JP3087181B2 - 硫化オリゴヌクレオチド類似体の合成方法 - Google Patents
硫化オリゴヌクレオチド類似体の合成方法Info
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- JP3087181B2 JP3087181B2 JP03508564A JP50856491A JP3087181B2 JP 3087181 B2 JP3087181 B2 JP 3087181B2 JP 03508564 A JP03508564 A JP 03508564A JP 50856491 A JP50856491 A JP 50856491A JP 3087181 B2 JP3087181 B2 JP 3087181B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明は一般にオリゴヌクレオチドの合成、そしてさ
らに特に、オリゴヌクレオチドをチウラムジスルフィド
を用いて硫化してそのホスホロチオエートおよび／また
はホスホロジチオエート類似体を生成する方法に関する
ものである。
らに特に、オリゴヌクレオチドをチウラムジスルフィド
を用いて硫化してそのホスホロチオエートおよび／また
はホスホロジチオエート類似体を生成する方法に関する
ものである。
背景 有効な合成方法の開発と共に、アンチセンスオリゴヌ
クレオチドを使用して種々の病気、特にウイルス性感染
を治療することに関心が向けられてきた。例えばマツク
ラら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミィ・オブ・サイエンシーズ（Proc.Natl.Acad.Sc
i.）、第86巻、4244−4448頁'1989）がある。アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドは長さが、通常は約12ないし30
個のヌクレオチドの範囲内で変化する合成ヌクレオチ
ド、またはヌクレオチド類似体であり、そのシーケンス
は新しく転写されたRNAまたは何らかのウイルス機能に
決定的なメッセンジャー（mRNA）の予定されたセグメン
トに相補的である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは
その標的RNAにハイブリッド形成するとき、RNAの翻訳ま
たは処理をブロックするかまたは酵素分解を受けやすく
すると信じられている。
クレオチドを使用して種々の病気、特にウイルス性感染
を治療することに関心が向けられてきた。例えばマツク
ラら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミィ・オブ・サイエンシーズ（Proc.Natl.Acad.Sc
i.）、第86巻、4244−4448頁'1989）がある。アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドは長さが、通常は約12ないし30
個のヌクレオチドの範囲内で変化する合成ヌクレオチ
ド、またはヌクレオチド類似体であり、そのシーケンス
は新しく転写されたRNAまたは何らかのウイルス機能に
決定的なメッセンジャー（mRNA）の予定されたセグメン
トに相補的である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは
その標的RNAにハイブリッド形成するとき、RNAの翻訳ま
たは処理をブロックするかまたは酵素分解を受けやすく
すると信じられている。
このアプローチのもつ問題のひとつは、望ましくない
蛋白質、例えばウイルス性酵素、外殻蛋白質等の合成を
妨げるのに有効な十分な濃度と十分な持続時間で、アン
チセンスヌクレオチドが標的RNAになることが困難であ
ることであった。ヌクレアーゼ消化に対するオリゴヌク
レオチドのホスホジエステル結合の感受性はこの困難性
の重要な原因であると信じられており、天然のホスホジ
エステル結合のヌクレアーゼ耐性類似体によって結合し
た種々のヌクレオシドオリゴマーの開発が試みられた、
例えばミラーら、米国特許第4,511,713号およびツオの
米国特許第4,469,863号（メチル−およびアリールホス
ホネート）；ミロら、ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ（Nucleic Acids Research）、第17巻、8207−8219頁
（1989）（ホスホロセレノエート）；ブリルら、ジャー
ナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ
（J.Am.Chem.Soc.）、第111巻、2321頁（1989）（ホス
ホロジチオエート）；およびマツクラら、プロシーディ
ングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サ
イエンシーズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）、第84巻、7706
−7710頁（1987）、およびジーン（Gene）、第72巻、34
3−347頁（1988）（ホスホロチオエート）。
蛋白質、例えばウイルス性酵素、外殻蛋白質等の合成を
妨げるのに有効な十分な濃度と十分な持続時間で、アン
チセンスヌクレオチドが標的RNAになることが困難であ
ることであった。ヌクレアーゼ消化に対するオリゴヌク
レオチドのホスホジエステル結合の感受性はこの困難性
の重要な原因であると信じられており、天然のホスホジ
エステル結合のヌクレアーゼ耐性類似体によって結合し
た種々のヌクレオシドオリゴマーの開発が試みられた、
例えばミラーら、米国特許第4,511,713号およびツオの
米国特許第4,469,863号（メチル−およびアリールホス
ホネート）；ミロら、ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ（Nucleic Acids Research）、第17巻、8207−8219頁
