DE69132611T2 - Verfahren zur herstellung von sulfierte oligonukleotid-analoge - Google Patents
Verfahren zur herstellung von sulfierte oligonukleotid-analogeInfo
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
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Description
- Die Erfindung betrifft allgemein die Synthese von Oligonucleotiden und, genauer ausgedrückt, ein Verfahren zum Schwefeln von Oligonucleotiden mit Thiuramdisulfiden zum Bilden von Phosphorthioat- und/oder Phosphordithioatentsprechungen derselben.
- Mit der Entwicklung wirksamer Syntheseverfahren ist Interesse an der Verwendung von Antisense-Oligonucleotiden zum Behandeln einer Vielfalt von Erkrankungen entstanden, insbesondere Virusinfektionen, z. B. Matsukura et al. Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 86, Seiten 4244-4448 (1989). Ein Antisense-Oligonucleotid ist ein synthetisches Oligonucleotid unterschiedlicher Länge, gewöhnlich im Bereich von 12 bis 30 Nucleotiden, oder Nucleotidentsprechungen, deren Sequenz komplementär zu einem vorbestimmten Segment von RNA ist, entweder frisch transkribiert oder der Bote (mRNA), das entscheidend für irgendeine Virusfunktion ist. Man geht davon aus, dass, wenn ein Antisense-Oligonucleotid zu seiner Ziel-RNA hybridisiert, es entweder die Übersetzung oder Verarbeitung der RNA blockiert oder sie für enzymatischem Abbau anfällig macht.
- Ein Problem mit diesem Ansatz ist die Schwierigkeit gewesen, die Antisense-Oligonucleotide zu ihrer Ziel-RNA in ausreichender Konzentration und für eine ausreichende Dauer zu bringen, um wirksam bei der Abstellung der Synthese unerwünschter Proteine, z. B. Virusenzyme, Hüllproteine und dergleichen zu sein. Man nimmt an, dass die Anfälligkeit der Phosphodiesterbindung der Oligonucleotide für Nucleaseverdauung eine wichtige Ursache dieser Schwierigkeit ist, und die Entwicklung einer Vielzahl von Nuclosidoligomeren verbunden durch nucleaseresistente Analoge der natürlichen Phosphodiesterbindung hervorgerufen hat, z. B. Miller et al. US-Patent 4,511,713 und Ts'o, US- Patent 4,469,863 (Methyl- und Arylphosphonate); Miro et al. Nucleic Acids Research, Bd. 17, Seiten 8207-8219 (1989) (Phosphorselenoate); Brill et al. J. Am. Chem. Soc., Bd. 111, Seiten 2321 (1989) (Phosphordithioate); und Matsukura et al. Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 84, Seiten 7706-7710 (1987) und Gene, Bd. 72, Seiten 343-347 (1988) (Phosphorthioate).
- Die Phosphortioat- und Phosphorditioatentsprechungen sind besonders vielversprechend, da sie äußerst nucleaseresistent sind, die gleiche Ladung wie natürliche Oligonucleotide haben und durch Zellen in wirksamen Mengen aufgenommen werden.
- Phosporthioate werden bequem durch automatische DNA- Synthetisiergeräte unter Verwendung von Wasserstoffphosphonatchemie synthetisiert, welche zulässt, dass das Phosphonatgrundgerüst in einem einzigen Schritt außerhalb des automatischen Synthetisiergeräts nach Synthese geschwefelt wird. Dies ist vorteilhaft, da die Phosphonatkomponenten geschwefelt werden, indem sie in einem organischen Lösungsmittel aufgelöstem Elementarschwefel ausgesetzt werden. Da der Schwefel einfach aus der Lösung ausfällt, vermeidet die Schwefelung außerhalb der Säule teurere Blockierungen von Ventilen und Rohrmaterial des Synthetisiergeräts durch Schwefelausfällungen. Ein Nachteil dieser Vorgehensweise von Phosphorthioatsynthese besteht darin, dass Kopplungserträge während Kettenverlängerung typischerweise kleiner als diejenigen sind, die durch Verwendung von Phosphoramimditchemie erhalten werden, Gaffney und Jones, Tett. Lett., Bd. 29, Seiten 2619-2622 (1988). Die praktische Bedeutung hoher Kopplungserträge wird durch die Synthese eines 28-mers demonstriert, wo ein 99%-tiger Kopplungsertrag pro Schritt zu einem Gesamtertrag von 76% (.99²&sup7;) führt, wohingegen ein 96%-tiger Ertrag pro Schritt zu einem Gesamtertrag von nur 33% (.96²&sup7;) führt.
