DE69123362T2

DE69123362T2 - Mikrobielles fermentierungsschutzmittel

Info

Publication number: DE69123362T2
Application number: DE69123362T
Authority: DE
Inventors: Arie Ben-Bassat; Kent Coddington; Donald Johnson
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1990-10-26
Filing date: 1991-09-27
Publication date: 1997-03-27
Anticipated expiration: 2011-09-28
Also published as: JPH06502308A; CA2094510C; GR3022391T3; DK0560800T3; AU658844B2; CA2094510A1; ES2097221T3; AU8928691A; JP3105250B2; DE69123362D1; WO1992007946A1; EP0560800B1; ATE145671T1; EP0560800A1; US5114849A

Description

Bereich der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft mikrobielle Fermentationsprozesse. Sie betrifft insbesondere ein verbessertes Verfahren für die Herstellung von Cellulose durch mikrobielle Fermentation.

Hintergrund der Erfindung

Cellulose wird produziert von Pflanzen und von verschiedenen Mikroorganismen. Beispiele von Cellulose produzierenden prokaryotischen Organismen schließen Acetobacter, Rhizobium, Agrobacterium und Aztobacter ein (Harris et al., Ann. Rev. Microbiol. 27 (1973), Seiten 27 bis 50). Acetobacter ist einer der am besten charakterisierten Cellulose produzierenden Organismen.
Acetobacter ist charäkteristischerweise ein Gram-negatives, stäbchenförmiges Bakterium mit einem Durchmesser von 0,6 bis 0,8 µm und einer Länge von 1,0 bis 4 µm. Es ist strikt aerob, und sein Metabolismus bzw. Stoffwechsel ist ein unter Atmung verlaufender (respiratorischer) Stoffwechsel, niemals ein unter Gärung verlaufender (fermentativer) Stoffwechsel. Es läßt sich weiter durch seine Fähigkeit unterscheiden, gleichzeitig mehrere Poly-β(1-4)-glucan-Ketten zu erzeugen, die chemisch mit Cellulose identisch sind. Mehrere Cellulose-Ketten oder Mikrofibrillen werden an Stellen auf der Zellwand des Bakteriums synthetisiert. Diese Mikrofibrillen werden von dem Bakterium in das Kulturmedium extrudiert.
Die von Acetobacter produzierten Cellulose-Mikrofibrillen haben Querschnittsdimensionen von etwa 1,6 nm x 5,8 nm. In statischen oder stehenden Kulturen vereinen sich die Mikrofibrillen an der Bakterienoberfläche unter Bildung einer Fibrille mit Querschnittsdimensionen von etwa 3,2 nm x 133 nm. Diese kleine Querschnittsbreite ist der Hauptunterschied zwischen Cellulose, die von Acetobacter produziert wird, und Cellulose, wie sie in Holzpulpe gefunden wird. Der geringe Querschnitt dieser von Acetobacter produzierten Fibrillen führt zusammen mit der gleichzeitig auftretenden größeren Oberfläche als bei herkömmlicher Holzpulpe-Cellulose und der dieser Cellulose eigenen Hydrophilie der Cellulose zu einem Cellulose-Produkt, das ein unüblich großes Vermögen zum Absorbieren wäßriger Lösungen aufweist. Dieses hohe Absorptionsvermögen hat zur Entwicklung einiger Produkte aus Acetobacter-Cellulose geführt, wie beispielsweise zur Entwicklung von Wundverbänden und Papierprodukten.
Im Jahre 1947 wurde von Hestrin et al. (Nature 159 (1947), Seiten 64 bis 65) gefunden, daß in Gegenwart von Glucose und Sauerstoff sich nicht vermehrende Zellen von Acetobacter Cellulose synthetisieren. Seit dieser Zeit wurde Acetobacter unter vielen verschiedenen Bedingungen gezüchtet, die eine Cellulose-Produktion unterstützen. Wenn man beispielsweise Zellen unter Hin- und Her-Schütteln mit etwa 90 bis 100 Cyclen pro Minute wachsen ließ, wurden sie in eine umfangreiche Gel-Masse eingearbeitet. Wenn man sie unter Bedingungen wachsen ließ, bei denen das Kulturmedium unter Wirbelbewegungen 4 h lang bewegt wurde, bildeten sich sternförmige Gelkörper, die aus Cellulose und Zellen bestanden. Wenn man sie in Form von Standkulturen züchtete, bildete sich an der Grenzfläche Luft- Medium ein Häutchen. Das Häutchen bildete sich in Form eines Kissens, das allgemein dieselbe Oberflächenform und -fläche wie die Flüssigkeitsoberfläche des Gefäßes aufweist, das die Kultur enthält (Hestrin und Schramm, Biochem. J. 58 (1954), 345 bis 352).