（1989）（ホスホロセレノエート）；ブリルら、ジャー
ナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ
（J.Am.Chem.Soc.）、第111巻、2321頁（1989）（ホス
ホロジチオエート）；およびマツクラら、プロシーディ
ングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サ
イエンシーズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）、第84巻、7706
−7710頁（1987）、およびジーン（Gene）、第72巻、34
3−347頁（1988）（ホスホロチオエート）。
ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエート類似
体は、ヌクレアーゼ耐性が大きく、天然のオリゴヌクレ
オシドと同じ電荷を有し、有効量で細胞によって吸収さ
れるので特に有望である。
体は、ヌクレアーゼ耐性が大きく、天然のオリゴヌクレ
オシドと同じ電荷を有し、有効量で細胞によって吸収さ
れるので特に有望である。
ホスホロチオエートは都合のよいことには水素ホスホ
ネート化学作用を用いる自動化DNAシンセサイザーによ
って合成され、ホスホネート主鎖は合成後に自動化シン
セサイザーから単一工程で硫化することができる。これ
はホスホネート部分が有機溶媒に溶解した元素硫黄にさ
らされることによって硫化されるので有利である。硫黄
は容易に溶液から析出するので、オフカラム硫化は硫黄
沈澱物によるシンセサイザーのバルブと管の費用のかか
る封鎖を回避する。このホスホロチオエート合成ルート
の欠点は、鎖を伸長する間のカップリング収率が、一般
にホスホルアミダイト化学を用いて得られるものよりも
低いことである、ガッフニイとジョーンズ、テトラヘド
ロン・レターズ（Tett.Lett.）、第29巻、2619−2622頁
（1988）。高いカップリング収率が実際い重要であるこ
とは28量体の合成によって示され、一工程につき99％の
カップリング収率は全収率が76％（.9927）となるが、
一工程につき96％の収率は全収率が33％（.9627）にし
かならない。
ネート化学作用を用いる自動化DNAシンセサイザーによ
って合成され、ホスホネート主鎖は合成後に自動化シン
セサイザーから単一工程で硫化することができる。これ
はホスホネート部分が有機溶媒に溶解した元素硫黄にさ
らされることによって硫化されるので有利である。硫黄
は容易に溶液から析出するので、オフカラム硫化は硫黄
沈澱物によるシンセサイザーのバルブと管の費用のかか
る封鎖を回避する。このホスホロチオエート合成ルート
の欠点は、鎖を伸長する間のカップリング収率が、一般
にホスホルアミダイト化学を用いて得られるものよりも
低いことである、ガッフニイとジョーンズ、テトラヘド
ロン・レターズ（Tett.Lett.）、第29巻、2619−2622頁
（1988）。高いカップリング収率が実際い重要であるこ
とは28量体の合成によって示され、一工程につき99％の
カップリング収率は全収率が76％（.9927）となるが、
一工程につき96％の収率は全収率が33％（.9627）にし
かならない。
代表的には99％よりも大きいカップリング収率をもつ
ホスホルアミダイト化学は、ホスホロチオエートおよび
ホスホロジチオエート合成へのアプローチに大いに望ま
しいことである。しかしながら、硫化されるホスファイ
ト中間体は反応サイクルの脱トリチル化工程の条件下に
不安定である。これは各カップリング工程後にホスファ
イト結合が硫化されることを必要とする。実際の目的の
ために、このような硫化は自動化シンセサイザーで行わ
れなければならないが、上記の硫黄沈澱の問題は市販さ
れている機械のどれかを使用することを妨げる。さら
に、ホスファイトの硫化速度が比較的遅く、副反応を受
けて最終生成物の汚染が増加することになる。
ホスホルアミダイト化学は、ホスホロチオエートおよび
ホスホロジチオエート合成へのアプローチに大いに望ま
しいことである。しかしながら、硫化されるホスファイ
ト中間体は反応サイクルの脱トリチル化工程の条件下に
不安定である。これは各カップリング工程後にホスファ
イト結合が硫化されることを必要とする。実際の目的の
ために、このような硫化は自動化シンセサイザーで行わ
れなければならないが、上記の硫黄沈澱の問題は市販さ
れている機械のどれかを使用することを妨げる。さら
に、ホスファイトの硫化速度が比較的遅く、副反応を受
けて最終生成物の汚染が増加することになる。
製薬化合物としてオリゴヌクレオシドのホスホロチオ
エートおよびホスホロジチオエート類似体を使用したい
という希望を考慮すると、完全に硫化された類似体の最
大可能な収率を達成し、自動化シンセサイザー、特にホ
スホルアミダイトおよび／またはホスホルチオアミダイ
ト化学と共に用いて影響を受ける硫化方法を利用できる
ことが有利である。
エートおよびホスホロジチオエート類似体を使用したい
という希望を考慮すると、完全に硫化された類似体の最
大可能な収率を達成し、自動化シンセサイザー、特にホ
スホルアミダイトおよび／またはホスホルチオアミダイ
ト化学と共に用いて影響を受ける硫化方法を利用できる
ことが有利である。
発明の概要 本発明はオリゴヌクレオシドの硫黄含有類似体、特
に、しかし限定はしないが、ホスホロチオエートおよび
ホスホロジチオエート類似体の合成方法に関する。本発
明の方法は所望の類似体の中間体のリン（III）結合を
チウラムジスルフィドを用いて処理して所望の類似体を
得る工程から成る。特にホスホルアミダイト化学を用い
るときはリン（III）結合がホスファイトであり最終生
成物がホスホロチオートであり、ホスホロチオアミダイ
ト化学を用いるときはリン（III）結合がチオホスファ
イトであり最終生成物がホスホロジチオエートであり、
そして水素ホスホネート化学を用いるときはリン（II
I）結合が水素ホスホネートジエステルであり最終生成
物がホスホロチオエートである。
