JPH0418033A - 抗腫瘍剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、医薬上有用なガンマー・インターフェロンと
インターロイキン−１との配合剤に関する。

従来の技術 ガンマー・インターフェロンは、１９６５年にイー・エ
フ・ライ−ロック（Ｅ、Ｆ　Ｗｈｅｅｌｏｃｋ；５ｃｉ
ｅｎｃｅ、　１４９．３１０−３１１．１９６５）が、
ヒト白血球に誘導剤としてＰＨＡ　（フィトヘムアグル
チニン）を加えて培養すると、ｐＨ２で失活するウィル
ス抑制因子が産生されることを見出し、得られたもので
ある。次いでアール・フフルコフ（Ｒ，Ｆａｌｃｏｆｌ
；Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、、　１６．２５１〜２５３
．１９７２）はｐＨ２で失活するウィルス抑制因子の分
子量が５００００であると報告したが、その後ワイ・ケ
ー・イソプら（Ｙ、に、Ｙｉｐ、ｅｔ　ａｌ；５ｃｉｅ
ｎｃｅ、　　２１５，４１１〜４１３．１９８２）は５
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）で処理するとガンマー・インターフェロンが分
子ｆｉ２５０００の両分と２００００の両分に分離し得
ることを報告した。

一方、ガンマー・インターフェロンが抗ウィルス活性の
みならず抗腫瘍活性を有することは公知であり、ジエイ
・エル・フレインら（Ｊ、　Ｌ、　Ｃｒａｎｅ、　Ｌ。

Ａ、　Ｇｌａｓｇｏｗ、　Ｅ、　Ｒ，Ｘｅｒｎ、　ａｎ
ｄ　Ｊ、　Ｓ、　Ｙｏｕｎｇｅｒ；Ｊ、　Ｎａｔｌ。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５１．、６１．８７１〜８７４．１
９７８）　、ジエイ・イー・ブラロツタら（Ｊ、　Ｅ、
　Ｂｌａ　１ｏｃｋ、　Ｊ、　Ａ、　Ｇｅｏｒｇｉａｄ
ｅｓ。

Ｍ、　Ｐ、　Ｌａｎｇｆｏｒｄ、　ａｎｄ　Ｈ，Ｍ、　
Ｊｏｈｎｓｏｎ；Ｃｅ１ｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　。

４９、３９０〜３９４．１９８０）は、アルファ・イン
ターフェロンやベーター・インターフェロンに比較して
、ガンマー・インターフェロンの抗Ｊｆｌ活性は２０〜
１００倍強いことを報告している。

他方、インターロイキン〜１は特異抗原、リポポリサッ
カライドなどにより活性化された単球あるいはマクロフ
ァージなどから産生される分子量１２０００〜１８００
０程度のポリペプチドである［ニス・ビー・ミゼル（Ｓ
、　Ｂ、　Ｍｉｘｅｌ）、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｒｅｖ、、　　６３．　５１〜７１．１９８２　］　。

］インターロイキンーはＴ細胞の活性化に関与するのみ
ならず、生体内ではきわめて多彩な作用を発揮している
［シー・ニー・ディナレロ（Ｃ，Ａ、Ｄｉｎａｒｅｌｌ
ｏ）；Ｎｅｗ　Ｅｎｇ。

Ｊ、　Ｍｅｄ、、　３１１．１４１３〜１４１８．１９
８４　］　、たとえば、］インターロイキンーはＢ細胞
活性化因子（Ｂ　ｃｅｌｌａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｆａ
ｃｔｏｒ　）とも呼ばれていたように、Ｂ細胞に作用し
、Ｂ細胞分化因子（Ｂ　ｃｅｌｌｄｉｌｌｅｒｅｎｌｉ
ａ目ｏｎ　ｌａｃｔａｍ；　ＢＣＤＦ）と共同して免疫
グロブリン産生を誘導する［アール・ジェイ・ファルコ
フら（Ｒ，Ｊ、　Ｆａｌｋｏｌ、　Ａ、　Ｍｕｒａｇｕ
ｃｈｉ、　Ｊ、　Ｘ、　Ｈｏｎｇ。

ｅｆ　　ａＬ　　）　　；Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、
１３１．　　８０１〜８０５．　１９８３コ　。　その
他インターロイキン−１は種々の細胞に働き、さまざま
な生物活性を示し免疫、炎症、造血、内分泌、脳神経な
ど、はとんどすべての生体反応に重要な役割をはたして
いる。さらにインターロイキン−１は種々の腫瘍細胞に
対し直接的な増殖抑制や、細胞致死活性を示す［ケー・
オノザキら（Ｋ、　０ｎｏｘａｋｉ、　Ｋ、　Ｍａｊｓ
ｕｓｈｉｍａ、　Ｂ、　Ｂ、　Ａｇｇａｒｗａｌ、　ｅ
ｔ　　ａｌ、　）；］、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、　１３
５．３９６２．１９８５　］　ことから抗腫瘍剤として
の用途も考えられている。