In statischen Kulturen erfolgt die Erzeugung von Cellulose durch Acetobacter an der Grenzfläche Luft-flüssiges Medium. Acetobacter ist ein zwingend an aerobe Bedingungen gebundenes Bakterium; daher erzeugt jedes Bakterium kontinuierlich eine Fibrille an der Grenzfläche Luft-Flüssigkeit. In dem Maße, wie neue Cellulose an der Oberfläche gebildet wird, wird die bereits existierende Cellulose nach unten in das Wachstumsmedium gedrückt. Als Ergebnis bestehen die Cellulose-Häutchen, die unter Bedingungen einer statischen Kultur produziert werden, aus Schichten von Cellulose-Fasern, die die wachsenden Acetobacter- Zellen an der Grenzfläche Luft-Medium halten. Signifikanterweise ist das Volumen der so produzierten Cellulose durch die Grenzfläche zwischen Luft und Kulturmedium beschränkt.
Acetobacter produzieren Cellulose auch dann, wenn man sie in bewegten Kulturen wachsen läßt. Jedoch war es bisher aus verschiedenen Gründen schwierig, eine hohe Cellulose- Produktivität bei bewegten Kulturen zu erhalten. Die Tendenz bekannter Acetobacter- Stämme, zu Nicht-Produzenten zu werden, wenn man sie unter bewegten Bedingungen bei erhöhten Konzentrationen an gelöstem Sauerstoff kultiviert, hat in der Vergangenheit die Menge an Cellulose stark beschränkt, die wirtschaftlich hergestellt werden kann. Das US- Patent Nr.4,863,565 offenbart eine Anzahl von Acetobacter-Stämmen, die in Langzeit- Kulturen sowohl unter bewegten als auch unter statischen Bedingungen stabil sind. Das Patent beschreibt ausgewählte Acetobacter-Stämme, die durch ein scharf reduziertes Vermögen zur Bildung von Gluconsäuren und Ketogluconsäuren gekennzeichnet sind, wenn man sie auf einem Glucose enthaltenden Medium züchtet. Der im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendete Stamm, der Stamm 1306-21, ist einer der stabilen Stämme, die in dem Patent offenbart wurden.
Ein zweites Problem, das die Cellulose-Produktion in bewegten Kulturen beschränkt hat, stammt von den hohen Bewegungsgeschwindigkeiten, die erforderlich sind, um das Fermentationsmedium mit Sauerstoff zu versorgen, wenn die Konzentrationen an Cellulose und Zellen in der Kultur steigen. Der Sauerstoffbedarf einer Kultur steigt, wenn die Zelldichte der Kultur steigt. Außerdem wird bei hohen Cellulose-Konzentrationen die Fermentationsbrühe viskoser; daher sinkt die Sauerstoff-Übertragungsrate von der Luft-Phase zur flüssigen Phase. Daher sind erhöhte Bewegungsgeschwindigkeiten erforderlich, um ausreichende Konzentrationen an gelöstem Sauerstoff in der Kultur zu halten und so das Zellwachstum und die Cellulose-Produktion aufrechtzuerhalten. Jedoch beeinträchtigt die erhöhte Bewegungsgeschwindigkeit die Menge an produzierter Cellulose negativ in Form eines deutlichen Rückgangs der Cellulose-Ausbeute und der auf das Volumen bezogenen Produktivität.
