Natriumhydrogencarbonatlösung (50 ml) und Wasser (50 ml) wurden zugegeben. Die wässriqe Schicht wurde mit Diethylether (6 x 60 ml) extrahiert und die vereinigten Etherextrakte mit Wasser (4 x 50 ml) gewaschen, getrocknet (MGSO&sub4;) und eingedampft, wobei 1,06 g (34 %) Produkt erhalten wurden. ¹H-NMR (60 MHz, CDCl&sub3;): 5,81 - 6,61 (2 x CH&sub2;=CH-,m), 5,84 (CH&sub2;,s).

(B) Gemahlene D-(+)-Galactose vernetzt mit Methylendiacrylat

Ein verschließbarer 25 ml Kolben wurde mit gemahlener D-(+)- Galactose, hergestellt wie in Präparat 1 beschrieben, unter Stickstoff befüllt und Methylendiacrylat (500 mg), gelöst in trockenem Methylenchlorid (10 ml), wurden unter Stickstoff zugefügt. Der verschlossen Kolben wurde 18 Stunden bei Zimmertemperatur sanft geschüttelt. Der feste Inhalt wurde filtriert und mehrere Male mit Methylenchlorid gewaschen und über Calciumchlorid in einem Exsikkator bei 5 mbar und Zimmertemperatur 24 Stunden getrocknet. Das resultierende Produkt war ein weißer Feststoff mit dem gleichen Aussehen wie das Edukt. Gewicht: etwa 0,96 g.

Beispiel 33

Reflektionsvermögen in vitro

10 ml Propylenglycol gemischt mit 90 ml einer Lösung von 5 % Dextrose in Wasser wurden als Trägerflüssigkeit zur Bestimmung des Reflektionsvermögens der Produkte aus den Beispielen verwendet. 1,0 g des zu testenden Produkts wurden in 3,0 ml der Trägerflüssigkeit dispergiert und 15 Sekunden geschüttelt. Die resultierende Mischung wurde zu 52 ml einer 5 %-igen Humanserumalbumininfusionslösung in der Messzelle zugeführt, die akustische Wirkung der Produkte wurde durch Messung der akustischen Transmission durch die Probe unter Verwendung eines 5 MHz Breitbandmesswandlers in Pulsreflektionstechnik untersucht. Die Temperatur in der Messzelle wurde auf 37 ºC stabilisiert und die Zirkulation der Flüssigkeit durch Rühren mit einer konstan ten Geschwindigkeit aufrechterhalten. Die Ultraschalltransmission durch die Proben wurde als Funktion der Zeit über 390 Sekunden gemessen. Die Ergebnisse wurden mit einer Referenzmessung von 55 ml einer 5 %-igen Humanserumalbumininfusionslösung normiert.
Die Ergebnisse für einige beispielhaft ausgewählte Produkte und Vergleichsergebnisse für unveränderte, gemahlene D-(+ )-Galactose, die wie in Präparat 1 beschrieben hergestellt wurde, sind in der angefügten Figur dargestellt. Es ist erkennbar, dass die erfindungsgemäßen Produkte in vitro einen starken Effekt auf die Abschwächung des Ultraschalls zeigen, wobei der Effekt mehrere Minuten anhält.

Claims

1. Ultraschallkontrastmittel in Form von Mikropartikeln, umfassend eine biologisch verträgliche Matrix, die mit einem Gas oder einem Präkursor dafür assoziiert ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikropartikel durch kovalente Bindung an die Matrix stabilisiert sind.

2. Ultraschallkontrastmittel nach Anspruch 1, worin die biologisch verträgliche Matrix ein Kohlenhydrat ist.

3. Ultraschallkontrastmittel nach Anspruch 2, worin das Kohlenhydrat Galactose ist.

4. Ultraschallkontrastmittel nach Anspruch 1, worin die biologisch verträgliche Matrix ein Röntgenkontrastmittel ist.

5. Ultraschallkontrastmittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Mikropartikel in Form von Aggregaten mit einer Aggregatgröße von 30-50 Mikrometern aus Mikropartikeln mit einer Partikelgröße von 5-10 Mikrometern vorliegen.

6. Ultraschallkontrastmittel nach Anspruch 5, wobei die Aggregate durch Vermahlen in einer Kugelmühle hergestellt wurden.

7. Ultraschallkontrastmittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Mikropartikel durch die Anwesenheit vernetzender Gruppen stabilisiert sind.

8. Ultraschallkontrastmittel nach Anspruch 7, worin die vernetzenden Gruppen biologisch abbaubare Bindungen enthalten, die ausgewählt sind unter Amid-, Imid-, Imin-, Ester-, Anhydrid-, Acetal-, Carbamat-, Carbonat-, Carbonatester- und Disulfidgruppen.

9. Ultraschallkontrastmittel nach Anspruch 8, worin die netzenden Gruppen biologisch abbaubare Bindungen der Formel (I)

enthalten (worin jeder der Reste X, die gleich oder verschieden sein können, ausgewählt ist unter -O-, -S- und - NR-, worin R für ein Wasserstoffatom oder eine organische Gruppe steht; jeder der Reste Y, die gleich oder verschieden sein können, für eine Carbonyl-, Thiocarbonyl-, Sulfonyl-, Phosphoryl- oder eine ähnliche säurebildende Gruppe steht; jeder der Reste Z, die gleich oder verschieden sein können, ausgewählt ist unter -O-, -S- und -NR-, worin R wie oben definiert ist; m und n, die gleich oder verschie den sein können, jeweils für 0 oder 1 stehen; und R¹ und R², die gleich oder verschieden sein können, jeweils ausgewählt sind unter Wasserstoffatomen, einwertigen organischen Gruppen und Gruppen der Formel -X.Y.(Z)m gemäß obiger Definition, oder R¹ und R² zusammen eine zweiwertige organische Gruppe bilden).

10. Ultraschallkontrastmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die Mikropartikel durch kovalente Bindung lipophiler Gruppen und/oder Moleküle stabilisiert sind.

11. Ultraschallkontrastmittel nach Anspruch 10, worin die Mikropartikel durch kovalente Bindung lipophiler Grupen stabilisiert sind, die von einer Fettsäure, einer Aralkansäure oder einem Cholesterin-, Poloxamer- oder Phospholipidderivat abgeleitet sind.

12. Ultraschallkontrastmittel nach Anspruch 11, worin die lipophilen Gruppen von Caprinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Linolensäure, Behensäure, Docosandicarbonsäure, Melissinsäure, Phenylbuttersäure, 5β-Cholansäure, Bis- (acryloyl)pluron-F68- oder Dioleylphosphatidylethanolamin abgeleitet sind.

13. Ultraschallkontrastmittel nach Anspruch 1, worin das Gas Luft ist oder das Gas oder der Präkursor davon ausgewählt ist unter Stickstoff, Sauerstoff, Wasserstoff, Distickstoffoxid, Kohlendioxid, Helium, Argon, Schwefelhexafluorid, Kohlenwasserstoffen mit niedrigem Molekulargewicht, fluorierten Kohlenwasserstoffen mit niedrigem Molekulargewicht und Gemischen davon mit Luft.

14. Ultraschallkontrastmittel nach Anspruch 1, enthaltend einen Präkursor, der ausgewählt ist unter Carbonaten, Bicarbonaten und Aminomalonatestern.