- Phosphoramimditchemie, mit Kopplungserträgen typischerweise über 99%, wäre ein äußerst wünschenswerter Ansatz zu Phosphorthioate- und Phosphordithioatsynthese. Die Phosphitzwischenprodukte, die geschwefelt werden würden, sind jedoch unter den Bedingungen des Detritylisierungsschritts des Reaktionskreislaufs instabil. Dies erfordert, dass die Phosphitbindung nach jedem Kopplungsschritt zu schwefeln ist. Für praktische Zwecke, würden solche Schwefelungen auf einem automatischen Synthetisiergerät durchgeführt werden müssen, aber das oben erörterte Ausfällungsproblem schließt die Verwendung eines jeglichen der im Handel erhältlichen Mechanismen aus. Außerdem ist die Schwefelungsgeschwindigkeit der Phosphite äußerst langsam und leidet unter Nebenreaktionen, die zu verstärkter Verunreinigung des Endprodukts führen.
- Kamer et al. Tetrahedron Letters, Bd. 30, Seiten 6757-6760 (1989) haben die Verwendungen von Phenacetyl und Benzyldisulphid für die schnelle P-Schwefelung von Phosphattriestern bzw. H-Phosphonatdiestern beschrieben, aber solche Reaktionen beinhalten Dimererträge von nur ungefähr 90%. Andere aktuelle Verfahren zum Synthetisieren von Dimerspezies mit Phosphor(di)thioatbindungen sind durch Peterson et al., ibid, Bd. 31, Seiten 911-914 (1990), durch Morvan et al. ibid, Bd. 31, Seiten 7149-7152 (1990), in EP-A-0306609; und durch Radhakrishnan et al., J. Org. Chem. 1990, 55, Seiten 4693-4699 beschrieben worden.
- Angesichts des Wunsches, Phosphorthioat- und Phosphordithioatentsprechungen von Oligonucleotiden als pharmazeutische Verbindungen zu verwenden, wäre es vorteilhaft, ein Verfahren zum Schwefeln zur Verfügung zu haben, das die höchstmöglichen Erträge von vollständig geschwefelten Analogen erzielt und das für Verwendung mit automatischen Synthetisiergeräten anpassbar wäre, insbesondere mit Phosphoramidit- und/oder Phosphorthioamiditchemien.
- Der Erfindung zufolge wird ein Verfahren zum Schwefeln einer Phosphor(III) enthaltenden Verbindung geschaffen, das den Schritt umfasst, die Phophor (III) enthaltende Verbindung mit einem Thiuramdisulfid zur Reaktion zu bringen, das aus der durch die folgende Formel definierten Gruppe ausgewählt ist:
- wobei
- R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; getrennt genommen:
- Wasserstoff;
- Alkyl mit von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen;
- Halogen-, Nitro- oder Cyano-substituiertes Alkyl mit von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen;
- oder einen von 5 bis 8 Kohlenstoffatomen enthaltenden Heterocyclus und ein aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel ausgewähltes Heteroatom darstellen;
- R&sub1; und R&sub2;, wenn zusammengenommen:
- Cycloalkyl mit von 4 bis 7 Kohlenstoffatomen;
- einen von 3 bis 6 Kohlenstoffatomen enthaltenden Heterocyclus und ein aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel ausgewähltes Heteroatom darstellen;
- R&sub3; und R&sub4;, wenn zusammengenommen:
- Cycloalkyl mit von 4 bis 7 Kohlenstoffatomen;
- oder einen von 3 bis 6 Kohlenstoffatomen enthaltenden Heterocyclus und ein aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel ausgewähltes Heteroatom darstellen; und
- R&sub2; und R&sub3;, wenn zusammengenommen, eine Bindung sind, so dass das Thiuramdisulfid ein substituierter 1,2-Dithio-4,5- Diaza-Heterocyclus ist.