に、しかし限定はしないが、ホスホロチオエートおよび
ホスホロジチオエート類似体の合成方法に関する。本発
明の方法は所望の類似体の中間体のリン（III）結合を
チウラムジスルフィドを用いて処理して所望の類似体を
得る工程から成る。特にホスホルアミダイト化学を用い
るときはリン（III）結合がホスファイトであり最終生
成物がホスホロチオートであり、ホスホロチオアミダイ
ト化学を用いるときはリン（III）結合がチオホスファ
イトであり最終生成物がホスホロジチオエートであり、
そして水素ホスホネート化学を用いるときはリン（II
I）結合が水素ホスホネートジエステルであり最終生成
物がホスホロチオエートである。
好ましくは、本発明に使用されるチウラムジスルフィ
ドは次式で表される化合物から成る群から選ばれる： 式中、R1、R2、R3およびR4は、別々に、水素、低級アル
キル、電子取出置換低級アルキル、低級アルキル−また
はハロ−置換アリール、または窒素、酸素、または硫黄
および５〜８個の炭素原子を含む複素環である。さらに
特に、R1、R2、R3およびR4は、別々に、メチル、エチ
ル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、sec−ブチ
ル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、シクロペンチルメチ
ル、イソペンチル、オネペンチル、ｎ−ヘキシル、ネオ
ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキシルメチル、ベー
タ−シクロペンチルエチル、ニトロ、低級アルキル−、
ニトロ−、またはハロ−置換フェニル、低級アルキル−
またはハロ−置換ベンジル、または低級アルキル−、ニ
トロ−、またはハロ−置換フェニルエチル、モルホリニ
ル、チオモルホリニル、ピペリジニル、ピペラジニル、
ベータ電子吸引性置換エチル等である。さらに好ましく
は、ベータ電子吸引性置換エチルの電子吸引性置換基は
シアノ、ニトロ、フェニルスルホニル、またはフェニル
エステルである。最も好ましくは、ベータ電子吸引性置
換エチルはベータシアノエチルである。さらに好ましく
は、低級アルキル−、ニトロ−、またはハロ−置換フェ
ニルおよびベンジルの低級アルキル−、ニトロ−、また
はハロ−置換基はメチル、クロロまたはブロモである。
さらに好ましくは、モルホリニル、チオモルホリニル、
およびピペリジニルは、それぞれモルホリノ、チオモル
ホリノ、およびピペリジノである。最も好ましくは、
R1、R2、R3およびR4は、別々に、メチル、エチル、また
はイソプロピルである。
ドは次式で表される化合物から成る群から選ばれる： 式中、R1、R2、R3およびR4は、別々に、水素、低級アル
キル、電子取出置換低級アルキル、低級アルキル−また
はハロ−置換アリール、または窒素、酸素、または硫黄
および５〜８個の炭素原子を含む複素環である。さらに
特に、R1、R2、R3およびR4は、別々に、メチル、エチ
ル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、sec−ブチ
ル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、シクロペンチルメチ
ル、イソペンチル、オネペンチル、ｎ−ヘキシル、ネオ
ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキシルメチル、ベー
タ−シクロペンチルエチル、ニトロ、低級アルキル−、
ニトロ−、またはハロ−置換フェニル、低級アルキル−
またはハロ−置換ベンジル、または低級アルキル−、ニ
トロ−、またはハロ−置換フェニルエチル、モルホリニ
ル、チオモルホリニル、ピペリジニル、ピペラジニル、
ベータ電子吸引性置換エチル等である。さらに好ましく
は、ベータ電子吸引性置換エチルの電子吸引性置換基は
シアノ、ニトロ、フェニルスルホニル、またはフェニル
エステルである。最も好ましくは、ベータ電子吸引性置
換エチルはベータシアノエチルである。さらに好ましく
は、低級アルキル−、ニトロ−、またはハロ−置換フェ
ニルおよびベンジルの低級アルキル−、ニトロ−、また
はハロ−置換基はメチル、クロロまたはブロモである。
さらに好ましくは、モルホリニル、チオモルホリニル、
およびピペリジニルは、それぞれモルホリノ、チオモル
ホリノ、およびピペリジノである。最も好ましくは、
R1、R2、R3およびR4は、別々に、メチル、エチル、また
はイソプロピルである。
一緒にとるときはR1およびR2は４ないし７個の炭素原
子を有するシクロアルキルまたは窒素、酸素、または硫
黄および３ないし６個の炭素原子を含む複素環であり；
さらに好ましくは、一緒にとるときは、R1およびR2は４
個の炭素原子を有するシクロアルキルである。
子を有するシクロアルキルまたは窒素、酸素、または硫
黄および３ないし６個の炭素原子を含む複素環であり；
さらに好ましくは、一緒にとるときは、R1およびR2は４
個の炭素原子を有するシクロアルキルである。
一緒にとるときはR3およびR4は４ないし７個の炭素原
子を有するシクロアルキルまたは窒素、酸素、または硫
黄および３ないし６個の炭素原子を含む複素環であり；
さらに好ましくは、一緒にとるときは、R3およびR4は４
個の炭素原子を有するシクロアルキルである。
子を有するシクロアルキルまたは窒素、酸素、または硫
黄および３ないし６個の炭素原子を含む複素環であり；
さらに好ましくは、一緒にとるときは、R3およびR4は４
個の炭素原子を有するシクロアルキルである。
一緒にとるときはR2およびR3は式Ｉの化合物が置換し
た1,2−ジチオ−4,5−ジアザ複素環であるような結合で
ある。
た1,2−ジチオ−4,5−ジアザ複素環であるような結合で
ある。
ここで用いられる“低級アルキル”の語は１〜６個の
炭素原子、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロ
ピル、tert−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、ネオ