Es wurde gezeigt, daß die Cellulose-Produktion durch Acetobacter zurückgeht, wenn die Geschwindigkeit des Bewegens der Kultur signifikant erhöht wird (siehe beispielsweise die nachfolgend in Beispiel 1 aufgeführten Daten). Die erhöhte Bewegungsgeschwindigkeit kann das Verhältnis Cellulose zu Zelle und/oder die Cellulose-Ausbeute der Kultur nachteilig beeinträchtigen. Diese Auswirkungen können der erhöhten Scher-Belastung der Zellen und der Cellulose zugeschrieben werden, wenn die Geschwindigkeit der Bewegung der Kultur erhöht wird. Bei hohen Bewegungsgeschwindigkeiten ist die Qualität der produzierten Cellulose ebenfalls beeinträchtigt. Verwiesen wird beispielsweise auf das US-Patent Nr. 4,863,565, das offenbart, daß in Tests in einem Fermenter (14 l) unter Verwendung eines Flügelrührers zum Bewegen der Brühe gefunden wurde, daß die charakteristischen Eigenschaften der Brühe (Viskosität) und der resultierenden Cellulose (Teilchengröße und Morphologie, Absetzgeschwindigkeit, Handblatt-Bildung) durch hohe Rührer-Geschwindigkeiten (oberhalb etwa 600 Upm in den durchgeführten Versuchen) beeinträchtigt wurden. Diese Wirkungen waren noch verstärkter, je länger die Kulturen bei solchen Geschwindigkeiten bewegt wurden.
Die vorliegende Erfindung offenbart die Verwendung von Polyacrylamiden und nahe verwandten anionischen Copolymeren. Die nahe verwandten anionischen Copolymere werden gebildet durch gemeinsame Polymerisation von Acrylamid und Acrylsäure (oder ihren Salzen) oder durch partielle Hydrolyse von funktionellen Amid-Gruppen eines Polyacrylamids.
Polyacrylamide werden für viele unterschiedliche Zwecke verwendet. Sie werden allgemein als Ausflockungsmittel zum Klären von Flüssigkeiten verwendet. Einige der Anwendungen von Polyacrylamiden schließen die Schlammverdickung, die Polymergewinnung, die Kontrolle der Kristallbildung und die Verwendung als Hilfsmittel beim Entwässern ein. Die Verbindungen können auch verwendet werden als Hilfsstoffe bei der Vakuumfiltration und -zentrifugation zur Erhöhung der Produktionsgeschwindigkeit und zum Einfangen von Feststoffen im Kuchen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein verbessertes Verfahren zur Produktion von mikrobieller Cellulose in bewegten Kulturen. Die Wirkung des verbesserten Verfahrens, wie es im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschrieben wird, ergibt sich typischerweise aus der erhöhten Cellulose-Produktivität pro Volumeneinheit und der erhöhten Ausbeute, die beobachtet wird, wenn das Verfahren verwendet wird zur Züchtung von bewegten Kolben- und Fermenter-Kulturen von Cellulose erzeugenden Mikroorganismen.
Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zur aeroben Erzeugung von mikrobieller Cellulose in einer bewegten Kultur mikrobieller Zellen, die zur Produktion von Cellulose befähigt sind und in einem geeigneten Nähr-Wachstumsmedium gezüchtet werden, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt, daß man
(a) die mikrobiellen Zellen in Gegenwart eines Mittels kultiviert, das ein Polyacrylamid enthaltendes Polymer, das ein Gewichtsmittel des Molekulargewichts im Bereich von etwa 10&sup6; bis etwa 10&sup7; Dalton aufweist, in einer Konzentration umfaßt, die wirksam ist zur Verbesserung der Cellulose-Ausbeute in einer bewegten Kultur; und
(a) die mikrobiell produzierte Cellulose gewinnt.
Bevorzugte Polyacrylamid enthaltende Polymere, die wirksam in der Stimulation des größten Anstiegs der Cellulose-Ausbeute in den bewegten Kulturen sind, sind Polymere mit hohem Molekulargewicht, die ein Gewichtsmittel des Molekulargewichts im Bereich von etwea 10&sup6; bis etwa 10&sup7; Dalton aufweisen. Diejenigen von diesen Polyacrylamid enthaltenden Polymeren mit hohem Molekulargewicht, die den größten Anstieg der Konzentration an Cellulose- Produkt stimulierten, waren nicht-ionische oder anionische Polymere. Es wurde gefunden, daß stark kationische Polymere allgemein toxisch für das Zellwachstum sind.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur list eine Grafik, die die Cellulose-Konzentration gegen die Zeit für Fermentationsreaktionen zeigt, die in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen des Polyacrylamids Floxan EA-1340 durchgeführt wurden.