- Einem anderen Aspekt der Erfindung zufolge wird ein Verfahren zum Synthetisieren einer geschwefelten Oligonucleotidentsprechung einer vorbestimmten Sequenz geschaffen, dass umfasst, eine Phosphor(III)-Bindung mit einem Thiuramdisulfid der obigen Formel I zu schwefeln. Vorzugsweise umfasst dieses Verfahren die Schritte:
- (a) ein geschütztes Nucleosid oder eine Entsprechung desselben befestigt an einem Festphasenträger vorzusehen, wobei das geschützte Nucleosid oder die Entsprechung desselben eine blockierte Funktionalität aufweist;
- (b) die Blockierung der blockierten Funktionalität zum Bilden einer reaktionsbereiten Funktionalität aufzuheben;
- (c) mit der reaktionsbereiten Funktionalität ein blockiertes geschütztes Nucleosidphosphoramidit- oder Phosphorthioamiditmonomer oder eine Entsprechung desselben zur Reaktion zu bringen, um eine Kette richtiger Sequenz mit einer Phosphor(III)-Bindung und einer blockierten Funktionalität zu bilden;
- (d) die Phosphor(III)-Bindung zu schwefeln, indem die Kette richtiger Sequenz einem Thiuramdisulfid ausgesetzt wird, und
- (e) die Schritte (b) bis (d) zu wiederholen, bis das geschwefelte Oligonucleotid der vorbestimmten Sequenz erhalten wird.
- Vorzugsweise sind in der Formel I R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4;, getrennt genommen, Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, n- butyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, Cyclopentylmethyl, Isopentyl, Neopentyl, n-hexyl, Neohexyl, Isohexyl, Cyclohexylmethyl, beta-cyclopentylethyl, Nitro, niederes Alkyl-, Nitro- oder Halogen-substituiertes Phenyl, niederes Alkyl- oder Halogen-substituiertes Benzyl, oder niederes Alkyl-, Nitro- oder Halogen-substituiertes Phenylethyl, Morpholinyl, Thiomorpholinyl, Piperidinyl, Piperazinyl, beta-elektronenabziehend-substituiertes Ethyl oder dergleichen. Es ist weiter bevorzugt, das der elektronenabziehende Substituent von beta- elektronenabziehend-substituiertem Ethyl Cyano, Nitro, Phenylsulphonyl oder Phenylester ist. Am stärksten bevorzugt ist das beta-elektronenabziehend-substituierte Ethyl beta-cyanoethyl. Es ist weiter bevorzugt, das die niederen Alkyl-, Nitro- oder Halogen-Substituenten des niederen Alkyl-, Nitro- oder Halogensubstituierten Phenyl und Benzyl Methyl, Chlor oder Brom darstellen. Es ist außerdem bevorzugt, dass Morpholinyl, Thiomorpholinyl und Piperidinyl Morpholino, Thiomorpholino bzw. Piperidino sind. Am stärksten bevorzugt sind R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4;, getrennt genommen, Methyl, Ethyl oder Isopropyl.
- R&sub1; und R&sub2;, wenn zusammengenommen, sind Cycloalkyl mit von 4 bis 7 Kohlenstoffatomen oder ein Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel und von 3 bis 6 Kohlenstoffatome enthaltender Heterozyklus; stärker bevorzugt sind R&sub1; und R&sub2;, wenn zusammengenommen, Cycloalkyl mit 4 Kohlenstoffatomen.
- R&sub3; und R&sub4;, wenn zusammengenommen, sind Cycloalkyl mit 4 bis 7 Kohlenstoffatomen oder ein Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel und von 3 bis 6 Kohlenstoffatome enthaltender Heterozyklus; stärker bevorzugt sind R&sub3; und R&sub4;, wenn zusammengenommen, Cycloalkyl mit 4 Kohlenstoffatomen.