ペンチル、tert−ペンチル等を含む直鎖および分枝鎖の
アルキル基を示す。“電子吸引性”は離れている、すな
わち陰性である分子の価電子を引きつけるような置換基
の傾向を示す、マーチ、アドバンスド・オーガニック・
ケミストリイ（Advanced Organic Chemistry）、16−18
頁（ジョン・ウィリィ、ニューヨーク、1985）。
炭素原子、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロ
ピル、tert−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、ネオ
ペンチル、tert−ペンチル等を含む直鎖および分枝鎖の
アルキル基を示す。“電子吸引性”は離れている、すな
わち陰性である分子の価電子を引きつけるような置換基
の傾向を示す、マーチ、アドバンスド・オーガニック・
ケミストリイ（Advanced Organic Chemistry）、16−18
頁（ジョン・ウィリィ、ニューヨーク、1985）。
ここで用いられる“オリゴヌクレオシド”の語は、天
然または改質したヌクレオシドまたはホスホジエステル
結合によって結合した非ヌクレオチド類似体の線形オリ
ゴマーまたは数モノマー単位、例えば２−３から、数百
モノマー単位までの大きさの範囲にあるそれらの類似体
を含む。特に、この用語はリン（III）の前駆体が硫化
の撮影を受けやすく、リン含有結合を有する非天然オリ
ゴマーを含む、例えばタケシタら、J.Biol.Cehm.,第282
巻、10171−10179頁（1987）；およびイーピエニスら、
225−230頁、ブルチクおよびステク編、バイオホスフェ
ートとそれらの類似体−−合成、構造、代謝、および活
性（エルセビアー、アムステルダム、1986）。
然または改質したヌクレオシドまたはホスホジエステル
結合によって結合した非ヌクレオチド類似体の線形オリ
ゴマーまたは数モノマー単位、例えば２−３から、数百
モノマー単位までの大きさの範囲にあるそれらの類似体
を含む。特に、この用語はリン（III）の前駆体が硫化
の撮影を受けやすく、リン含有結合を有する非天然オリ
ゴマーを含む、例えばタケシタら、J.Biol.Cehm.,第282
巻、10171−10179頁（1987）；およびイーピエニスら、
225−230頁、ブルチクおよびステク編、バイオホスフェ
ートとそれらの類似体−−合成、構造、代謝、および活
性（エルセビアー、アムステルダム、1986）。
発明の詳細な説明 本発明はホスホロチオエートおよびホスホロジチオエ
ートを合成する方法を含む。本発明の重要な特徴はオリ
ゴヌクレオチド中間体のリンIII含有部分をチウラムジ
スルフィドを用いて反応させて硫化する工程である。チ
ウラムジスルフィドは溶液から析出しない有効な硫化剤
であるので、本発明は特に、水素ホスホネート、ホスホ
ルアミダイト、またはホスホロチオアミダイト化学を含
む商業的に実行可能なアプローチのすべてによってオリ
ゴヌクレオチドのホスホロチオエートおよびホスホロジ
チオエート類似体の自動化合成に有用である。
ートを合成する方法を含む。本発明の重要な特徴はオリ
ゴヌクレオチド中間体のリンIII含有部分をチウラムジ
スルフィドを用いて反応させて硫化する工程である。チ
ウラムジスルフィドは溶液から析出しない有効な硫化剤
であるので、本発明は特に、水素ホスホネート、ホスホ
ルアミダイト、またはホスホロチオアミダイト化学を含
む商業的に実行可能なアプローチのすべてによってオリ
ゴヌクレオチドのホスホロチオエートおよびホスホロジ
チオエート類似体の自動化合成に有用である。
オリゴヌクレオチド合成のホスホルアミダイト、ホス
ホルチオアミダイド、および水素ホスホネート方法のた
めの詳細な手順は次の参考文献に記載されており、これ
らは参考として組み込まれる：カルーサースら、米国特
許第4,458,066号および4,500,707号；コエスターら、米
国特許第4,725,677号；マッテウッチら、ジャーナル・
オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ（J.Am
er.Chem.Soc.）第103巻、3185−3191頁（1981）；カル
ーサースら、ジュネティック・エンジニアリング（Gene
tic Engineering）、第４巻、１−17頁（1981）；ジョ
ーンズ、２章、およびアトキンソンら、３章、ゲイト
編、オリゴヌクレオチド合成：実際のアプローチ（IRL
プレス、ワシントン、D.C、1984）；フレーラーら、テ
トラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Letters）、第2
7巻、469−472頁（1986）；ガレッグら、テトラヘドロ
ン・レターズ（Tetrahedron Letters）、第27巻、4051
−4054頁および4055−4058頁（1986）；アンドルスら、
米国特許第4,816,571号；ブリルら、ジャーナル・オブ
・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ（J.Amer.C
hem.Soc.）、第111巻、2321−頁（1989）；およびフレ
ーラーら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nuclei
c Acids Research）、第14巻、5399−5407頁（1986）。
ホルチオアミダイド、および水素ホスホネート方法のた
めの詳細な手順は次の参考文献に記載されており、これ
らは参考として組み込まれる：カルーサースら、米国特
許第4,458,066号および4,500,707号；コエスターら、米
国特許第4,725,677号；マッテウッチら、ジャーナル・
オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ（J.Am
er.Chem.Soc.）第103巻、3185−3191頁（1981）；カル