Wege zur Durchführung der Erfindung

Zellwachstum und Cellulose-Produktion in statischen und bewegten Kulturen von Cellulose erzeugenden Mikroorganismen wie beispielsweise Acetobacter können beschränkt werden durch eine unzureichende Zufuhr von gelöstem Sauerstoff zum Kulturmedium. Während jedoch ein Anstieg der Bewegungsgeschwindigkeit zu einem verstarkten Zellwachstum führen kann, erhöht die erhöhte Bewegungsgeschwindigkeit nicht in entsprechender Weise die Cellulose-Produktion. Tatsächlich geht die Cellulose-Ausbeute zurück, wenn die Bewegungsgeschwindigkeit von Cellulose erzeugenden mikrobiellen Kulturen erhöht wird. Wir wünschen nicht, an irgendeine besondere Theorie gebunden zu sein; es ist jedoch wahrscheinlich, daß die Scher-Belastung, die sich bei höheren Bewegungsgeschwindigkeiten ergibt, eine nachteilige Wirkung auf die Cellulose-Ausbeute hat.
Die vorliegende Erfindung offenbart geeignete Polyacrylamid enthaltende Polymere, die wirksam sind zum Schutz der in bewegten Kulturen von Cellulose erzeugenden Mikroorganismen erzeugter Cellulose vor der Verringerung der Cellulose-Ausbeute und der auf das Volumen bezogenen Produktivität, die mit einer hohen Geschwindigkeit der Bewegung verbunden ist. Der Ausdruck "Polyacrylamid enthaltendes Polymer", wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, bezieht sich auf ein Polymer, das aus Acrylamid-Monomeren aufgebaut ist. Der Begriff "Polyacrylamid enthaltendes Polymer" ist nicht auf Polymere beschränkt, die ausschließlich aus Acrylamid-Monomeren bestehen, sondern schließt auch beispielsweise Copolymere von Acrylamid und Natriumacrylat ein. Es wurde gefunden, daß die Verwendung des Polyacrylamid enthaltenden Polymers in einer Konzentration im Bereich von etwa 0,1 g/l bis etwa 5,0 g/l, noch mehr bevorzugt von etwa 0,4 g/l bis etwa 3 g/l, die Cellulose-Ausbeute aus bewegten Fermentationskulturen erhöht.
Jeder beliebige Mikroben-Stamm, der in der Lage ist, Cellulose zu produzieren, kann in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Geeignete Stämme schließen Stämme ein, die zum Genus Acetobacter gehören, beispielsweise Stämme der hinterlegten Spezies Acetobacter-Stamm 1306-3 und dessen Derivate. Der Begriff "Acetobacter", wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, bezieht sich auf ein Genus von Mikroorganismen und insbesondere auf Mitglieder des Genus, die Cellulose produzieren.
Der Acetobacter-Stamm 1306-21 wurde derivatisiert durch mutagene Behandlung von Stamm 1306-3 und Selektieren eines Isolats, das geringere Konzentrationsmengen Gluconsäure produzierte. Die Herstellung und Identifikation von Stamm 1306-21 ist beschrieben in dem US-Patent Nr.4,863,565. Es wurde gefunden, daß Stamm 1306-21 eine geringere Säureproduktion und eine größere Cellulose-Ausbeute als die anderen überprüften Isolate zeigt. Die Acetobacter-Stämme 1306-3 und 1306-21 wurden hinterlegt bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, USA, unter den Hinterlegungsnummern ATCC 53264 bzw. 53524. Diese Stamme wurden unter dem Budapester Abkommen über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für Zwecke der Patentverfahren und den Regeln dieses Abkommens (Budapester Vertrag) hinterlegt.
