DE69200916T2

DE69200916T2 - Vorrichtung zum messen des ph-wertes einer probe, methode zur anwendung einer solchen vorrichtung und anwendungen.

Info

Publication number: DE69200916T2
Application number: DE69200916T
Authority: DE
Inventors: Jean-Marie Le Fontenelle G4 F-34090 Montpellier Devoisselle; Vincent F-59130 Lambersart Maunoury; Serge F-59491 Villeneuve-D'ascq Mordon
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1991-01-04
Filing date: 1992-01-03
Publication date: 1995-04-13
Anticipated expiration: 2012-01-04
Also published as: JPH06503979A; JP3151669B2; CA2099571C; DE69200916D1; FR2671405B1; WO1992012412A3; EP0565599A1; EP0565599B1; WO1992012412A2; FR2671405A1; CA2099571A1; US5370119A

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Messung des pH- Werts einer geeigneten Probe, insbesondere eines Tumors, ein Verfahren zur Verwendung der Vorrichtung sowie ihre Anwendungen, insbesondere zur Kontrolle der Behandlung von Tumoren durch Hyperthermie.
Die Früherkennung von Tumoren ist zur Verbesserung ihrer Prognose essentiell; indes sind Tumore von Organen oder von Geweben oft schwierig nachzuweisen, und im Falle von Speiseröhrenkrebs beispielsweise hat die Einführung der Oesophagus-Fibroskopie die Frühdiagnose nicht verbessert.
Andere Methoden zur Frühdiagnose wurden vorgeschlagen und bedienen sich mehrerer Techniken:
1. Fixierung eines Kontrastmittels oder eines Färbemittels und die Diagnose durch Abbildung. Das Färbemittel kann entweder eine große Affinität für die Nucleinsäuren (beispielsweise Toluidin-Blau) besitzen oder im Gegenteil keine Fixierung am Tumor besitzen (Lugol beispielsweise reagiert nur mit dem Glykogen des differenzierten malpighischen Epithels); schließlich erfolgt die Diagnostik unter Verwendung von Photosensibilisatoren, die einen Fluoreszenzgipfel bzw. -peak bei einer geeigneten Anregung durch Licht ergeben (Photodiagnostik). Diese Techniken sind mit dem Erhalt eines Fluoreszenzgradienten zwischen dem gesunden Gewebe und dem Tumorgewebe verbunden, der die auswählende Fixierung oder die spezielle Zurückhaltung des Markers durch den Tumor notwendig macht. Andernfalls hängen diese Techniken von zahlreichen Faktoren und insbesondere der Vaskularisation, der Nekrose und der phagozytären Kapazität des Tumors ab.
2. Verwendung von monoclonalen Antikörpern oder Vektorbildung des Markers durch Liposomen; diese Technik besitzt bei alleiniger Anwendung den Nachteil, daß spezifische und kostspielige Reagentien benötigt werden.
3. Spektraluntersuchung der emittierten Fluoreszenz. Dieses zuletzt genannte Verfahren, bei dem keine spezifischen Reagentien verwendet werden müssen, kann die vorstehend genannten Nachteile vermeiden. Als Diagnoseverfahren unter Verwendung der Spektraluntersuchung der emittierten Fluoreszenz sind zu nennen:
- das von S. ANDERSSON-ENGELS et al. vorgeschlagene Diagnoseverfahren (Lasers in Medical Science, 1988, 4, 171- 181), das die Lokalisation und die Detektion von atheromatischen Plaques durch Messung der durch einen Laser als Anregunglichtquelle induzierten Autofluoreszenz beschreibt;
- die Diagnose von Tumoren durch Analyse der Fluoreszenz, die insbesondere beschrieben wurde in:
. dem Artikel von R.R. ALFANO et al., erschienen in J. Quantum Electronics, 1984, Bd. OE-20, 12, 1507-1511, der die Messung der durch eine Laserquelle induzierten Autofluoreszenz sowohl an Krebsgeweben als auch an gesunden Geweben beschreibt und der zeigt, daß die spektralen Profile der Krebsgewebe sich von denjenigen der gesunden Gewebe unterscheiden.