- R&sub2; und R&sub3;, wenn zusammengenommen, sind eine Bindung, so dass die Verbindung von Formel I ein substituierter 1,2- Dithio-4,5-Diaza-Heterozyklus ist.
- Der Ausdruck "niederes Alkyl", wie er hier verwendet wird, kennzeichnet Alkylgruppen mit gerader Kette und verzweigter Kette, die von 1-6 Kohlenstoffatome enthalten, z. B. Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, tert-butyl, Isobutyl, sec-butyl, Neopentyl, tert-pentyl und dergleichen. "Elektronenabziehend" bedeutet die Tendenz eines Substituenten, Valenzelektronen des Moleküls anzuziehen, von dem er getrennt ist, d.h. er ist elektronennegativ, March, Advanced Organic Chemistry, Seiten 16-18 (John Wiley, New York, 1985).
- Der Ausdruck "Oligomere", wie er hier verwendet wird, umfasst lineare Oligonucleotide natürlicher oder modifizierter Nucleoside oder nicht nucleosidische Entsprechungen gebunden durch Phosphodiesterbindungen oder Entsprechungen derselben, die hinsichtlich ihrer Größe von ein paar Monomereinheiten, z. B. 2-3 bis zu mehreren hundert Monomereinheiten reichen. Genau ausgedrückt, umfasst der Ausdruck nichtnatürliche Oligomere mit phosphorhaltigen Bindungen, deren Phosphor(III)Vorläufer zu Schwefelung fähig sind, z. B. Takeshita et al. J. Biol, Chem. Bd. 282, Seiten 10171-10179 (1987); und Eapienis et al. Seiten 225-230 in Bruzik und Stec, Herausgeber, Biophosphates and Their Analogs - Synthesis, Structure, Metabolism and Activity [Biophosphate und ihre Entsprechungen - Synthese, Struktur, Metabolismus und Aktivität] (Elsevier, Amsterdam, 1986).
- Die Erfindung umfasst ein Verfahren zum Synthetisieren von Phosphorthioaten und Phosphordithioaten. Ein wichtiges Merkmal der Erfindung ist der Schritt zum Reagieren lassen von Phosphor(III) enthaltenden Komponenten von Oligonucleotidzwischenprodukten mit einem Thiuramdisulfid zum Erzeugen von Schwefelung. Da Thiuramdisulfide wirksame Schwefelungsmittel sind, die nicht aus der Lösung ausfällen, ist die Erfindung besonders nützlich bei der automatischen Synthese von Phosphorthioate- und Phosphordithioatentsprechungen von Oligonucleotiden durch alle die kommerziell praktizierbaren Ansätze, einschließlich Wasserstoffphosphonat-, Phosphoramidit- und Phosphorthioamiditchemien.
- Ausführliche. Vorgehensweisen für die Phosphoramidit-, Phosphorthioamidit- und Wasserstoffphosphonatverfahren von Oligonucleotidsynthese sind in den folgenden Quellen beschrieben, die durch Bezugnahme eingeschlossen sind:
- Caruthers et al. US-Patente 4,458,066 und 4,500,707; Koester et al. US-Patent 4,725,677; Matteucci et al. J. Amer. Chem. Soc., Bd. 103, Seiten 3185-3191 (1981); Caruthers et al. Genetic Engineering, Bd. 4, Seiten 1-17 (1981); Jones, Kapitel 2, und Atkinson et al. Kapitel 3, in Galt, Herausgeber: Oligonucleotid Synthesis: A Practical Approach [Oligonucleotidsynthese: Ein praktischer Ansatz] (IRL Press, Washington, D. C., 1984); Froehler et al. Tetrahedron Letters, Bd. 27, Seiten 469-472 (1986); Garegg et al. Tetrahedron Letters, Bd. 27, Seiten 4051-4054 und 4055-4058 (1986); Andrus et al. US-Patent. 4,816,571; Brill et al. J. Am. Chem. Soc., Bd. 111, Seiten 2321- (1989); und Froehler et al. Nucleic Acids Research, Bd. 14, Seiten 5399-5407 (1986).