ーサースら、ジュネティック・エンジニアリング（Gene
tic Engineering）、第４巻、１−17頁（1981）；ジョ
ーンズ、２章、およびアトキンソンら、３章、ゲイト
編、オリゴヌクレオチド合成：実際のアプローチ（IRL
プレス、ワシントン、D.C、1984）；フレーラーら、テ
トラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Letters）、第2
7巻、469−472頁（1986）；ガレッグら、テトラヘドロ
ン・レターズ（Tetrahedron Letters）、第27巻、4051
−4054頁および4055−4058頁（1986）；アンドルスら、
米国特許第4,816,571号；ブリルら、ジャーナル・オブ
・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ（J.Amer.C
hem.Soc.）、第111巻、2321−頁（1989）；およびフレ
ーラーら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nuclei
c Acids Research）、第14巻、5399−5407頁（1986）。
チウラムジスルフィドは、殺カビ剤、局所用殺菌剤、
およびゴム合成における促進剤を含めて、多くの産業用
途を有する良く知られた化合物である。チウラムジスル
フィドを合成する性質および方法もまたよく知られてお
り、ここに参考として組み込まれる次の参考文献に記載
されている：米国特許第1,782,111号；米国特許第1,79
6,977号；ナッシュら、フロリイ編、薬品物質の分析プ
ロフィール（Analytical Profiles of Drug Substance
s）、第４巻、168−191頁（アカデミック・プレス、ニ
ューヨーク、1975）；クミングスら、インダストリアル
・アンド・エンジニアリング・ケミストリイ（Indust.E
ng.Chem.），第20巻、1173−1176頁（1928）；およびワ
ールド・ヘルス・オーガナイゼーション（World Health
Organization）、人への化学薬品の発癌性危険の評価
のIARCモノグラフ（IARC Monographs on the Evaluatio
n for Carcinogenic Risk of Chemicals to Man）、第1
2巻、225−236頁（1976）。これらの参考文献に示され
ているように、チウラムジスルフィドは、ジメチルジチ
オカルバミン酸のジメチルアミン塩をエタノール溶液中
のヨードを用いて酸化することによって、例えばフォン
・ブラウン、I.Chem.Ber.、第35巻、817−829頁（190
2）、ジメチルジチオカルバミン酸ナトリウムの溶液に
塩素を通すことによって、例えばウェンヨン、ケミカル
・テクノロジイ（Chemical Technology）：エンサイク
ロペディク・トリートメント（An Encyclopedic Treatm
ent）、第４巻、621−623頁（バーンス・アンド・ノブ
ル、ニューヨーク、1972）、またはジメチルジチオカル
バミン酸ナトリウムを過酸化水素またはヨードを用いて
酸化することによって、例えばスペンサー、作物保護に
使用される化学へのガイド（Guide to the Chemical Us
ed in Crop Protection）、６版、ウェスタン大学、オ
ンタリオ、パブリケーション1093（ロンドン、オンタリ
オ、1973）、種々の方法で合成される。
およびゴム合成における促進剤を含めて、多くの産業用
途を有する良く知られた化合物である。チウラムジスル
フィドを合成する性質および方法もまたよく知られてお
り、ここに参考として組み込まれる次の参考文献に記載
されている：米国特許第1,782,111号；米国特許第1,79
6,977号；ナッシュら、フロリイ編、薬品物質の分析プ
ロフィール（Analytical Profiles of Drug Substance
s）、第４巻、168−191頁（アカデミック・プレス、ニ
ューヨーク、1975）；クミングスら、インダストリアル
・アンド・エンジニアリング・ケミストリイ（Indust.E
ng.Chem.），第20巻、1173−1176頁（1928）；およびワ
ールド・ヘルス・オーガナイゼーション（World Health
Organization）、人への化学薬品の発癌性危険の評価
のIARCモノグラフ（IARC Monographs on the Evaluatio
n for Carcinogenic Risk of Chemicals to Man）、第1
2巻、225−236頁（1976）。これらの参考文献に示され
ているように、チウラムジスルフィドは、ジメチルジチ
オカルバミン酸のジメチルアミン塩をエタノール溶液中
のヨードを用いて酸化することによって、例えばフォン
・ブラウン、I.Chem.Ber.、第35巻、817−829頁（190
2）、ジメチルジチオカルバミン酸ナトリウムの溶液に
塩素を通すことによって、例えばウェンヨン、ケミカル
・テクノロジイ（Chemical Technology）：エンサイク
ロペディク・トリートメント（An Encyclopedic Treatm
ent）、第４巻、621−623頁（バーンス・アンド・ノブ
ル、ニューヨーク、1972）、またはジメチルジチオカル
バミン酸ナトリウムを過酸化水素またはヨードを用いて
酸化することによって、例えばスペンサー、作物保護に
使用される化学へのガイド（Guide to the Chemical Us
ed in Crop Protection）、６版、ウェスタン大学、オ
ンタリオ、パブリケーション1093（ロンドン、オンタリ
オ、1973）、種々の方法で合成される。
水素ホスホネートのアプローチにおいて硫化剤として
用いるとき、チウラムジスルフィドはアセトニトリル、
テトラヒドロフラン、ジクロロメタン等の適当な有機溶
媒中で、約0.01Mないし約2.0Mの濃度で完全オリゴヌク
レオチド鎖に送られる。好ましくは、硫化は自動化DNA
