DE69131518T2

DE69131518T2 - Endothelin-Antagonisten

Info

Publication number: DE69131518T2
Application number: DE69131518T
Authority: DE
Inventors: Gilles Hamon; Dung Le-Nguyen; Eve Mahe
Original assignee: Hoechst Marion Roussel
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1990-11-21
Filing date: 1991-11-20
Publication date: 2000-01-13
Anticipated expiration: 2011-11-21
Also published as: GR3031331T3; DK0487410T3; JP3373217B2; EP0487410A2; DE69131518D1; FR2669339A1; EP0487410A3; US5510331A; ATE183203T1; CA2055902A1; FR2669339B1; EP0487410B1; ES2135389T3; JPH04283600A

Description

Die vorliegende Anmeldung betrifft neue Peptidderivate, das Verfahren zur Herstellung, die Anwendung dieser neuen Derivate als Medikament und die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die sie enthalten.
Man weiß, daß das Endothelin ein starkes gefäßverengendes Mittel ist, das aus dem Aortaendothel vom Schwein extrahiert wird. Dieses Peptid, das vor kurzem isoliert wurde, umfaßt 21 Aminosäuren, weist 2 Disulfidbrücken auf und hat als Formel:
(- A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells, M. Yanagisawa, H. Kurihara, S. Kimura, Y. Tomobe, M. Kobayashi, Y. Mitsui, Y. Yazaki, K. Goto & T. Masaki, Nature, (1988) 332, S. 411-415). Dieses Peptid wird im folgenden mit dem Namen ET1 bezeichnet.
Die verwendete Nomenklatur ist diejenige der Kommision IUPAC-IUB (1984) European J. Biochem 183, 9-37.
Dieses Peptid, das 21 Aminosäurereste, 2 Disulfidbrücken enthält, ist in der Lage, in sehr geringen Dosen die Zellen der glatten Muskeln (Arterien und Venen) von verschiedenen Säugerarten (Mensch, Hund, Katze, Schwein, Meerschweinchen, Ratte, Kaninchen ...) zu kontrahieren. Indem sie versuchte, die Kette zu verkürzen und bestimmte Aminosäurereste des Endothelins durch andere Aminosäuren zu ersetzen, hat die Anmelderin durch Synthese neue Peptidderivate hergestellt, in denen die gefäßverengende Wirkung des Endothelins praktisch verschwunden ist und die zudem die Eigenschaft aufweisen, die natürlichen Rezeptoren des Endothelins zu blockieren und sich an ihnen festzusetzen. So weisen die Produkte eine Aktivität auf, die sich jeder Wirkung einer späteren Freisetzung des Endothelins entgegenstellt.
Diese Produkte weisen außerdem den Vorteil auf, durch Totalsynthese in großen Mengen hergestellt werden zu können.
Der Artikel "Biochemical and Biophysical Research Communications", Vol. 163, Nr. 1, 30. August 1989, Nakajima et al., "Structure - activity relationship of endothelin: Importance of charged groups" beschreibt die Bedeutung der Gruppen COOH und NH&sub2; für die Bildung der Bindung zwischen ET und seinem Rezeptor.
Der Artikel FEBS, Vol. 256, Nr. 1-2, Oktober 1989, Bdolah et al., "SRTX-d, a new native peptide of the endothelin/sarafotoxin family" beschreibt die Bedeutung der Substitution in Position 2 (Ser/Thr).
EP-A-0402313, ein eingeschobenes Dokument, beschreibt das [NLe-7]-ET1; die Unterdrückung der gefäßverengenden Aktivität wird nicht erwähnt.
WO-A-9202237 beschreibt bestimmte Derivate des Endothelins.
Die vorliegende Anmeldung hat so neue Peptidderivate zum Gegenstand, die der allgemeinen Formel (I):
R1 - H X1 D X2 I X3 (I)
entsprechen, in der X, einen Leucin-, Arginin- oder Glutaminrest darstellt, X&sub2; einen Isoleucin- oder Valinrest darstellt, X&sub3; einen Tryptophan-, Amidotrypothan- oder D- Naphthylalaninrest darstellt und R1 einen Rest aus 15 Aminosäuren der Formel (Ia):
darstellt, in dem X&sub4; in Position 7 einen Glycin-, Norleucin-, Valin-, Isoleucin-, Leucin-, Alanin-, Phenylalanin-, beta-Alanin- oder Methioninrest darstellt, X&sub5; in Position 12 einen Valin-, Leucin- oder Glutaminsäurerest darstellt und die punktierte Linie gegebenenfalls eine Disulfidbrücke zwischen 2 Cysteinresten darstellt, wobei es sich versteht, daß X&sub4; keinen Methioninrest darstellen kann, wenn X&sub5; einen Valinrest darstellt,