発明が解決しようとする課題 ガンマー・インターフェロン及びインターロイキン−１
は両者ともに腫瘍細胞に対して増殖抑制効果を有してい
るが、これらのいずれか一方を有効成分とする抗腫瘍剤
を投与した臨床治験では、発熱、胃腸症状、全身倦怠、
低血圧、筋肉痛などの副作用を示すことが報告されてい
る。［エイチ・ニーゆハーヴエイら（Ｌ　Ａ、Ｈａｒｖ
ｅｙ、　Ａ、　Ｌｉｐｌｏｎ、　Ｄ。

Ｓ、ＷＩｉｔｅ、ｅｌ　ａｔ、）　；Ｐｒｏｃ、ＡＳＣ
ｏ、　２４，４６．１９８３］　。このため、ガンマー
・インターフェロン及びインターロイキン−１はいずれ
も、癌の治療に対して期待されていたもののこのような
副作用を有するために大量投与などの試みを断念せざる
を得ないのが現状である。

従って、本発明は、ガンマー・インターフェロン又はイ
ンターロイキン−１の抗腫瘍活性を増強し、これにより
これらの投与量を低減させ、上記副作用の軽減が可能な
抗腫瘍剤を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段 本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねる
過程で、ガンマー・インターフェロン又はインターロイ
キン−１のいずれかの抗腫瘍活性を増強する物質の検索
を行ったが、良好な結果を得るには至らなかった。とこ
ろが、ガンマー・インターフェロンおよびインターロイ
キン−１を併用すると、予想外にも、それぞれの抗腫瘍
活性が相互に著しく増強され、それぞれ単独では抗腫瘍
効果が発揮されないような低い投与量においても腫瘍細
胞の増殖抑制効果が得られ、その結果、両者の投与量を
大幅に低減することが可能となることを見出した。本発
明は、この新知見に基づき完成されたものである。

すなわち、本発明は、ガンマー・インターフェロンとイ
ンターロイキン−１とを有効成分とする抗腫瘍剤を提供
するものである。

本発明の抗腫瘍剤に用いるガンマー・インターフェロン
は、インターフェロン活性を有するものであれば、天然
、あるいは組換えのガンマー・インターフェロンでもよ
い。一般にガンマー−インターフェロンの製造は、天然
型の場合はヒト白血球を採取するか、または、通常のヒ
ト細胞を培養する方法によって株化Ｔ細胞を培養し、こ
れに誘導剤としてＰＨＡ、ＣｏｎＡ等を用いて誘導産生
ずる方法が取られている〔イラナ　ナサン（Ｉｌａｎａ
　Ｎａ１ｈａｎ）　　ら、Ｎａｔｕｒｅ、　　２９２．
　８４２゜１９８１　７サコマツヤ？　（Ｍａｓａｋｏ
　Ｍａｉｓｕｙａｍａ）ら、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　
ｏｆ　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　、　　１２９．　４５０
．１９８２）。この方法によって細胞を大量に得るには
技術面、コスト面で困難な点が多（、より安価に細胞を
増殖させる方法として、）１ムスター法が開発されてい
る（特公昭６３−１２９６号及び特公昭５６−５４１５
８号）。該方法の概要は次の通りである。即ち、あらか
じめ免疫抑制剤を投与した幼若ハムスターの背部皮下に
株化Ｔ細胞を移植することによってＴ細胞を増殖せしめ
ると、ハムスターの背部に腫瘍塊が出来る。これが一定
の大きさになったところでこの腫瘍塊を取り出し、裁断
後、破砕して細胞を分散させて細胞浮遊液を調製する。

このようにして調製されたＴ細胞にＰＨＡを用いてガン
マー・インターフェロンを誘導産生ずる方法である。本
方法によって得られるガンマー・インターフェロンは天
然型と同一の糖鎖を有していることを特徴とする。この
他、ガンマー・インターフェロンを安定に、安価に製造
するために遺伝子組換え技術によって作成されたヒトの
ガンマー・インターフェロン遺伝子を組み込まれた微生
物を培養することにより、産生ずることもできる〔パト
リック　ダブリュー　グレイ（Ｐａｌｒｉｋ　Ｗ、Ｇｒ
ａｙ　）ら、Ｎａｊｕｔｅ、　２９５．５０１．１９８
２）。但し、該方法によって得られるガンマー・インタ
ーフェロンは糖鎖を有していない〔エルンスト　リンデ
ルクネヒト（Ｅｒｎｓｌ　Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｌ　
）　ら、Ｔｈｅ　ＪｏｕＩｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５９，６７９０．１９
８４）。