シンセサイザー、例えばアプライド・バイオシステムズ
・モデル380または類似の機械で行われる。
用いるとき、チウラムジスルフィドはアセトニトリル、
テトラヒドロフラン、ジクロロメタン等の適当な有機溶
媒中で、約0.01Mないし約2.0Mの濃度で完全オリゴヌク
レオチド鎖に送られる。好ましくは、硫化は自動化DNA
シンセサイザー、例えばアプライド・バイオシステムズ
・モデル380または類似の機械で行われる。
最も好ましくは、チウラムジスルフィドはホスホルア
ミダイトまたはホスホルチオアミダイトのアプローチに
おいて硫化剤として用いられる。チウラムジスルフィド
は各添加サイクル内で分離工程として成長するオリゴマ
ーに送られる。一般に、これらの合成方法の追加のサイ
クルは次の工程を含む：（１）成長する適正なシーケン
ス鎖で、または固相支持体に結合した最初の単量体で、
ブロックされた官能基（通常は５′−トリチル化ヒドロ
キシル）を脱ブロックし、反応性官能基（例えば５′−
ヒドロキシル）を生成し、（２）ブロックし保護したヌ
クレオシドホスホルアミダイトまたはホスホルチオアミ
ダイト単量体またはその類似体を（通常は活性化剤、例
えばテトラゾールの存在で）成長する適正なシーケンス
鎖の反応性官能基と反応させ、（３）未反応の反応性官
能基をキャッピングし、そして（４）新しく生成したリ
ン（III）結合を酸化して自然に生ずる五配位結合状態
を形成する。上記工程（３）および（４）のシーケンス
は逆にすることができる。単量体、特にヌクレオシドホ
スホルアミダイトまたはホスホルチオアミダイトに関し
て“保護された”の語は、環外窒素、２′−ヒドロキシ
ル、リンに結合した酸素等の部分が、合成が完了した後
に除かれる結合した（通常は塩素不安定な）保護基を有
することを意味する、例えばコエスターら（上記に引
用）に記載されたようなもの、またはモルコらの1987年
10月14日付の欧州特許公報第241,363号。この語はまた
保護基を要する部分をもたなくてもよい単量体、例えば
ヌクレオシド類似体、塩基性ヌクレオシド等を含むこと
を意味する。本発明の方法では、チウラムジスルフィド
は酸化工程の代わりに硫化剤として用いられる。好まし
くは、チウラムジスルフィドは適当な有機溶媒、例えば
アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン
等の中で、約0.01Mないし約2.0Mの濃度で、成長するオ
リゴマーに送られる。好ましくは、チウラムジスルフィ
ドを用いた硫化工程は自動化DNAシンセサイザーで行わ
れる。両方のアプローチにおいて広範囲の反応温度を使
用できる。好ましくは、硫化は０℃ないし100℃の範囲
で、さらに好ましくは、15℃ないし60℃の範囲の温度で
行われる。
ミダイトまたはホスホルチオアミダイトのアプローチに
おいて硫化剤として用いられる。チウラムジスルフィド
は各添加サイクル内で分離工程として成長するオリゴマ
ーに送られる。一般に、これらの合成方法の追加のサイ
クルは次の工程を含む：（１）成長する適正なシーケン
ス鎖で、または固相支持体に結合した最初の単量体で、
ブロックされた官能基（通常は５′−トリチル化ヒドロ
キシル）を脱ブロックし、反応性官能基（例えば５′−
ヒドロキシル）を生成し、（２）ブロックし保護したヌ
クレオシドホスホルアミダイトまたはホスホルチオアミ
ダイト単量体またはその類似体を（通常は活性化剤、例
えばテトラゾールの存在で）成長する適正なシーケンス
鎖の反応性官能基と反応させ、（３）未反応の反応性官
能基をキャッピングし、そして（４）新しく生成したリ
ン（III）結合を酸化して自然に生ずる五配位結合状態
を形成する。上記工程（３）および（４）のシーケンス
は逆にすることができる。単量体、特にヌクレオシドホ
スホルアミダイトまたはホスホルチオアミダイトに関し
て“保護された”の語は、環外窒素、２′−ヒドロキシ
ル、リンに結合した酸素等の部分が、合成が完了した後
に除かれる結合した（通常は塩素不安定な）保護基を有
することを意味する、例えばコエスターら（上記に引
用）に記載されたようなもの、またはモルコらの1987年
10月14日付の欧州特許公報第241,363号。この語はまた
保護基を要する部分をもたなくてもよい単量体、例えば
ヌクレオシド類似体、塩基性ヌクレオシド等を含むこと
を意味する。本発明の方法では、チウラムジスルフィド
は酸化工程の代わりに硫化剤として用いられる。好まし
くは、チウラムジスルフィドは適当な有機溶媒、例えば
アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン
等の中で、約0.01Mないし約2.0Mの濃度で、成長するオ
リゴマーに送られる。好ましくは、チウラムジスルフィ
ドを用いた硫化工程は自動化DNAシンセサイザーで行わ
れる。両方のアプローチにおいて広範囲の反応温度を使
用できる。好ましくは、硫化は０℃ないし100℃の範囲
で、さらに好ましくは、15℃ないし60℃の範囲の温度で
行われる。
実施例 硫化剤としてテトラエチルチウラムジスルフィドを用い
る22−塩基ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合
成 22−塩基ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、
５′−CTTCGATCATCGGTATGCTCCTを自動化シンセサイザー
でホスホルアミダイト法によって合成し、その反応容器
は、反応温度をコントロールするようにインテグラルRT
Dを用いた抵抗加熱容器（ワルト、セントルイス、MO）
でラップして改良した。加熱部材を外部リレーを用いて
オムロン温度制御器に連結し反応温度を制御するためテ
ープに記録した。酸化工程の代りに硫化工程に置き換え
た以外は、標準の合成プロトコルに従った。換言する
と、この合成は脱トリチル化、カップリング、硫化、お
よびキャッピングの繰り返しサイクルから成る。合成カ
ラムからの最終生成物の分離と精製は標準方法によって
行った。硫化工程は成長する鎖をアセトニトリル中で0.