Rekombinante Stämme von Cellulose produzierenden Organismen können ebenfalls in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Geeignete Wirtszellen, die das gesamte Cellulosesynthase-Operon von Acetobacter xylinum oder Teile davon enthalten, sind eine Ausführungsform der Erfindung. Der Stamm 1306-3 pUC18-824 pABCD, ein rekombinanter Acetobacter-Stamm, der die Gene A, B, C und D des Cellulosesynthase- Operons trägt, ist beschrieben in der Druckschrift WO 90/12098. Das Plasmid pABCD wurde bei der American Type Culture Collection in einem E. coli-Wirt (E. coli DG101 pUC 18-824 - pABCD) unter der Hinterlegungsnummer ATCC 68264 hinterlegt.
Verschiedene Nährstoffe können als Kohlenstoff-Quelle zum Wachstum der Cellulose erzeugenden Mikroorganismen gemäß dem Verfahren der Erfindung verwendet werden. Geeignete Kohlenstoff-Quellen schließen ein: Monosaccharide und deren Mischungen wie beispielsweise Glucose und Fructose und Disaccharide wie beispielsweise Sucrose in reiner oder partiell gereinigter Form oder als Monosaccharid und Disaccharid enthaltende Ausgangsmaterialien wie beispielsweise hydrolysierte Maisstarke, hydrolysiertes Holz und Melassen. Casein-Hydrolysat, Protein-Hydrolysat, Hefeextrakt, Malzextrakt, Ammonium- Salze, Mais-Einweich-Flüssigkeit und andere stickstoffreiche Substanzen können als allgemeine Quelle von Aminosäuren, Stickstoff, Mineralien und Vitaminen verwendet werden.
Bakterienkulturen können unter bewegten Kulturbedingungen mit jedem beliebigen Mittel gezüchtet werden, das bekannt ist zur Erzeugung von Turbulenz in dem flüssigen Kulturmedium. Solche Mittel sind Fachleuten im Bereich der Fermentationstechnik wohlbekannt. In kleinem Maßstab, allgemein weniger als 11 Kulturvolumen, können flüssige Kulturen bewegt werden durch sich hin- und herbewegende oder Schüttel-Inkubatoren, die dem Medium eine Wirbelbewegung verleihen.
Verschiedene Ausführungen des Reaktors können für die Produktion des Cellulose-Produkts gemäß der Erfindung im großen Maßstab geeignet sein; siehe z.B. Kapitel 7 von "Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook; Herausgeber: Atkinson und Mavitnua; 1. Ausgabe; The Nature Press, N. Y., 1983". Für Cellulose-Produktionen im großen Maßstab mit Volumenmengen der Kultur, die allgemein über 1 l liegen, kann die Kulturbrühe mit einer Anzahl von Mitteln bewegt werden, die verschiedene Typen von Flügelrührern, Schwimmauftriebs-Fermenter einschließlich Luftauftriebs-Fermenter, pumpenbetriebene Umwälzung der Fermenterbrühe oder Kombinationen daraus einschließen. Wünschenswerte charakteristische Eigenschaften der Fermenter-Rührer schließen hohe Massentransfer-Geschwindigkeiten, hohe Umlaufgeschwindigkeiten und niedrige Belastung durch Scherung ein.