. und die Verfahren durch hervorgerufene Fluoreszenz, wie in dein Artikel von A.E. PROFIO et al., erschienen in Med. Phys., 1984, 11, 4, 516-520, näher ausgeführt wird, der ein Fluorometer zur endoskopischen Diagnose von Tumoren beschreibt. Genauer, ein fluoreszierendes Hematoporphyrin derivat wird injiziert und dann wird der Tumor durch Detektion der emittierten Fluoreszenz charakterisiert. Die Anregungsquelle ist ein violettes Licht, das durch eine optische Faser bis zum Endoskop geleitet wird, während die einittierte Fluoreszenz sowie das reflektierte violette Licht in einer anderen optischen Faser gebündelt werden.
Die Fluoreszenz im roten Licht und im violetten Licht werden mit Hilfe eines dichroitischen Spiegels und eines Filters getrennt und mit Hilfe von Photomultiplikatoren detektiert. Dieses Verfahren besitzt den Nachteil, daß kleine Tumore schwierig zu lokalisieren sind, es absolut abhängig von den Meßbedingungen ist, und daß der Konzentrationsgradient zwischen dem gesunden Gewebe und dem Tumorgewebe gering ist, wobei außerdem ein Risiko der Phototoxizität für die Haut besteht.
- Ein anderes Verfahren durch hervorgerufene Fluoreszenz ist in dem Patent GB Nr. 2 126 717 A näher ausgeführt, das eine Vorrichtung zur Diagnose und Behandlung von Krebsarten beschreibt.
Diese Vorrichtung umfaßt mindestens eine gepulste Laserquelle, ein Mittel zur Detektion von Bildern, ein Mittel zur Kontrolle und ein Endoskop. Das Ende des Endoskops ist gegenüber dem Ort, an dem ein photosensibles Produkt mit einer Affinität für Krebs absorbiert wurde, so daß die Diagnose des Krebses durch Exposition des befallenen Organismus gegenüber der Laserquelle durchgeführt werden kann.
Dieses Verfahren besitzt den Nachteil, daß es ebenso von den Meßbedingungen abhängig ist.
Die Verfahren zur Diagnose von Tumoren durch Fluoreszenz, die im Stand der Technik vorgeschlagen sind, besitzen ausserdem den Hauptnachteil, daß sie absolute Techniken sind, die zahlreiche falsche positive oder falsche negative Werte mit sich bringen, da sie von den Meßbedingungen (Position der Aufnahmefasern beispielsweise oder Struktur des zu untersuchenden Gewebes) abhängig sind.
Eine bestimmte Anzahl von Druckschriften beschreibt Optroden (optische Elektroden) zur Messung des pH-Werts (Medical & Biological Engineering & Computing, 1987, 25, 5, 597-604; IEEE Transactions on Biocheinical Engineering, 1986, BME-33, 117-132), jedoch besitzen derartige Optroden den Hauptnachteil, daß sie in einem bildgebenden System insofern nicht verwendet werden können, als sie nur eine punktuelle Messung am Kontaktpunkt mit dem betroffenen Gewebe erlauben.
Folglich liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung und ein Verfahren bereitzustellen, die die Lösung des Problems des Nachweises eines Tumors, der durch die Methoden aus dem Stand der Technik schwierig nachzuweisen ist oder deren Ergebnisse schwierig zu interpretieren sind, erlauben und ebenso die Lösung des Problems der gegenseitigen Abhängigkeit von den Meßbedingungen, auf die man in den im Stand der Technik vorgeschlagenen Systemen trifft (A.E. PROFIO et al.); in der Tat ist die Lösung dieses Problems entscheidend für den Erhalt von Ergebnissen, die zuverlässig sind und mit denen falsche positive und falsche negative Werte vermieden werden können.