これらガンマー・インターフェロンのうちでも、特に、
上記ハムスター法により製造されるもの等が好ましく使
用できる。

一方、本発明で使用されるインターロイキン−１として
は、インターロイキン−１活性を有するかぎりにおいて
、天然型あるいは遺伝子組換えにより産生されたインタ
ーロイキン−１が包含される。天然型のインターロイキ
ン−１の製造法は特開昭６２−１７４０２２号に詳述さ
れている方法によって得ることが可能である。さらに遺
伝子の組換えによって得られるインターロイキン−１は
特開昭６３−１５２３９８号に詳述されている方法によ
って種々のインターロイキン−１誘導体を得ることが可
能である。

これらインターロイキン−１のうちでも、本発明では、
特に、ＩＬ−１βそのもの又は上記特開昭６３−１５２
３９８号に記載されているインターロイキン−１β誘導
体、例えば、下記に記載のものを例示できる。

ｏＩＬ−１β自イ本 ０　（Ｇｌｙ’　）ＩＬ−１β（４位ＡｒｇをＧｌｙに
置換したＩＬ−１β） ｏ　［Ａ１ａ８］ＩＬ−１β（８位ＣｙｓをＡｌａに置
換したＩＬ−１β） ｏ　（Ａ１ａ７］）ＩＬ−１β（７１位ＣｙｓをＡｌａ
に置換したＩＬ−１β） ｏ　（Ｌｅｕ”）ＩＬ−１β（９３位ＬｙｓをＬｅｕに
置換したＩＬ−’１β） ｏ　（Ａｒｇ１２’　）ＩＬ−１β（１２０位Ｔｒｐを
Ａｒｇに置換したＩＬ−１β） ｏ　（Ｔｙｒ３０）ＩＬ−１β（３０位ＨｉｓをＴｙｒ
に置換したＩＬ−１β） ｏ　（Ａｌａ８Ａ１ａ７Ｊ　ＩＬ−１β（８位Ｃｙｓ及
び７１位Ｃｙｓを８位Ａｌａ及び７１位Ａｌａに置換し
たＩＬ−１β） ｏＩＬ−１β−（４−１５３）ポリペプチド（１位Ａｌ
ａから３位Ｖａｌに至るアミノ酸配列を欠失させたＩＬ
−１β） ｏＩＬ−１β−（１−１５０）ポリペプチド（１５１位
以降を欠失させたＩＬ−１β）本発明の抗腫瘍剤は、ガ
ンマー・インターフェロンとインターロイキン−１とが
単一の製剤中に含まれるように調製して投与してもよく
、或し１は、ガンマー・インターフェロンとインターロ
イキン−１とのそれぞれを別個の製剤として調製し、こ
れら２つの製剤を投与しても良い。いずれの場合も、ガ
ンマー・インターフェロンとインターロイキン−１とは
、相互に一方が他方の腫瘍細胞増殖抑制作用を増強する
ため、両者の使用割合は、極めて広い範囲から適宜選択
できる。

本発明の抗腫瘍剤を臨床上使用するに際し、成人に対す
る一日当たりの有効量に関しては、広い範囲から選択で
き、ガンマー・インターフェロンは、通常−日当たり４
．　２　ｕ　ｇ／ｂｏｄｙ〜４．　２ｍｇ／ｂｏｄｙ程
度の範囲で使用すれば良く、一方、インターロイキン−
１は、一般に一日当たり０．０８〜８μｇ／ｂｏｄｙ程
度の範囲で使用するのが望ましい。本発明では、既述の
ごとく、ガンマー・インターフェロンとインターロイキ
ン−１とは、相互に一方が他方の腫瘍細胞増殖抑制作用
を増強するため、たとえば、ガンマー・インターフェロ
ンをこの分野で通常採用されている臨床投与量で使用す
る場合は、インターロイキン−１の通常採用されている
臨床投与量を１／１００倍〜９／１０倍程度に減少させ
ることができる。同様に、インターロイキン−１を一般
にこの分野で採用されている臨床投与量で使用する場合
は、ガンマー・インターフェロンの通常採用されている
臨床投与量を１／１００倍〜９／１０倍程度に減少させ
ることができる。前記副作用を回避する観点から、本発
明では、ガンマー・インターフェロンとインターロイキ
ン−１のいずれか一方を上記有効量範囲内の低い目の投
与量で使用するのが望ましい。

本発明の抗腫瘍剤は、その使用目的に応じ、この分野で
慣用されている各種の投与形態で使用される。特に、本
発明では、上記製剤を製造する際に、人血清アルブミン
及び／又は糖類と界面活性剤を使用することにより、有
効成分、就中インターロイキン−１の安定性を向上させ
ることもできる。