Solange das Kulturmedium bewegt wird, sind verschiedene Fermentationsverfahren zum Züchten der Cellulose erzeugenden Mikroorganismen bei einer mittleren, auf das Volumen bezogenen Produktivität von Cellulose, die im Umfang der vorliegenden Erfindung liegt, von wenigstens 0,1 g/l/h für längere Zeiträume geeignet. Geeignete Fermentationsverfahren schließen die Batch-Fermentierung, Batch-Fermentierungen mit Zufuhr einzelner Substanzen, die wiederholte Batch-Fermentierung und die kontinuierliche Fermentierung ein. Bei Batch- Fermentationsverfahren wird der Cellulose erzeugende Mikroorganismus in ein Fermentationsgefäß inokuliert, und die Fermentation läuft ohne weitere Zugabe von Kulturmedien ab. Am Schluß des Fermentationsverfahrens wird der Inhalt des Fermentationsgefäßes aufgenommen, und die Cellulose wird entfernt. Bei Batch-Fermentationsverfahren unter Zufuhr verschiedener Substanzen werden verschiedene Nährstoffe wie beispielsweise die Kohlenstoff-Quelle oder die Stickstoff-Quelle dem Medium während des Fermentationsdurchlaufs ohne Entfernen der Fermentationsbrühe zur Verarbeitung zugesetzt, und zwar bis zum Ende des Fermentationsdurchgangs. Die Nährstoffe können kontinuierlich, in vorbestimmten Zeitabständen oder dann zugesetzt werden, wenn die Konzentrationen an Nährstoff in dem Medium unter gewünschte Werte fallen. Bei wiederholten Batch- Fermentierungen wird eine Volumenmenge der Kulturbrühe zur Verarbeitung entfernt; eine Volumenmenge frischen Kulturmediums wird der in dem Kulturgefaß verbliebenen Kulturbrühe zugesetzt, und die Fermentation wird wieder aufgenommen. Bei wiederholten Batch-Fermentationsverfahren können wie bei Batch-Fermentationsverfahren unter Zusatz bestimmter Substanzen die Nährstoffe kontinuierlich, in vorbestimmten Zeitabständen oder dann zugesetzt werden, wenn die Konzentrationen in dem Medium unter bestimmte gewünschte Werte fallen. Bei kontinuierlichen Fermentationsverfahren wird die Brühe auf dem Fermentationsgefaß entfernt und durch frisches Medium ersetzt, was mit einer konstanten Geschwindigkeit geschieht. Bei kontinuierlichen Fermentationsverfahren kann durch Einstellen der Strömungsgeschwindigkeit des Mediums in das Gefaß hinein und der Kulturbrühe aus dem Gefaß heraus die spezielle Wachstumsgeschwindigkeit des Cellulose erzeugenden Mikroorganismus bei einem etwa konstanten Wert gehalten werden.
Batch-Fermentationsverfahren, Batch-Fermentationsverfahren unter Zusatz bestimmter Substanzen, wiederholte Batch-Fermentationsverfahren und kontinuierliche Fermentationsverfahren sind alle zur Erzielung einer mittleren, auf das Volumen bezogene Produktivität vor wenigstens 0,1 g/l/h geeignet, solange das Inokulum des Kulturmediums anfänglich wenigstens 1 % beträgt (v/v). Ein Inokulum im Bereich von 1 bis 10 % (v/v) in dem Kulturmedium ist wirksam zum Erhalt einer mittleren, auf das Volumen bezogenen Produktivät an Cellulose von 0,1 g/l/h. Ein Inokulum von etwa 5 bis 10 % (v/v) des Kulturmediums ist bevorzugt. In kontinuierlich geführten Kulturen werden als Medium Cellulose produzierende Zellen und Cellulose entfernt, und frisches Medium wird mit einer Rate zugesetzt, die ausreichend ist, um die auf das Volumen bezogene Produktivität bei einem Mittelwert von wenigstens 0,1 g/l/h zu halten.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden Schutzmittel definiert als Chemikalien, die die Cellulose-Ausbeute bei Bedingungen des Wachstums unter starker Bewegung erhöhen. Diese Schutzmittel können in einem Drei-Schritt-Prozeß identifiziert werden. Ein anfängliches Auswahlverfahren potentieller Schutzmittel wird in Schüttelkolben durchgeführt.
Jedes Schutzmittel wird auf seine Fähigkeit zur Erhöhung der Biomasse-Produktion in einer separaten Kultur getestet, die bei 375 Upm 3 d lang bewegt wurde. Die Biomasse entspricht den Massen an Zellen und Cellulose. Unsere Studien haben gezeigt, daß die Cellulose- Produktion und -Ausbeute sehr empfindlich gegenüber Bewegen sind, während das Zellwachstum signifikant weniger empfindlich ist. Daher können Änderungen der Biomasse- Konzentration als Indikator für eine Schädigung durch Belastung durch Scherung und für den Schutz durch ein Schutzmittel verwendet werden.