55Mのテトラエチルチウラムジスルフィド（アルドリッ
チ、ミルウォーキー、WI）に50℃にて15分間さらして行
った。テトラエチルチウラムジスルフィドはアセトニト
リルから都合良く再結晶することができる；しかしなが
ら、再結晶した物質を用いた結果または製造業者によっ
て供給されるような物質を用いた結果では差異は認めら
れなかった。
る22−塩基ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合
成 22−塩基ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、
５′−CTTCGATCATCGGTATGCTCCTを自動化シンセサイザー
でホスホルアミダイト法によって合成し、その反応容器
は、反応温度をコントロールするようにインテグラルRT
Dを用いた抵抗加熱容器（ワルト、セントルイス、MO）
でラップして改良した。加熱部材を外部リレーを用いて
オムロン温度制御器に連結し反応温度を制御するためテ
ープに記録した。酸化工程の代りに硫化工程に置き換え
た以外は、標準の合成プロトコルに従った。換言する
と、この合成は脱トリチル化、カップリング、硫化、お
よびキャッピングの繰り返しサイクルから成る。合成カ
ラムからの最終生成物の分離と精製は標準方法によって
行った。硫化工程は成長する鎖をアセトニトリル中で0.
55Mのテトラエチルチウラムジスルフィド（アルドリッ
チ、ミルウォーキー、WI）に50℃にて15分間さらして行
った。テトラエチルチウラムジスルフィドはアセトニト
リルから都合良く再結晶することができる；しかしなが
ら、再結晶した物質を用いた結果または製造業者によっ
て供給されるような物質を用いた結果では差異は認めら
れなかった。
脱トリチル化工程中に放出されたトリチルカチオンの
収率は平均して99％であった。トリチルの収率は、オリ
ゴヌクレオチド中の硫化されていない（または酸化され
た）三価のリン結合が脱トリチル化の間の開裂に不安定
であるから、カップリング効率の測定と硫化の範囲の測
定の両方である。
収率は平均して99％であった。トリチルの収率は、オリ
ゴヌクレオチド中の硫化されていない（または酸化され
た）三価のリン結合が脱トリチル化の間の開裂に不安定
であるから、カップリング効率の測定と硫化の範囲の測
定の両方である。
22量体は55℃で３時間濃水酸化アンモニウムを用いる
と支持体から開裂し脱保護された。生成物の31P−NMRス
ペクトル（JEOL、36.5MHz、ppm vs H3PO4の外部参照）
は２％以下の酸素混入（−1.1ppm）と共に98％以上の硫
黄混入（55.1ppm）を示した。
と支持体から開裂し脱保護された。生成物の31P−NMRス
ペクトル（JEOL、36.5MHz、ppm vs H3PO4の外部参照）
は２％以下の酸素混入（−1.1ppm）と共に98％以上の硫
黄混入（55.1ppm）を示した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07H 21/00 - 21/04 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (10)
- 【請求項１】ホスファイトまたは水素ホスホネートジエ
ステル結合を有するオリゴヌクレオチドを、次式によっ
て定義される群から選ばれるチウラムジスルフィドと反
応させる工程から成る前記オリゴヌクレオチドを硫化す
る方法。 式中、R1、R2、R3およびR4は、別々に、１個から７個ま
での炭素原子を有するアルキル；ハロ−、ニトロ−、ま
たはシアノ−置換の１個から７個までの炭素原子を有す
るアルキル；低級アルキル−、ニトロ−、またはハロ−
置換アリール；低級アルキル−、ニトロ−、またはハロ
−置換ベンジル；低級アルキル−、ニトロ−、またはハ
ロ置換フェニルエチル；および５個から８個までの炭素
原子および窒素、酸素、または硫黄からなる群から選ば
れるヘテロ原子を含む複素環からなる群から選ばれ； R1およびR2は一緒にとるときは４個から７個までの炭素
原子を有するシクロアルキルおよび３個から６個までの
炭素原子および窒素、酸素、および硫黄からなる群から
選ばれるヘテロ原子を含む複素環からなる群から選ば
れ； R3およびR4は一緒にとるときは４個から７個までの炭素
原子を有するシクロアルキルおよび３個から６個までの
炭素原子および窒素、酸素、および硫黄から成る群から
選択されるヘテロ原子を含む複素環から成る群から選択
され；そして R2およびR3は一緒にとるときは前記チウラムジスルフィ
ドが置換した1,2−ジチオ−4,5−ジアザ複素環であるよ
うな結合である。 - 【請求項２】R1、R2、R3およびR4は、別々に、メチル、
エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、sec−
ブチル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、シクロペンチル
メチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、
ネオヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキシルメチル、
ベータシクロペンチルエチル、低級アルキル−、ニトロ
−、またはハロ−置換フェニル、低級アルキル−、ニト
ロ−、またはハロ−置換ベンジル、または低級アルキル
−、ニトロ−、またはハロ−置換フェニルエチル、モル
ホリニル、チオモルホリニル、ピペリジニル、ピペラジ
ニルであり； R1およびR2は一緒にとるときは４個の炭素原子を有する
シクロアルキルであり；そして R3およびR4は一緒にとるときは４個の炭素原子を有する
シクロアルキルである請求項１記載の方法。 - 【請求項３】R1、R2、R3およびR4は、別々に、水素、メ
チル、エチル、またはイソプロピルである請求項２記載
の方法。 - 【請求項４】（ａ）固相支持体に結合した保護されたヌ
クレオシドまたはその類似体を用意し、その保護された
ヌクレオシドまたはその類似体はブロックされた官能基
を有し； （ｂ）ブロックされた官能価を脱ブロックして反応性官
能基を形成し； （ｃ）反応性官能基とブロックされ保護されたヌクレオ
シドホスホルアミダイトまたはホスホルチオアミダイト
単量体またはその類似体と反応させてリン（III）結合
およびブロックされた官能基を有する適正なシーケンス
鎖を形成し； （ｄ）適正なシーケンス鎖をチウラムジスルフィドにさ
らしてリン（III）結合を硫化し；そして （ｅ）予定されたシーケンスの硫化オリゴヌクレオチド
が得られるまで工程（ｂ）から（ｄ）までを繰り返す 各工程から成る予定されたシーケンスの硫化オリゴヌク
レオチド類似体を合成する方法。 - 【請求項５】さらに前記硫化工程の後に未反応の反応性
官能基をキャップする工程を含む請求項４記載の方法。 - 【請求項６】さらに前記硫化オリゴヌクレオチド類似体
を前記固相支持体から開裂する工程を含む請求項５記載
の方法。 - 【請求項７】前記ブロックされた官能基が前記適正なシ
ーケンス鎖または前記保護されたヌクレオシドまたはそ
の類似体のトリチル化５′−ヒドロキシルである請求項
６記載の方法。 - 【請求項８】前記チウラムジスルフィドが次式によって
定義される群から選ばれる請求項７記載の方法。 式中、R1、R2、R3およびR4は、別々に、１個から７個ま
での炭素原子を有するアルキル；ハロ−、ニトロ−、ま