Die Erfinder haben dazu die Messungen des zellulären Metabolismus und insbesondere die Messung des intrazellulären pH-Werts mit Hilfe von Fluoreszenzmarkern mit pH-abhängigen Spektren, wie insbesondere in J.A. THOMAS et al., (Biochem., 1979, 18, 2210-2218) ausgeführt wurde, verwendet, der die Spektraleigenschaften von Fluorescein und von 6-Carboxyfluorescein (6-CF), die pH-abhängig sind, mit dem Ziel, einen gegebenenfalls vorhandenen Tumor nachzuweisen, beschreibt. Die Absorption bei 490 nm (peak) unter Bezugnahme auf die Absorption bei 465 nm (isosbestischer Punkt, d.h. PH-unabhängig) zeigt, daß die Absorption bei pH 7,8 größer ist als bei pH 6,25.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Messung des pH-Werts einer Probe, vom Typ umfassend eine Lichtquelle mit der Eignung zur Auswahl von mindestens zwei Anregungswellenlängen der Fluoreszenz eines fluoreszierenden Markers, der auf der Probe fixiert ist und dessen Fluoreszenzemissionsspektrum pH-abhängig ist und ein Mittel zum Nachweis und zum Ablesen der emittierten Fluoreszenz, das dadurch gekennzeichnet ist, daß
* sie zur Messung des pH-Werts ohne direkten Kontakt mit der Probe:
- mindestens ein Überträgermittel der Lichtquelle in die Probe,
- mindestens ein Mittel zur Aufnahme der emittierten Fluoreszenz,
- ein System zur Berechnung des pH-Werts der Probe aus dem Verhältnis der emittierten Fluoreszenzsignale, die als Folge von mindestens zwei Anregungswellenlängen erhalten wurden,
umfaßt, und
*daß die Lichtquelle mit einem Mittel zum Umschalten von einer Anregungswellenlänge in die andere verbunden ist.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Vorrichtung umfaßt das Mittel zur Übertragung der Lichtquelle mindestens eine optische Faser.
Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der Vorrichtung umfaßt das Mittel zur Aufnahme der Fluoreszenz mindestens eine optische Faser.
Unter optischer Faser versteht man im Sinne der Erfindung jede Faser aus einem dielektrischen Material mit der Eignung, beispielsweise elektromagnetische sichtbare oder infrarote Wellen weiterzuleiten.
Erfindungsgemäß sind das Übertragungmittel und/oder das Mittel zur Aufnahme in einem Endoskop vereinigt, das mit einem Bildverstärker verbunden ist, der seinerseits mit einer Videokamera verbunden ist.
Unter Endoskop werden im Sinne der vorliegenden Erfindung sowohl die klassischen Endoskope, d.h. die Apparate, mit denen das Innere einer Höhle des menschlichen Körpers erhellt und sichtbar gemacht werden soll als auch die Fibroskope, d.h. elastische Endoskope, die aus einem Bündel extrem feiner optischer Fasern gebildet sind, verstanden.
Gemäß einer vorteilhaften Vorrichtung dieser zuletzt genannten Ausführungsform sind das Überträgermittel und/oder das Aufnahmemittel in dem Endoskop eingeschlossen.
Eine derartige Vorrichtung erlaubt den gleichzeitigen Erhalt eines Fluoreszenzbildes und eines sichtbaren Bildes der Probe.
Das Mittel zur Messung der von einer markierten Probe emittierten Fluoreszenzsignale ist vorteilhafterweise ein Spektrophotometer und umfaßt mindestens einen optischen Filter, mindestens einen Photomultiplikator und/oder mindestens einen Photodetektor zur Umwandlung der Lichtsignale und ein Mittel zur Weiterleitung der entsprechenden elektrischen Signale in ein System zur Berechnung des pH-Werts.
Die pH-empfindlichen Fluoreszenzmarker sind insbesondere in dem Artikel, der von R.Y. TSIEN (Methods in Cell Biology, 1989, 30, 127-156) erschienen ist, beschrieben, worin insbesondere ausgeführt ist, daß die folgenden Fluoreszenzmarker Fluorescein, an Dextran oder an ein anderes inertes Molekül konjugiertes Fluorescein (DF), 5- und/oder 6-Carboxyfluorescein (CF), 2',7'-Bis-(carboxyethyl) -5- und/oder 6-carboxyfluorescein (BCECF) und ihre Ester, Pyramin (8-Hydroxypyren-1,3,6-trisulfonat), 4-Methylumbelliferon oder 4- Methyl-7-hydroxycumarin (4-MU), 3,6-Dicyanohydrochinon (DHPN), SNARF-1 und -2SNAF (Semi-Naphthorhodofluor bzw. Semi-Naphthofluorescein), ein Wellenlängenpaar ergeben, dessen Anregungsverhältnis mit dem pH-Wert steigt.
Diese Marker erlauben insbesondere die Messung des pH-Werts des Cytosols.
Erfindungsgemäß ist der Fluoreszenzmarker vorteilhafterweise mit Liposomen und/oder geeigneten monoclonalen Antikörpern assoziiert.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung umfaßt das System zur Berechnung des pH-Werts vorteilhafterweise ein Mittel zur Berechnung des Verhältnisses der Signale der emittierten Fluoreszenz, erhalten als Folge von mindestens zwei Anregungswellenlängen und ein Mittel zur Ablesung des dem erhaltenen Verhältnis entsprechenden pH-Werts auf einer Eichkurve des Markers als Funktion des pH-Werts.
Gemäß einer vorteilhaften Vorrichtung dieser Ausführungsform umfaßt das System zur Berechnung ebenso ein System zur Kontrolle des Mittels zum Umschalten.
Ein derartiges System wird insbesondere durch einen geeigneten Mikrocomputer wiedergegeben, der den gleichzeitigen Erhalt des pH-Werts als Funktion der Verhältnisse der Signale der emittierten Fluoreszenz und die Kontrolle des Mittels zum Umschalten von einer Anregungswellenlänge zur anderen erlaubt.
Wenn die Probe eine Zelle, ein Gewebe oder ein Organ ist, besitzt die erfindungsgemäße Vorrichtung die folgenden Vorteile:
- die Messung des pH-Werts wird in situ ohne direkten Kontakt mit der Zelle, dem Gewebe oder Organ durchgeführt;
- diese Messung des pH-Werts erlaubt den Nachweis eines Tumors, da die Tumorzellen einen saureren pH-Wert als die normalen Zellen insofern besitzen, als die Tumorzellen im allgemeinen anoxisch sind und somit auf eine anaerobe Glykolyse zurückgreifen, deren Folge die Bildung von Milchsäure ist. Diese PH-Messung ist zuverlässig, da bei ihr ein Verhältnis von Fluoreszenzintensitäten bei zwei verschiedenen Wellenlängen verwendet wird, das die Abhängigkeit von den Meßparametern (insbesondere Struktur der Probe, Winkel zwischen der Aufnahmefaser und der durch die Probe emittierten Fluoreszenz) vermeidet, was bei Fluoreszenzmessungen oft wichtig ist, und was den Erhalt von Signalen guter Qualität und gegebenenfalls ihre Verstärkung erlaubt.
Die Erfindung betrifft auch eine Vorrichtung zur Kontrolle der Hyperthermie bei der Behandlung von Tumoren durch Hyperthermie, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Messung des pH-Werts in Kopplung an ein geeignetes Mittel zur Erhitzung des Tumors umfaßt.
Das Mittel zur Erhitzung des Tumors wird vorteilhafterweise unter den folgenden Mitteln ausgewählt: Laserquelle, Mikrowellen, Ultraschall, Radiofrequenz oder Kreislauf von heissein Wasser.
Erfindungsgemäß ist das Mittel zur Erhitzung insbesondere mit einem Mittel zur Focussierung der produzierten Wärme in Richtung Tumor, insbesondere einer Sonde, einem Katheter oder einem externen Fühler verbunden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Erhalt charakteristischer Informationen bezüglich der zeitlichen Entwicklung des pH-Werts einer geeigneten Probe, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
- die zu analysierende Probe mit einem Fluoreszenzmarker in Kontakt bringt, der mindestens zwei Anregungspeaks und einen Emissionspeak besitzt und dessen Emissionsspektrum pH-abhängig ist,
- man die so behandelte Probe mittels der Anregungswellenlängen des Fluoreszenzmarkers anregt,
- den pH-Wert der zu analysierenden Probe ausgehend von dem Verhältnis der Signale der emittierten Fluoreszenz, erhalten als Folge von mindestens zwei Anregungswellenlängen, durch Ablesen des pH-Werts entsprechend dem erhaltenen Verhältnis auf einer Eichkurve des Markers als Funktion des pH-Werts, berechnet.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens wird vor dem Inkontaktbringen der zu analysierenden Probe mit dem Fluoreszenzmarker die Probe mit einem Zucker, insbesondere Glucose, in Kontakt gebracht.
Das Inkontaktbringen der Probe mit dem Zucker macht das Verfahren insofern noch empfindlicher, als es die weitere Verringerung des pH-Werts der Tumorgewebe bezüglich der gesunden Gewebe und somit die Erhöhung des Unterschieds zwischen dem Tumorgewebe und dem gesunden Gewebe erlaubt.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Fluoreszenzmarker insbesondere aus der Gruppe umfassend Fluorescein, an Dextran oder ein anderes inertes Molekül konjugiertes Fluorescein (DF), 5- und/oder 6-Carboxyfluorescein (CF), 2',7'-Bis-(carboxyethyl)-5- und/oder -6-carboxyfluorescein (BCECF) und ihren Estern, Pyramin-(8-hydroxypyren-1,3,6-trisulfonat), 4-Methylumbelliferon oder 4-Methyl-7-hydroxycumarin (4-MU), 3,6-Dicyanohydrochinon (DHPN), SNARF-1 und SNAF-2 (Semi- Naphthorhodofluor und Semi-Naphthofluorescein) ausgewählt
Gemäß einer vorteilhaften Vorrichtung dieser Ausführungsform ist der Fluoreszenzmarker an Liposome und/oder geeignete monoclonale Antikörper gebunden.
Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen und das erfindungsgemäße Verfahren werden vorteilhafterweise auf die Messung des pH-Werts von Tumoren, insbesondere solchen, die nur endoskopisch zugänglich sind, angewendet und erlauben das Verfolgen des pH-Werts des Tumors an verschiedenen Punkten und der Entwicklung der Behandlung durch Hyperthermie der Tumore, was die Berechnung der benötigten thermischen Dosis, unabhängig vom Punkt des Tumors, möglich macht. In der Tat unterscheidet sich die anzuwendende thermische Dosis entsprechend dem pH-Wert.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung erlaubt auch die Kontrolle der tatsächlichen Zeit der anzuwendenden thermischen Dosis.
Außer den vorstehend beschriebenen Vorrichtungen umfaßt die Erfindung noch andere Vorrichtungen, die aus der nachstehenden Beschreibung hervorgehen, die sich auf Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens und eine ausführliche Beschreibung der erfindungsgemäßen Vorrichtung unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren bezieht. Darin
- zeigen die Figuren 1 und 2 schematisch zwei Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Messung des pH-Werts;
- zeigt die Figur 3 das kinetische Fluoreszenzprofil von zwei gesunden Proben (S&sub1; und S&sub2;);
- zeigt die Figur 4 die Wirkung von 5,6-CF auf die Werte des Verhältnisses der Intensitäten der emittierten Fluoreszenz aus zwei gesunden Zonen der Haut, berechnet ausgehend von den Fluoreszenzintensitäten, die bei 490 und 465 nm erhalten wurden;
- zeigt die Figur 5 das kinetische Profil der Fluoreszenz von normalen und Tumorgeweben nach Injektion von 250 ul 5,6-CF in einer Konzentration von 10&supmin;³ M;
- zeigt die Figur 6 die Wirkung eines gesunden Gewebes oder eines Tumorgewebes auf die Werte der Verhältnisse, die Fluoreszenzintensitäten berechnet ausgehend von Intensitäten, erhalten bei 490 und 465 nm;
- zeigt die Figur 7 die Entwicklung des Fluoreszenzemissionsspektruins von 5,6-DF als Funktion des pH-Werts;
- zeigt die Figur 8 die Kalibrierungskurve von 6-CF als Funktion des pH-Werts;
- zeigt die Figur 9 den Einfluß des pH-Werts auf eine Behandlung durch Hyperthermie;
Es ist jedenfalls zu verstehen, daß diese Beispiele nur der Erläuterung des Gegenstands der Erfindung dienen und in keiner Weise eine Beschränkung darstellen.
Die Figur 1 zeigt eine schematische Ansicht der erfindungs gemäßen Vorrichtung zur Messung des pH-Werts, umfassend:
- eine Anregungsquelle 10, die in der dargestellten Ausführungsform und in keiner Weise beschränkend eine Bogenlampe USHIO 155 XENON (USHIO, JAPAN) 101, einen sphärischen Spiegel mit einem Krümmungsradius von 3 cm 102, einen Kondensor 66061 ORIEL 103 (ORIEL, USA), eine Konvergenzlinse mit einem Durchmesser von 7,5 cm und einer Brennweite von 200 mm 104, Interferenzfilter 105, die bei 450 nm, 465 nm, 490 nm und 500 nm zentriert sind, und die Auswahl der gewünschten Wellenlängen erlauben, umfaßt. Ein Mittel zum Umschalten 106 oder ein Commutator erlaubt die Umschaltung von einer Anregungswellenlänge in die andere. Eine letzte Linse 20 mit einem Durchmesser von 22,4 mm erlaubt die Focussierung des Lichts in das Innere einer 600 um Übertragungsfaser 30 (O.N. = 0,48). Die angelegte Spannung beträgt 3 mW in einer Breite von 10 nm. Die Übertragungsfaser ist in Kontakt mit der Probe 40, insbesondere einem Gewebe, dessen pH-Wert in situ zu analysieren ist;
- eine Aufnahmefaser 50 mit einem Durchmesser von 600 um ist mit einem Monochromator MC1-03 (OPTOMETRICS, USA) 60 verbunden, der mit einem Photomultiplikator 70 (MINI-CHROM; Bande 300 nm bis 800 nm) verbunden ist;
- das Signal wird in der angegebenen Ausführungsform auf einem Voltmeter DIPITOL 80 abgelesen;
- das System zur Berechnung wird durch einen Mikrocomputer 90 dargestellt, mit dem das System zur Aufnahme (Aufnahmefaser 50, Monochromator 60 und Photomultiplikator 70) und das Mittel zum Umschalten 106 verbunden sind.
Das System zur Berechnung erlaubt die Berechnung des Verhältnisses der Signale der emittierten Fluoreszenz, erhalten aus zwei für den verwendeten Marker geeigneten Anregungswellenlängen, anschließend die Berechnung des pH-Werts der Probe 40 entsprechend dem erhaltenen Verhältnis auf einer Eichkurve des Markers als Funktion des pH-Werts.
Die Figur 2 zeigt eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Messung des pH-Werts, worin die Aufnahmefaser 50' in einem Endoskop 51 eingeschlossen ist, was so den gleichzeitigen Erhalt eines Fluoreszenzbildes und eines sichtbaren Bildes erlaubt.
Die in Figur 2 dargestellte Vorrichtung umfaßt:
. eine Fluoreszenzanregungswelle 10', deren Eigenschaften denjenigen der in Beispiel 1 beschriebenen Quelle identisch sein können, die mit einer Vorrichtung zur Umschaltung der Anregungswellenlängen 106' verbunden ist, die vorteilhafterweise durch einen Computer 901 kontrolliert sein kann. Der Umschalter 106' ist mit der Probe 40' über eine Übertragungsfaser 30' vom gleichen Typ wie in Beispiel 1 verbunden;
. ein Endoskop 51, das eine Lichtquelle 501, einen Verschluß 502 und ein Bündel geeigneter Fasern 503 umfaßt;
. eine Aufnahmefaser 50', die in einem Endoskop 51 eingeschlossen ist, das mit einem Filter 61 zur Auswahl der Emissionswellenlänge (beispielsweise 515 nm, wenn der Marker 6-CF ist) oder einem Monochromator verbunden ist; sie ist einerseits mit einem Bildverstärker 52 verbunden, der selbst mit einer Kamera 53 verbunden ist und andererseits mit einer Videokamera 54, die den Erhalt eines Bildes der Probe erlaubt.
Die Fluoreszenzsignale (Fluoreszenzbild) und das Bild im Sichtbaren werden zu dem Mikrocomputer 901 geleitet.
Das Aufnahmesystem (Aufnahmefaser 50', Filter 61 oder Monochromator, Bildverstärker 52, Kamera 53), das Endoskop 51, die Videokamera 54 und der Computer 901 stellen ein Abbildungssystem dar, das gleichzeitig die Speicherung von Bildern und von Fluoreszenzspektren erlaubt.
Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen erlauben die Messung des pH-Werts einer Probe.
Man verfährt wie folgt: die Messung wird an CDF-Mäusen, die eine lymphoide Leukämie P388 besitzen, durchgeführt.
Der Tumor wird subkutan an einer Seite der Maus transplantiert. Die Spontanentwicklung des Tumors ist reproduzierbar. Der Tumor mit einem Durchmesser von 20 mm wird 12 Tage nach der Transplantation erhalten.
Eine intraperitoneale Injektion von 250 ul 5,6-CF in einem 0,9% NaCl-Puffer in einer Konzentration von 10&supmin;³ M, 5.10&supmin;³ M oder 10&supmin;&sup4; M (5 mg/kg, 2,5 mg/kg oder 0,5 mg/kg) wird am Tag 12 durchgeführt.
Vor der Messung der Fluoreszenz und der Berechnung des pH- Werts des Tumors werden die Tumorzone und ein entsprechendes gesundes Gewebe rasiert.
Die Injektion von 5,6-CF wird als Zeitpunkt Null angenommen, und die Fluoreszenzintensitäten werden zu den Zeitpunkten -3 Minuten, +3 Minuten, anschließend alle 10 Minuten während 1 Stunde gemessen.
Kontrolltests werden an der normalen Haut und an den Tumoren, die noch keinen Kontakt mit dem Fluoreszenzmarker hatten, durchgeführt.
Die Figur 3, bei der auf der Abszisse die Zeit in Minuten und auf der Ordinate die Fluoreszenzintensitäten aufgetragen sind, zeigt die verschiedenen kinetischen Profile zwischen zwei Zonen der gesunden Gewebe (S1 und S2). Die maximalen Fluoreszenzintensitäten können relativ verschieden sein. Die maximalen Intensitäten werden im Verlauf von 5 bis 30 Minuten erhalten, aber unterscheiden sich für jedes Gewebe. Die Unterschiede in den kinetischen Profilen können die Folge von insbesondere Störungen in den Nachweisbedingungen in den zwei Zonen sein. Die Kurven 1 und 2 zeigen die kinetischen Profile des Gewebes S2 bei 465 bzw. 490 nm und die Kurven 3 und 4 zeigen die kinetischen Profile des Gewebes S1 bei 465 bzw. 490 nm.
Die Figur 4 zeigt, daß unabhängig von den Fluoreszenzintensitäten in den beiden Zonen die Unterschiede die Verhältniswerte, die konstant bleiben und für die beiden Zonen S1 und S2 zwischen 15 Minuten und 50 Minuten nach der Injektion quasi identisch sind, nicht beeinflussen.
Die Figur 5 zeigt die Fluoreszenzintensitäten, die als Funktion der Zeit an einem gesunden Gewebe (- -) und an einem Tumorgewebe (- -) erhalten wurden. Diese Figur zeigt die kinetischen Profile, die nach Injektion von CF in einer Konzentration von 10&supmin;³ M erhalten wurden. Die Fluoreszenz der normalen Gewebe liegt über derjenigen der Tumorgewebe.
Die Figur 6 zeigt die Werte der Verhältnisse I&sub4;&sub9;&sub0;/I&sub4;&sub6;&sub5; und zeigt, daß sehr wohl ein signifikanter Unterschied zwischen den gesunden Geweben und den Tumorgeweben vorhanden ist.
Die Ergebnisse zeigen, daß das Eindringen des Anregungs lichts ausreicht, um die spektralen Änderungen der Fluoreszenz durch das Verfahren der Verhältnisse nachzuweisen, und erlauben den Erhalt des pH-Werts im Tumor; in der Tat, die Figur 7 zeigt die Entwicklung des Spektrums der Fluoreszenzemission von Carboxyfluorescein als Funktion des pH- Werts und die Figur 8 zeigt die Eichkurve von 5,6-CF als Funktion des pH-Werts.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt ebenso die Bewertung der thermischen Dosis (Dauer und Zeit), die notwendig ist, um die Tumorzellen zu zerstören, als Funktion des pH-Werts der Zellen.
Die Figur 9 zeigt den Einfluß des pH-Werts auf die Resistenz der eine Hyperthermie unterworfenen Zellkulturen.
Aus den vorstehenden Ausführungen folgt, daß die Erfindung in keiner Weise auf diejenigen Ausführungsformen, Durchführungsformen und Anwendungen beschränkt sind, die ausführlicher beschrieben wurden. Sie umfaßt im Gegensatz dazu alle Variationen, die einem Fachmann auf dem Gebiet einfallen können, ohne vom Umfang oder Gehalt der vorliegenden Erfindung wie beansprucht abzuweichen.

Claims

1. Vorrichtung zur Messung des pH-Werts einer Probe vom Typ umfassend eine Lichtquelle (101) mit der Eignung zur Auswahl von mindestens zwei Anregungswellenlängen der Fluoreszenz eines fluoreszierenden Markers, der auf der Probe fixiert ist und dessen Fluoreszenzemissionsspektruin pH-abhängig ist und ein Mittel zum Nachweis und zum Ablesen der emittierten Fluoreszenz (60, 70, 80; 61, 52, 53) dadurch gekennzeichnet, daß

* sie zur Messung des pH-Werts ohne direkten Kontakt mit der Probe:

- mindestens ein Überträgermittel (30, 30') der Lichtquelle in die Probe (40, 40'),

- mindestens ein Mittel zur Aufnahme (50, 50') der emittierten Fluoreszenz,

- ein System zur Berechnung des pH-Werts der Probe aus dem Verhältnis der emittierten Fluoreszenzsignale, die als Folge von mindestens zwei Anregungswellenlängen (90, 901) erhalten wurden,

umfaßt, und

* daß die Lichtquelle mit einem Mittel zum Umschalten (106, 106') von einer Anregungswellenlänge in die andere verbunden ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Überträgermittel der Lichtquelle mindestens eine optische Faser umfaßt.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zur Aufnahme der Fluoreszenz mindestens eine optische Faser umfaßt.

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Überträgermittel und/oder das Mittel zur Aufnahme mit einem Endoskop (51) verbunden sind, welches an einen Bildverstärker (52) gekoppelt ist, der seinerseits an eine Videokamera (53) angeschlossen ist.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Überträgermittel und/oder das Mittel zur Aufnahme in dem Endoskop eingeschlossen sind.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Fluoreszenzmarker vorteilhafterweise mit Liposomen und/oder geeigneten monoclonalen Antikörpern assoziiert ist.

7 Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das System zur Berechnung des pH-Werts vorteilhafterweise ein Mittel zur Berechnung des Verhältnisses der Signale der emittierten Fluoreszenz, die als Folge von mindestens zwei Anregungswellenlängen erhalten wurden, und ein Mittel zur Ablesung des pH-Werts entsprechend dem erhaltenen Verhältnis auf einer Eichkurve des Markers als Funktion des pH-Werts umfaßt.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das System zur Berechnung ebenso ein System zur Kontrolle des Mittels zur Umschaltung umfaßt.

9. Vorrichtung zur Kontrolle der Hyperthermie bei der Behandlung von Tumoren durch Hyperthermie dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Vorrichtung zur Messung des pH-Werts nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zusammen mit einem geeigneten Erhitzungsmittels für den Tumor umfaßt.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zur Erhitzung mit einem Mittel zur Fokussierung der produzierten Wärme, insbesondere einer Sonde, einem Katheder oder einer Außenantenne verbunden ist.

11. Verfahren zur Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zum Erhalt charakteristischer Informationen bezüglich der zeitlichen Entwicklung des pH-Werts einer geeigneten Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man

- die zu analysierende Probe mit einem Fluoreszenzmarker in Kontakt bringt, der mindestens zwei Anregungsgipfel und einen Emissionsgipfel besitzt und dessen Emissionsspektrum pH abhängig ist,

- man die so behandelte Probe mittels der Anregungswellenlängen des Fluoreszenzmarkers anregt,

- die durch die zu analysierende Probe als Folge der Anregungswellenlängen einittierte Fluoreszenz mißt und

- den pH-Wert der zu analysierenden Probe ausgehend von dem Verhältnis der Signale der emittierten Fluoreszenz, erhalten als Folge von mindestens zwei Anregungswellenlängen, durch Ablesen des pH-Werts entsprechend dem erhaltenen Verhältnis auf einer Eichkurve des Markers als Funktion des pH-Werts berechnet.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß vor dem In-Kontakt-Bringen der zu analysierenden Probe mit dem Fluoreszenzmarker die Probe mit einem Zucker, insbesondere Glucose, in Kontakt gebracht wird.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Fluoreszenzmarker, insbesondere aus der Gruppe umfassend Fluorescein, an Dextran oder ein anderes inertes Molekül (DF) konjugiertes Fluorescein, 5-und/oder 6-Carboxyfluorescein (CF) 2',7'-Bis-5- und/oder 6-(carboxyethyl)carboxyfluorescein (BCECF) und ihre Ester, Pyramin (8-Hydroxypyrrol-1,3,6-trisulfonat), 4-Methylumbelliferon oder 4-Methyl-7-hydroxycumarin (4-MU), 3,6-Dicyanohydrochinon (DHPN), 1-SNARF und 2-SNARF (jeweils Semi-Naphthorhodofluor und Semi-Naphthofluorescein) ausgewählt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Fluoreszenzmarker mit geeigneten Liposomen und/oder geeigneten monoclonalen Antikörpern assoziiert ist.