mit Ausnahme des Derivats [Nle-7]-ET1.
Peptidderivate sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche 2 bis 4.
Die Erfindung hat auch ein Verfahren zur Herstellung der neuen Peptidderivate, wie oben definiert, zum Gegenstand, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Synthese in fester Phase ausführt, indem man auf einem Träger vom Typ vernetztes Polystyrol nacheinander die ordnungsgemäß geschützten Aminosäuren mit Hilfe eines Kupplungsmittels einführt, die Schutzgruppen der Aminosäuren entfernt und die so gebildete Peptidkette aus dem Harz freisetzt, dann gegebenenfalls die Disulfidbrücke oder -brücken cyclisiert, um das so angestrebte Peptidderivat zu erhalten.
Unter bevorzugten Ausführungsbedingungen ist das oben beschriebene Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß
- der Träger vom Typ vernetztes Polystyrol ein Harz vom Typ "Boc-Trp-CM" ist, in dem Boc eine tert-Butyloxycarbonylgruppe ist, Trp eine Tryptophylgruppe ist und cm den Träger aus vernetztem Polystyrol bezeichnet,
- das Kupplungsmittel (Benzotriazol-1-yloxy)-tris-(dimethylamino)-phosphoniumhexafluorophosphat oder Bop ist,
- die Freisetzung der Peptidkette vom Träger sowie die Entfernung der Schutzgruppen der Aminosäuren mittels Fluorwasserstoffsäure ausgeführt wird, wobei man bei niedriger Temperatur, vorzugsweise bei etwa 0ºC arbeitet.
Die neuen Peptidderivate, Gegenstand der vorliegenden Erfindung, weisen sehr interessante pharmakologische Eigenschaften auf; man verzeichnet insbesondere einen bemerkenswerten Effekt der Hemmung des von Endothelin erzeugten Hochdrucks, einen antiischämischen Effekt. Die gefäßverengende Aktivität des Endothelins ist dagegen verschwunden.
Bestimmte dieser Eigenschaften werden weiter unten im experimentellen Teil erläutert.
Diese Eigenschaften rechtfertigen die Verwendung der neuen Peptidderivate, die der obigen Formel (I) entsprechen, als Medikamente.
Die vorliegende Erfindung hat so auch die Anwendung der neuen Peptidderivate, wie durch die obige allgemeinen Formel (I) definiert und Gegenstand der Produktansprüche, zum Gegenstand.
Diese Medikamente finden beispielsweise ihre Anwendung bei der Behandlung aller Gefäßspasmen, bei der Behandlung der Gehirnnachblutungen, bei der Behandlung der Koronarspasmen, der periphären Gefäßspasmen sowie bei der Behandlung der Niereninsuffizienzen.
Die übliche Dosis, die je nach dem verwendeten Produkt, dem behandelten Patienten und der fraglichen Erkrankung variabel ist, kann beispielsweise beim Menschen auf intravenösem Weg 1 bis 300 mg pro Tag betragen.
Die Erfindung hat auch die pharmazeutischen Zusammensetzungen zum Gegenstand, die als Wirkstoff wenigstens ein oben angeführtes Derivat enthalten.
Als Wirkstoff können die Peptidderivate, die der allgemeinen Formel (I) entsprechen, zu pharmazeutischen Zusammensetzungen, die für den digestiven oder parenteralen Weg bestimmt sind, zugesetzt werden.
Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können beispielsweise fest oder flüssig sein und in den üblicherweise in der Humanmedizin verwendeten pharmazeutischen Formen vorliegen, wie beispielsweise den einfachen oder dragierten Tabletten, den Gelatinekapseln, den Kapseln, den Granulaten, den Zäpfchen, den injizierbaren Zubereitungen, den Aerosolen; sie werden gemäß den üblichen Verfahren hergestellt. Der oder die Wirkstoffe können zu üblicherweise in diesen pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendeten Exzipienten zugesetzt werden, wie Talk, Gummi arabicum, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Kakaobutter, wäßrige oder nicht wäßrige Träger, Fette tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, Paraffinderivate, Glykole, verschiedene Benetzungs-, Dispersions- oder Emulgierungsmittel, Konservierungsstoffe.
Es werden jetzt nichtbeschränkend Ausführungsbeispiele der Erfindung angegeben.

BEISPIEL 1: Derivat [Nle-7]-ET1

STUFE A: Zusammenfügen der Peptidkette

Man verwendet einen Träger vom Typ "Boc-Trp-CM-Träger", in dem Boc eine tert-Butyloxycarbonylgruppe ist, Trp eine Tryptophylgruppe darstellt und CM-Träger den Träger aus vernetztem Polystyrol bezeichnet.
Der Träger, der 0,6 mmol Trp/g enthält, wurde durch das Verfahren mit Kaliumfluorid gemäß der von Horiki K., Igano K. & Inouye K. (1978) Chemistry Lett., 165-168 beschriebenen Technik hergestellt.
Alle Aminosäuren sind durch die tert-Butylcarbonylgruppe N-geschützt, die Schutzgruppen der Seitenketten waren die folgenden:
- p-Methylbenzyl für das Cystein,
- Cyclohexylester für die Asparaginsäure und die Glutaminsäure,
- Benzyl für das Serin,
- o-Chlorbenzyloxycarbonyl für das Lysin,
- 2,6-Dichlorbenzyl für das Tyrosin,
- Nim-tert-butyloxycarbonyl,
- Tryptophan und Methionin sind nicht geschützt.
Die Kupplungsreaktionen wurden unter Verwendung von Bop oder (Benzotriazol-1-yloxy-tris-(dimethylamino)-phosphoniumhexafluorophosphat ausgeführt.
Ein Kupplungszyklus kann wie folgt zusammengefaßt werden:

Entfernung der Schutzgruppen:

1 - Behandlung mit einer Trifluoressigsäurelösung (50%) in Dichlormethan, die 3% Ethandithiol enthält, während 1 Minute.
2 - Abgießen, dann Behandlung mit einer 50%igen Trifluoressigsäurelösung in Dichlormethan, die 3% Ethandithiol enthält, während 30 Minuten.
3 - Abgießen, dann Waschen mit Isopropanol, das 5% Ethandithiol enthält.
4 - Waschen mit Dichlormethan, zwei Mal.

Kupplung:

1 - Zugabe von Bop und Boc-Aminosäure.
2 - Zugabe von Diisopropylethylamin (6 Äquivalente), dann von Lösungsmittel (Dichlormethan oder Dimethylformamid) unter Rühren.
3 - Nach negativer Reaktion mit Ninhydrin 2mal Waschen mit Dichlormethan.
Die Kontrolltests, die Ninhydrin verwenden, wurden gemäß dem von Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D. & Cook, P. I. (1970) Anal. Biochem. 24, 595-598 beschriebenen Verfahren ausgeführt.
Vor der Behandlung mit der Fluorwasserstoffsäure wird die letzte Boc-Gruppe durch Trifluoressigsäure entfernt. Aus 2 g Harz "Boc-Trp-CM-Harz" erhielt man so unter manuellem Arbeiten 5,25 g Komplex geschützte Peptidkette, Harz, den man in der folgenden Stufe direkt verwendet.

STUFE B: Freisetzung des Komplexes geschützte Peptidkette - Harz

Man setzt 1,5 g Komplex geschützte Peptidkette - Harz 60 Minuten lang mit 15 ml Fluorwasserstoffsäure bei 0ºC in Gegenwart von Anisol (1 ml) und Dimethylsulfid (0,5 ml) um. Das Harz wird mit Ether gewaschen; das Rohpeptid wird mit einer 20%igen wäßrigen Essigsäurelösung extrahiert. Nach Lyophilisation erhält man 660 mg nicht cyclisiertes Rohprodukt, das man in der folgenden Stufe direkt verwendet.

STUFE C: Cyclisierung und Reinigung

Man löst 500 mg des oben erhaltenen Rohpeptids in 250 ml Wasser, rührt heftig, fügt Diisopropylethylamin bis zum Erhalt von pH 8 hinzu (ein Tropfen des Gemischs wird jede Stunde gewonnen und zu einem Tropfen einer Lösung hinzugefügt, die Dithio-bis-2-(nitrobenzoesäure) in einem molaren K&sub2;HPO&sub4;-Puffer (pH 8) enthält, um die Oxidationsreaktion zu verfolgen). Während der ganzen Reaktion hält man den pH durch Zugabe von Diisopropylethylamin auf 8. Die Reaktion wird durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) verfolgt.
Nach 28 Stunden stellt man bei dem Test mit Dithio-bis-(2-nitrobenzoesäure) die Abwesenheit von gelber Färbung fest.
Das erhaltene Produkt wird durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) über eine Säule Whatman M20 ODS3 gereinigt und mit einem Gemisch Wasser - Acetonitril, das 0,1% Trifluoressigsäure enthält, eluiert.
Man lyophilisiert die erhaltene Fraktion und gewinnt schließlich 30 mg erwartetes Produkt.
Die Zusammensetzung an Aminosäuren erscheint in der folgenden Tabelle I.

BEISPIELE 2 bis 15:

Indem man auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1, aber mit anderen Aminosäuren arbeitete, stellte man die 14 anderen Mikroproteine, die nachstehend erscheinen, her; für die Produkte der Beispiele 2 bis 15 verwendete man jedoch in der Stufe C der Cyclisierung und Reinigung 500 ml Wasser pro 500 mg Peptid.
BEISPIEL 2: Derivat (Gly-7)-ET1:
BEISPIEL 3: Derivat (Nle-7)-D-Naphthylalanin-21-ET1
BEISPIEL 4: Derivat (Nle-7)-Amidotryptophan-21-ET1
BEISPIEL 5: Derivat (beta-Alanin-7)-ET1
BEISPIEL 6: Derivat (Val-7)-ET1
BEISPIEL 12: Derivat der Formel 1a (X&sub4; in 7 = Nle, X&sub1; = Gln, X&sub2; = Ile, X&sub3; = Trp, X&sub5; = Val. Mit zwei Disulfidbrücken zwischen den Cysteinen 1-15 und 3-11)
BEISPIEL 13: Derivat der Formel 1a (X&sub4; in 7 = Met, X&sub5; in 12 = Leu, X&sub1; = Gln, X&sub2; = Ile, X&sub3; = Trp. Mit zwei Disulfidbrücken zwischen den Cysteinen 1-15 und 3-11)
Die Zusammensetzungen an Aminosäuren sind in der nachstehenden Tabelle I angegeben. TABELLE I TABELLE I (Fortsetzung)

BEISPIEL 16:

Man stellte eine injizierbare Lösung her, die der folgenden Formulierung entsprach:
- Produkt des Beispiels 1 .......................................... 1 mg
- Exzipient steriles Wasser ....................................... 2 ml

BEISPIEL 17:

Man stellte Tabletten her, die der folgenden Formulierung entsprachen:
- Produkt des Beispiels 1 .......................................... 2 mg
- Exzipient q.s. für eine fertige Tablette mit ................. 150 mg
(Zusammensetzung des Exzipienten: Lactose, Stärke, Talk, Magnesiumstearat).

STUDIE DER AKTIVITÄT AM ENDOTHELIN-REZEPTOR

Man stellt ein Membranpräparat aus hinterer Großhirnrinde plus Kleinhirn der Ratte her. Das Gewebe wird mit dem POLYTRON in einem Tris-Puffer 50 mM pH = 7,4 gemahlen.
Nach 30 Minuten bei 25ºC (B. M.) wird das Homogenat mit 30000 g 15 Minuten lang zentrifugiert (2 Zentrifugationen mit dazwischenliegender Wiederaufnahme in dem Tris-Puffer pH = 7,4).
Die Rückstände werden wieder in einem Inkubationspuffer (Tris 25 mM, Pepstatin A 5 mikrog/ml, Aprotinin 3 mikrog/ml, PMSF 0,1 mM, ETDA 3 mM, EGTA 1 mM pH 7,4) suspendiert.
Man teilt in gleiche Teile von 2 ml in Hämolyseröhrchen auf und fügt 1251 Endothelin (etwa 50000 dpm/Röhrchen) und das zu untersuchende Produkt hinzu. (Das Produkt wird zuerst dreimal mit 3 · 10&supmin;&sup5; M untersucht). Wenn das untersuchte Produkt die spezifisch mit dem Rezeptor verbundene Radioaktivität um mehr als 50% verschiebt, wird es von neuem gemäß einer Reihe von 7 Konzentrationen untersucht, um die Konzentration zu bestimmen, die die spezifisch mit dem Rezeptor verbundene Radioaktivität um 50% hemmt. Man bestimmt so die 50%- Hemmkonzentration.
Die nicht spezifische Bindung wird durch Zugabe von Endothelin mit 10~ M (dreimal) bestimmt. Man inkubiert 60 Minuten lang bei 25ºC, stellt 5 Minuten lang ins Wasserbad bei 0ºC zurück, filtriert unter vermindertem Druck, spült mit Tris- Puffer pH 7,4 und zählt die Radioaktivität in Gegenwart des Scintillators Triton.
Das Ergebnis wird direkt als 50%-Hemmkonzentration (C150) ausgedrückt, das heißt als Konzentration an untersuchtem Produkt, ausgedrückt in nM, die notwendig ist, um 50% der spezifischen an den untersuchten Rezeptor gebundenen Radioaktivität zu verschieben.

Ergebnis:

Die für die Produkte der Beispiele 1 bis 15 gefundenen C150 sind in der folgenden Tabelle II in Nanomol angegeben.

TABELLE II

PRODUKTE DER BEISPIELE CI50 (nM)
1 10
2 1,4
3 2
4 10
5 2,5
6 5,2
12 2,3
13 3,5

Claims

1. Peptidderivate, die der allgemeinen Formel (I):

R1 - H X1 D X2 I X3 (I)

entsprechen, in der X1 einen Leucin-, Arginin- oder Glutaminrest darstellt, X2 einen Isoleucin- oder Valinrest darstellt, X3 einen Tryptophan-, Amidotryptophan- oder D- Naphthylalaninrest darstellt und R1 einen Rest aus 15 Aminosäuren der Formel (Ia):

darstellt, in dem X4 in Position 7 einen Glycin-, Norleucin-, Valin-, Isoleucin-, Leucin-, Alanin-, Phenylalanin-, beta-Alanin- oder Methioninrest darstellt, X5 in Position 12 einen Valin-, Leucin- oder Glutaminsäurerest darstellt und die punktierte Linie gegebenenfalls eine Disulfidbrücke zwischen 2 Cysteinresten darstellt, wobei es sich versteht, daß X4 keinen Methioninrest darstellen kann, wenn X5 einen Valinrest darstellt;

mit Ausnahme des Derivats [Nle-7]-ET1.

2. Peptidderivate gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem der folgenden Peptidderivate bestehen:

worin Xaa D-Naphthylalanin darstellt

3. Verfahren zur Herstellung der neuen Peptidderivate wie in einem der Ansprüche 1 oder 2 definiert, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Synthese in fester Phase ausführt, indem man auf einem Träger vom Typ vernetztes Polystyrol nacheinander die ordnungsgemäß geschützten Aminosäuren mit Hilfe eines Kupplungsmittels einführt, die Schutzgruppen der Aminosäuren entfernt und die so gebildete Peptidkette aus dem Harz freisetzt, dann gegebenenfalls die Disulfidbrücke oder -brücken cyclisiert, um das so angestrebte Peptidderivat zu erhalten.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß:

- der Träger vom Typ vernetztes Polystyrol ein Harz vom Typ "Boc-Trp-CM" ist, in dem Boc eine tert-Butyloxycarbonylgruppe ist, Trp eine Tryptophylgruppe ist und cm den Träger aus vernetztem Polystyrol bezeichnet,

- das Kupplungsmittel (Benzotriazol-1-yloxy)-tris-(dimethylamino)-phosphoniumhexafluorophosphat oder Bop ist,

- die Freisetzung der Peptidkette vom Träger sowie die Entfernung der Schutzgruppen der Aminosäuren mittels Fluorwasserstoffsäure ausgeführt wird, wobei man bei niedriger Temperatur, vorzugsweise bei etwa 0ºC arbeitet.

5. Medikamente, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus den Peptidderivaten wie durch die allgemeine Formel (I) des Anspruchs 1 definiert bestehen.

6. Medikamente, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus den Peptidderivaten wie in Anspruch 2 definiert bestehen.

7. Pharmazeutische Zusammensetzungen, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff wenigstens eines der Medikamente wie in einem der Ansprüche 5 und 6 definiert enthalten.

8. Verwendung des [Nle-7]-ET1-Derivats für die Herstellung eines Medikaments zur Hemmung des Hochdrucks, erzeugt von Endothelin ohne gefäßverengende Wirkung des Endothelins.