- Thiuramdisulfide sind gut bekannte Verbindungen, die viele industrielle Verwendungen einschließlich Verwendungen als Fungizide, aktuelle Antiseptika, und Beschleuniger bei der Synthese von Gummi haben. Eigenschaften und Verfahren zum Synthetisieren von Thiuramdisulfiden sind auch gut bekannt und sind in den folgenden Quellen beschrieben, die durch Bezugnahme eingeschlossen sind: US-Patent 1,782,111; US-Patent 1, 796, 977; Nash et al. Seiten 168-191 in Florey, Herausgeber, Analytical Profiles of Drug Substances [Analytisches Profil von Arzneimitteln], Bd. 4, (Academic Press, New York, 1975); Cummings et al. Indust. Eng. Chem. Bd. 20, Seiten 1173-1176 (1928); und Weltgesundheitsorganisation, Seiten 225-236 in IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risk of Chemicals to Man [Monographien bezüglich der Bewertung des Krebserregungsrisikos von Chemikalien für Menschen], Bd. 12 (1976). Wie durch diese Quellen angegeben wird, werden Thiuramdisulfide auf mehrere verschiedene Arten synthetisiert, einschließlich durch die Oxidation des Dimethylaminsalzes von Dimethyldithiocarbaminsäure mit Jod in einer Ethanollösung, z. B. von Braun, I. Chem. Ber., Bd. 35, Seiten 817-829 (1902) durch Führen von Chlorgas durch eine Lösung aus Natriumdimethyldithiocarbamat, z. B. Wenyon, Seiten 621-623 in Chemical Technology: An Encyclopedic Treatment [Eine Enzyklopädische Behandlung], Bd. 4, (Barnes und Noble, New York, 1972), oder durch Oxidation von Natriumdimethyldithiocarbamat mit Wasserstoffperoxid oder Jod, z. B. Spencer, Guide to the Chemical Used in Crop Protection [Anleitung für die in Pflanzenschutz verwendeten Chemikalien], 6. Ausgabe, Universität von West Ontario, Veröffentlichung 1093 (London, Ontario, 1973).
- Wenn als ein Schwefelungsmittel in dem Wasserstoffphosphonatansatz verwendet, wird Thiuramdisulfid der fertigen Oligonucleotidkette in einem geeigneten organischen Lösungsmittel so wie Acetonitril, Tetrahydronfuran, Dichlormethan oder dergleichen in einer Konzentration zwischen etwa 0,01 M bis etwa 2,0 M zugeführt. Vorzugsweise wird die Schwefelung auf einem automatischen DNA-Synthetisiergerät, z. B. dem Model 3809 von Applied Biosystems oder einem ähnlichen Gerät durchgeführt.
- Am stärksten bevorzugt werden Thiuramdisulfide als Schwefelungsmittel in den Phosphoramidit- oder Phosphorthioamiditansätzen verwendet. Ein Thiuramdisulfid wird dem wachsenden Oligomer während eines getrennten Schritts in jedem Zugabezyklus zugeführt. Allgemein beinhalten die Zugabezyklen dieser Syntheseverfahren die folgenden Schritte: (1) Aufheben der Blockierung einer blockierten Funktionalität (gewöhnlich ein 5'-trityliertes Hydroxyl) an der wachsenden Kette richtiger Sequenz, oder an dem an einem Festphasenträger befestigten Ausgangsmonomer zum Bilden eine reaktionsbereiten Funktionalität (z. B. ein 5'-Hydroxyl), (2) ein blockiertes und geschütztes Nucleosid-, Phosphoramidit- oder Phosphorthioamiditmonomer oder eine Entsprechung desselben (gewöhnlich in Anwesenheit eines Aktivierungsmittels, z. B. Tetrazol) mit der reaktionsbereiten Funktionalität der wachsenden Kette richtiger Sequenz zur Reaktion zu bringen, (3) nichtreagierte reaktionsbereite Funktionalitäten abzudecken, und (4) die neu gebildete Phophor(III)-Bindung zum Bilden des natürlich auftretenden pentakoodinierten Zustands zu oxidieren. Die Abfolge der obigen Schritte (3) und (4) kann umgekehrt werden. Der Ausdruck "geschützt" bezüglich eines Monomers, insbesondere Nucleosidphosphoramiditen oder Phosphorthioamiditen bedeutet, dass Komponenten so wie exocyclische Stickstoffe, 2-Hydroxyle, an den Phosphor gebundene Sauerstoffe oder dergleichen befestigte Schutzgruppen aufweisen (gewöhnlich basenlabil), die nach Abschluss der Synthese entfernt werden, z. B. wie diejenigen, die in Koester el al (oben zitiert), oder in Molko et al. Europäische Patentveröffentlichung Nr. 241,363 vom 14. Oktober 1987 beschrieben sind, Der Ausdruck soll auch Monomere einschließen, die keine Schutzgruppen benötigenden Komponenten umfassen können, z. B. einige Nucleosidanaloge, nichtbasische Nucleoside und dergleichen. Bei dem Verfahren der Erfindung werden Thiuramdisulfide als Schwefelungsmittel anstelle des Oxidationsschritts verwendet. Vorzugsweise wird ein Thiuramdisulfid dem wachsenden Oligomer in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, so wie Acetonitril, Tetrahydrofuran, Dichlormethan, oder dergleichen in einer Konzentration, von zwischen etwa 0,01 M bis etwa 2,0 M zugeführt. Vorzugsweise wird der Schwefelungsschritt mit einem Thiuramdisulfid auf einem automatischen DNA-Synthetisiergerät durchgeführt. Bei beiden Ansätzen kann eine breite Vielfalt von Reaktionstemperaturen verwendet werden. Vorzugsweise wird die Schwefelung bei einer Temperatur im Bereich von 0ºC bis 100ºC, und stärker bevorzugt im Bereich von 15ºC bis 60ºC durchgeführt.
- Ein 22-Basen-Phosphorthioatoligonucleotid, 5'- CTTCGATCATCGGTATGCTCCT wurde durch das Phosphoramiditverfahren auf einem automatischen Synthetisiergerät synthetisiert, an dem das Reaktionsgefäß durch Umwickeln desselben mit einem Widerstandsheizelement mit integrierter RTD (Watlo, St. Louis, MO) modifiziert war, um Steuerung der Reaktionstemperatur zu ermöglichen. Das Heizelement war an eine Omron-Temperatursteuerung mit einem externen Relaisband angeschlossen, um Steuerung der Reaktionstemperatur bereitzustellen. Das normale Syntheseprotokoll wurde befolgt, außer dass anstelle des Oxidationsschritts ein Schwefelungsschritt eingesetzt wurde. Mit anderen Worten bestand die Synthese aus wiederholten Zyklen von Detritylisierung, Kopplung, Schwefelung und Abdeckung. Trennung des Endprodukts von der Synthesesäule und Reinigung wurden durch Standardmittel durchgeführt. Der Schwefelungsschritt wurde durchgeführt, indem die wachsende Kette 0,55 M Tetraethylthiuramdisulfid (Aldrich, Mikwaukee, WI) 15 Minuten lang in Acetonitril bei 50ºC ausgesetzt wurde. Das Tetraethylthiuramdisulfid kann bequem von Acetonitril wieder kristallisiert werden; es wurde jedoch kein Unterschied bei den Ergebnissen zwischen der Verwendung von wieder kristallisiertem Material oder Material festgestellt, das durch den Hersteller geliefert wurde.
- Der Ertrag von während der Detritylisierungsschritte freigesetztem Tritylkation betrug im Durchschnitt 99%. Der Tritylertrag ist sowohl ein Maß von Kopplungseffizienz als auch ein Maß des Schwefelungsumfangs, da nichtgeschwefelte (oder oxidierte) dreiwertige Phosphorbindungen in dem Oligonucleotid während Detritylisierung anfällig für Abspaltung sind.
- Das 22-mer wurde von dem Träger abgespalten und sein Schutz wurde mit konzentrierter Ammoniaklösung 3 Stunden lang bei 55ºC aufgehoben. Das ³¹P-NMR-Spektrum (JEOL, 36,5 MHz ppm vs. H&sub3;PO&sub4; Außenreferenz) des Produkts zeigte mehr als 98% Schwefeleinbau (55,1 ppm) bei weniger als 2% Sauerstoffeinbau (-1,1 ppm).
Claims (11)
1. Verfahren zum Schwefeln einer Phosphor(III) enthaltenden
Verbindung, das den Schritt umfasst, die Phophor (III)
enthaltende Verbindung mit einem Thiuramdisulfid zur
Reaktion zu bringen, das aus der durch die folgende Formel
definierten Gruppe ausgewählt ist:
wobei
R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; getrennt genommen:
Wasserstoff;
Alkyl mit von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen;
Halogen-, Nitro- oder Cyano-substituiertes Alkyl mit von 1
bis 6 Kohlenstoffatomen;
oder einen von 5 bis 8 Kohlenstoffatomen enthaltenden
Heterocyclus und ein aus Stickstoff, Sauerstoff und
Schwefel ausgewähltes Heteroatom darstellen;
R&sub1; und R&sub2;, wenn zusammengenommen:
Cycloalkyl mit von 4 bis 7 Kohlenstoffatomen;
einen von 3 bis 6 Kohlenstoffatomen enthaltenden
Heterocyclus und ein aus Stickstoff, Sauerstoff und
Schwefel ausgewähltes Heteroatom darstellen;
R&sub3; und R&sub4;, wenn zusammen genommen:
Cycloalkyl mit von 4 bis 7 Kohlenstoffatomen;
oder einen von 3 bis 6 Kohlenstoffatomen enthaltenden
Heterocyclus und ein aus Stickstoff, Sauerstoff und
Schwefel ausgewähltes Heteroatom darstellen; und
R&sub2; und R&sub3;, wenn zusammen genommen, eine Bindung sind, so
dass das Thiuramdisulfid ein substituierter 1,2-Dithio-4,5-
Diaza-Heterocyclus ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Phosphor(III)
enthaltende Verbindung ein lineares Oligomer mit wenigstens
einer Phosphit- oder Wasserstoffphosphonatdiesterverbindung
darstellt.
3. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, bei dem:
R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4;, getrennt genommen, Wasserstoff, Methyl,
Ethyl, Propyl, Isopropyl, n-Butyl, sec-Butyl, tert-Butyl,
n-Pentyl, Cyclopentylmethyl, Isopentyl, Neopentyl, n-Hexyl,
Neohexyl, Isohexyl, Cyclohexylmethyl, beta-
cyclopentylethyl, niederes Alkyl-, Nitro- oder Halogen-
substituiertes Phenyl, niederes Alkyl-, Nitro- oder
Halogen-substituiertes Benzyl, oder ein niederes Alkyl-,
Nitro- oder Halogen-substituiertes Phenylethyl,
Morpholinyl, Thiomorpholinyl, Piperidinyl, Piperazinyl
darstellen;
R&sub1; und R&sub2;, wenn zusammengenommen, Cycloalkyl mit 4
Kohlenstoffatomen sind; und
R&sub3; und R&sub4;, wenn zusammengenommen, Cycloalkyl mit 4
Kohlenstoffatomen darstellen.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei dem R&sub1;,
R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; getrennt genommen Wasserstoff, Methyl, Ethyl
oder Isopropyl darstellen.
5. Verfahren zum Synthetisieren einer geschwefelten
Oligonucleotidentsprechung einer vorbestimmten Sequenz, das
umfasst, eine Phosphor(III)-Bindung mit einem
Thiuramdisulfid ausgewählt aus der durch die folgende
Formel definierten Gruppe zu schwefeln:
wobei
R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; getrennt genommen:
Wasserstoff;
Alkyl mit von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen;
Halogen-, Nitro- oder Cyano-substituiertes Alkyl mit von 1
bis 6 Kohlenstoffatomen;
oder einen von 5 bis 8 Kohlenstoffatomen enthaltenden
Heterocyclus und ein aus Stickstoff, Sauerstoff und
Schwefel ausgewähltes Heteroatom darstellen;
R&sub1; und R&sub2;, wenn zusammengenommen:
Cycloalkyl mit von 4 bis 7 Kohlenstoffatomen;
einen von 3 bis 6 Kohlenstoffatomen enthaltenden
Heterocyclus und ein aus Stickstoff, Sauerstoff und
Schwefel ausgewähltes Heteroatom darstellen;
R&sub3; und R&sub4;, wenn zusammen genommen:
Cycloalkyl mit von 4 bis 7 Kohlenstoffatomen;
oder einen von 3 bis 6 Kohlenstoffatomen enthaltenden
Heterocyclus und ein aus Stickstoff, Sauerstoff und
Schwefel ausgewähltes Heteroatom darstellen; und
R&sub2; und R&sub3;, wenn zusammen genommen, eine Bindung sind, so
dass das Thiuramdisulfid ein substituierter 1,2-Dithio-4,5-
Diaza-Heterocyclus ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, das die Schritte umfasst:
(a) ein geschütztes Nucleosid oder eine Entsprechung
desselben befestigt an einem Festphasenträger
vorzusehen, wobei das geschützte Nucleosid oder die
Entsprechung desselben eine blockiert
Funktionalität aufweist;
(b) die Blockierung der blockierten Funktionalität zum
Bilden einer reaktionsbereiten Funktionalität
aufzuheben;
(c) mit der reaktionsbereiten Funktionalität ein
blockiertes geschütztes Nucleosidphosphoramidit-
oder Phosporthioamiditmonomer oder ein Entsprechung
desselben zur Reaktion zu bringen, um eine Kette
richtiger Sequenz mit einer Phosphor(III)-Bindung
und einer blockierten Funktionalität zu bilden;
(d) die Phosphor(III)-bindung zu schwefeln, indem die
Kette richtiger Sequenz einem Thiuramdisulfid
ausgesetzt wird, und
(e) die Schritte (b) bis (d) zu wiederholen, bis das
geschwefelte Oligonucleotid der vorbestimmten
Sequenz erhalten wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, das weiter den Schritt
umfasst, nichtreagierte reaktionsbereite Funktionalitäten
nach dem Schwefelungsschritt abzudecken.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, das weiter
den Schritt umfasst, die geschwefelte
Oligonucleotidentsprechung von dem Festphasenträger
abzuspalten.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6, 7 oder 8, bei dem
die blockierte Funktionalität ein trityliertes 5'-Hydroxyl
der Kette richtiger Sequenz oder des geschützten Nucleosids
oder einer Entsprechung desselben darstellt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6, 7, 8 oder 9, bei
dem:
R&sub1;, 1%, R&sub3; und R&sub4;, getrennt genommen, Methyl, Ethyl, Propyl,
Isopropyl, n-butyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl,
Cyclopentylmethyl, Isopentyl, Neopentyl, n-hexyl, Neohexyl,
Isohexyl, Cyclohexylmethyl, beta-cyclopentylethyl,
niederes Alkyl-, Nitro- oder Halogen-substituiertes Phenyl,
niederes Alkyl-, Nitro- oder Halogen-substituiertes Benzyl,
oder ein niederes Alkyl-, Nitro- oder Halogen-
substituiertes Phenylethyl, Morpholinyl, Thiomorpholinyl,
Piperidinyl, Piperazinyl darstellen,
R&sub1; und R&sub2;, wenn zusammengenommen, Cycloalkyl mit 4
Kohlenstoffatomen sind; und
R&sub3; und R&sub4;, wenn zusammengenommen, Cycloalkyl mit 4
Kohlenstoffatomen darstellen.
11. Verfahren von Anspruch 11, bei dem R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4;,
getrennt genommen, Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder
Isopropyl darstellen.
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