たはシアノ−置換の１個から７個までの炭素原子を有す
るアルキル；低級アルキル−、ニトロ−、またはハロ−
置換アリール；低級アルキル−、ニトロ−、またはハロ
−置換ベンジル；低級アルキル−、ニトロ−、またはハ
ロ置換フェニルエチル；および５個から８個までの炭素
原子および窒素、酸素、または硫黄からなる群から選ば
れるヘテロ原子を含む複素環からなる群から選ばれ； R1およびR2は一緒にとるときは４個から７個までの炭素
原子を有するシクロアルキルおよび３個から６個までの
炭素原子および窒素、酸素、および硫黄からなる群から
選ばれるヘテロ原子を含む複素環からなる群から選ば
れ； R3およびR4は一緒にとるときは４個から７個までの炭素
原子を有するシクロアルキルおよび３個から６個までの
炭素原子および窒素、酸素、および硫黄から成る群から
選択されるヘテロ原子を含む複素環から成る群から選択
され；そして R2およびR3は一緒にとるときは前記チウラムジスルフィ
ドが置換した1,2−ジチオ−4,5−ジアザ複素環である。 - 【請求項９】R1、R2、R3およびR4は、別々に、メチル、
エチル、プロピル、イソプロビル、ｎ−ブチル、sec−
ブチル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、シクロペンチル
メチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、
ネオヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキシルメチル、
ベータシクロペンチルエチル、低級アルキル−、ニトロ
−、またはハロ−置換フェニル、低級アルキル−、ニト
ロ−、またはハロ置換ベンジル、または低級アルキル
−、ニトロ−、またはハロ−置換フェニルエチル、モル
ホリニル、チオモルホリニル、ピペリジニル、ピペラジ
ニルであり； R1およびR2は一緒にとるときは４個の炭素原子を有する
シクロアルキルであり；そして R3およびR4は一緒にとるときは４個の炭素原子を有する
シクロアルキルである請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】R1、R2、R3およびR4は、別々に、水素、
メチル、エチル、またはイソプロビルである請求項９記
載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/US1991/001008 WO1992014742A1 (en) | 1991-02-14 | 1991-02-14 | Method of synthesizing sulfurized oligonucleotide analogs |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06504982A JPH06504982A (ja) | 1994-06-09 |
| JP3087181B2 true JP3087181B2 (ja) | 2000-09-11 |
Family
ID=22225344
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03508564A Expired - Fee Related JP3087181B2 (ja) | 1991-02-14 | 1991-02-14 | 硫化オリゴヌクレオチド類似体の合成方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0643721B1 (ja) |
| JP (1) | JP3087181B2 (ja) |
| AT (1) | ATE201212T1 (ja) |
| DE (1) | DE69132611T2 (ja) |
| WO (1) | WO1992014742A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0540789U (ja) * | 1991-10-28 | 1993-06-01 | 株式会社ヨシノ | 冷蔵庫用テーブル |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5852168A (en) * | 1996-04-30 | 1998-12-22 | Regents Of The University Of Minesota | Sulfurization of phosphorus-containing compounds |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3730379A1 (de) | 1987-09-10 | 1989-03-30 | Kernforschungsz Karlsruhe | Verfahren zur herstellung eines halbzeugs oder endproduktes aus einphasigem, hochlegiertem martensitischem chromstahl durch warm- und/oder kaltverformung |
| US5194599A (en) * | 1988-09-23 | 1993-03-16 | Gilead Sciences, Inc. | Hydrogen phosphonodithioate compositions |
-
1991
- 1991-02-14 JP JP03508564A patent/JP3087181B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1991-02-14 DE DE69132611T patent/DE69132611T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-02-14 WO PCT/US1991/001008 patent/WO1992014742A1/en active IP Right Grant
- 1991-02-14 EP EP92918677A patent/EP0643721B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-14 AT AT92918677T patent/ATE201212T1/de not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0540789U (ja) * | 1991-10-28 | 1993-06-01 | 株式会社ヨシノ | 冷蔵庫用テーブル |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69132611D1 (de) | 2001-06-21 |
| ATE201212T1 (de) | 2001-06-15 |
| DE69132611T2 (de) | 2002-04-18 |
| EP0643721B1 (en) | 2001-05-16 |
| WO1992014742A1 (en) | 1992-09-03 |
| EP0643721A4 (en) | 1994-06-06 |
| JPH06504982A (ja) | 1994-06-09 |
| EP0643721A1 (en) | 1995-03-22 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |