TECHNISCHES GEBIET
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Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung,
die gamma-Interferon und Interleukin-1 enthält.
STAND DER TECHNIK
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Gamma-Interferon wurde zuerst 1965 entdeckt, als E. F.
Wheelock [Science, 149, 310-311, 1965] fand, daß die
Kultivierung von Humanleukocyten in Gegenwart von PHA
(Phytohämagglutin) als Induktor einen Virus-Inhibitionsfaktor
produziert, welcher bei pH 2 inaktiviert wird. R. Falcoff
[J. Gen. Virol., 16, 251-253, 1972] berichtete dann, daß der
Virus-Inhibitionsfaktor, der bei pH 2 inaktiviert wird, eine
Substanz mit einem Molekulargewicht von 50.000 ist.
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Anschließend berichteten Y. K. Yip et al. [Science, 215, 411-
413, 1982], daß bei Durchführung einer SDS-Polyacrylamid-
Gelelektrophorese (SDS-PAGE) gamma-Interferon in eine
Fraktion mit einem Molekulargewicht von 25.000 und eine
Fraktion mit einem Molekulargewicht von 20.000 aufgetrennt
wird. Mittlerweile ist bekannt, daß gamma-Interferon nicht
nur eine antivirale Aktivität, sondern auch
Antitumoraktivität hat, wobei J. L. Crane et al. [J. L. Crane,
L. A. Glasgow, E. R. Kern und J. S. Younger, J. Natl. Cancer
Inst., 61, 871-874, 1978] und J. E. Blalock et al. [J. E.
Blalock [J. E. Blalock, J. A. Georgiades, M. P. Langford und
H. M. Johnson, Cell Immunol., 49, 390-394, 1980] berichten,
daß die Antitumoraktivität von gamma-Interferon 20- bis
100fach so hoch als die der alpha- und beta-Interferone ist.
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Andererseits ist Interleukin-1 ein Polypeptid mit einem
Molekulargewicht von ca. 12.000 bis 18.000, das von Monocyten
oder Makrophagen, die durch ein Lipopolysaccharid oder
ähnliches aktiviert wurden [S. B. Mizel, Immunol. Rev., 63,
51-71, 1982], produziert wird. Interleukin-1 wird nicht nur
mit der Aktivierung von T-Zellen in Verbindung gebracht,
sondern ist auch bei einer Vielzahl von Funktionen im
lebenden Organismus beteiligt [C. A. Dinarello, New Eng. J.
Med., 311, 1413-1418, 1984]. Da es z. B. einmal
B-Zellenaktivierender Faktor genannt wurde, wirkt Interleukin-1 auf
B-Zellen, und in Zusammenhang mit dem B-Zellen-
Differentierungsfaktor (BCDF) induziert es die Produktion von
Immunglobulin [R. J. Falkof, A. Muraguchi, J. X, Hong, et al.,
J. Immunol., 131, 801-805, 1983]. Zusätzlich wirkt
Interleukin-1 auf verschiedene andere Zellen unter Auslösung
einer Vielzahl biologischer Aktivitäten, und spielt eine
Hauptrolle in beinahe allen biologischen Reaktionen, wie
Immunität, Entzündung, Hämatopoese, endocrinen und
cerebroneuralen Funktionen usw. Ferner zeigt Interleukin-1
eine direkte Wachstumshemmung oder cytocidale Effekte auf
verschiedene Arten von Tumorzellen [K. Onozaki, K.
Matsushima, B. B. Aggarwal, et al., J. Immunol., 135, 3962,
1985] und, man erwartet, daß es als solches von Wert als
Antitumormittel ist.
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Chen, L. et al. (J. Immuno., Band 139, 1987, 4096-4101)
offenbart die Verwendung von rekombinanten IL-1ß und
rekombinanten γ-IFN unter Auslösung eines Antitumoreffekts,
der von einer cytotoxischen Macrophagen-Aktivität herrührt.
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Zusäztlich offenbart Tsai und Gaffney (J. N. C. I., Band 79,
1987, 77-81), daß ein additiver Effekt bei der Modulation der
Tumorzell-Proliferation durch rekombinantes IL-1ß und
rekombinantes γ-IFN erreicht werden kann.
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Daher haben sowohl gamma-Interferon als auch Interleukin-1
wachstumsinhibitorische Wirkungen auf Tumorzellen, jedoch
wurde in klinischen Studien unter Verwendung von
Antitumorzusammensetzungen, die eines davon als Wirkstoff
enthalten, von einer Vielzahl von Nebenwirkungen, wie
Pyrexie, gastrointestinale Symptome, allgemeine Übelkeit,
Bluthochdruck, Muskelschmerz usw. berichtet [H. A. Harvey, A.
Lipton, D. S. Wlite, et al., Proc. ASCO, 24, 46, 1983]. Daher
mußte trotz der Wirksamkeit für die Krebstherapie, die man
sowohl von gamma-Interferon als auch von Interleukin-1
erwartete, die Idee ihrer Verabreichung in hohen Dosen oder
ähnlichem aufgrund dieser Nebenwirkungen aufgegeben werden.
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Die Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer
Antitumorzusammensetzung, die eine verstärkte
Antitumoraktivität von gamma-Interferon oder Interleukin-1
zur Verfügung stellt, wodurch die Verringerung der Dosierung
und daher das Risiko von Nebenwirkungen unterstützt wird.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
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Im Verlauf unserer Forschungen als Versuch zur Lösung der
obigen Aufgabe führten wir ein Substanz-Screening durch,
welches die Antitumoraktivität von gamma-Interferon oder
Interleukin-1 verstärken könnte, ohne daß ausreichende
Ergebnisse erhalten werden konnten. Überraschenderweise wurde
jedoch, wenn gamma-Interferon und Interleukin-1 in
Kombination verwendet wurden, gefunden, daß sich ihre
Antitumoraktivitäten synergistisch so weit potenzierten, daß
ein ausreichender Tumorwachstums-Inhibitionseffekt auch bei
geringen Dösen erhalten werden konnte, bei denen keine von
den Arzneistoffen bei alleiniger Verwendung eine
Antitumorwirkung zeigen, was es erlaubt, die Dosierung der
Stoffe merklich zu reduzieren. Die Erfindung beruht auf der
obigen Erkenntnis.
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Die vorliegende Erfindung stellt eine
Antitumorzusammensetzung zur Verfügung, die gamma-Interferon
und Interleukin-1 (Interleukin-1 gemäß der Erfindung
bedeutet: [Ser&sup7;¹]IL-1ß) als Wirkstoffe enthält.
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In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung
- von natürlichem gamma-Interferon und [Ser&sup7;¹]IL-1ß zur
Herstellung eines therapeutischen Mittels zur Tumorzell-
Wachstumsinhibierung und die Verwendung von gamma-Interferon,
produziert von BALL-1-Zellen, und [Ser&sup7;¹]IL-1ß zur
Herstellung eines therapeutischen Mittels zur Tumorzell-
Wachstumsinhibierung zur Verfügung.
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Das in der erfindungsgemäßen Antitumorzusammensetzung zu
verwendende gamma-Interferon kann jedes der natürlichen
gamma-Interferone, rekombinanten gamma-Interferone und
Derivate davon sein, solange sie gamma-Interferon-Aktivität
haben, insbesondere humane gamma-Interferon-Aktivität. Das
allgemeine Verfahren zur Herstellung von gamma-Interferon, im
Falle eines natürlichen Interferons, umfaßt die Isolierung
von humanen Leukocyten oder Kultur humaner Zellen unter
Erhalt einer T-Zell-Linie, und Induzieren der Produktion
unter Verwendung eines Induktors, wie PHA, ConA oder
ähnlichem [Ilana Nathan et al., Nature, 292, 842, 1981;
Masako Matsuyama et al., The Journal of Immunology, 129, 450,
1982]. Da jedoch großmaßstäbliche Produktion von Zellen nach
diesem Verfahren viele Schwierigkeiten hinsichtlich
Technologie und Kosten mit sich bringt, wurde ein auf Hamster
basierendes Verfahren entwickelt (japanische geprüfte
Patentveröffentlichung Nr. 63-1296 und Nr. 56-54158). Das
Verfahren kann wie folgt zusammengefaßt werden. Unter
Verwendung eines jungen Hamsters, der zuvor mit einem
Immunsuppressor dosiert worden war, wird eine T-Zell-Linie
subkutan im Nacken transplantiert, und man läßt sie wachsen,
wodurch sich eine Tumormasse im Hamsterrücken bildet. Wenn
die Masse eine gewisse Größe erreicht hat, wird sie heraus
operiert, unter Bereitstellung einer Zellsuspension
zerschnitten und zerkleinert. Zu den so hergestellten T-
Zellen wird PHA unter Induktion der Produktion von gamma-
Interferon zugegeben. Das auf diese Weise produzierte
Interferon ist gekennzeichnet, daß es eine Zuckerkette hat,
die identisch zu der von natürlichem gamma-Interferon ist.
Ein alternatives Verfahren zur stabilen und billigen
Herstellung von gamma-Interferon umfaßt das Wachsenlassen
eines Mikroorganismus, in den ein humanes gamma-Interferongen
durch ein genetisches Rekombinationsverfahren eingefügt wurde
[Patrick, W. Gray et al., Nature, 295, 501, 1982]. Jedoch hat
das nach diesem Verfahren produzierte gamma-Interferon keine
Zuckerkette [Ernst Rinderknecht et al., The Journal of
Biological Chemistry, 259, 6790, 1984].
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Unter den obigen gamma-Inteferonen ist dasjenige, das nach
einem Verfahren unter Verwendung eines Hamsters produziert
wird, bevorzugt.
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Andererseits umfaßt Interleukin-1 zur erfindungsgemäßen
Verwendung [Ser&sup7;¹] IL-1ß.
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Ein natürliches Interleukin-1 kann hergestellt werden durch
das Verfahren, wie in der japanischen ungeprüften
Patentveröffentlichung Nr. 62-174022 beschrieben. Eine
Vielzahl rekombinanter Interleukine-1 oder Derivate davon
kann hergestellt werden nach den Verfahren, die in der
japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung Nr. 63-152398
und der europäischen Patentveröffentlichung Nr. EP 0237967A2
beschrieben sind. Unter solchen Interleukinen-1, soll IL-1ß
als solches oder Interleukin-1ß-Derivate Erwähnung finden,
wie sie in der oben erwähnten japanischen ungeprüften
Patentveröffentlichung Nr. 63-152398 und der europäischen
Patentveröffentlichung EP 0237967A2 offenbart werden, wie
solche, die im folgenden aufgeführt sind.
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o IL-1ß als solches
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o [Gly&sup4;]IL-1ß (IL-1ß, worin Arg an Position-4 durch Gly
ersetzt ist)
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o [Ser&sup7;¹]IL-1ß (IL-1ß, worin Cys an Position-71 durch
Ser ersetzt ist)
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o [Ala&sup8;]IL-1ß (IL-1ß, worin Cys an Position-8 durch
Ala ersetzt ist)
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o [Ala&sup7;¹]IL-1ß (IL-1ß, worin Cys an Position-71 durch
Ala ersetzt ist)
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o [Leu&sup9;³]IL-1ß (IL-1ß, worin Lys an Position-93 durch
Leu ersetzt ist)
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o [Arg¹²&sup0;]IL-1ß (IL-1ß, worin Trp an Position-120 durch
Arg ersetzt ist)
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o [Tyr³&sup0;]IL-1ß (IL-1ß, worin His an Position-30 durch
Tyr ersetzt ist)
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o [Ala&sup8;Ala&sup7;¹]IL-1ß (IL-1ß, worin Cys an Position-8
durch Ala an Position-8 und Cys an
Position-71 durch Ala an Position-71
ersetzt ist)
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o IL-1ß-(4-153)polypeptid
(IL-1ß, dem die Aminosäuresequenz
von Ala an der 1-Position bis Val an
der 3-Position fehlt)
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o IL-1ß-(1-150)polypeptid
(IL-1ß, worin die Aminosäuren an der
151-Position und folgende fehlen)
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Es ist selbstverständlich, daß die obigen IL-1ß und IL-1ß-
Derivate unter Bezugnahme auf die für Interleukin-1ß in der
japanischen ungeprüften Patentoffenlegung Nr. 63-152398 und
der europäischen Patentoffenlegung EP 0237967A2, auf die
vorstehend Bezug genommen wurde, erwähnte Aminosäuresequenz
beschrieben werden.
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Die erfindungsgemäße Antitumorzusammensetzung kann in Form
einer Einzelpräparation verabreicht werden, die sowohl gamma-
Interferon als auch Interleukin-1 enthält, oder in Form von
zwei Präparationen für getrennte Dosen verabreicht werden
kann, von denen eine gamma-Interferon und die andere
Interleukin-1 enthält. In beiden Fällen potenzieren gamma-
Interferon und Interleukin-1 die jeweils andere
Tumorzellwachstums-Inhibitionsaktivität und daher kann das
Verhältnis der beiden Bestandteile aus einem äußerst breiten
Bereich ausgewählt werden.
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Für die klinische Anwendung der erfindungsgemäßen
Antitumorzusammensetzung kann die wirksame täglich Dosis für
humane Erwachsene aus einem breiten Bereich ausgewählt
werden. Daher kann für humane Erwachsene gamma-Interferon im
allgemeinen im Bereich von ca. 4,2 ug/Körper bis 4,2
mg/Körper pro Tag verwendet werden, und Interleukin-1 kann
vorzugsweise im Bereich von ca. 0,08 bis 8 ug/Körper pro Tag
verwendet werden. In der erfindungsgmäßen Zusammensetzung
verstärken gamma-Interferon und Interleukin-1 jeweils andere
Tumorzellenwachstums-Inhibitionsaktivität, wie oben erwähnt.
Wenn daher gamma-Interferon in einer klinischen Dosis, die im
allgemeinen in diesem Gebiet empfohlen wird, verwendet wird,
kann die übliche klinische Dosis von Interleukin-1 auf ca.
Einhundertstel (1/100) bis etwa Neunzehntel (9/10) verringert
werden. Wenn in ähnlicher Weise Interleukin-1 in der
klinischen Dosis, die im allgemeinen in diesem Gebiet
empfohlen wird, eingesetzt wird, kann die übliche klinische
Dosis von gamma-Interferon auf ca. Einhundertstel (1/100) bis
ca. Neunzehntel (9/10) verringert werden. Im Hinblick auf die
Vermeidung des zuvor erwähnten Risikos von Nebenwirkungen ist
es bevorzugt, entweder gamma-Interferon oder Interleukin-1 in
einer niedrigen Dosierung innerhalb des oben erwähnten
wirksamen Bereiches zu verwenden.
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Die Antitumorzusammensetzung der Erfindung kann in einer
Vielzahl von Dosierungsformen, die üblicherweise in diesem
Gebiet eingesetzt werden, je nach beabsichtigten Anwendungen
verwendet werden. Insbesondere kann bei der Herstellung der
erfindungsgemäßen Antitumorzusammensetzung die Stabilität der
Wirkstoffe, insbesondere von Interleukin-1, besser durch mit
Aufnahme von mindestens einer Substanz, ausgewählt aus
Humanserumalbumin, Zuckern und oberflächenaktiven Mitteln,
sichergestellt werden.
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Die oben erwähnten Zucker sind nicht besonders eingeschränkt
und umfassen z. B. Monosaccharide wie Glucose, Mannose,
Galactose, Fructose usw., Zuckeralkohole wie Mannitol,
Inositol, Xylytol usw., Disaccharide wie Saccharose, Maltose,
Lactose usw., und Polysaccharide wie Dextran,
Hydroxypropylstärke usw.. Diese Zucker können allein oder in
Kombination verwendet werden. Besonders bevorzugte Zucker
sind Saccharose, Maltose, Mannitol, Inositol und Dextran.
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Die oben erwähnten oberflächenaktiven Mittel sind auch nicht
besonders eingeschränkt. Daher können sowohl ionische als
auch nichtionische oberflächenaktive Mittel nützlich sein.
Bevorzugte oberflächenaktive Mittel sind
Polyoxyethylenglykolsorbitanalkylester,
Polyoxyethylenalkylether, Sorbitanmonoacylester,
Fettsäureglyceride usw..
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Die Menge der zu verwendenden Zucker ist nicht als ca. 0,1
mg, bevorzugt ca. 1 bis 100 mg, pro ug Interleukin-1 oder
einem Derivat davon (im folgenden zusammenfassend bezeichnet
als "IL-1 aktive Substanz"). Die Menge des zu verwendenden
oberflächenaktiven Mittels ist nicht weniger als ca.
0,0001 mg, vorzugsweise ca. 0,001 bis 0,1 mg, pro ug IL-1
aktiver Substanz. Die Menge an zu verwendendem
Humanserumalbumin pro ug IL-1 aktiver Substanz ist nicht
weniger als ca. 0,001 mg und vorzugsweise ca. 0,01 bis 10 mg.
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Die erfindungsgemäße Antitumorzusammensetzung kann in einer
Vielzahl von Dosierungsformen bereitgestellt werden, die im
allgemeinen für die Verabreichung dieser Art Arzneimittel
verwendet werden, und kann daher andere pharmakologisch
wirksame Substanzen und/oder konventionelle pharmazeutische
Exzipienten und andere Additive enthalten.
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Insbesondere im Hinblick auf andere Bestandteile, die in der
erfindungsgemäßen Antitumorzusammensetzung enthalten sein
können, kann ein konventionelles schwefelhaltiges
Reduktionsmittel zur weiteren Verbesserung der Stabilität der
IL-1-aktiven Substanz Erwähnung finden. Das bevorzugte
schwefelhaltige Reduktionsmittel umfaßt z. B. solche relativ
milden Reduktionsmittel, wie Cystein, N-Acetylhomocystein,
Thioctinsäure und Thioglykolsäure und Salze davon,
Thioethanolamin, Thioglycerin, Natriumthiosulfat,
Thiomilchsäure, Dithiothreitol, Glutathion usw. Diese
Reduktionsmittel können allein oder in Kombination verwendet
werden. Die Menge eines solchen zu verwendenden
Reduktionsmittels oder -mittel (die Gesamtmenge, falls mehr
als eines verwendet wird) ist nicht kritisch, jedoch
geeigneterweise nicht weniger als ca. 0,001 mg, vorzugsweise
ca. 0,01 bis 10 mg, pro ug IL-1ß-aktiver Substanz.
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Die erfindungsgemäße Antitumorzusammensetzung wird
vorzugsweise isoton mit einem geeigneten Puffer unter Erhalt
einer stabilen isotonen Präparation gemacht. Typische zu
verwendende Puffer umfassen verschiedene Pufferlösungen mit
einem pH von ca. 4 bis 8, vorzugsweise ca. 5 bis 6, wie z. B.
Zitronensäure-Natriumcitrat, Zitronensäure-Natriumphosphat,
Essigsäure-Natriumacetat, Zitronensäure-Borax usw.
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Die erfindungsgemäße Antitumorzusammensetzung kann z. B. als
pharmazeutische Präparation bereitgestellt werden, die
pharmakologisch wirksame Mengen an gamma-Interferon, IL-1-
aktiver Substanz und anderen der oben erwähnten Bestandteile
in Kombination mit pharmazeutisch verträglichen Vehikeln
umfaßt. Daher kann, je nach Art der zu verwendenden
Präparationen, als solches Vehikel jedes solcher Exzipienten
und Verdünner eingesetzt werden, z. B. Füllstoffe,
Volumenbildner, Bindemittel, Feuchtigkeitsmittel,
Sprengmittel usw., die üblicherweise bei der pharmazeutischen
Herstellung verwendet werden. Es gibt keine bestimmte
Einschränkung hinsichtlich der Dosisform, die verwendet
werden kann, solange sie effektiv die Wirkstoffe enthalten
kann. Daher können feste Formen, wie z. B. Tabletten, Pulver,
Granulate, Pillen, wie auch injizierbare flüssige Formen, wie
z. B. Lösungen, Suspensionen, Emulsionen usw. eingesetzt
werden. Die erfindungsgemäße Antitumorzusammensetzung kann
auch in einer Trockenform vorliegen, die in die Flüssigform
durch Zugabe eines geeigneten Vehikels vor der Verwendung
rekonstituiert werden kann. Jede der oben erwähnten
Präparationen kann nach konventionellen Verfahren hergestellt
werden.
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Diese pharmazeutischen Herstellungen können auf einem
geeigneten Verabreichungsweg verabreicht werden. Zum Beispiel
können injizierbare Präparationen intravenös, intramuskulär,
subkutan, intradermal oder intraperitoneal verabreicht
werden, und feste Präparationen können oral oder rektal
verabreicht werden. Die Verabreichung kann in einer
Einzeldosis pro Tag oder in 3 bis 4 unterteilten Dosen pro
Tag erfolgen.
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Erfindungsgemäß verstärkt bei gemeinsamer Verwendung von
gamma-Interferon und Interleukin-1 jedes von diesen
gegenseitig die Antitumoraktivität, so daß ein ausreichender
Tumorwachstum-inhibierender Effekt erreicht werden kann, auch
bei niedrigen Dosispiegeln, wo keiner der Arzneistoffe bei
alleiniger Verwendung wirksam ist. Als Folge kann eine
drastische Dosisreduzierung für beide Arzneistoffe und daher
die Verminderung der Risikospiegel für verschiedene
Nebenwirkungen realisiert werden.
BEISPIELE
Referenzbeispiel 1 Herstellung von gamma-Interferon
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Ein gamma-Interferon wurde hergestellt wie folgt gemäß
dem in der japanischen geprüften Patentveröffentlichung Nr.
63-1296 (12. Januar 1988) beschriebenen Verfahren.
(1) Wachstum der Zellen
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BALL-1-Zellen wurden in RPMI-1640-Medium (pH 7,2), das 20%
FCS (fötales Kalbsserum) enthielt, bei 37ºc wachsengelassen.
Die erhaltenen Zellen wurden mit serumfreiem RPMI-1640-Medium
(pH 7,2) gewaschen und im gleichen Medium unter Erhalt einer
Konzentration von ca. 1 · 10&sup6;-Zellen/ml suspendiert. Die oben
präparierten BALL-1-Zellen wurden subkutan in neugeborene
Hamster transplantiert, die durch Verabreichung von
Kaninchen-Antiserum immunsuppremiert wurden, und die Tiere
wurden auf die übliche Weise für ca. drei Wochen aufgezogen.
Dann wurde die Masse der unterhalb der Haut gewachsenen BALL-
1-Zellen ausgeschnitten, fein zerteilt und in
Trypsinhaltiger physiologischer Kochsalzlösung unter Erhalt einer
Zellsuspension suspendiert.
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Die Zellen wurden mit serumfreiem RPMI-1640-Medium gewaschen
und im gleichen Medium, das 10% FCS enthielt, unter Erhalt
einer Konzentration von 1 · 10&sup6; Zellen/ml suspendiert. Die
erhaltene Suspension wurde bei der folgenden Produktion von
gamma-Interferon verwendet.
(2) Produktion von gamma-Interferon
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Zu der Suspension von BALL-1-Zellen in RPMI-1640-Medium, das
10% FCS enthielt, hergestellt nach dem Verfahren (1) oben,
wurden 100 ng Lipopolysaccharid (LPS) als Induktionsmittel
zugegeben, und die Mischung wurde bei 37ºC 3 Tage unter
Induktion der Produktion von gamma-Interferon inkubiert.
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Nach der Inkubation wurde das System unter Entfernung der
Zellen zentrifugiert und der Überstand wurde durch
Ultrafiltration konzentriert. Das Konzentrat wurde dann unter
Verwendung einer monoclonalen Antikörpersäule gereinigt. Die
spezifische Aktivität dieses Produkts war 7,35 · 10&sup6; IE/mg
Protein.
Referenzbeispiel 2 Herstellung von Interleukin-1
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Gemäß dem Verfahren, beschrieben in Beispiel 1 der
japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung Nr. 63-152398,
wurde ein Interleukin-1ß, worin Cys an Position-71 durch Ser
ausgetauscht war, hergestellt, isoliert und gereinigt.
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Anschließend wurde unter Verwendung des in Referenzbeispiel 1
erhaltenen gamma-Interferons und des in obigem
Referenzbeispiel 2 erhaltenen Interleukin-1 in verschiedenen
Verhältnissen der Wachstumsinhibitionseffekt auf Tumorzellen
bewertet. Die Ergebnisse sind im folgenden in den Beispielen
1 (1) bis (3) dargestellt.
Beispiel 1 Kombinierter inhibitorischer Effekt auf das
Wachstum von humanen Tumorzell-Linien
(1) Wirkung auf COLO 205-Zellen
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COLO 205-Zellen (humane Colon-Carcinomzelle, Cancer
Res., 38, 1345, 1978) wurden nach dem Verfahren von Moore et
al. (J. Am. Med. Assoc., 199, 519, 1967) kultiviert, und die
erhaltenen Zellen wurden zweimal mit PBS(-)-Lösung (Nissui
Pharmaceutical, Phosphat-gepufferte physiologische
Kochsalzlösung) gewaschen. Nach Ablösung der Zellen mit
0,05% Trypsin (Flow Laboratories), wurden die Zellen in
RPMI-1640-Medium (GIPCO Laboratories) unter Bereitstellung
einer Zellsuspension pipettiert. Die Zellen wurden mittels
Zentrifugation bei 1.200 U/min (25ºC) für 5 Minuten (unter
Verwendung von Hitachi 05PR-22) gewaschen und im gleichen
Medium resuspendiert, worauf die Zugabe von FRS (fötales
Rinderserum, GIBCO Laboratories) auf eine Endkonzentration
von 10% erfolgte. Nach Färbung der Zellen mit Tryptan-Blau-
Lösung (Wako Pure Chemicals) wurde die Anzahl an
lebensfähigen Zellen unter einem Lichtmikroskop gezählt.
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Unter Verwendung einer 12-Well-Mikrotiterplatte (Costar)
wurden Zellsuspensionen in Verdünnungsreihen von 6,3 · 10²
Zellen/ml bis 2 · 10&sup4; Zellen/ml, in 0,5 ml Portionen in die
Vertiefungen gegeben und unter 5% CO&sub2; bei 37ºC für 9 Tage
(Napco CO&sub2;-Inkubator) für eine vorläufige Analyse der
Zellkonzentration und Inkubationszeit inkubiert. Anschließend
wurden 0, 0,014, 0,14, 1,4, 14 oder 140 ng/ml (d. h. 0, 0,1,
1, 10, 100 oder 1000 E/ml) des gamma-Interferons aus
Referenzbeispiel 1 (im folgenden als IFN-γ bezeichnet) und 0,
0,01, 0,1, 1, 10 oder 100 ng/ml des Interleukin-1ß aus
Referenzbeispiel 2 (im folgenden als IL-1ß bezeichnet) in
Portionen von 0,025 ml in verschiedenen Variationen
zugegeben. Zusätzlich wurden 0,5 ml Portionen einer
Zellsuspension, die zuvor auf eine Konzentration von 1,3 ·
103 Zellen/ml eingestellt worden war, gemäß den Ergebnissen
der vorläufigen Analyse zugegeben. Die Mikrotiterplatte wurde
dann unter 5% CO&sub2; bei 37ºC für 8 Tage inkubiert. Nach
Inkubation wurden dann die Zellen in den Wells mit PBS(+)-
Lösung (Nissui Pharmaceutical) gewaschen und mit Methanol
(Wako Pure Chemicals) fixiert. Nach Trocknen an der Luft
wurden die Zellen mit Giemsa-Farbstoff (MERCK) gefärbt, und
die Anzahl an Kolonien wurde unter Verwendung eines
automatischen Partikelzählers (CP-2000, Shiraimatsu Kikai)
oder eines stereoskopischen Mikroskops (SZH, Olympus)
gezählt. Die Rate des Zellwachstums in jeder Gruppe wurde im
Hinblick auf gamma-Interferon und Interleukin-1ß unter
Verwendung der mit dem Medium allein behandelten Gruppe als
Kontrolle berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1
dargelegt.
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Wie in Tabelle 1 gezeigt, war der wachstumsinhibitorische
Effekt von Interleukin-1ß, allein verwendet, auf COLO 205-
Zellen über einen Konzentrationsbereich von 1 ng/ml bis 100
ng/ml schwach, wobei nur eine ca. 35%ige Inhibierung bei 100
ng/ml erhalten wurde. Mit gamma-Interferon allein wurde eine
65%ige Wachstumsinhibierung in der 0,14 ng/ml Gruppe
gefunden.
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Andererseits war in der mit IFN-γ allein behandelten Gruppe
der ED50-Wert (bestimmt nach dem Probit-Verfahren; selbiges
trifft auf das Folgende zu) von IFN-γ 0,18 ng/ml. Im
Gegensatz war hierzu in der Gruppe, worin 0,01 ng/ml IL-1ß
gemeinsam verwendet wurde, der ED50-Wert von IFN-γ 0,042
ng/ml, und der in der Gruppe, worin 0,1 ng/ml IL-1ß gemeinsam
verwendet wurde, 0,007 ng/ml. Daher wurde eine Verstärkung
der wachstumsinhibierenden Aktivität um das 4,3- bis 25,7-
fache beobachtet.
TABELLE 1 Wachstum von COLO 205-Zellen (%)
(2) (1) Wirkung auf KPK-1-Zellen
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KPK-1-Zellen (humane renale Carcinom-Zell-Linie) wurden
nach dem Verfahren von Moore et al. (J. Am. Med. Assoc., 199,
519, 1967) kultiviert, und die erhaltenen Zellen wurden
zweimal mit PBS(-)-Lösung (Nissui Pharmaceutical) gewaschen.
Nach Ablösung der Zellen mit 0,05% Trypsin (Flow Laborities)
wurden die Zellen in RPMI-1640-Medium (GIBCO Laboratories)
unter Bereitstellung einer Zellsuspension pipettiert. Die
Zellen wurden mittels Zentrifugation bei 1200 U/min (25ºC)
für 5 Minuten (unter Verwendung von Hitachi 05PR-22)
gewaschen und im gleichen Medium resuspendiert, worauf die
Zugabe von FRS (fötales Rinderserum, GIBCO Laboratories) auf
eine Endkonzentration von 10% folgte. Nach Färben der Zellen
mit Trypan-Blau-Lösung (Wako Pure Chemicals), wurde die
Anzahl der lebensfähigen Zellen unter einem Lichtmikroskop
gezählt.
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Unter Verwendung einer 12-Well-Mikrotiterplatte (Costar)
wurden Zellsuspensionen in Verdünnungsreihen von 6,3 · 10²
Zellen/ml bis 2 · 10&sup4; Zellen/ml in 0,5 ml Portionen in die
Wells eingebracht und unter 5% CO&sub2; bei 37ºC 6 Tage (Napco
CO&sub2;-Inkubator) für eine vorläufige Analyse der
Zellkonzentration und Inkubationszeit inkubiert. Anschließend
wurden 0, 0,014, 0,14, 1,4, 14 oder 140 ng/ml (d. h. 0, 0,1,
1, 10, 100 und 1000 E/ml) des gamma-Interferons aus
Referenzbeispiel 1 und 0, 0,01, 0,1, 1, 10 oder 100 ng/ml
des Interleukin-1ß aus Referenzbeispiel 2 in Portionen zu
0,025 ml in verschiedenen Kombinationen zugegeben. Zusätzlich
wurden 0,5 ml Portionen einer Zellsuspension, die zuvor auf
eine Konzentration von 2 · 10&sup4; Zellen/ml, gemäß den
Ergebnissen des Vortests eingestellt worden war, zugegeben.
Die Mikrotiterplatte wurde dann unter 5% CO&sub2; bei 37ºC für 7
Tage inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen in den
Wells mit PBS(+)-Lösung (Nissui Pharmaceutical) gewaschen und
mit Methanol (Wako Pure Chemicals) fixiert. Nach dem Trocknen
an der Luft wurden die Zellen mit Giemsa-Farbstoff (MERCK)
gefärbt, und die Anzahl an Kolonien wurde unter Verwendung
eines automatischen Partikelzählers (CP-2000, Shiraimatsu
Kikai) oder eines stereoskopischen Mikroskops (SZH, Olympus)
gezählt. Die Zellwachstumsrate in jeder Gruppe wurde unter
Verwendung einer Gruppe als Kontrolle, die mit Medium allein
behandelt worden war, im Hinblick auf gamma-Interferon und
Interleukin-1ß getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2
dargestellt.
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Es geht aus Tabelle 2 hervor, daß gegen KPK-1-Zellen
Interleukin-1ß nur einen sehr schwachen
Wachstumsinhibitionseffekt zeigte, was zu einer ca. 15%igen
Inhibierung, sogar bei einer Konzentration von 100 ng/ml,
führte. Gamma-Interferon verursachte eine 57%ige Inhibition
bei 14 ng/ml. Auf der anderen Seite war in der Gruppe, die
mit IFN-γ allein behandelt war, der ED50 -Wert von IFN-γ
11,301 ng/ml. Im Gegensatz hierzu war in der Gruppe, worin
0,1 ng/ml IL-1ß gemeinsam verwendet wurde, der ED50-Wert von
IFN-γ 1,862 ng/ml, und der in der Gruppe, worin 1 ng/ml IL-1ß
gemeinsam verwendet wurde, war er 0,255 ng/ml.
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Daher wurde eine Verstärkung der wachstumsinhibierenden
Aktivität um 6,1- bis 44,3-fach erhalten.
TABELLE 2 Wachstum von KPK-1-Zellen (%)
(3) (1) Wirkung auf verschiedene Zellen
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SW48-Zellen (humane Colon-Carcinom-Zelle, Cancer Res.,
36, 4562, 1976) wurden nach dem Verfahren von Leibovitz et
al. (Am. J. Hyg., 78, 173, 1963) kultiviert, und die
gewachsenen Zellen wurden zweimal mit PBS(-)-Lösung (Nissui
Pharmaceutical) gewaschen. Nach Ablösung der Zellen mit
0,05% Trypsin (Flow Laboratories), wurden die Zellen in
L-15-Medium (Flow Laboratories) unter Bereitstellung einer
Zellsuspension pipettiert. Die Zellen wurden mittels
Zentrifugation bei 1200 U/min (25ºC) 5 Minuten (unter
Verwendung von Hitachi 05PR-22) gewaschen, und im gleichen
Medium resuspendiert, worauf Zugabe von FRS (fötales
Rinderserum, GIBCO Laboratories) auf eine Endkonzentration
von 10% folgte. Nach Färben der Zellen mit Trypan-Blau-
Lösung (Wako Pure Chemicals) wurde die Anzahl an
lebensfähigen Zellen unter dem Lichtmikroskop gezählt.
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Unter Verwendung einer 12-Well-Mikrotiterplatte (Costar)
wurden Zellsuspensionen in Verdünnungsreihen von 6,3 · 10²
Zellen/ml bis 2 · 10&sup4; Zellen/ml in 0,5 ml Portionen in die
Wells eingebracht, und unter 5%iger CO&sub2; bei 37ºC für 8 Tage
(Napco CO&sub2;-Inkubator) für eine vorläufige Analyse der
Zellkonzentration und Inkubationszeit inkubiert. Anschließend
wurde 0 oder 1,4 ng/ml gamma-Interferon aus Referenzbeispiel
1 und 0 oder 1,0 ng/ml des Interleukin-1ß aus
Referenzbeispiel 2 in Portionen von 0,025 ml zugegeben,
entweder einzeln oder in verschiedenen Kombinationen. Ferner
wurden 0,5 ml Portionen einer Zellsuspension, die zuvor auf
eine Konzentration von 2,5 · 10³ Zellen/ml nach den
Ergebnissen der Voruntersuchungen eingestellt worden war,
zugegeben. Dann wurde die Mikrotiterplatte unter 5%iger CO&sub2;
bei 37ºC für 12 Tage inkubiert. Nach der Inkubation wurden
die Zellen in den Wells mit PBS(+)-Lösung (Nissui
Pharmaceutical) gewaschen und mit Methanol (Wako Pure
Chemicals) fixiert.
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Calu-3-Zellen (humane Lungen-Carcinom-Zelle, J. Nat. Cancer
Inst., 58, 209, 1977) wurden nach dem Verfahren von Eagle, H.
et al. (Science, 130, 432, 1959) kultiviert, und die
erhaltenen Zellen wurden zweimal mit PBS(-)-Lösung (Nissui
Pharmaceutical) gewaschen und in einem Medium aus 0,05%
Trypsin (Flow Laboratories) plus 10% NEAA (nichtessentielle
Aminosäure, Flow Laboratories), das 1 ml Natrium Pyruvat
enthielt, suspendiert. Die Zellen wurden mittels
Zentrifugation bei 1200 U/min (25ºC) 5 Minuten gewaschen
(unter Verwendung eines Hitachi 05PR-22) und im gleichen
Medium resuspendiert, worauf Zugabe von FCS (GIBCO
Laboratories) auf eine Endkonzentration von 10% folgte. Nach
Färben der Zellen mit Trypan-Blau-Lösung (Wako Pure
Chemicals) wurde die Anzahl an lebensfähigen Zellen unter
einem Lichtmikroskop gezählt.
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Unter Verwendung einer 12-Well-Mikrotiterplatte (Costar)
wurden Zellsuspensionen in Verdünnungsreihen von 6,3 · 10²
Zellen/ml bis 2 · 10&sup4; Zellen/ml in 0,5 ml Portionen in die
Wells eingebracht und unter 5% CO&sub2; bei 37ºC 9 Tage (Napco
CO&sub2;-Inkubator) für eine vorläufige Analyse der
Zellkonzentration und Inkubationszeit inkubiert. Anschließend
wurden 0 oder 1,4 ng/ml des gamma-Interferons aus
Referenzbeispiel 1 und 0 oder 1,0 ng/ml des Interleukin-1ß
aus Referenzbeispiel 2 in Portionen zu 0,025 ml entweder
einzeln oder in verschiedenen Kombinationen zugegeben. Ferner
wurden 0,5 ml Portionen einer Zellsuspension, die zuvor auf
eine Konzentration von 2,0 · 10&sup4; Zellen/ml nach den in den
vorläufigen Analysen erhaltenen Ergebnissen eingestellt war,
zugegeben. Dann wurde die Mikrotiterplatte unter 5% CO&sub2; bei
37ºC 12 Tage inkubiert. Die Zellen in den Wells wurden dann
mit PBS(+)-Lösung (Nissui Pharmaceutical) gewaschen und mit
Methanol (Wako Pure Chemicals) fixiert.
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Nach Herstellung der Präparation von COLO 205- und KPK-1-
Zellen, wie in Beispiel 1 (1) und (2) beschrieben, wurden 0
oder 1,4 ng/ml des gamma-Interferons aus Referenzbeispiel 1
und 0 oder 1,0 ng/ml des Interleukin-1ß aus Referenzbeispiel
2 einzeln oder in Kombination zur Bestimmung der
wachstumsinhibierenden Wirkungen dieser Antitumormittel auf
jede der Zellen verwendet.
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Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargelegt. Wie bei den SW
48-Zellen inhibierten weder Interleukin-1ß noch gamma-
Inteferon bei alleiniger Verwendung das Wachstum, wogegen
ihre Verwendung in Kombination Wachstumsinhibierung von mehr
als 90% erreichte. Gegen Calu-3-Zellen waren Interleukin-1ß
noch gamma-Interferon bei alleiniger Verwendung zur
Inhibierung des kompletten Wachstums in der Lage. Wenn jedoch
beide Mittel in Kombination eingesetzt wurden, wurde das
Wachstum von Calu-3-Zellen im wesentlichen vollständig
inhibiert. Auch gegen KPK-1- und COLO 205-Zellen führte die
gemeinsame Verwendung von Interleukin-1ß und gamma-Interferon
zu einer signifikanten Verstärkung des wachstumsinhibierenden
Effekts auf diese Zellen, gerade sowie in in den Tabellen 1
und 2 dargelegten Fällen.
TABELLE 3 Wachstum von humanen Tumorzellen (%)
Präparationsbeispiel 1
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Interleukin-1ß 0,8 ug/ml
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gamma-Interferon 42 ug/ml
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Tween 80 0,01 mg/ml
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Dextran 40 15 mg/ml
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Cystein 0,1 mg/ml
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HSA (Humanserumalbumin) 1,0 mg/ml
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Die obigen Bestandteile wurden zu 0,01 M Zitronensäure-
Natriumcitratpuffer (pH 6; 0) in den entsprechenden
Endkonzentrationen, wie oben angegeben, zugegeben, und die
Mischung wurde filtriert (unter Verwendung eines 0,22 um
Membranfilters). Das Filtrat wurde aseptisch in 1 ml
Portionen in Ampullen verteilt und unter Bereitstellung einer
injizierbaren Präparation des erfindungsgemäßen
Antitumormittels lyophilisiert.
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Zur Verabreichung wird diese Präparation in 1 ml
physiologischer Kochsalzlösung gelöst.
Präparationsbeispiel 2
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Interleukin-1ß 0,08 ug/ml
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gamma-Interferon 420 ug/ml
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Tween 80 0,01 mg/ml
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Dextran 40 15 mg/ml
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Cystein 0,1 mg/ml
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HSA (Humanserumalbumin) 1,0 mg/ml
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Die obigen Bestandteile wurden zu 0,01 M Zitronensäure-
Natriumcitratpuffer (pH 6,0) zu den entsprechenden
Endkonzentrationen, wie oben angegeben, zugegeben, und die
Mischung wurde filtriert (unter Verwendung eines 0,22 um
Membranfilters). Das Filtrat wurde aseptisch in 1 ml
Portionen in Ampullen verteilt und unter Bereitstellung einer
injizierbaren Präparation des erfindungsgemäßen
Antitumormittels lyophilisiert.
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Zur Verabreichung wurde diese Präparation in 1 ml
physiologischer Kochsalzlösung gelöst.