上記において糖としては特に限定はなく、例えばグルコ
ース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マ
ンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコ
ール類、ショ糖、マルトース、乳糖等の三糖類、デキス
トラン、ヒドロキシプロピルスターチ等の多糖類等を使
用でき、之等は一種単独でも二種以上混合しても用い得
る。之等の中で特にショ糖、マルトース、マンニトール
、イノシトール、デキストラン等が好ましい。

界面活性剤としても特に限定はなく、イオン性及び非イ
オン性界面活性剤のいずれも使用でき、就中、ポリオキ
シエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、
ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモ
ノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等の界面活性
剤を好ましく利用できる。

上記糖類の添加口は、インターロイキン−１そのもの又
はその前記誘導体（以下ｒｌＬ−１活性物」という）１
μｇ当たり約０．　１ｍｇ程度以上、好ましくは約１〜
１００ｍｇ程度の範囲とするのが適当であり、界面活性
剤の悉加量は、ＩＬ−１活性物１μｇ当たり約０．００
０１ｍｇ程度以上、好ましくけ約０．００１〜Ｏ，１ｍ
ｇ程度の範囲とするのが適当である。また人血清アルブ
ミンの添加口はＩＬ−１活性物１μｇ当たり約０．　０
０１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．０１〜１０ｍｇ程
度の範囲とするのが適当である。

本発明の抗腫瘍剤は、通常のこの種医薬組成物と同様の
ものとすることができ、他の薬理的有効成分や製剤上の
慣用成分等を任意に配合してもよい。

特に、本発明抗腫瘍剤に配合できる他の成分としては、
ＩＬ−１活性物の安定化を更に増加させる面より、通常
の含硫還元剤が好ましい。該含硫還元剤としては、具体
的にはシスティン、Ｎ−アセチルホモシスティン、チオ
クト酸、チオグリコール酸及び之等の塩類、チオエタノ
ールアミン、チオグリセロール、チオ硫酸ナトリウム、
チオ乳酸、ジチオスレイトール、グルタチオン等の比較
的温和な還元剤等を好ましく例示でき、之等は一種単独
でも利用でき、２種以上併用することもできる。之等の
添加量は特に制限されないが、ＩＬ−１β活性物１μｇ
当たり約０．００１ｍｇ程度以上、好ましくは０．０１
〜１０ｍｇ程度（２種以上を併用する場合はそれらの合
計毒）とするのが適当である。

本発明の抗腫瘍剤は、また、緩衝液で等張出して安定な
等張出製剤とされるのが適当である。ここで用いられる
緩衝液としては、例えば代表的には、クエン酸−クエン
酸ナトリウム、クエン酸−リン酸ナトリウム、酢酸−酢
酸ナトリウム、クエン酸−ホウ砂等のｐＨ４〜８程度、
好ましくはｐＨ５〜６程度の各種緩衝液を例示できる。

本発明抗腫瘍剤は、例えば通常薬理有効毒のガンマー・
インターフェロン、ＩＬ−１活性物及び前記特定の配合
成分と共に、適当な医薬製剤担体を配合して製剤組成物
の形態に調製される。該製剤担体としては使用形態に応
じた製剤の調製に通常慣用される充填剤、増量剤、結合
剤、付湿剤、崩壊剤等の賦形剤乃至稀釈剤をいずれも使
用できる。製剤組成物の形態は、これが有効成分を効果
的に含有する状態であれば特に限定はなく、錠剤、粉末
剤、顆粒剤、先割等の固剤であってもよく、液剤、懸濁
剤、乳剤等の注射剤形態であってもよい。またこれは使
用前に適当な担体の添加により液状となし得る乾燥品と
することもできる。之等の製剤組成物はいずれも常法に
従い調製され得る。

得られる医薬製剤は、該製剤組成物の形態に応じた適当
な投与経路、例えば、注射剤形態の医薬製剤は、静脈内
、筋肉内、皮下、皮肉、腹腔内投与等により投与され、
固剤形態の医薬製剤は、経口乃至は経腸投与され得る。

該投与は、−日１回であってもよ（、また−日３〜４回
に分けることもできる。

発明の効果 本発明によれば、カンマ−・インターフェロンとインタ
ーロイキン−１とを併用することにより、それぞれの抗
腫瘍活性が相互に著しく増強され、それぞれ単独では抗
腫瘍効果が発揮されないような低い投与量においても腫
瘍細胞の増殖抑制効果が得られる。その結果、両者の投
与量の大幅な低減および前記副作用の軽減が可能となる
。

実施例 参考例１．ガンマー・インターフェロンの調製ガンマー
・インターフェロンはｅｆ　公開６３−１２９６号（１
９８８，１，１２）に従って以下の方法により調製され
た。

（１）細胞の増殖 ＢＡＬＬ−１細胞をＦｅ２　Ｃウシ胎児血清）２０％を
含むＲＰＭＩ〜１６４０培地（ｐＨ７，２）中、３７℃
で培養した。得られた細胞を血清無添加のＲＰＭＩ−１
６４０培地（ｐＨ７，２）で洗浄し、次いで同培地に約
ｌＸ１０６個／回になるように懸濁した。

あらかじめ、ウサギ抗血清を投与して免疫反応を抑制し
た新生児ハムスターの皮下に、上記で調製したＢＡＬＬ
−１細胞を移植し、約３週間通常の飼育を行った。次い
で皮下に増殖したＢ　Ａ　Ｌ、　Ｌ＝１細胞の主要塊を
摘出し細切した後、トリプシン含有の生理食塩水に懸濁
して細胞を分散させた。

得られた細胞を血清無添加のＲＰＭ　Ｉ　−１６４０培
地で洗浄し、１０％ＦＣ８を含む同培地に約ｌＸ１０６
個／脱になるように懸濁し、以降のガンマー・インター
フェロンの産生に供した。

（２）ガンマー・インターフェロンの産生上記（１）の
方法で得られた１０％ＦＣ３に懸濁したＢＡＬＬ−１細
胞に、誘導剤としてリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を
１１００ｎ添加して３７℃で３日間培養し、ガンマー・
インターフェロンを誘導産生させた。

培養後、遠心分離を行って細胞を除去し、限外濾過によ
り濃縮した。濃縮液をモノクローナル抗体カラムを用い
て精製を行った。本標品の比活性は７．　３５Ｘ１０６
ＩＵ／ｍｇ　　ｐｒｏｔｅｌｎであった。

参考例２．インターロイキン−１の調製特開昭６３−１
５２．３９８号の実施例１に記載の方法に従い、７１位
ＣｙｓをＳｅｔに置換したインターロイキン−１βを調
製し、単離、精製した。

以下、上記参考例１で得たガンマー・インターフェロン
及び上記参考例２で得たインターロイキン−１を種々の
使用割合で使用し、腫瘍細胞の増殖抑制効果を測定した
。その結果を、下記の実施例１（１）〜（３）に示す。

実施例１．ヒト腫瘍細胞株の増殖に対する併用効里 （１）Ｃｏｌｏ　　２０５細胞に対する効果Ｃｏ１ｏ　
　２０５細胞（ヒト結腸腺癌細胞、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ
ｓ、　、　３８．１３４５．１９７８）をムーアＱ！ｏ
ｏｒｅ　）らの方法（Ｊ、　Ａｍ、　Ｍｅｄ、　Ａｓ５
ｏｃ、　、　１９９．５１９．１９６７）に従って培養
し、得られた細胞を、ＰＢ’５（−）溶液（日永製薬社
製、リン酸緩衝生理食塩水）で２回洗浄し、０．０５％
トリプシン（フロー・ラボラドリース社製）で細胞をは
がした後、ピペツテングによりＲＰＭＩ−１６４０培地
（ギブコ社製）に細胞を懸濁した。２５℃、１２０Ｏｒ
ｐｍで５分間遠心洗浄（日立製作新製、０５ＰＲ−２２
型）した細胞を再び同培地に懸濁し、最終濃度が１０％
となるようにＦＢＳ　（ウシ胎児血清、ギブコ社製）を
加えた。生細胞数はトリパンブルー溶液（和光紬薬社製
）にて染色して、光学顕微鏡下で計測した。

即ち、１２穴のマイクロプレート（コースタ−社製）の
各人に６．３×１０２個／謂から２×１０４個／ｍｌの
希釈系列にした細胞溶液を０．５眼ずつ加えて５％　Ｃ
Ｏ２下、３７℃で９日間培養（ナプコ社製Ｃ０２インキ
ュベーター）し、細胞濃度と培養時間の予備検討を行っ
た。ついてマイクロプレー）・の各人に最終濃度がＯｌ
ｏ、０１４．０．１４．１．４．１４．１４０ｎｇ／−
（即ち、０．０．１．１．１０．１００及び１０００ｕ
／ｍＱ）の参考例１のガンマー・インターフェロン（以
下、ｒＩＦＮ−γ」という）または０．０．０１．０．
１．１．１０．１１００ｎ／謂の参考例２のインターロ
イキン−１β（以下ｒｌＬ−１β」という）をそれぞれ
組み合わせてｏ、ｏ２５謂ずつ添加し、さらに予備検討
の結果に合わせて細胞濃度を１．３×１０３個／賎に希
釈調整した細胞溶液を０．５閾ずつ加えて５％Ｃ０２下
、３７°Ｃで８日間培養した。培養後、各人の細胞はＰ
ＢＳ（＋）溶液（日永製薬社製）で洗浄し、メタノール
（和光紬薬社製）固定した。

風乾後、ギムザ染色（メルク社製）を行い、オートマチ
イックパーティクルカウンター（ｃｐ−２０００、白井
松器械社製）または実体顕微鏡（ＳＺＨ、オリンパス社
製）下でコロニー数を計測した。各群の細胞増殖率を、
ガンマー・インターフェロンおよびインターロイキン−
１βの代わりに培養液のみを添加した群を対照として算
出した。結果を第１表に示す。

この結果、第１表に示すように、Ｃｏ１゜２０５細胞に
対してインターロイキン−１βは該細胞に対する単独の
増殖抑制効果は弱く、ｌｎｇ／謂から１００　ｎ　ｇ／
ｍＱまでの添加で、増殖抑制効果は弱く、１１００ｎ／
ｒｒｌＱで３５％前後の増殖抑制効果しか示さなかった
。またガンマー・インターフェロンのみでは０．１４％
ｇ／ｍＱｉ加群で６５％の増殖抑制効果を示した。

これに対して、ＩＦＮ−γ単独処置群では、１ＦＮ−７
のＥＤ、ｏ値（Ｐｒｏｂｉｌ法による、以下同じ）が０
．１８％ｇ／謂であるのに比較して、０．Ｏ１ｎｇ／ｍ
ＱのＩＬ−１βを併用した群では、ＩＦＮ−７のＥＤ５
ｏ値が０．０４２ｎｇ／ｍＱ、０．１βｇ／四のＩＬ−
１β併用群では、０．００７ｎｇ　／　Ｍａｒとなり、
実に４．３〜２５．７倍もの増殖抑制活性の増強が認め
られた。

（２）ＫＰＫ−１細胞に対する効果 ＫＰＫ−１細胞（ヒト腎癌細胞）をムーア（ｋ（ｏｏ＋
ｅ　）らの方法（Ｊ、八ｍ、　Ｍｅｄ、　Ａｓ５ｏｃ、
　、　１９９．５１９゜１９６７）に従って培養し、得
られた細胞を、ＰＢＳ（−）溶液（日永製薬社製）で２
回洗浄し、０．０５％トリプシン（フロー・ラボラドリ
ース社製）で細胞をはがした後、ピペツテンクによりＲ
ＰＭＩ−１６４０培地（ギブコ社製）に細胞を懸濁した
。２５°Ｃ，１２０Ｏｒｐｍで５分間遠心洗浄（日立製
作新製、０５ＰＲ−２２型）した細胞を再び同培地に懸
濁し、最終濃度が１０％となるようにＦＢＳ　（ウシ胎
児血清、ギブコ社製）を加えた。生細胞数はトリパンブ
ルー溶液（和光紬薬社製）にて染色して、光学顕微鏡下
で計測した。

即ち、１２穴のマイクロプレート（コースタ−社製）の
各式に６．３Ｘ、１０２個／ｍ１２から２×１０４個／
ｍＱの希釈系列にした細胞溶液を０．　５虻ずつ加えて
５％　Ｃ０２下、３７℃で６日間培養（ナプコ社製ＣＯ
２インキュヘーター）し、細胞濃度と培養時間の予備検
討を行った。ついでマイクロプレートの各人に、最終濃
度が０．０．０１４．０，１４．１．４．１４．１４０
βｇ／回（即ち、０．０．１．１．１０．１００．１０
００ｕ／！ＩＩＱ）の参考例１のガンマー・インターフ
ェロンまたは０．０．０１．０．１．１．１０．１１０
０ｎ／回の参考例２のインターロイキン−１βをそれぞ
れ組み合わせて０．　０２５ｍＱずつ添加し、−さらに
予備検討の結果に合わせて細胞濃度を２Ｘ１０’個／ｍ
ｌに希釈調整した細胞溶液を０．５鵬ずつ加えて５％Ｃ
Ｏ２下、３７℃で７日間培養した。培養後、各人の細胞
はＰＢＳ（＋）溶液（白水製薬社製）で洗浄し、メタノ
ール（和光紬薬社製）固定した。風乾後、ギムザ染色（
メルク社製）を行い、オートマチイックパーティクルカ
ウンター（ＣＰ−２０００、白井松器械社製）または実
体顕微鏡（ＳＺＨ、オリンパス社製）下でコロニー数を
計測した。各群の細胞増殖率を、ガンマー・インターフ
ェロンおよびインターロイキン−１βの代わりに培養液
のみを添加した群を対照として算出した。結果を第２表
に示す。

第２表から明らかなように、ＫＰＫ−１細胞に対してイ
ンターロイキン−１βは非常に弱い増殖抑制効果しか示
さず、１１００ｎ／ｍＱでも１５％程度の抑制であった
。ガンマー・インターフェロンは１４％ｇ／ｍＱで５７
％の増殖抑制効果を示した。これに比較し、ＩＦＮ−γ
単独処置群では、ＩＦＮ−７のＥＤ５０値が１１．３０
１βｇ／ｍＱであるのに比較して、０．１βｇ／謂のＩ
Ｌ−１βを併用した群では、ＩＦＮ−γのＥＤ、。値が
１゜８６２βｇ／ｍＱ、１　ｎ　ｇ／噌のＩＬ−１β併
用群では、０．２５５βｇ／閾となり、実に６．１〜４
４．３倍もの増殖抑制活性の増強が認められた。

（３）各種細胞に対する効果 ５Ｗ４８細胞（ヒト結腸腺癌細胞、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ
、、　　３６，４５６２．１９７６）を、レイボヴイッ
ッ（Ｌｅｉｂｏｖｉｌｚ　）らの方法（Ａｍ、　１．　
Ｈｙｇ、　、　７８．１７３゜１９６３）に従って培養
し、得られた細胞を、ＰＢＳ（−）溶液（白水製薬社製
）で２回洗浄し、０．０５％トリプシン（フロー・ラボ
ラドリース社製）で細胞をはがした後、ピペッテンクに
よりＬ−１５培地（フロー・ラボラトリーズ社製）に細
胞を懸濁した。２５°Ｃ，１２０Ｏｒｐｍで５分間遠心
洗浄（日立製作新製、０５ＰＲ−２２型）した細胞を再
び同培地に懸濁し、最終濃度が１０％となるようにＦＢ
Ｓ　（ウシ胎児血清、キブコ社製）を加えた。生細胞数
はトリパンブルー溶液（和光紬薬社製）にて染色して、
光学顕微鏡下で計測した。

即ち、１２穴のマイクロプレート（コースタ−社製）の
各人に６．３Ｘ１０”個／ｍｌがら２×１０４個／ｍｌ
の希釈系列にした細胞溶液を０．５鵬ずつ加えて５％　
ＣＯ２下、３７°Ｃで８日間培養（ナプコ社製ＣＯ２イ
ンキュベーター）し、細胞濃度と培養時間の予備検討を
行った。ついでマイクロプレートの各人に、最終濃度が
０もしくは１．４βｇ／ｍＱの参考例１のガンマー・イ
ンターフェロンまたは０もしくは１．０βｇ／ｍＱの参
考例２のインターロイキン−１βをそれぞれ単独、又は
組み合わせて０．０２５謂ずつ添加し、さらに予備検討
の結果に合わせて細胞濃度を２．５×１０３個／謂に希
釈調整した細胞溶液を０．５謂ずつ加えて５％ＣＯ２下
、３７°Ｃで１２日間培養した。培養後、各人の細胞は
ＰＢＳ　（＋）（日本製薬社製）で洗浄し、メタノール
（和光紬薬社製）固定した。

Ｃａ１ｕ−３細胞（ヒト肺癌細胞、Ｊ、Ｎａｌ。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、　、　５８．２０９．１９７
７）を、イーグル・エイチ（Ｅａｇｌｅ、　）１．　）
らの方法（Ｓｃ１ｅｎｃｅ、　１３０．４３２．１９５
９）に従って培養し、得られた細胞をＰＢＳ　（−）溶
液（日本製薬社製）で２回洗浄し、０．０５％トリプシ
ン（フロー・ラボラトリーズ社製）＋１０％Ｎ　Ｅ　Ａ
　Ａ　（Ｎｏｎ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａ
ｃｉｄ、　　フロー・ラボラトリーズ社製）に１＋Ｉｌ
（のピルビン酸ナトリウムを含む培地に細胞を懸濁した
。２５°ＣＣ１１２００ｒｐで５分間遠心洗浄（日立製
作前装、０５ＰＲ−２２型）した細胞を再び同培地に懸
濁し、最終濃度が１０％となるようにＦｅ２　（ウシ胎
児血清、ギブコ社製）を加えた。生細胞数はトリパンブ
ルー溶液（和光紬薬社製）にて染色して、光学顕微鏡下
で計測した。

これを１２穴のマイクロプレート（コースタ−社製）の
各穴６．３Ｘ１０２個／謂から２×１０４個／謂の希釈
系列にした細胞溶液を０．５閾ずつ加えて５％　ＣＯ２
下、３７℃で９日間培養（ナプコ社製、Ｃ０２インキユ
ベーター）し、細胞濃度と培養時間の予備検討を行った
。次いでマイクロプレートの各人に、最終濃度が０もし
くは１．４βｇ／ｍＱの参考例１のガンマー・インター
フェロン、または０もしくは１．０βｇ／ＩＱの参考例
２のインターロイキン−１βをそれぞれ単独、または組
み合わせて０．０２５ｍＱずつ添加し、さらに予備検討
の結果に合わせて細胞濃度を２．５×１０３個／回に希
釈調整した細胞溶液を０゜５謂ずつ加えて５％　ＣＯ２
下、３７°Ｃて１２日間培養した。培養後、各人の細胞
はＰＢＳ（＋）溶液（日本製薬社製）で洗浄し、メタノ
ール（和　□光紬薬社製）固定した。

Ｃｏ１ｏ　　２０５細胞は実施例１（１）に示した方法
により、ＫＰＫ−１細胞は実施例１（２）に示した方法
により、それぞれ準備して参考例１のガンマー・インタ
ーフェロン０もしくは１．４βｇ／四、あるいは参考例
２のインターロイキン−１βを０もしくは１．０βｇ／
ｍＱの単独、あるいは両者を併用して各細胞に対する増
殖抑制効果を調べた。

この結果、第３表に示すようにＳＷ　　４８細胞に対し
てインターロイキン−１βもガンマー・インターフェロ
ンも夫々単独では増殖抑制効果を示さないが、両者を併
用することにより、その増殖を実に９０％以上抑制した
。Ｃａ１ｕ−３細胞に対してはインターロイキン−１β
もガンマー・インターフェロンも夫々単独では使用した
濃度では完全に抑制しなかった。しかし、両者を併用す
ることによりＣａ１ｕ−３細胞の増殖を実質上完全に抑
制した。Ｋ　Ｐ　Ｋ、−１及びＣｏ］ｏ　　２０５細胞
に対しても、第１表及び第２表に示した結果と同様に、
これらの細胞の増殖抑制効果はインターロイキン−１β
とガンマー・インターフェロンの併用により著しく上昇
した。

製剤例１ インターロイキン−１β　　　０．８μｇ／較ガンマー
・インターフェロン　　４２μｇ／−ツウィーン８０　
　　　　　　０．０１ｍｇ／回デキストラン４０　　　
　　　　　　１５ｍｇ／ｍＱシスティン　　　　　　　
　　　　Ｏ，１ｍｇ／噌Ｈ８Ａ　（ヒト血清アルブミン
）　　　１．　０ｍｇ／ｍｆ２上記各成分を、上記の濃
度となるように、０．０１Ｍクエン酸−クエン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ６，０）に加えて混合し、混合物を濾
過（０，２２μｍメンブランフィルタ−使用）後、炉液
を無菌的に１回ずつバイアル瓶に分注し、凍結乾燥して
、注射用製剤形態の本発明抗腫瘍剤を調製した。

該製剤は、これを用時、生理食塩水１制に溶解して利用
される。

製剤例２ インターロイキン−１β　　０．０８μｇ／ｍＱガンマ
ー・インターフェロン　４２０μｇ／噌ツウィーン８０
　　　　　　　０．０１ｍｇ／賎デキストラン４０　　
　　　　　　１５ｍｇ／戒システィン　　　　　　　　
　　０，１ｍｇ／噌Ｈ８Ａ　Ｃヒト血清アルブミン）　
　　１．　０ｍｇ／ｍＱ上記各成分を、上記の濃度とな
るように、０．０１Ｍクエン酸−クエン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ６，０）に加えて混合し、混合物を濾過（０
，２２μｍメンブランフィルタ−使用）後、炉液を無菌
的に１鵬ずつバイアル瓶に分注し、凍結乾燥して、注射
用製剤形態の本発明抗腫瘍剤を調製した。

該製剤は、これを用時、生理食塩水１噌に溶解して利用
される。

（以　上）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ガンマー・インターフェロンとインターロイキン
   −１とを有効成分とする抗腫瘍剤。
2. （２）ガンマー・インターフェロンが、天然型のガンマ
   ー・インターフェロンまたは遺伝子組換え法により産生
   されたガンマー・インターフェロンもしくはガンマー・
   インターフェロン活性を有するガンマー・インターフェ
   ロン誘導体である請求項１に記載の抗腫瘍剤。
3. （３）インターロイキン−１が、天然型のインターロイ
   キン−１βまたは遺伝子組換え法により産生されたイン
   ターロイキン−１βもしくはインターロイキン−１β活
   性を有するインターロイキン−１β誘導体である請求項
   １に記載の抗腫瘍剤。