DE69133383T2

DE69133383T2 - Menschliche zellinie, die 5 prokarzinogen-aktivierende enzyme kodierende cdnas stabil exprimiert

Info

Publication number: DE69133383T2
Application number: DE69133383T
Authority: DE
Inventors: B. Charles CRESPI; W. Bruce PENMAN
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1990-10-15
Filing date: 1991-10-10
Publication date: 2004-09-09
Anticipated expiration: 2011-10-11
Also published as: WO1992007085A1; DE69133383D1; EP0555315A1; JPH06504428A; AU8878191A; ATE265536T1; EP0555315B1; JP3519080B2; EP0555315A4

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft allgemein die Gebiete Biochemie, Molekularbiologie, Pharmakologie und Toxikologie und insbesondere eine gentechnisch veränderte Zellinie, die bei Mutagenitäts-, Toxizitäts- und Stoffwechselstudien vorteilhaft ist.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die P450-Cytochrome stellen eine große Familie von Hämproteinen dar, die in der Lage sind, Xenobiotika wie beispielsweise Arzneimittel, Prokarzinogene und Umweltgifte sowie Endobiotika wie beispielsweise Steroide, Fettsäuren und Prostaglandine abzubauen. Viele Säugetier-Zellinien haben die Fähigkeit, Cytochrom-P450-katalysierte Reaktionen durchzuführen, zum großen Teil oder gänzlich verloren. Diese Limitierung hat Studien zum Cytochrom-P450-vermittelten Stoffwechsel entweder auf Primärzellen oder Gewebehomogenate beschränkt. Der Mangel an geeigneten endogenen P450-Cytochromen hat auch zur Aufnahme von extrazellulären Stoffwechselsystemen, üblicherweise Nagetier-Leberhomogenate, in Tests geführt, die zur Bestimmung genotoxischer Wirkungen auf Promutagene und Prokarzinogene vorgesehen sind.
Kürzlich haben mehrere Laboratorien P450-Cytochrom-cDNAs erfolgreich in Säugetier-Zellinien transfiziert. Nahezu alle Zellinien wurden durch Transfizieren einer einzelnen P450-cDNA in die Ziel-Zellinie entwickelt. Obwohl diese Zellinien zur Untersuchung der P450-spezifischen Aktivierung von Pro karzinogenen vorteilhaft sein können, ist es angesichts der Vielzahl von in vivo exprimierten P450-Formen klar, daß die Verwendung von Zellinien, die ein einzelnes P450 exprimieren, aufgrund der großen Zahl benötigter Zellinien zum Untersuchen von Verbindungen auf mutagene Wirkung eine gewaltige Aufgabe sein wird. Entsprechend wäre es wünschenswert, eine kleine Zahl von Zellinien zu verwenden, die mehrere P450 exprimiert. Noch wünschenswerter wäre es, eine einzige Zellinie zur Verfügung zu haben und zu verwenden, die alle menschlichen P450-Formen exprimiert, die primär für die Aktivierung von Prokarzinogenen in menschlichen Mikrosomen verantwortlich sind.
Die Aufgabe, eine Zellinie zu schaffen, die mehrere P450 exprimiert, weist deutliche Hindernisse auf. Da die P450-Gene eine erhebliche Homologie aufweisen, wäre es zu erwarten, daß eine einzelne Zellinie, die mit mehreren P450 transfiziert ist, aufgrund der Wahrscheinlichkeit von Inter- oder Intra-Vektor-Rekombination instabil ist. Darüber hinaus wäre Instabilität weiter auch in einer Zellinie zu erwarten, die mehrere tranfizierte Promotoren enthält, da die Promotoren sich gegenseitig stören. Diese und andere Nachteile werden durch die erfindungsgemäßen Verfahren und Zellinien überwunden.
ZUSAMMENFASSENDE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Nach der Erfindung werden sowohl eine Zellinie, die eine Vielzahl von P450 exprimiert, als auch Verfahren zur Herstellung solcher Zellinien und Verwendungen solcher Zellinien bereitgestellt.
In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung demgemäß eine unsterbliche Säugetier-Zellinie bereit, die minde stens vier verschiedene transfizierte P450-Cytochrome unterhalb des Niveaus stabil exprimiert, das die P450-Expression in der Zellinie instabil macht, wobei die P450-Cytochrome P450IA2 und P450IIIA4 einschließen. Bevorzugt schließen die P450 P450IA2, P450IIE1 und P450IIIA4 ein.
In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung eine unsterbliche Säugetier-Zellinie bereit, die mindestens vier verschiedene transfizierte P450-Cytochrome unterhalb des Niveaus stabil exprimiert, das die P450-Expression in der. Zellinie instabil macht, wobei die P450-Cytochrome P450IIA3 und P450IIIA4 einschließen. Bevorzugt schließen die P450 P450IIA3, P450IIE1 und P450IIIA4 ein.
In bevorzugten Ausführungsformen von jedem der Aspekte der Erfindung schließen die P450-Cytochrome P450IA2, P450IIA3, P450IIE1 und P450IIIA4 ein.
Zellinien gemäß jedem Aspekte der Erfindung können mit den Plasmiden pME23, wie aus 4 ersichtlich, und pH441., wie aus 5 ersichtlich, transfiziert sein. Für die Zellinien gemäß der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, daß sie menschliche Zellinien sind, und für die P450-Cytochrome, daß sie menschlich sind.
In einem dritten Aspekte stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Durchführung eines Stoffwechsel-, Toxizitätsoder Mutagenitätstests, umfassend die Verwendung einer Zellinie gemäß dem ersten und/oder zweiten Aspekt der Erfindung, bereit. Das Verfahren kann das Exponierung einer Kultur einer Zellinie gemäß dem ersten und/oder zweiten Aspekt der Erfindung gegenüber einer Testsubstanz und Untersuchen der metabo lischen, toxischen und/oder mutagenen Wirkungen der Substanz, sofern vorhanden, auf die Zellinie umfassen.
In bevorzugten Ausführungsformen, umfaßt das erfinderische Verfahren die Schritte des

(a) Exponierens einer Kultur einer Zellinie gemäß dem ersten und/oder zweiten Aspekt der Erfindung gegenüber der Substanz,
(b) Feststellens der Anzahl mutierter Zellen in der exponierten Kultur, und
(c) Vergleichens der Mutationshäufigkeit der exponierten Zellen mit der Mutationshäufigkeit von nicht-exponierten Zellen zur Ermittlung der Mutagenität der Substanz.

Im Vertragsstaat ES ist die Erfindung in jenem angefügten Satz von Ansprüchen definiert, der als nur für diesen Staat wirksam gekennzeichnet ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist eine Restriktionsendonukleasen-Karte eines Fragments von menschlicher DNA, das das für P450IIA3 kodierende Gen einschließt;
2 ist eine Restriktionsendonukleasen-Karte eines Fragments von menschlicher DNA, das das für menschliche Epoxid-Hydrolase kodierende Gen einschließt;
3 ist eine Restriktionsendonukleasen-Karte des rekombinanten Expressionsvektors pMF6;
4 ist eine Restriktionsendonukleasen-Karte des erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektors pME23;
5 ist eine Restriktionsendonukleasen-Karte des erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektors pH 441;
6. ist eine Restriktionsendonukleasen-Karte des Expressionsvektors aus 3, einschließlich des DNA-Fragments von 1 und 2;
7 ist eine Restriktionsendonukleasen-Karte des rekombinanten Expressionsvektors aus 3, einschließlich des DNA-Fragments aus 1;
8 ist eine Restriktionsendonukleasen-Karte des rekombinanten Expressionsvektors aus 3, einschließlich des DNA-Fragments aus 2;
9 ist eine Tabelle der Enzymexpressionsniveaus in der MCL-5-Zellinie im Vergleich zur Expression in Zellen mit einer einzelnen cDNA pro Vektor;
10 ist eine Grafik, die das relative Überleben und die relative Empfindlichkeit der MCl-5-Zellinie gegenüber den mutagenen Wirkungen von Benzo(a)pyren, 3-Methylcholanthren und N-Nitrosodiethylamin zeigt;
11 ist eine Grafik, die das relative Überleben und die relative Empfindlichkeit der MCl-5-Zellinie gegenüber den mutagenen Wirkungen von Aflatoxin B₁, N-Nitrosodimethylamin, 2-Acetaminofluoren und Benzidin zeigt; und
12 ist eine Tabelle der Empfindlichkeiten der MCl-5-Zellinie und AHH-1-Ze11en gegenüber den mutagenen Wirkungen von Benzo(a)pyren, 3-Methylchloranthren, N-Nitrosodiethylamin, Nitrosodimethylamin, Aflatoxin B₁, 2-Acetaminofluoren und Benzidin.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
Nach der Erfindung wird eine Zellinie bereitgestellt, die eine Vielzahl von P450 exprimiert. Die bevorzugte Zellinie, MCL-5, exprimiert P450IA2, P450IIA3, P450IIE1 und P450IIIA4, die jene P450 sind, die primär für die Aktivierung der wichtigsten bekannten Prokarzinogene verantwortlich sind. Sie exprimiert auch P450 IA1 sowie Epoxid-Hydrolase. Die Zellinie kann daher als Screening-Werkzeug verwendet werden und vermeidet das Erfordernis, viele einzelne Zellinien sowie viele einzelne Tests zur Untersuchung der bekannten Haupt-Prokarzinogene zu verwenden.
Überraschend wurde gefunden, daß, wenn die P450-Expression ein bestimmtes Niveau erreicht (1 pmol/10⁶ Zellen für die eingesetzte Zellinie), die P450-Expression instabil wird. Unter instabil ist zu verstehen, daß die Aktivitäten der cDNA – exprimierten Enzyme sich über die Zeit des Zellwachstums in Kultur ändern. Es war daher nicht nur erforderlich, mehrere P450 in eine einzelne Zellinie einzubringen, sondern es war auch darüber hinaus erforderlich, dies in einer Weise zu tun, daß die absolute Expression von P450 in der Zelle reguliert und das Einstellen der P450-Produktion durch die Zelle vermieden wird. Es wurde angenommen, daß die Verwendung von mehreren Promotoren, die mehrere cDNAs kontrollieren, eine Pro motor-Störung und unvorhersehbare oder inakzeptable Expressionsniveaus ergeben würde. Genauso wurde angenommen, daß der relativ hohe Grad von Homologie zwischen den P450-cDNAs sowie zwischen ihren entsprechenden Promotoren durch Rekombination zu einer Verminderung oder zum Verlust der Expression führen würde. Es war ebenfalls wünschenswert, wenn nicht sogar kritisch, einen Transfektionsplan zu entwickeln, der nicht fünf einzelne Transfektionen und fünf einzelne selektierbare Marker, jeweils einen für jede tranfizierte cDNA, erforderte.
Nach der vorliegenden Erfindung wurden daher zwei Ansätze gleichzeitig verfolgt. Erstens wurden mehrere cDNAs in einzelne, nicht-integrierende Vektoren eingebaut. Zweitens wurden stark exprimierte cDNAs in niedriger Kopienzahl in Zellinien eingebracht, während vergleichsweise schwach exprimierte cDNAs in relativ hoher Kopienzahl in Zellinien eingebaut wurden. Auf diese Weise wurde eine angemessene Expression der verschiedenen P450 erreicht, während die absolute Expression von P450 auf. einem Niveau gehalten wurde, das niedriger war als dasjenige, das zu einer instabilen Expression von P450 führen würde. Bei der bestimmten verwendeten Zellinie betrug das Niveau 1 pmol/10⁶ Zellen. Es ist jedoch ersichtlich, daß das Niveau in Abhängigkeit von der jeweiligen gewählten Zelllinie variieren wird, und die Erfindung ist nicht auf Expression-Niveaus unterhalb dieses Wertes beschränkt. Vielmehr umfaßt die Erfindung Zellinien, die eine Vielzahl von P450 unterhalb desjenigen Niveaus exprimiert, das die Expression instabil macht, ohne daß es darauf ankäme, welches das jeweilige absolute Niveau für eine bestimmte Zellinie sein mag.
Die erfindungsgemäßen Zellinien können in Mutagenitätstests verwendet werden. Zum Beispiel wird eine Kultur von MCl-5- Zellen einer Substanz ausgesetzt. Dann werden die exponierten Zellen für eine Zeitdauer, die eine phänotypische Expression erlaubt, angezogen. Als nächstes wird die Mutationshäufigkeit bestimmt. Schließlich wird die Mutationshäufigkeit der exponierten Zellen mit der Mutationshäufigkeit von nicht-exponierten Zellen desselben Typs verglichen, um die Mutagenität der Substanz zu ermitteln.
Die Zellinien können bei Stoffwechseluntersuchungen verwendet werden. Zum Beispiel wird eine Kultur von MCL-5-Zellen oder eine aus MCL-5-Zellen hergestellte Enzymzubereitung mit einer Testsubstanz inkubiert. Nach einiger Zeit werden der/die Metabolit/Metabolite und die nicht-metabolisierte Testsubstanz, sofern erforderlich, getrennt. Trennverfahren beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf Lösungsmittelextraktion, Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) und andere chromatographische Trennungen. Die Menge von Metabolit(en) wird dann durch Messung einiger physikalischer Eigenschaften des/der Metaboliten quantifiziert. Solche Messungen beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, Lichtabsorption, Fluoreszenz- und Flüssig-Szintillationszählung.
Die erfindungsgemäßen Zellinien können auch in Toxizitäts-Tests verwendet werden. Zum Beispiel wird eine Kultur von MCL-5-Zellen einer Substanz ausgesetzt. Als nächstes wird der Anstieg der Zellzahl über eine Zeitdauer festgestellt. Schließlich wird der Anstieg der Zellzahl der exponierten Zellen mit dem Anstieg der Zellzahl von nicht-exponierten Zellen verglichen, um die Toxizität der Substanz zu ermitteln. Alternativ wird die Koloniebildungsfähigkeit der exponierten Zellen mit der Koloniebildungsfähigkeit von nicht- exponierten Zellen verglichen, um die Toxizität der Substanz zu ermitteln.
MCL-5 Zellen wurden von der L3-Zellinie, einer Variante der menschlichen B-Lymphoblastenzelle AHH-1, abgeleitet. Die Konstruktion der L3-Zellinie wurde in Referenz 7 beschrieben, Die Konstruktion der AHH-1-Eltern-Zellinie wurde im U.S.-Patent 4,532,204 beschrieben. Wie die Eltern-Zellinie exprimieren diese Zellen ein erhöhtes Niveau von P450IA1-Aktivität, wachsen gut in Suspensionskultur, besitzen eine unbegrenzte Lebensspanne und besitzen die Fähigkeit, Kolonien in Mikrotiterplatten zu bilden. Im Unterschied zur Eltern-Zellinie erwiesen sich die MCL-5-Zellen als empfindlicher gegenüber der Zytotoxizität von Benzo(a)pyren, 3-Methylcholanthren, N-Nitrosodiethylamin, N-Nitrosodimethylamin, Aflatoxin B₁ und 2-Acetaminofluoren.
Für alle Prokarzinogene mit Ausnahme von Benzidin war die MCL-5-Zellinie signifikant empfindlicher als AHH-1-Zellen. Die Nitrosamine sind mehr als 10.000fach aktiver. Benzo(a)pyren und Aflatoxin B₁ waren etwa 1000fach aktiver und 2-Acetaminofluoren war 3fach aktiver bei MCL-5-Zellen. Nur Benzidin ergab vergleichbare Reaktionen bei beiden Zollinien. Auf Grundlage der bei MCL-5-Zellen beobachteten mutagenen Reaktionen und den Vergleichen mit AHH-1-Zellen schlossen wir, daß wir die prokarzinogenaktivierende Kapazität durch das Transfektionsverfahren wesentlich erhöht haben. MCL-5-Zellen waren sehr empfindlich gegenüber den mutagenen Wirkungen von zwei polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffon, zwei Nitrosaminen, einem Mykotoxin und einem aromatischen Amid. Diese Ergebnisse zeigen, daß diese Zellinie ein Spektrum von Prokarzinogenen aktivieren kann.
Aus der folgenden Beschreibung wird ersichtlich werden, daß andere unsterbliche menschliche Zellinien als die letztlich von AHH-1 abgeleiteten an die Stelle der L3-Zellinie gemäß verschiedener Ausführungsformen der Erfindung gesetzt werden könnten.
MATERIALIEN UND ALLGEMEINE VORGEHENSWEISEN
RPMI-Medium 1640 wurde von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO oder Hazelton, Inc., Denver, PA, erhalten. Pferdeserum wurde von Hazelton, Inc., erhalten. Die Zellen wurden in einem normalen Wachstumsmedium aus RPMI-Medium 1640, das mit 9% V/V Pferdeserum versetzt war, vermehrt. Die Zellen wurden in Polystyrol-Gewebekulturflaschen kultiviert. Die routinemäßige Zellkultivierung wurde durch Bestimmen der Zellzahl mit Hilfe elektronischer Partikelzählung und Verdünnen der Zellen mit frischem Medium zu 3 oder 4 × 10⁵ Zellen pro ml jeden Tag, 2 × 10⁵ Zellen pro ml alle zwei Tage oder 1 × 10⁵ Zellen alle 3 Tage durchgeführt. Zertrifugationen von menschlichen Lymphoblasten wurden bei 1000 × g für 5 Minuten durchgeführt. Zellen, die rekombinante Plasmide trugen, wurden entweder in Medium mit 100–200 μg/ml Hydromycin B (für pMF6-basierte Vektoren) oder in Medium mit 2 mM L-Histidinol, ohne L-Histidin, (für pEBVHistk-basierte Vektoren) gehalten. Protoplastenfusionen wurden gemäß veröffentlichter Verfahren durchgeführt (1). Das Ausplattieren der Zellen wurde in 96-Loch-Mikrotiterplatten gemäß der Technik von Furth et al., 1981 (2), durchgeführt. Die Platten wurden für 13 Tage inkubiert, um die Bildung von Kolonien zu ermöglichen. Hygromycin B wurde von Calbiochem, La Jolla, CA, erhalten. Unmarkiertes und [³H]-Benzo(a)pyren-4,5-oxid wurden vom Lager für chemische Kanzerogene des Nationalen Krebsinstituts (USA) erhalten. 6-(Beta)-Hydroxytestosteron-Standard wurde von Steraloids, Inc. Wilton, N. H., erhalten. 6-Hydroxychlorzoxazon-Standard wurde von Dr. F. P. Guengerich, Vanderbilt University, Nashville, zur Verfügung gestellt. Alle anderen Chemikalien wurden von Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, erhalten.
Bibliotheken und Plasmide.
Eine Rattenleber-cDANA-Bibliothek (RL1001b), eine Menschenleber-cDNA-Bibliothek (HL1001b) und eine menschliche Plazenta-cDNA-Bibliothek (HL1008) wurden von Clontech, Palo Alto, CA, erhalten. Alle drei Bibliotheken wurden im Bakteriophagen Lambda gt11 (3) konstruiert und in E. coli Y1090 vermehrt.
Der Plasmid pHEBo (5) wurde von Dr. William Sugden, Universität von Wisconsin, Madison, erhalten. Der Vektor pHEBo trägt die Gene für Ampicillin-Resistenz und Hygromycin-Resistenz, und enthält Sequenzen vom Replikationsursprung des Epstein-Barr-Virus und pBR322, was die autonome Replikation sowohl in EBV-transformierten lymphoblastoiden Zellen als auch in E. coli ermöglicht (5). pHEBo weist eine Größe von 7,1 kb auf und besitzt singuläre Schnittstellen für die Restriktionsenzyme Cla I, Hind III, Bam HI und Sal I, die für die Insertion der interessierenden DNA verwendet werden können.
Der Plasmid pHSV106 wurde von den Bethesda Forschungslaboratorien, Gaithersburg, MD, erhalten. Der Vektor pHSV106 trägt das Thymidinkinase-Gen des Herpes-simplex-Virus (HSV-tk-Gen) und wurde als Quelle für die Kontrollsequenzen des HSV-tk-Gens verwendet. Alle Plasmide wurden in E. coli HB101 vermehrt (6).
Die Konstruktion des pMF6-basierten Plasmids, bezeichnet als pHEPtkl, wird auf den folgenden Seiten einbezogen und wurde früher in der anhängigen US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/162,885 offenbart und veröffentlicht (7). Der Plasmid pHEPtk1 enthält unabhängig exprimierte P450IIA3- und mikrosomale Epoxidhydrolase(EH)-cDNAs, das Gen für Hygromycin-Resistenz, und enthält darüber hinaus Sequenzen vom Replikationsursprung des Epstein-Barr-Virus (EBV) und pBR322, was ihm die autonome Replikation sowohl in EBV-transformierten lymphoblastoiden Zellen als auch in E. coli ermöglicht (5). PHEPtk1 weist eine Größe von 13,1 kb auf und besitzt singuläre Schnittstellen für das Restriktionsenzym Hind III, das für die Insertion der interessierenden DNA verwendet werden kann.
Die Konstruktionen des pEBVHistk-Vektors sowie dessen abgeleitete Plasmide, bezeichnet als pH44 und pH441, sind auf den folgenden Seiten offenbart. Die Konstruktion von pEBVHistk wurde früher in der anhängigen US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 37/162,865 offenbart und wurde veröffentlicht (8). Die Konstruktion wird hier teilweise wiedergegeben, um die Ausführbarkeit zu erleichtern. Der Plasmid pHBVHistk enthält das E.-coli-HisD-Gen, welches L-Histidinol-Resistenz verleiht (8), und enthält Sequenzen vom Replikationsursprung des EBV und pBR322, was ihm die autonome Replikation in EBV-transformierten lymphoblastoiden Zellen und E. coli ermöglicht. Der Plasmid pEBVHistk weist eine Größe von 9,6 kb auf und besitzt singuläre Schnittstellen für die Restriktionsenzyme Sal I, Nhe I und Bam HI, die für die Insertion der interessierenden DNA verwendet werden können. Unter geeigneten Selektionsbedingungen wird der Plasmid pHEPtk1 auf 5 Kopien je diploi der Zell-DNA gehalten, und pEBVHistk sowie dessen abgeleitete Plasmide auf 40 Kopien je diploider Zell-DNA gehalten.
Die Restriktionsendonukleasen, das Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I und T4-DNA-Ligase wurden von New England Biolabs, Beverly, MA, erhalten und wurden nach den Empfehlungen des Herstellers verwendet. Kälberdarm-DNA, alkalische Phosphatase und T4-Polynukleotide wurden von Pharmacia, Piscataway, New Jersey, bezogen. [³²P]-markiertes ATP und Desoxynukleotide wurden von DUPONT/NEN, Boston, Massachusetts, erhalten.
Isolierung des P450IIA3-Klons
Die Strategie für die Isolierung des P450IIA3-Klons war wie folgt. Eine partielle cDNA-Sequenz eines humanen Cytochroms P450IIA3, isoliert durch Hybridisierung mit der P450e kodierenden Ratten-cDNA, wurde von Phillips und Kollegen (9) beschrieben. Die cDNA war von ausreichender Länge, um lediglich zwei Drittel des Gens zu kodieren. Wir haben Oligonukleotid am 5'-Ende der veröffentlichten Sequenz ausgewählt, um es als Sonde der Menschenleber-cDNA-Bibliothek zu verwenden.
Die Menschenleber-cDNA-Bibliothek HL1001b wurde gemäß Standardverfahren (10) zu einer Dichte von 4,25 × 10⁴ Phagen pro 150-mm-Petrischale ausplattiert. Plaque-Replika-Lifts wurden auf BA-85-Nitrozellulosefilter von Schleicher und Schuell nach Standardverfahren (11) durchgeführt. Das P450-Oligomer (d[pACRTTGGAGAATGTGCGGAT]) wurde mit Polynukleotidkinase und [Gamma-³²p]-ATP wie beschrieben (11) markiert.
Hybridisierungen und P450-Oligomer wurden für 16 Stunden bei 30°C in 37,8% Formamid, 5x Denhardt-Lösung (12), 5x SSPE (11), 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 250 μg pro/ml denaturierter Heringssperma-DNA durchgeführt. Nach der Hybridisierung erhielten die Plaque-Lifts drei Fünfzehn-Minuten-Waschungen bei Raumtemperatur und drei Fünfzehn-Minutem-Waschungen bei 42°C, jeweils in 500 ml 2x SSC (13) und 0,1% SDS. Die gewaschenen Filter wurden dann auf ein Blatt Whatman-3MM-Filter-Papier fixiert, mit Kunststoffolie abgedeckt und für 1 bis 24 Stunden einem Kodak-XAR-Röntgenfilm ausgesetzt. Der Film wurde gemäß Herstelleranweisungen entwickelt. Positive Plaques wurden mit Hilfe von Pasteur-Pipetten gepickt und durch aufeinanderfolgende Durchläufe von Plaque-Replika-Lifts und Screenings mit der Oligonukleotid-Sonde bis zur Homogenität gereinigt. Von den 125 positiven Klonen wurden 31 für die DNA-Isolierung und -analyse ausgewählt. Die DNA wurde unter Verwendung des Lambdasorb^TM Phagenadsorptionsprotokolls von Promega, Madison, WI, aus gereinigten rekombinanten Phagen isoliert. Lambdasorb^TM ist eine Zubereitung aus gegen Partikel des Bakteriophagen Lambda gerichteten polyklonalen Antikörpern des Kaninchens, wobei die Antikörper an formalinfixierte Staphylococcus-aureus-Bakterienzellen gebunden sind. Bakteriophagenlysate, hergestellt nach Standardverfahren (11), wurden mit 0,01 Volumen Lambdasorb^TM für 30 Minuten bei 0°C inkubiert. Der absorbierte Phage wurde durch Zentrifugation bei 7500 UPM in einer Beckman-Mikrofuge II für 10 Minuten niedergeschlagen. Der präzipitierte Phage wurde in 1 ml Phagen-Suspensions-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 0,01% Gelatine) resuspendiert und bei 13.000 UPM für 1,5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Dies wurde wiederholt, woraufhin der Niederschlag in 0,5 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM EDTA resuspendiert und für 5 Minuten auf 70°C erhitzt wurde, um die Phagen-DNA von dem Lambdasorb^TM freizusetzen. Die Zubereitung wurde zur Niederschlagung des Absorbens für 2 Minuten bei 13.000 UPM zentrifugiert, woraufhin der Überstand zweimal mit einer 1 : 1-Mischung von trisgepuffertem Phenol/Chloroform (11) extrahiert wurde, gefolgt von einer einzelnen Extraktion mit Chloroform. Der Überstand wurde dann mit 0,25 ml 5 M NaCl und 0,25 ml 30% Polyethylenglykol (mit einem ungefähren Molekulargewicht von 8000 Dalton) in 1,5 M NaCl versetzt, woraufhin er gut gemischt und für 30 Minuten auf Eis inkubiert wurde. Die Mischung wurde bei 13.000 UPM für 5 Minuten zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen und der DNA-Niederschlag wurde in 70% Ethanol gespült und erneut zentrifugiert. Der DNA-Niederschlag wurde unter Vakuum getrocknet und in 25 Mikroliter 10 mM Tris-HCl, pH 7,8, 0,1 mM EDTA, resuspendiert. Die isolierte DNA wurde mit Eco RI verdaut und einer Elektrophorese auf 0,8% Agarose-Gelen unterzogen, um die Größe des cDNA-Inserts zu bestimmen. Die Gele wurden mit 0,5 μg/ml Ethidiumbromid gefärbt und die Banden wurden unter ultravioletter Beleuchtung sichtbar gemacht. Die Klone fielen auf Basis der Insert-Größe in sieben Klassen, wobei drei eine ausreichende Größe aufwiesen, um das vollständige P450IIA3-Gen zu kodieren. Das 1,8 kb Eco-RI-Fragment eines großen Klons, bezeichnet als 91D, wurde aus dem Agarosegel gemäß Standard-Protokollen (11) isoliert. (1) Um eine geeignete Quelle für 91D-DNA bereitzustellen, wurde das Fragment in pBR322 eingeführt und vermehrt. Das 91D-Fragment wurde in die Eco-RI-Stelle von pBR322 (14) wie folgt eingeführt: pBR322-DNA wurde mit Ecu-RI verdaut und anschließend mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm behandelt, um die Rezirkularisierung des Vektors zu verhindern. Das Eco-RI-cDNA-Fragment wurde mit dem Eco-RI-geschnittenen pBR322 in dreifachem molaren Überschuß vereinigt und unter Verwendung von T4-DNA-Ligase in den Vektor ligiert. Der ligierte Plasmid wurde dann verwendet, um E. coli HB101 gemäß dem in Maniatis et al. (11) beschriebenen Rubidiumchlorid-Verfahren zu transformieren. Transformierte Kolonien wurden auf mit Ampicillin (50 μg/ml) versetzten Luria-Broth-Platten selektiert. Mehrere Kolonien wurden auf 5-ml-Flüssigkulturen überimpft und die Plasmid-DNA wurde nach dem in Maniatis et al. (11) beschriebenen Miniprep-Verfahren mit alkalischer Lyse isoliert. Die DNA wurde mit Eco RI verdaut und einer Elektrophorese wie oben zur Verifizierung des Vorhandenseins der 1,8-kb-Bande ausgesetzt. Eine solche Kolonie wurde identifiziert und auf eine 1-Liter-Flüssigkultur zur Isolierung von Milligramm-Mengen DNA des rekombinanten Plasmids, p91D, überimpft. Dies wurde nach Garger et al. (15) durchgeführt. Die Plasmid-DNA wurde dann mit einer Reihe von Restriktionsendonukleasen verdaut und eine detaillierte Restriktionskarte wurde erstellt. Das Fragment 91D wurde bei entsprechenden Regionen mit dem durch Phillips et al. (9) beschriebenen Fragment verglichen. Fragment 91D hat Stellen für die folgenden Restriktionsenzyme mit dem von Phillips et al. beschriebenen Fragment gemeinsam: Bam HI, Hinc II, OxaN I, Rsa I, Sac I, SfaN I, Sph I, Stu I, Sty I und Xmn I. Ein Konflikt wurde bei der Position der Stelle für das Restriktionsenzym FnuD II beobachtet, was einen Sequenzunterschied aufgrund allelischer Variation repräsentieren könnte. Auf der Basis der Ähnlichkeiten in den Restriktionskarten haben wir das 91D-Isolat der P450IIA3-K1asse zugeordnet.
Der Ort des 5'-Endes von 91D wurde durch Verdauung mit dem Restriktionsenzym Bam HI, gefolgt von Agarosegel-Elektrophorese und Southern-Blotting (13) bestimmt. Die Blots wurden mit dem 5'-Oligomer untersucht und die Zuordnung der Lage des 5'-Endes wurde auf Grundlage des Hybridisierungsmusters vorgenommen.
Isolierung des Epoxidhydrolase-Klons
Die Strategie zur Isolierung des menschlichen Epoxidhydrolase(EH)-Gens benötigt zwei Teile, wie folgt: das Gen für die Ratten-EH wurde isoliert (16) und sequenziert (17) und konnte daher als Sonde für eine menschliche cDNA-Bibliothek verwendet werden, um das menschliche Gen zu isolieren. Aus der publizierten Sequenz wurde ein Oligonukleotid hergestellt und zur Isolierung eines Ratten-EH-Klons, bezeichnet als 14A, verwendet.
Die Rattenleber-cDNA-Bibliothek RL1001b wurde zu einer Dichte von 4,3 × 10⁴ Phagen pro 150-ml-Platte ausplattiert und es wurden Nitrozellulose-Replika-Lifts durchgeführt. Das Oligomer (d[pCCCCAGTCCCCGCCTTGAAT]) wurde mit [Gamma-³²P]-ATP wie oben endmarkiert. Die Hybridisierungen mit dem Ratten-Epoxidhydrolase-Oligomer wurden bei 30°C und 50% Formamid, 5x Denhardt-Lösung, 5x SSPE, 0,1% SDS und 250 μg/ml denaturierter Heringssperma-DNA durchgeführt. Nach 16stündiger Hybridisierung wurden die Filter drei. 15minütigen Waschungen bei Raumtemperatur, zwei 15minütigen Waschungen bei 42°C und einer 15minütigen Waschung bei 52°C, jeweils in 2x SSC und 0,1% SDS, unterzogen. Der XAR-Röntgenfilm wurde exponiert und wie oben beschrieben entwickelt. Positive Plaques wurden unter Verwendung einer Pasteurpipette gepickt und bis zur Homogenität durch wiederholte Screeningdurchläufe gereinigt. Die DNA von rekombinanten Phagen wurde wie oben unter Anwendung des Lambdasorb^TM-Protokolls von Promega, Madison, WI, isoliert und wurde zur Bestimmung der Größe des cDNA-Inserts mit Eco RI verdaut. Die cDNAs fielen in sieben Klassen, die in der Größe von 0,74 kb bis 1,6 kb reichten. Ein Vertreter der größten Klasse Klon 14A, 1,6 kb) wurde für die weitere Analyse ausgewählt.
Die Identität von 14A wurde durch extensive Restriktionskartierung und Vergleich mit einer computergenerierten Karte der publizierten Ratten-EH-Sequenz verifiziert. Das 1,6-kb-Eco-RI-Fragment von 14A wurde in die Eco-RI-Stelle von pBR322 subkloniert, was zum Plasmid p14A führte. Ein 5'-Eco-R1-Bam-HI-Fragment von p14A wurde als Sonde für die Menschenleber-und Plazenta-cDNA-Bibliotheken, HL1001b und HL1008, verwendet. HL1001b wurde zu einer Dichte von 4,3 × 10⁴ Plaques pro 150-mm-Platte ausplattiert und HL1008 wurde zu einer Dichte von 5 × 10⁴ Plaques pro Platte ausplattiert. Das 5'-Eco-RI-Bam-HI-Fragment von p14A (0,46 kb) wurde mit [Alpha-³²P]dCTP und TTP (11) zu einer spezifischen Aktivität von 5 × 10⁷ cpm/μg nicktranslatiert, und die Plaque-Lifts wurden drei 15minütigen Waschungen bei Raumtemperatur und einer anschließenden 30minütigen Waschung bei 68°C, jeweils in 2x SSC und 0,1% SDS, unterzogen. Insgesamt wurden 42 positive Klone identifiziert, von denen 36 in der Leber-Bibliothek und sechs in der Plazenta-Bibliothek gefunden wurden. Von 14 Klonen wurde die DNA isoliert. Durch Restriktionsanalyse wurde festgestellt, daß die Klone auf Basis ihrer Größe in acht Klassen fielen. Der größte Klon, 167D, war von ausreichender Länge (1,93 kb), um das vollständige EH-Gen zu kodieren. (2) Die Anwesenheit von zwei inneren Eco-RI-Stellen machte die Verwendung alternativer Restriktionsenzyme bei der Subklonierung der Sequenz erforderlich. Klon 167D wurde mit Kpn I und Pvu I exzidiert, was zur Subklonierung von 2,24 kb die cDNA flankierender Phagen-DNA führte. Die überhängenden 3'-Enden wurden mit dem Klenow-Fragment der E.-coli-DNA-Polymerase I glattendig ("blunt-ended") gemacht und Hind-III-Linker wurden kinasiert und an das Fragment ligiert (11). Das 4,17-kb-Fragment wurde in die Hind-III-Stelle von pBR322 insertiert. Im Anschluß an die Transformation von HB101, der Isolierung von DNA aus den transformierten Kolonien und Verdauung mit Hind III zur Sicherstellung der Anwesenheit des 4,17 kb 167D-Fragments wurde ein Plasmid mit der Bezeichnung 167D selektiert. Die Plasmid-DNA wurde isoliert und eine detaillierte Restriktionskarte wurde erstellt. Wie oben für Klon 91D beschrieben, wurde die Bestimmung des 5'-Endes von Klon 167D durch Southern-Hybridisierung eines Eco-RI-Restriktionsverdaus mit dem 5'-Eco-RI-Bam-HI-Fragment des Ratten-EH-Klons 14A erreicht.
Der P450IA2-Klon
Die P450IA2-cDNA (in der Eco-RI-Stelle von pUC9) wurde ursprünglich von Dres. Frank Gonzalez und Harry Gelboin am Nationalen Krebsinstitut erhalten. Von dem rekombinanten Plasmid wurde die cDNA durch Verdau mit Eco RI und Dral isoliert, wodurch ein 1,6-kb-Fragment mit der vollständigen kodierenden Sequenz erhalten wurde. Die restriktionsenzymverdauten klebrigen Enden ("sticky ends") wurden mit dem Klenow-Fragment von E.-coli-DNA Polymerase I glattendig gemacht und Xhol-Linker wurden an das Fragment ligiert (11). Die modifizierte cDNA wurde in die singuläre Sal-I-Schnittstelle des Expressionsvektors pMF6 eingeführt. (3) Im Anschluß an die Transformation von HB101, der Isolierung von DNA aus transformierten Kolonien und der Analyse der Struktur durch Restriktionskartierung wurde der Plasmid als pMF6/IA2-Teil be zeichnet. Die DNA des Plasmids wurde isoliert und einer partiellen Verdauung mit Nar I ausgesetzt, um das 2,6-kb-Fragment, enthaltend die P450IA2-cDNA, den Promotor und das Poly-A-Signal von HSVtk, zu isolieren und zu reinigen.
Der P450IIIA4-Klon
Die Isolierung des P450IIIA4-Klons ist veröffentlicht worden (19). Dieser Klon wurde ursprünglich von Dres. Frank Gonzalez und Harry Gelboin am Nationalen Krebsinstitut erhalten. Von dem rekombinanten Plasmid wurde die cDNA durch Verdau mit Bsu 36 I und partieller Verdauung mit Eco RI isoliert, wodurch ein 1,6-kb-Fragment (19) mit der vollständigen kodierenden Sequenz erhalten wurde. Das Restriktionsenzym-verdaute Fragment wurde glattendig gemacht und durch Addition von Xhol-Linkern modifiziert und in die singuläre Sal-I-Schnittstelle des Expressionsvektors pMF6 (20) eingeführt. Dieser Vektor wurde als pMF6/3A4 bezeichnet.
Ein 2,6-kb-Nar-I-Fragment mit der P450IIIA4-cDNA, dem Promotor und dem Poly-A-Signal von HSVtk wurde isoliert und gereinigt.
Isolierung des P450IIE1-Klons
Die menschliche Cytochrom-P450IIE1-cDNA wurde unter Verwendung einer Oligonukleotidsonde isoliert, deren Sequenz auf der publizierten Sequenz der menschlichen P450IIE1-cDNA (21) basierte. Das Oligonukleotid war komplementär zu den Basenpaaren 82 bis 101 der kodierenden Sequenz der cDNA und wies eine Sequenz von 5'GCAGCTGGAATCTGCCCC 3' auf. Das Oligo nukleotid wurde mit ³²P endmarkiert und zum Screening einer Menschenleber-cDNA-Bibliothek in λgt11 verwendet (HL1001b).
Die Menschenleber-cDNR-Bibliothek HL1001b wurde gemäß Standardverfahren (10) zu einer Dichte von 4,25 × 10⁴ Phagen pro 150-mm-Petrischale ausplattiert. Plaque-Replika-Lifts wurden auf BA-85-Nitrozellulosefiltern von Schleicher & Schuell nach Standardverfahren (11) durchgeführt. Das P450-Oligomer (d[pACATTGGAGAATGTGCGGAT]) wurde mit Polynukleotidkinase und [gamma-³²P]ATP wie beschrieben (11) endmarkiert.
Hybridisierungen mit dem P450-Oligomer wurden für 16 Stunden bei 30°C in 37,8% Formamid, 5x Denhardt-Lösung (12), 5x SSPE (11), 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 250 μg/ml denaturierter Heringssperma-DNA durchgeführt. Im Anschluß an die Hybridisierung wurden die Plaque-Lifts drei 15minütigen Waschungen bei Raumtemperatur und drei 15minütigen Waschungen bei 42°C, jeweils in 500 ml 2x SSC (13) und 0,1% SDS, unterzogen. Die gewaschenen Filter wurden dann auf einem Blatt Whatman-3MM-Filterpapier fixiert, mit Kunststoffolie abgedeckt und für 1 bis 24 Stunden einem Kodak-XAR-Röntgenfilm ausgesetzt. Der Film wurde gemäß Herstelleranweisungen entwickelt. Positive Plaques wurden unter Verwendung von Pasteurpipetten gepickt und bis zur Homogenität durch aufeinanderfolgende Durchläufe von Plaque-Replika-Lifts und Screening mit der Oligonukleotidsonde gereinigt. Positive Kolonien wurden gereinigt, die cDNA-Inserts wurden exzidiert, in die Eco-RI-Stelle pUC19 Lambdasorb^TM-subkloniert und Restriktionskarten wurden erzeugt. Die Restriktionskarte des größten Isolats, bezeichnet als 257A, zeigt beträchtliche Übereinstimmung mit der der publizierten P450IIE1-cDNA (8).
Um festzustellen, ob das cDNA-Isolat die vollständige kodierende Sequenz enthielt, wurden 100 Basenpaare am 5'-Ende in pUC19 direkt sequenziert. Es wurde gefunden, daß das Isolat 257A gegenüber der vollständigen kodierenden Sequenz um 11 Basenpaare kürzer war. In dem Isolat waren im Vergleich zu dem von Song et al. (21) auch drei Basenaustausche vorhanden, die sämtlich kryptisch waren. Eine cDNA mit der vollständigen kodierenden Sequenz wurde durch "Blunt-end"-Ligation von synthetischen Oligonukleotiden erzeugt. Das Isolat 257A wurde am 5'-Klonierungslinker (Eco RI) und am 3'-Ende mit Nde I geschnitten. Das DNA-Fragment wurde mit Mungbohnen-Nuklease glattendig gemacht und die unten angegebenen synthetischen Oligonukleotiden wurden an das glattendige Fragment ligiert.
Diese Oligonukleotide wurden so synthetisiert, daß sie der publizierten kodierenden. Sequenz der 5'-cDNA entsprachen und die Xho-I-"sticky-ends" aufwiesen, um die Subklonierung in den Expressionsvektor pMF6 (8) zu erleichtern. Die Ligierung der Oligonukleotide an die glattendige cDNA führte zu einer Sequenz, die einen einzelnen, konservativen Aminosäureaustausch an Position 4 (Alanin für Leucin) enthielt. Es wird nicht erwartet, daß dieser Austausch die Enzymfunktion beeinträchtigt. Die ligierte Mischung wurde mit Xho I verdaut und das gewünschte Fragment wurde gereinigt und in die singuläre Sal-I-Schnittstelle in dem Expressionsvektors pMF6 subkloniert. Das korrekte Konstrukt wurde als p257Atk2 bezeichnet. Ein 2,6 kb NarI-Fragment, das die EP450IIEI-cDNA, den Promo tor und das Poly-A-Signal für Hvtk enthielt, wurde isoliert und nach Standardverfahren gereinigt.
Konstruktion der Expressionsvektoren pME23 und pM441
Die folgenden Abschnitte beschreiben die Konstruktion der Expressionsvektoren pME23 und pH441, die verwendet wurden, um L3-Zellen zu transfizieren. Der Plasmid pME23 enthält P450IA2-, P450IIA3- und mEH-cDNAs. PME23 ist von pHEPtk1 abgeleitet, einem pMF6-basierten Plasmid, der die P450IIA3- und P450EH-Gene enthält. Der Plasmid pH441 ist abgeleitet vom Plasmid pH44, einem pEBVHIStk-basierten Plasmid, und enthält zwei P450IIIA4-cDNAs und eine P450IIE1-cDNA.
Schematische Karten der pME23- und pH441-Vektoren sind in den 4 bzw. 5 dargestellt. Die dünne Linie repräsentiert pBR322-Sequenzen, das schwarze Kästchen repräsentiert die vom EBV stammenden Ori-P-Sequenzen, die schraffierten Kästchen repräsentieren das Hygromycin-B-Resistenz-Gen (4)oder das E.-coli-His-D-Gen (5), die punktierten Kästchen repräsentieren den HSV-Promotor, die kreuzschraffierten Kästchen repräsentieren das HSV-Poly-A-Signal und die offenen Kästchen repräsentieren die cDNAs. Die Identitäten der cDNAs und die Transkriptionsrichtung sind in den Figuren angegeben.
A. Konstruktion des Expressionsvektors pME23
A1. Konstruktion des Expressionsvektors pHEPthl
Der Plasmid pHEPtk1 (6) enthält Transkriptionseinheiten für P450IIA3 und EH. Die Konstruktion dieses Vektors war wie folgt: Wie durch Restriktionsanalyse festgestellt wurde, wurde keiner der Klone P450IIA3 oder EH durch Sal I oder Xho I geschnitten. Daher würde die Konstruktion eines Expressionsvektors mit einer Promotorsequenz und einer Poly-A-Additionssignalsequenz, die durch durch eine singuläre Sal-I-Schnittstelle getrennt sind, die einfache Insertion des klonierten Fragments in den Expressionsvektor erlauben. Der Plasmid pHE-Bo besitzt eine singuläre Sal-I-Schnittstelle, und dieser Plasmid wurde als Ausgangspunkt für die Erzeugung des Expressionsvektors mit Kontrollregionen, die durch eine singuläre Sal-I-Schnittstelle getrennt sind, ausgewählt.
Der Expressionsvektor für die P450IIA3- und EH-Gene wurde wie folgt erzeugt: der Plasmid pHSV106 (17), der das Thymidinkinase-Gen des Herpes-simplex-Virus trägt, wurde mit Pvu II verdaut und dann wurden Xho-I-Linker addiert (11). Die DNA wurde dann mit Sma I verdaut und Sal-I-Linker wurden angefügt, um ein Fragment mit Xho-Linkern an einem Ende und Sal-I-Linkern am anderen Ende zu erzeugen. Eingeschlossen wurde ein die 3'-Poly-A-Additionssignale des HSV-tk-Gens (22, 23) tragendes 0,6-kb-Fragment, das nun in die Sal-I-Stelle von pHEBo eingebaut werden konnte.
pHEBo wurde mit Sal I verdaut und anschließend mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm behandelt, um die Rezirkularisierung von pHEBo während des Ligations-Schrittes zu verhindern. Die 0,6-kb-Fragmente mit Xho-Linkern an einem Ende und Sal-I-Linkern an dem anderen wurden zugegeben und die DNA wurde ligiert. Da sowohl Xho-Linker als auch Sal-Linker an den Sal-I-Schnitt in pHEBo ligieren, waren zwei Orientierungen des Fragments möglich. Bei den zwei Orientierungen war das Fragment korrekt eingebaut, wenn die bewahrte Sal-I-Schnittstelle am 5'-Ende des Fragments proximal zu der Bam-HI-Schnittstelle von pHEBo lag, und die funktionslose 3'-Sal-I-Xho-I-Fusionsschnittstelle distal zu der Bam-HI-Schnittstelle lag. Im Anschluß an die Ligation wurden Bakterien mit den neu erzeugten Plasmiden transformiert und die Plasmid-DNA wurde aus den transformierten Kolonien isoliert. Isolierte Plasmid-DNA aus verschiedenen Kolonien wurde mit Eco RI und sowohl mit Cla-I und Sal-I verdaut, um die Anwesenheit und Orientierung der inserierten HSV-tk-Sequenzen festzustellen. Der Plasmid, der die korrekte Orientierung aufwies, wurde als P12L bezeichnet.
Die 5'-Promotorsequenzen wurden aus pHSV106 isoliert durch Schneiden des Plasmids mit Bgl II, Auffüllen der Enden mit dem Klenow-Fragment der E.-coli-DNA-Polymerase I (11) und Addieren von Sal-I-Linkern. Die DNA wurde dann mit Bam HI geschnitten, um ein 0,7-kb-Fragment zu erzeugen, das eine Bam-HI-Schnittstelle an dem 5'-Ende und einen Sal-I-Linker an dem anderen 3'-Ende besitzt. Anschließend wurde der Plasmid p12L mit Bam HI und Sal I geschnitten, das 0,7-kb-Fragment wurde zu der geschnittenen p12L-DNA zugegeben, und die gesamte DNA wurde ligiert und zur Transformation von HB101 verwendet. Dann wurde die DNA aus transformierten HB101-Kolonien unter Verwendung des Miniprep-Verfahrens isoliert und die DNA wurde mit Pst I, Eco RI und sowohl Bam HI als auch Sal I geschnitten, um die korrekte Konstruktion zu identifizieren. Der so erhaltene Plasmid, bezeichnet als pMF6, enthielt sowohl die 5'- als auch die 3'-Kontrollsequenzen von dem HSV-TK-Gen und bewahrte die Singularität der Sal-I-Schnittstelle zur Verwendung für die Insertion von in menschlichen Lymphoblasten zu exprimierenden Genen.
A2. Einführung der P450IIA3-cDNA in den Expressionsvektor pMF6
DNA des Plasmids pMF6 wurde mit Sal I verdaut und mit Kälberdarm-Phosphatase wie oben behandelt. Der P450IIA3-Klon 91D wurde mit Eco RI aus dem Plasmid p91D ausgeschnitten. Das erhaltene Fragment wurde unter Verwendung des Klenow-Polymerase-Fragments glattendig gemacht und Xho-I-Linker wurden zugegeben, woraufhin das Fragment direkt in den Sal-I-geschnittenen pMF6 ligiert wurde. HB101 wurde mit dem ligierten Plasmid transformiert, die DNA wurde aus den erhaltenen Kolonien isoliert und die Orientierung des Fragments in Bezug auf die HSV-tk-Sequenzen wurde durch Verdau mit Bam HI festgestellt. Das geeignete Konstrukt wurde als p91Dtk bezeichnet (7).
A3. Einführung der EH-cDNA in den Expressionsvektor pMF6
Die Einführung des EH-Klons in pMF6 wurde durch die Anwesenheit von inneren Eco-RI-Schnittstelle in dem Klon kompliziert. Extensive Restriktionskartierung des Plasmids p167D ergab, daß die Verwendung von Nde I und Rsr II das Ausschneiden des Klons 167D mit nur 220 Basenpaaren flankierender Phagen-DNA (weniger als 50 by am 5'-Ende und ungefähr 180 by am 3'-Ende) erlauben würde. Das erhaltene Fragment von 2,15 kb wurde mit Klenow glattendig gemacht, und Xho-Linker wurden angefügt. Das Fragment wurde dann in den Sal-I-geschnittenen pMF6 ligiert. Aus transformierten HB101-Kolonien wurde die DNA isoliert und ein rekombinanter Plasmid, der den EH-Klon in der geeigneten Orientierung in Bezug auf die HSV-tk-Sequenzen enthielt, wurde durch doppelten Verdau mit den Re striktionsenzymen Hind III und Xba I isoliert. Der Plasmid wurde als p167Dtk bezeichnet (8).
A4. Vereinigung von P450IIA2- und EH-cDNAs auf einem einzigen pMF6-Plasmid
Um die Einführung der neuen Aktivitäten in die verbesserte Lymphoblasten-Zellinie L3 zu vereinfachen wurde ein Plasmid konstruiert, der die neu isolierten Gene zusammen mit deren begleitenden Kontrollsequenzen enthielt. Die komplette Expressionsregion von p167Dtk, einschließlich der erforderlichen HSV-Sequenzen sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende, wurden mit Nar I ausgeschnitten. Das erhaltene 3,2-kb-Fragment wurde in die singuläre Cla-I-Schnittstelle von p91Dtk eingeführt. Die 167Dtk-Sequenzen können in den p91Dtk-Plasmid in einer von zwei möglichen Orientierungen ligiert werden, von denen angenommen werden kann, daß sie beide leistungsfähig sind. Bakterien wurden mit der Ligationsmischung transformiert, und von den transformierten Kolonien wurde DNA unter Verwendung des Alkalilyse-Miniprep-Verfahrens isoliert. Die Orientierung der inserierten DNA wurde durch doppelten Verdau mit Hind III und Xba I bestimmt, Plasmide mit Inserts in beiden Orientierungen wurden erhalten. Bei pHEPtk1 werden die 167Dtk-Sequenzen in entgegengesetzter Richtung zu den 91Dtk-Sequenzen transkribiert. Bei dem alternativen Plasmid, bezeichnet als pHEPtk2, werden die zwei Gene in derselben Richtung transkribiert.
A5. Einführung der P450IA2-cDNA in den Vektor pHEPtk1 zur Konstruktion des Expressionsvektors pME23.
Der Plasmid pHEPtk1 wurde mit Hind III verdaut, der Schnitt wurde glattendig gemacht und durch Addition von Cla-I-Linkern modifiziert und dann mit Phosphatase behandelt. Der Vektor wurde an das 2,6-kb-Nar-I-Fragment, erhalten aus der partiellen Verdauung von pMF6/IA2 (18), das die vorher beschriebene vollständige P450IA2-Transkriptionseinheit enthielt, ligiert.
HB101 wurde mit dem ligierten Plasmid transformiert, die DNA wurde aus den erhaltenen Kolonien isoliert und die Identität des Konstrukts wurde durch Restriktionskartierung verifiziert. Das erhaltene Konstrukt wurde als pME23 bezeichnet (4).
B. Konstruktion des Expressionsvektors pH441.
Die folgenden Abschnitte beschreiben die Konstruktion des pEBVHiStk-basierten Expressionsvektors pH441 mit den cDNAs für P450IIIA4 und P450IIE1.
B1. Konstruktion des Expressionsvektors pEBVHistk.
pEBVHistk wurde wie folgt konstruiert: das 2,5-kb-Nar-I-Fragment von pMF6, das den EBV-DNA-Replikationsursprung enthielt, wurde in Nar-I-verdauten pBR322 (kurze HSV-tk-Sequenzen an jedem Ende dieses Fragments funktionslos) eingeführt und das Konstrukt wurde als pEBV bezeichnet. Die Isolierung des 2,5-kb-Nar-I-Fragments wurde früher in der anhängigen US-Anmeldung mit der Seriennummer 07/162,885 offenbart, wovon unten zur Erleichterung der Ausführbarkeit eine Zusammenfassung wiedergegeben ist. Das 2,5-kb-Nar-I-Fragment von pMF6, enthaltend das HisD-Gen aus E. coli (geschnitten mit Ava II am 5'-Ende und Hind III am 3'-Ende, ungefähr 600 Basenpaaren am 3'-Ende wurden mit Ba131-Nuklease entfernt) wurde in die Cla-I-Schnittstelle von pEBV zur Erzeugung von pEBVHis eingeführt. Schließlich wurde das 1,0-kb-Nar-I-Fragment von pMF6 durch Addition von Hind-III-Linkern modifiziert und in die Hind-III-Schnittstelle von pEBVHis zur Erzeugung von pEBV-Histk eingeführt.
B2. Einführung des P450IIIA4-Gens in den Vektor pEBVHistk zur Konstruktion des Expressionsvektors pH44.
Der Plasmid pH44 wurde wie folgt hergestellt: das 1,6-kb-Eco-RI/Bsu36-I-Fragment der P450IIIA4-cDNA (19), das die vollständige kodierende Sequenz enthielt, wurde durch Addition von Xho-I-Linkern modifiziert. Die modifizierte cDNA wurde in die singuläre Sal-I-Schnittstelle des Expressionsvektors pMF6 (20) eingeführt. Dieser Vektor, bezeichnet als pMF6/3A4, wurde mit Nar I verdaut und ein 2,6-kb-Nar-I-Fragment, das die vollständige P450IIIA4-Transkriptionseinheit (oben beschrieben) enthielt, wurde isoliert und nach Modifizieren der Hind-III-Stelle durch Addition von Cla-I-Linkern und Behandlung mit Kälberdarm-Phosphatase in den Vektor pEBVHis (24) ligiert. Dieser Vektor vermittelt Resistenzen gegenüber L-Histidinol und wird in hohen Kopienzahlen (40 pro Zelle) gehalten. Um die erwartete geringere Expression von P50IIIA4 teilweise auszugleichen, wurde ein Plasmid, der zwei vollständige P450IIIA4-Transkriptionseinheiten enthielt, konstruiert und als pH44 bezeichnet. Um die Konstruktion in einem einzigen Schritt zu erleichtern, wurde bei der Ligation ein molares Verhältnis von 10 : 1 des P450IIIA4-haltigen 2,6-kb-Fragments zum Vektor verwendet.
B3. Einführung der P450IIE1-cDNA in den Vektor pH44 zur Konstruktion des Expressionsvektors pH441.
Der Plasmid pH44 wurde einem partiellen Nar-I-Verdau und einer Kälberdarm-Phosphatase-Behandlung unterzogen. Der Vektor wurde an das 2,6-kb-Nar-I-Fragment von p257Atk2 (8), das eine vollständige P450IIE1-Transkriptionseinheit wie oben beschrieben enthält, ligiert. Die Identität des Konstrukts wurde durch Restriktionskartierung verifiziert und der unterhaltene Plasmid wurde als pH441 bezeichnet (5).
Transfektionsverfahren
A. Transfer von Plasmid pH441 in L3-Zellen
Die Plasmide pH441 und pME23 wurden nacheinander via Protoplastenfusionen in die L3-Zellinie eingeführt. Der Plasmid pH441 wurde zuerst eingeführt.
Der Plasmid pH441 wurde durch Protoplastenfusionen (12) in die L3-Zellen eingeführt. E. coli HB 101, der das Plasmid pH441 enthielt, wurde in Luria-Broth mit 50 μg/ml Ampicillin (150 ml Gesamtvolumen) angezogen. Wenn die Bakterienkonzentration eine OD₆₀₀ von 0,6 erreicht hatte, wurden 200 μg/ml Chloramphenicol zu der Kultur zugegeben und die Kultur wurde über Nacht gerührt. Die Bakterien wurden bei 2000 × g für 10 Minuten zentrifugiert und der Zellniederschlag in 1,5 ml HBS-20 (20 mM HEPES, 20% Saccharose, pH 7,1) resuspendiert und 0, 48 ml einer 10 mg/ml Lysozym-Lösung (in HBS-20, sterilfiltriert) zugegeben. Die Bakterien wurden bei Raumtemperatur für 45 Minuten inkubiert, die Lysozym-Reaktion wurde durch Hinzufügen von 0,24 ml 1,25 M CaCl₂ beendet. Überschlüssiges Ca⁺⁺ wurde durch Zugabe von 0,6 ml 0,25 M EDTA chelatiert. Die obige Protoplasten-Zubereitung wurde durch Addition von 6 ml HBS-9 (20 mM HEPES, 9% Saccharose, pH 7,1) verdünnt.
L3-Zellen (2 bis 3 × 10⁷ Zellen) wurden zentrifugiert und der Zellniederschlag durch Beklopfen des Röhrchens dispergiert. 1,5 ml PEG-Fusionsreagenz (PEG-Fusionsreagenz bestand aus 48% (Gew./Gew.) Polyethylenglykol, 1450, gereinigt gemäß (36) mit dem balancierten RPMI-Medium 1640) wurden zu den Zellen zugegeben. Sofern nicht anders angegeben, bedeutet eine Bezugnahme auf normales Medium in diesem Protokoll RPMI-Medium 1640, versetzt mit 9% Pferdeserum. 2,5 ml der Protoplasten-Suspension wurde sofort hinzugegeben und die erhaltene Suspension wurde bei 800 × g für 3 Minuten zentrifugiert. Der Niederschlag wurde durch Schlagen des Röhrchen dispergiert, 1,5 ml PEG-Fusionsreagenz wurde zugegeben und die Zellen wurden für 1 Minute inkubiert. Das PEG-Fusionsreagenz wurde mit 50 ml normalem Medium verdünnt, die Zellen wurden zentrifugiert und in 80 ml normalem Medium, enthaltend 100 U/ml Penicillin, 1,0.0 μg/ml Streptomycin und 100 μg/ml Gentamycin (PSG) resuspendiert. Einen Tag nach der Protoplastenfusion wurden 2,6 × 10⁷ Zellen zentrifugiert (1000 × g für 5 Min) und in Medium enthaltend 0,5 mM L-Histidinol (ohne L-Histidin) und PSG wie oben beschrieben resuspendiert. Fünf Tage nach der Protoplastenfusion wurde die Kultur von 50 ml auf 80 ml mit demselben Medium verdünnt. Acht Tage nach der Protoplastenfusion wurden 50 ml der Kultur zentrifugiert, in 20 ml desselben Mediums resuspendiert und zu der Kultur zurückgegeben. Elf Tage nach der Protoplastenfusion wurde die Kultur durch Zugabe von 30 ml Medium mit 2 mM Histidinol verdünnt. Von diesem Punkt an wurde die Zellkonzentration jeden 2. bis 5. Tag bestimmt, und wenn sie 2,5 × 10⁵ Zellen/ml überschritt, wurde die Kultur (ohne L-Histidin) und PSG verdünnt. Dreiundzwanzig Tage nach der Protoplastenfusion wurde die Kultur von 58 auf 100 ml durch Zugabe von Medium mit 2 mM L-Histidinol (ohne L-Histidin) und PSG verdünnt. Neunundzwanzig Tage nach der Protoplastenfusion wurde die Kultur auf 1,5 × 10⁵ Zellen/ml in 100 ml mit demselben Medium verdünnt. Dreiunddreißig und siebenunddreißig Tage nach der Protoplastenfusion wurde die Kultur erneut wie oben beschrieben verdünnt. Vierzig und zweiundvierzig Tage nach der Protoplastenfusion wurde die Kultur auf 2 × 10⁵ Zellen/ml in 100 ml mit denselben Medien verdünnt. Vierundvierzig Tage nach der Protoplastenfusion wurde die Kultur auf 1 × 10⁵ Zellen/ml in 100 ml mit denselben Medien verdünnt. Siebenundvierzig Tage nach der Protoplastenfusion wurden die Zellen in 96-Loch-Mikrotiterplatten in den obigen Medien ausplattiert. Die Zellen wurden über 8 Platten mit durchschnittlich 0,5 Zellen pro Loch aufgeteilt. Die Platten wurden zu 12 Tage inkubiert. Kolonien wurden isoliert und in Medien mit 2 mM L-Histidinol (ohne L-Histidin) zu Massenkulturen (ungefähr 100 ml) angereichert.
Die Enzymaktivitäten von P450IIIA4 (gemessen als Testosteron6(β)-Hydroxylaseaktivität), P450IIE1 ( gemessen als Empfindlichkeit gegenüber der Zytotoxizität von N-Nitrosodimethylamin) und nativem P450IA1 (gemessen als 7-Ethoxyresorufin-Deethylase-Aktivität) und die Struktur und Kopienzahl (durch Southern-Blotting von Eco-RI-verdauter genomischer DNA) des Vektors wurden in den Klonpopulationen festgestellt. Eine Klon-Populationen wurde für die anschließende Transfektion ausgewählt. Diese Zellinie, enthaltend ungefähr 40 Kopien des pH441 Vektors, zeigte eine Testosteron-6(β)-Hydroxylaseaktivität von 1,5–1,9 pmol Produkt/10⁶ Zellen min. Aussetzen gegenüber 100 ng/ml N-Nitrosodimethylamin reduzierte das Überleben im Verhältnis zu (unbehandelten) Kontroll-Zellen auf 0,18 und wies eine 7-Ethoxyresorufin-Deethylase-Aktivität (nach Vorbehandlung über 20 Stunden mit 0,1 μM Dibenz(a, h)-anthracen) von 1,6 pmol Produkt/10⁶ Zellen-min. auf.
Es sollte ersichtlich sein, daß das obige Protokoll zur Protoplastenfusion eine spezifische Ausführungsform der Erfindung repräsentiert, und daß die genaue Zahl von Tagen zwischen Zellverdünnungen in Abhängigkeit von der Zellwachstumsrate variieren kann. Eine Zellverdünnung ist angezeigt, wenn die Zellzahl sich im Vergleich zur vorhergehenden Verdünnung verdoppelt hat. Entsprechend ist eine Zellverdünnung angezeigt, wenn die Zellen eine Zahl zwischen ungefähr 4 × 10⁵ und 6 × 10⁵ Zellen pro ml überschritten haben.
B. Transfer des Plasmids pME23 in L3-Zellen, die vorher mit dem Plasmid pH441 transfiziert wurden
Dasselbe oben in Zusammenhang mit dem Transfer des Plasmids pH441 in eine L3-Zollinie beschriebene Protoplastenfusions-Verfahren wurde für die Insertion des Plasmids pME23 in die pH441-tranfizierte L3-Zollinie angewendet, mit folgenden Ausnahmen:
Die Selektion wurde auf Grundlage der Resistenz sowohl gegenüber 2 mM L-Histidinol als auch Hygromycin B durchgeführt. Im Anschluß an die Transfektion wurden die Kulturen in Medien kultiviert, die 2 mM L-Histidinol (ohne L-Histidin), 30 μg/ml 4-Aminolävulinsäure, 100 μg/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 100 μg/ml Gentamycin enthielten. Einen Tag nach der Protoplastenfusion wurden die Zellen auf 50 ml zu 2,5 × 10⁵ Zellen pro ml verdünnt und 400 μg/ml Hygromycin B wurden zu gegeben. Fünf Tage nach der Protoplastenfusion wurden die Zellen von 50 ml auf 80 ml verdünnt und 300 μg/ml Hygromycin B wurden zugegeben. Acht Tage nach der Protoplastenfusion wurden 50 ml der Kultur zentrifugiert, in 20 ml frischem Medium resuspendiert, zu der Kultur zurückgegeben, und 200 μg/ml Hygromycin B wurden zu der Kultur zugegeben. Elf Tage nach der Protoplastenfusion begann die Massenpopulation zu wachsen; die Zellen wurden auf 2 × 10⁵ Zellen pro ml (80 ml Gesamtvolumen) verdünnt. Danach wurden die Zellen entweder auf 2 × 10⁵ Zellen pro ml verdünnt und 100 μg/ml Hygromycin B wurden alle 2 Tage zugegeben, oder die Zellen auf 1 × 10⁵ Zellen pro ml verdünnt und 200 μg/ml Hygromycin B wurden jeden 3. Tag zugegeben. Die gesamte transfizierte Massenpopulation wurde als MCL-5 bezeichnet.
Tests
A. Enzymtests
Die Enzymaktivitäten wurden in ganzen Zellen gemessen. Kumarin-7-Hydroxylase wurde gemäß der Methode von Greenlee und Poland (vom 20) durch direkte Zugabe von 100 μM Kumarin zur Zellkultur und Messung der gebildeten Fluoreszenz nach zweistündiger Inkubation gemessen. Die mikrosomale Epoxidhydrolase wurde nach dem Verfahren von Glatt et al. (26) unter Verwendung von 5 × 10⁶ Zellen in einem Gesamtvolumen von 0, 5 ml und Inkubation über 30 Minuten gemessen. Die 7-Ethoxyresorufin-Deethylase-Aktivität (27) wurde in ganzen Zellen gemäß (28) gemessen. Alle anderen Enzymtests verwendeten 1 × 10⁷ Zellen in einem 1-ml-Inkubationsvolumen. Acetanilid-4-Hydroxylase wurde gemäß (29) gemessen. Chlorzoxazon-6-Hydroxy lase wurde gemäß (30) gemessen. Die Testosteron-Hydroxylase wurde nach Waxman et al (31) gemessen.
B. Zytotoxizitäts- und Mutagenitätstests
Die Zytotoxizität wurde durch Messung des Wachstums nach Exposition gegenüber dem Prokarzinogenen abgeschätzt. Nachdem die Kulturen wieder exponentielles Wachstum aufgenommen hatten, wurde das kumulative Wachstum der mutagenbehandelten Kulturen durch das kumulative Wachstum der Negativkontroll-Kulturen geteilt, um das relative Überleben zu erhalten.
Stammkulturen von MCL-5-Zellen wurden in RPMl-1046-Medium (ohne Histidin), versetzt mit 9% Pferdeserum, 100–200 μg/ml Hygromycin B und 2 mM L-Histidinol und 30 μg/ml 4-Aminolävulinsäure wie oben beschrieben vermehrt. Vor dem Einsatz in einem Mutagenitätstest wurden Teilmengen der Stamm-MCL-5-Zellen für drei Tage in HAT-Medium (Stammkulturmedium mit 100 μM Hypoxanthin, 0,8 μM Aminopterin, 35 μM Thymidin) angzogen, zentriftugiert, in TH-Medium (HAT ohne Aminopterin) resuspendiert und für drei Tage mit Verdünnungen durch Stammkulturmedium angezogen. Die HAT/TH-Behandlung entfernt vorhandene tk- und hgprt-Mutanten.
Teilmengen von MCL-5-Zellen (3 × 10⁷ Zellen in 60 ml) wurden einer oder mehr Konzentrationen der Testchemikalie, dem Lösungsmittel allein oder einem bekannten Mutagen, üblicherweise in parallelen Kulturen, für 28 Std. ausgesetzt. Die Mutagen-Exposition wurde in normalem Medium mit 50–100 μg/ml Hygromycin B und 1–2 mM L-Histidinol und 15 bis 30 μg/ml 4-Aminolävulinsätire durchgeführt. Die Exposition gegenüber den Chemikalien wurde durch Zentrifugieren der Kulturen und Re stispendieren der Zellen in frischem Medium (üblicherweise 3 × 10⁷ Zellen 80 ml) oder Hygromycin oder L-Histidinol beendet. Die Kulturen wurden dann überimpft (üblicherweise jeden Tag zu 3 × 10⁷ Zellen 150 ml), um die phänotypische Expression der induzierten Mutation (mindestens drei Tage für den tk-Lokus und mindestens sieben Tage für den hgprt-Lokus) zu ermöglichen. Nach dem Ablauf einer ausreichenden Zeit für die phänotypische Expression der induzierten Mutation wurden Teilmengen der Kulturen in 96-Loch-Mikrotiterplatten plaziert, um den Mutanten-Anteil zu bestimmen. Die Zellen wurden zu durchschnittlich 2,5 × 10⁴ Zellen pro Loch (üblicherweise drei Platten) in Gegenwart von 4 μg/ml Trifluorthymidin, um die Mutation am tk-Lokus zu messen, zu durchschnittlich 2,5 μ 10⁴ Zellen pro Loch (üblicherweise drei Platten) in Gegenwart von 0,6 μg/ml 6-Thioguanin zur Messung der Mutation am hgprt-Lokus und zu durchschnittlich 2,5 Zellen pro Loch (üblicherweise drei Platten) ohne Selektion zur Messung der Plattierungs-Effizienz ausplattiert. Die Platten wurden für 13 Tage inkubiert und auf Anwesenheit oder Abwesenheit einer Kolonie in jedem, Loch untersucht. Die Ermittlung des Mutanten-Anteils und die statistische Analyse erfolgte wie früher beschrieben (32).
Beispiele
Beispiel 1: Enzymexpression in MCL-5-Zellen und Vergleich zur Expression mit einer einzelnen cDNA pro Vektor.
Bei der Vielzahl verwandter Vektoren und der großen Zahl der vom tk-Gen des Herpes-simplex-Virus (HSV) abgeleiteten Promotoren und Poly-A-Signale (4 pro Vektor), ergaben sich Beden ken hinsichtlich der Stabilität der Zellinie und der Wirksamkeit der Expression jeder cDNA.
Zur Verifizierung der cDNA- und nativen P450IA1-Expression, und auch zur Untersuchung der Stabilität der Zellinie, wurde eine Reihe von für P450-Cytochrome formspezifischen Enzymtests und Prokarzinogen-Aktivierungen in Abhängigkeit von der Zeit in Zellkultur gemessen (9). Die Niveaus der Aktivitäten in MCL-5-Zellen wurden mit Hilfe derselben Selektion mit denen verglichen, die in mit einer einzelnen cDNA transfizierten Zellen beobachtet wurden.
Die Niveaus der induzierten 7-Ethoxyresorufin-Deethylase-Aktivität in MCL-5-Zellen waren mit denen vergleichbar, die bei der untransfizierten L3-Zellinie (sieben) beobachtet wurden. Die Acetanilid-4-Hydroxylase-Aktivität (P450IA2-spezifisch), Testosteron-6-(beta)-Hydroxylase-Aktivität (P450IIIA4-spezifisch) und die Aktivität mikrosomaler Epoxidhydrolase bei MCL-5-Zellen waren zu jenen vergleichbarer (innerhalb eines Faktors von 2), die bei Zellen beobachtet wurden, die mit pMF6/IA2 (18), p91Dtk (pMF6/2A3; (33)), pH44 (pEBVHistk mit zwei CYP3A4-cDNAs;) bzw. p167Dtk (pMF6/mEH; (7)) transfiziert wurden. Die Niveaus von Chlorzoxazon-6-Hydroxylase (P450IIE1-spezifisch) bei MCL-5-Zellen lagen um etwa das 3fache über denen bei Zellen, die pEBVHis/2E1 trugen. Auf Grundlage dieser Tests und Vergleiche wurden alle cDNAs sowie. auch das native P450IA1 angemessen exprimiert. Es scheint, daß bei diesem Vektorkonstrukt keine nennenswerte Promotor-Interferenz auftrat.
Es sollte beachtet werden, daß, obwohl höhere Niveaus einer stabilen Expression für jede der obigen cDNAs bei Konstrukten erreicht wurde, die eine einzelne cDNA enthielten, die vorliegende Erfindung die Expression einer Mehrzahl von P450-Formen erreicht. Es existiert sicherlich eine obere Grenze für den P450-Gehalt (derzeit unbekannt), der in dieser Zellinie stabil gestützt wird. Diese Konstrukte waren in einer Weise ausgelegt, daß der Gesamt-P450-Gehalt nicht über dem als in diesem System stabil gestützt beobachteten liegen würde (z. B. enthalten Zellen, die P450IIA3 in dem pEBVHistk-Vektor tragen, etwa 1 pmol P450 pro 1 Million Zellen).
Dies wurde erreicht durch Plazierung zweier ineffizient exprimierter P450-cDNAs (P450IIIA4 und P4502E1) in dem Hochkopiezahlvektor (pEBVHistk) und zweier effizient exprimierter P450-cDNAs in dem Niedrigkopiezahlvektor (pMF6). Auf diese Weise oder der erwartete Gesamt-P450-Gehalt unterhalb von 1 pmol/Million Zellen gehalten.
Die Stabilität der Expression auf dem Enzymniveau wurde durch Überwachung der Niveaus der Enzymaktivität in Abhängigkeit von der Zeit des Wachstums in Zellkultur bestimmt. Für dieses Experiment haben wir die transfizierten Zellen zunächst kultiviert und die Größe der Kultur ausreichend erhöht, um einen Gefrierschrankvorrat mit mehreren 100 Fläschchen aufzubauen. Den Null-Zeitpunkt repräsentierte der Aufbau einer Kultur aus diesem Vorrat. Unabhängige Fläschchen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten aufgetaut und gleichzeitig in Kulturen, die für 6, 37 und 63 Tage (9) vermehrt worden waren, getestet.
Die Niveaus der Enzymaktivitäten variierten nicht wesentlich in Abhängigkeit von der Kulturzeit. Die maximale Differenz zwischen zwei Zeitpunkten betrug weniger als ein Faktor von 1,5. Die Analyse über einen Zeitrahmen von zwei Monaten deu tet darauf hin, daß die MCL-5-Zellinie ausreichend stabil ist, um viele Anwendungen zu erlauben, einschließlich Langzeit-, Niedrigdosis-Expositions-Experimenten (34, 35) und dem Transfer der Zellinie zu unabhängigen Laboratorien.
Auf Basis des P450-spezifischen Enzymtests schlossen wir, daß MCL-5-Zellen gleichzeitig die menschlichen P450-Formen exprimieren, die sich als primär verantwortlich für die Aktivierung von vielen Prokarzinogenen herausgestellt haben. MCL-5-Zellen besitzen daher das Potential, ein wirksames Screening-Werkzeug für die Human-Prokarzinogenen-Aktivierung zu bilden.
Beispiel 2: Prokarzinogenen-Aktivierung durch MCL-5-Zellen: Zytotoxizitäts- und Mutagenitätstest-Verfahren
Das folgende Verfahren ist gerichtet auf Zytotoxizitäts- und Mutagenitätstests im Anschluß an die Exposition von MCL-5-Zellen gegenüber dem Prokarzinogen Benzo(a)pyren. Das identisch Verfahren wurde verwendet, um die Zytotoxizität und Mutagenität für jedes der getesteten Prokarzinogene festzustellen.
Die Mutanten-Anteile wurden für alle Prokarzinogen-Konzentrationen an dem hprt-Lokus festgestellt, und wurden auch an dem tk-Lokus für die höchste Prokarzinogen-Konzentration bestimmt. Die Ergebnisse sind in dem folgenden Beispiel dargestellt. Im allgemeinen waren die Mutanten-Anteile der Negativkontrolle an den hprt- und tk-Loci bei MCL-5-Zellen vergleichbar mit denen, die in der Eltern-L3-Zellinie beobachtet wurden. Dies zeigt an, daß die Expression der P450-Cytochrome die Spontanmutationsrate nicht wesentlich beeinflußt (möglicherweise durch die Erzeugung von aktivierten Sauerstoff- Spezies). Diese Beobachtung stimmt überein mit unseren vorhergehenden Beobachtungen, daß die P450-Expression die Hintergrund-Mutantenhäufigkeit (38–41) nicht beeinflußt.
Im allgemeinen ergab sich eine gute Übereinstimmung zwischen hprt und tk in der Größenordnung der beobachteten mutagenen Antwort. Die Werte lagen alle innerhalb eines Faktors von zwei. Dies zeigt, daß der tk-Lokus für viele Screening-Anwendungen aufgrund der kürzeren phänotypischen Expressionszeit bei tk im Vergleich zu hprt unter signifikanter Einsparung von Zeit und Materialien verwendet werden kann.
Die Zytotoxizität wurde durch Messung des Wachstums nach der Behandlung abgeschätzt. Nachdem die Kulturen wieder exponentielles Wachstum erreicht hatten, wurde das kumulative Wachstum der mutagenbehandelten Kulturen durch das kumulative Wachstum der Negativkontroll-Kulturen geteilt, um das relative Überleben zu erhalten. Die Induktion von Mutationen an den hprt- und tk-Loci wurde durch vorher publizierte Protokolle (32) mit geringen Modifikationen gemessen. Menschliche Lymphoblasten wurden dem Mutagen für 28 Stunden ausgesetzt. Jede Parallel-Kultur enthielt 3 × 10⁷ Zellen. Nach einer Zeitdauer von sieben Tagen phänotypischer Expression wurde der Mutanten-Anteile nach den vorstehend beschriebenen Verfahren gemessen. Aflatoxin B₁, Benzo(a)pyren, 3-Methylchloranthren, 2-Acetaminofluoren und Benzidin wurden in Dimethylsulfoxid gelöst; N-Nitrosodimethylamin und N-Nitrosodiethylamin wurden für die Zuführung zu den Zellkulturen in Wasser gelöst.
Beispiel 3: Toxizität und Mutagenität von Benzo(a)pyren
Die Toxizität und Mutagenität des Karzinogens Benzo(a)pyren wurde unter Anwendung der oben beschriebenen Verfahren bestimmt. Von Benzo(a)pyren ist bekannt, daß es durch P450IA1 zu mutagenen Spezies metabolisiert wird. Diese Mutagenität kann durch die Wirkung von Epoxidhydrolase in Übereinstimmung mit dem P450IA1 potenziert werden, um vizinales Diolepoxid zu erzeugen.
Die Mutagenität von Benzo(a)pyren, 3-Methylcholanthren und N-Nitrosodiethylamin wurde an den hprt- und tk-Loci in MCL-5-Zellen bestimmt. Die Prokarzinogen-Zytotoxizität und -Mutagenität ist in 10 dargestellt. Die Zellen wurden den angegebenen Konzentrationen des Mutagens für 28 Stunden ausgesetzt. Jede Chemikalie wurde in mindestens zwei unabhängigen Experimenten mit mindestens zwei Kulturen bei jedem Experiment getestet. Mittelwerte sind aufgezeichnet. Alle Konzentrationen wurden auf den Mutanten-Anteil an dem hprt-Lokus untersucht, die höchste Konzentration wurde auch auf den Mutanten-Anteil an dem tk-Lokus untersucht. Die tk-Lokus-Datenpunkt sind in Klammern angegeben. Die Prokarzinogene sind die folgenden: Kreise, Benzo(a)pyren; Quadrate, 3-Methylcholanthren und Dreiecke, N-Nitrosodiethylamin. Die mittleren Negativkontrolle-Mutanten-Anteile betrugen 2,8 × 10^–6 und 3,6 × 10^–6 an den hprt- bzw. tk-Loci.
Benzo(a)pyren induzierte eine signifikante mutagene Reaktion bei einer Expositionskonzentration von 3 ng/ml, und ein steter Anstieg des Mutanten-Anteils wurde über einen 1000fachen Konzentrationsbereich (10) beobachtet. Benzo(a)pyren war nicht besonders zytotoxisch; wesentliche Anstiege im Mutanten-Anteil wurden bei Abwesenheit von signifikanter Zytoto xizität beobachtet, und Exposition gegenüber 3 μg/ml verminderte das relative Überleben nur auf 60%.
Die MCL-5-Zellen waren 3 bis 10mal empfindlicher gegenüber Benzo(a)pyren als MCL-1-Zellen, die P450IIA3 und mEH unter Hygromycin-B-Selektion exprimieren (sieben). Diese Beobachtung steht in Übereinstimmung damit, daß P450IA1 und mEH primär bei dieser Aktivierung involviert sind und legt eine potentielle Rolle für andere P450 bei der Aktivierung von Benzo(a)pyren nahe. Shimada, et al. (36) haben berichtet, daß P450IIIA4 Benzo(a)pyrene-7,8-diol in menschlichen Lebermikrosomen. aktivieren kann.
Beispiel 4: Toxizität und Mutagenität von N-Nitrosodiethylamin
Die Toxizität und Mutagenität von N-Nitrosodiethylamin wurde in MCL-5-Zellen bestimmt (10).
N-Nitrosodiethylamin induzierte eine signifikante mutagene Reaktion bei einer Expositionskonzentration von 100 ng/ml, und wie bei Benzo(a)pyren wurde über einen 1000fachen Konzentrationsbereich, einschließlich nicht-zytotoxischer Expositionskonzentrationen, ein steter Anstieg des Mutanten-Anteils beobachtet (10). Wir haben früher gezeigt, daß sowohl P450IIA3 als auch P450IIE1 N-Nitrosodiethylamin aktivieren kann (33). Die beobachteten Mutanten-Anteile bei MCL-5-Zellen lagen etwa 2fach höher als auf Grundlage der Summe der Mutanten-Anteile bei IIA3/Hyg-Zellen und IIE1/Hol-Zellen vorhergesagt (33). Die höheren Mutanten-Anteile bei MCL-5-Zellen können auf die offenbar höheren, durch Chlorzoxazon-6-Hydroxy lase-Aktivität und N-Nitrosodiethylamin-Sensitivität bestimmten, Niveaus von P450E1 zurückgeführt werden.
Beispiel 5: Toxizität und Mutagenität von N-Nitrosodimethylamin
Die Toxizität und Mutagenität von N-Nitrosodimethylamin wurde in MCL-5-Zellen bestimmt (11). Die Prokarzinogene sind in 11 wie folgt angegeben: Kreise, N-Nitrosodimethylamin; Quadrate, Aflatoxin B₁ und Dreiecke, 2-Acetaminofluoren und Rauten, Benzidin. Die Versuche wurden wie oben beschrieben durchgeführt und aufgezeichnet.
N-Nitrosodimethylamin induzierte einen signifikanten Anstieg des Mutanten-Anteils. bei einer Expositionkonzentration von 20 ng/ml (11). Diese Chemikalie war auch recht zytotoxisch. Die MCL-5-Zellen waren etwa 3mal empfindlicher gegenüber N-Nitrosodimethylamin als 2E1/Hol-Zellen (33), was mit den höheren Niveaus der Chlorzoxazon-6-Hydroxylase-Aktivität bei MCL-5-Zellen übereinstimmt. P450IIA3 spielt eine geringe Rolle bei der Aktivierung von N-Nitrosodimethylamin (1000fach weniger aktiv als P450IIE1), was möglicherweise nicht signifikant zu der erhöhten mutagenen Reaktion beitrug.
Beispiel 6: Toxizität und Mutagenität von Aflatoxin-B1 an den tk- und hgprt-Loci
Die Toxizität und Mutagenität des Karzinogens Aflatoxin B₁ wurde unter Anwendung der oben beschriebenen Verfahren untersucht. Aflatoxin-B₁ wird durch mehrere Cytochrom-P450-Enzyme, einschließlich P450IA1, P450IIA3, P450IIIA4 und P450IA2, metabolisiert. Es wurde daher erwartet, daß MCL-5-Zellen gegen über Aflatoxin-B₁-induzierter Mutagenität empfindlicher sein würden.
Aflatoxin B1 rief einen signifikanten Anstieg des Mutanten-Anteils bei einer Expositionskonzentration von 5 ng/ml hervor (11). Anders als Benzo(a)pyren, 3-Methylchloranthren und N-Nitrosodiethylamin, war Aflatoxin B₁ bei niedrigen Konzentrationen ziemlich zytotoxisch. Wir haben früher beobachtet, daß Aflatoxin B₁ in 1A2/Hyg, 3A4/Hol- und 2A3/Hyg-Zellen zu einem Mutagen aktiviert wird (unveröffentlichte Ergebnisse), wobei IA2/Hyg-Zellen etwa 8mal empfindlicher waren als 3A4/Hol-Zellen, die etwa 15mal empfindlicher waren als 2A3/Hyg-Zellen. Die native Zellinie ist ebenfalls empfindlich gegenüber Aflatoxin B₁. Die Empfindlichkeit von MCL-5-Zellen steht in Einklang mit der Summe der einzelnen enzymatischen Aktivierungskapazitäten.
Beispiel 7: Toxizität und Mutagenität von 3-Methylcholanthren
3-Methylcholanthren rief einen signifikanten Anstieg des Mutanten-Anteils bei der Expositionskonzentration von 30 ng/ml hervor, und es würde über einen 100fachen Konzentrationsbereich ein steter Anstieg des Mutanten-Anteils beobachtet ( 10). Erneut wurden beträchtliche Anstiege des Mutanten-Anteils in Abwesenheit einer signifikanten Zytotoxizität beobachtet.
Die bei MCL-5-Zellen für Benzo(a)pyren, N-Nitrosodiethylamin und 3-Methylchloranthren beobachteten Mutanten-Anteile waren mit die höchsten in diesem System, und waren größer als bei vielen direkt-agierenden alkylierenden Agenzien. Diese Beob achtung unterstreicht die beträchtliche prokarzinogenaktivierende Kapazität bei MCL-5-Zellen.
Beispiel 8: Toxizität und Mutagenität von 2-Acetaminofluoren
Von 2-Acetaminofluoren ist berichtet worden, daß es durch P450IA1 und P450IA2 (37) aktiviert wird. 2-Acetaminofluoren ruft einen signifikanten Anstieg des Mutanten-Anteils bei einer Expositionskonzentration von 10 μg/ml hervor, wie in 11 dargestellt. Die Reaktion bei MCL-5-Zellen war größer als sie für die Eltern-AHH-1-Zellinie beobachtet wurde und war daher damit in Einklang, daß eine der transfizierten und höheren Aktivitäten von nativem P450IA1 diese Aktivierung vermittelt. Weitere Untersuchungen mit Zellinien, die einzelne cDNAs exprimieren, sind erforderlich, um zu ermitteln, welche Form(en) verantwortlich waren.
Beispiel 9: Toxizität und Mutagenität von Benzidin
Benzidin ruft einen sehr geringen Anstieg des Mutanten-Anteils (? bis 3fach, 11) hervor. Die Reaktion bei MCL-5-Zellen war mit derjenigen vergleichbar, die bei der Eltern-Zellinie AHH-1 beobachtet wurde (weiter unten beschrieben). Dies deutet darauf hin, daß der Metabolismus durch die transfizierten Aktivitäten möglicherweise nicht der geschwindigkeitsbestimmende Schritt für die Aktivierung dieser Verbindung zu einem Mutagen war.
Beispiel 10: Vergleich der Empfindlichkeit der MCL-5-Zellinie mit der Eltern-Zellinie AHH-1
Um die Wirkungen der cDNA-Transfektion weiter zu veranschaulichen, wurde die Empfindlichkeit der Zellinie MCL-5 mit derjenigen der Eltern-Zellinie AHH-1, welche ausschließlich native P4501A1-Aktivität enthält, verglichen. Für diesen Vergleich wurden die für eine Verdopplung des Mutanten-Anteils an dem hprt-Lokus erforderlichen Mutagen-Konzentrationen durch lineare Interpolation ermittelt. Eine Verdopplung des Mutanten-Anteils stellt einen signifikanten Anstieg im Mutanten-Anteil dar. Dieser Vergleich war für alle Chemikalien mit Ausnahme von 3-Methylchloranthren möglich, für das keine Daten hinsichtlich der AHH-1-Zellinie erhältlich waren. Sowohl die AHH-1 als auch die MCL-5-Zellen weisen vergleichsweise negative Kontroll-Mutanten-Anteile an dem hprt-Lokus auf (2,5 bis 3 × 10^–6). Dieser Vergleich ist in 12 dargestellt. Für alle Prokarzinogene mit Ausnahme von Benzidin war die MCL-5-Zellinie signifikant empfindlicher als die AHH-1-Zellen. Die Nitrosamine waren bei MCL-5-Zellen mehr als 10000mal aktiver, Benzo(a)pyren und Aflatoxin B₁ waren etwa 1000mal aktiver und 2-Acetaminofluoren war 3mal aktiver. Nur Benzidin ergab bei beiden Zellinien vergleichbare Reaktionen. Auf Basis der bei den MCL-5-Zellen beobachteten mutagenen Reaktionen und der Vergleiche zu AHH-1-Ze11en, wurde die prokarzinogenaktivierende Kapazität durch das Transfektionsverfahren beträchtlich verbessert. Die MCL-5-Zellen waren sehr empfindlich gegenüber den mutagenen Wirkungen von zwei polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen, zwei Nitrosaminen, einem Mykotoxin und einem aromatischen Amid. Diese Ergebnisse zeigen, daß diese Zellinie ein Spektrum von Prokarzinogenen aktivieren kann.
Es sollte beachtet werden, daß unser Verständnis der Prokarzinogen-Aktivierung beim Menschen und der für diese Aktivie rung verantwortlichen P450-Formen noch in den Kinderschuhen steckt. Es ist daher wahrscheinlich zu erwarten, daß weitere P450 sich als primär verantwortlich für die Aktivierung von anderen Prokarzinogenen erweisen. Die Entwicklung der MCL-5-Zellinie eröffnet die Möglichkeit der Transfektion mehrerer menschlicher P450-cDNAs, und es ist wahrscheinlich anzunehmen, daß weitere P450 in die MCL-5-Zellen, entweder in denselben Vektoren oder in einem unabhängig selektierten Vektor, aufgenommen werden könnten. Alternativ kann eine zweite Zelllinie, die einen anderen Satz von P450-cDNAs exprimiert, entwickelt werden.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, eine Zellinie zu konstruieren, die mehrere P450-cDNAs exprimiert, und nicht, das spezifische P450-Profil eines bestimmten Gewebes (d. h. Leber) zu rekonstruieren. Entsprechend sollten diese Ergebnisse nicht als Hinweis auf eine quantitative menschliche Gewebeempfindlichkeit gegenüber Prokarzinogen-Exposition interpretiert werden. Wenn mehr über spezifische P450-Profile in bestimmten Geweben bekannt wird, ergibt die vorliegende Studie, daß es im Prinzip möglich sein sollte, solch ein Profil in einer stabilen Zellinie für die kontrollierte Analyse zu rekonstruieren.
Es sollte ersichtlich sein, daß verschiedene Änderungen und Modifikationen der bevorzugten Ausführungsformen innerhalb des Bereichs der Erfindung vorgenommen werden können. Beispielsweise können andere menschliche Zellinien oder Säugetier Zellinien verwendet werden, um die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren zu erhalten. Genauso können die Verfahren der Erfindung in Verbindung mit der Klonierung anderer als der hier beschriebenen menschlichen Cytochrom- P450-cDNA verwendet werden. Es ist daher beabsichtigt, daß alle Gegenstände, die in der obigen Beschreibung enthalten sind, in veranschaulichendem und nicht in einem limitierenden Sinne verstanden werden sollen.
Literatur

1. Yoakum, G. H. (1984) Biotechniques 1/2, 24–30
2. Furth et al (1981) Anal. Biochem. 110: 1–8.
3. Young, R. A. et al (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1194–1198.
4. Young, R. A, et al (1983) Science 222: 778–782.
5. Sugden, B. et al (1985) Mol. Cell Biol. 5: 410–413.
6. Boyer, H. W. et al (1969) J. Mol. Biol. 41: 459–472.
7. Davies, R. L., Rudo, K., Turner, T. R. und Langenbach, R. (1989) Carcinogensis 10: 885–891.
8. Crespi, C. L., Langenbach, R. and Penman, B. W. (1990) Progress in Clinical and Biological Research. Mendelsohn,M. L. and Albertini, F. J. (Hsg.) Wiley-Liss, New York, Bd. 340B, S 97–106.
9. Phillips, I. R. et al (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 983–987.
10. Davis et al (1980) Advanced Bacterial Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.).
11. Maniatis. T. et al (1982) Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.).
12. Denhardt, D. T. (1966) Biochem. Biophys. Res. Commun., 28: 641–651.
13. Southern, E. M. (1975) J. Mol. Biol. 98: 503–517.
14. Bolivar, F. et al (1977) Gene 2: 95–113.
15. Garger, 5. J. et al (1983) Biochem. Biophys. Res. Commun. 117: 835–832.
16. Gonzalez, F. J. et al (1981) J. Biol. Chem. 256: 4697– 4700.
17. McKnight, S. L. (1980) Nucl. Acids Res. 8: 5931–5948.
18. Crespi, C. L., Steimel, D. T., Aoyama, T., Gelboin, H. V. und Gonzalez, F. J. (1990) Mol. Carcinogenesis 3: 5–8.
19. Gonzalez, F. J., Schmid, B. J., Umeno, M., McBride, O. W., Hardwick, J. P., Meyer, U. A., Gelboin, H. V. und Idle, J. R. (1988) Human P450PCN1: sequence, chromosome, localization, and direct evidence through cDNA expression that P450PCN1 is nifedipine oxidase. DNA 7: 79–86.
20. Davies, R. L., Crespi, C. L., Rudo, K., Turner, T. R. und Langenbach, R. (1989) Development of a human cell line by selection and drug-metabolizing gene transfection with increased capacity to activate promutagens. Carcinogenesis 10: 885–891.
21. Song B. J., Gelboin, H. V., Park, S. -S., Yang, C. S. und Gonzalez, F. J. (1986) J. Biol. Chem. 261: 16689–16697.
22. McKnight, S. L. (1980) Nucl. Acids Res. 8: 5949–5964.
23. Wagner et al (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1441– 1445.
24. Crespi, C. L., Langenbach, R. und Penman, B. W. (1989) The development of a panel of human cell lines expressing specific human cytochrome P450 cDNAs. In: Mutation and the Environment, Mendelsohn, M. L. und Albertini, R. (Hsg.) Alan Liss, New York, Bd. 340D, S. 97–106.
25. Greenlee, W. F. und Poland, A. (1978) J. Pharmacol. Exp. Ther. 205: 596–605.
26. Glatt, H. Kaltenbach, E. und Oesch, F. (1980) Cancer Res. 40: 2552–2556.
27. Burke, M. D. und Mayer, F. T. (1974) Drug Metab. Disp. 2: 583–588.
28. Crespi, D. L., Altman, J. D. und Marletta, M. A. (1985) Chem. Biol. Interact 53: 257–272.
29. Guenthner, T. M., Negishi, M. und Nebert, D. W. (1979) Anal. Biochem. 96: 201–207.
30. Peters, R., Bocher, R., Peaune, P., Iwasaki, M. und Gueugerich, F. P. (1990) In: Drugs, Metabolizing Enzymes: Genetics, Regulation and Toxicology. Ingelman-Sundberg, M. Gustafsson, J-A., und Orrenius, S. (Hsg.). Proceedings of the VIIIth international symposium on Microsomes and Drug oxidations, Stockholm, Karolinska Institute, 1990, S. 234.
31. Waxman, D. J., Ko, A. und Walsh, C. (1983) J. Biol. Chem. 258: 11937–11943.
32. Penman, B. W, und Crespi, C. L. (1987) Environ. Mol. Mutagen 10: 35–60.
33. Crespi, C. L., Penman, B: W., Leakey, J. A. E., Arlotto, M. P., Stark, A., Parkinson, A., Turner, T., Steimel, D. T., Rudo, K., Davies, R. L. und Langenbach, R. (1990) Carcinogenesis 11: 1293–1300.
34. Penman, B. W., Crespi, C. L., Komives, E. A., Liber, H. L. und Thilly, W. G. (1983) Mutat. Res. 108: 417–436.
35. Crespi, C. L., Seixas, G. M., Turner, T. und Penman, B. W. (1990) Environ. Molec. Mutagen. 15: 71–77.
36. Shimada, T. Mazrtin, M. V., Pruess-Schwartz, D. Marnett, L. und Guengerich, F. P. (1989) Cancer Res. 49: 6304–6312.
37. McManus, M. E., Burgess, W. M., Veronese, M. E., Huggett, A., Quattrochi, L. C., und Tukey, R. H. (1990) Cancer Res. 50: 3367–3376.
38. Skopek, T. R. et al (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 410–414.
39. Hoffman, G. R. et al. (1975) Mutat. Res. 27: 307–318.
40. Chu E. H. Y. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 61: 1306– 1312.
41. Hsie, A. W., et al (1975) Somat. Cell Genet. 1: 383–389.

Claims

Unsterbliche Säugetier-Zellinie, die mindestens vier verschiedene transfizierte P450-Cytochrome unterhalb des Niveaus stabil exprimiert, das die P450-Expression in der Zellinie instabil macht, wobei die P450-Cytochrome P450IA2 und P450IIIA4 einschließen.
Zellinie nach Anspruch 1, wobei die P450-Cytochrome P450IA2, P450IIE1 und P450IIIA4 einschließen.
Unsterbliche Säugetier-Zellinie, die mindestens vier verschiedene transfizierte P450-Cytochrome unterhalb des Niveaus stabil exprimiert, das die P450-Expression in der Zellinie instabil macht, wobei die P450-Cytochrome P450IIA3 und P450IIIA4 einschließen.
Zellinie nach Anspruch drei, wobei die P450-Cytochrome P450IIA3, P450IIE1 und P450IIIA4 einschließen.
Zellinie nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die P450-Cytochrome P450IA2, P450IIA3, P450IIE1 und P450IIIA4 einschließen.
Unsterbliche Säugetier-Zellinie nach einem der vorhergehenden Ansprüche, transfiziert mit den Plasmiden pME23, wie aus 4 ersichtlich, und pH441, wie aus 5 ersichtlich.
Zellinie nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zellinie eine menschliche Zellinie ist.
Zellinie nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die P450-Cytochrome menschlich sind.
Verfahren zur Durchführung eines Stoffwechsel-, Toxizitäts- oder Mutagenitätstests, umfassend die Verwendung einer Zellinie nach einem der Ansprüche 1–8.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Verfahren das Exponierung einer Kultur einer Zellinie nach einem der Ansprüche 1–8 gegenüber einer Testsubstanz und Untersuchen der metabolischen, toxischen und/oder mutagenen Wirkungen der Substanz, sofern vorhanden, auf die Zellinie umfaßt.
Verfahren zur Durchführung eines Mutagenitätstests nach Anspruch 10, umfassend die Schritte des: (a) Exponierens einer Kultur einer Zellinie nach einem der Ansprüche 1–8 gegenüber der Substanz, (b) Feststellens der Anzahl mutierter Zellen in der exponierten Kultur, und (c) Vergleichens der Mutationshäufigkeit der exponierten Zellen mit der Mutationshäufigkeit von nicht-exponierten Zellen zur Ermittlung der Mutagenität der Substanz.
Verfahren zur Herstellung einer unsterblichen Säugetier-Zellinie, die mindestens vier verschiedene transfizierte P450-Cytochrome unterhalb des Niveaus stabil exprimiert, das die P450-Expression in der Zellinie instabil macht, wobei das Verfahren das Transfizieren einer Säugetier-Zellinie mit den Plasmiden pME23, wie aus 4 ersichtlich, und pH441, wie aus 5 ersichtlich, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zellinie eine menschliche Zellinie ist.
Verfahren zur Durchführung eines Stoffwechsel-, Toxizitätsoder Mutagenitätstests, umfassend die Verwendung einer unsterblichen Säugetier-Zellinie, die mindestens vier verschiedene transfizierte P450-Cytochrome unterhalb des Niveaus stabil exprimiert, das die P450-Expression in der Zellinie instabil macht, und die mit den Plasmiden pME23, wie aus 4 ersichtlich, und pH441, wie aus 5 ersichtlich, transfiziert ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Verfahren das Exponieren einer Kultur einer unsterblichen Säugetier-Zellinie, die mindestens vier verschiedene transfizierte P450-Cytochrome unterhalb des Niveaus stabil exprimiert, das die P450-Expression in der Zellinie instabil macht, und die mit den Plasmiden pME23, wie aus 4 ersichtlich, und pH441, wie aus 5 ersichtlich, transfiziert ist, gegenüber einer Testsubstanz und das Untersuchen der metabolischen, toxischen und/oder mutagenen Wirkungen der Substanz, sofern vorhanden, auf die Zellinie umfaßt.
Verfahren zur Durchführung eines Mutagenitätstests nach Anspruch 4, umfassend die Schritte des: (a) Exponierens einer Kultur einer unsterblichen Säugetier-Zellinie, die mindestens vier verschiedene transfizierte P450-Cytochrome unterhalb des Niveaus stabil exprimiert, das die P450-Expression in der Zellinie instabil macht, und die mit den Plasmiden pME23, wie aus 4 ersichtlich, und pH441, wie aus 5 ersichtlich, transfiziert ist, gegenüber der Substanz, (b) Feststellens der Anzahl mutierter Zellen in der exponierten Kultur, und (c) Vergleichens der Mutationshäufigkeit der exponierten Zellen mit der Mutationshäufigkeit von nicht-exponierten Zellen zur Ermittlung der Mutagenität der Substanz.