Die Schutzmittel werden in Konzentrationen getestet, die im Bereich von 0,4 g/l bis 5 g/l liegen. Die Biomasse-Konzentration jeder Testkultur wird verglichen mit Biomasse- Konzentrationen in Kontrollkulturen, in denen keine Schutzmittel zugegen sind und die entweder bei 125 oder 375 Upm bewegt werden. Die Testkulturen werden gesichtet, um zu bestimmen, welche Schutzmittel die höchsten Biomasse-Konzentrationen ergeben, bezogen auf die bei 375 Upm bewegte Kontrollkultur. Die Biomasse-Konzentrationen der Testkulturen sind nicht notwendigerweise höher als diejenige der bei 125 Upm bewegten Kontroll-Kultur.
Die am meisten versprechenden Schutzmittel, d.h. diejenigen, die zu den höchsten Biomasse-Konzentrationen bei hohen Bewegungsgeschwindigkeiten in dem anfänglichen Auswahlverfahren führen, werden dann getestet, um die optimalen Konzentrationen zu bestimmen. Jedes Schutzmittel wird innerhalb eines Konzentrationsbereichs von 0,1 bis 5 g/l getestet. Allgemein erhöht eine Schutzmittel-Konzentration von etwa 1 g/l die Biomasse- Produktion am meisten.
Schutzmittel, die vielversprechende Ergebnisse in den beiden ersten Schritten des Auswahlverfahrens zeigen, werden anschließend in einer Fermentation im Labormaßstab getestet, z.B. in einem 14-l-Chemap-Fermenter. Die Schutzmittel werden allgemein zuerst in den Fermentern bei einer Konzentration von 1 g/l getestet. Während der Versuchsläufe im Fermenter werden Proben entnommen, und es werden die Zellkonzentration, die Cellulose-Konzentration, die Ausbeute, die auf das Volumen bezogene Produktivität und die Verhältnisse Cellulose/Zellen bestimmt.
Die Polyacrylamid enthaltenden Polymere, die ein Gewichtsmittel des Molekulargewichts im Bereich von etwa 106 bis etwa 10&sup7; Dalton aufweisen, sind die am meisten wirksamen Schutzmittel, und Zellen, die in der Gegenwart der Polymere mit hohem Molekulargewicht kultiviert werden, zeigen die größten Anstiege der Cellulose-Ausbeute. Allgemein sind die am meisten wirksamen Polymere nicht-ionisch oder anionisch. Es wurde gefunden, daß stark kationische Polymere allgemein toxisch sind. Spezielle Beispiele von Polyacrylamid enthaltenden Polymeren, die die Cellulose-Ausbeute erhöhen, wenn sie bewegten Kulturen zugesetzt werden, schließen ein:
Magnifloc 833A ist ein anionisches Flokkulierungsmittel mit hohem Molekulargewicht, das hergestellt wird von der Firma American Cyanamid Company. Seine typischen Eigenschaften schließen ein:
Erscheinungsbild weißliches Granulatpulver
Grad an anionischer Ladung hoch
Schüttdichte 50 bis 56 lb/ft³ (800 bis 900 kg/m³)
pH-Wert einer 0,5 %igen Lösung bei 25 ºC (77 ºF) 7,5 bis 9,5
Viskosität* (in cps):
Anmerkung: * Brookfield Viskosimeter
Floxan EA-1340 ist eine anionische Polyacrylamid-Öl-in-Wasser-Emulsion, die hergestellt wird von der Firma Henkel Corporation. Ihre Zusammensetzung und ihre physikalischen Eigenschaften schließen ein:
Polytex-Polyacrylamide, die hergestellt werden von der Firma Tecna Corporation, sind Polyacrylamide mit hohem Molekulargewicht. Typische Eigenschaften dieser Produkte schließen ein:
Die von der Firma Hercules Incorporated hergestellten Reten -Polyacrylamide haben die folgenden Eigenschaften:
Anmerkung: (*) Nach Herstellerangaben; diese Werte können nicht als Spezifikationen der Produkte angesehen werden.
Die im Rahmen der Erfindung beschriebenen Experimente offenbaren, daß sich ein Kulturmedium, das mit dem in ihm enthaltenen, ein Polyacrylamid enthaltenden Polymer gelagert wird, im Laufe der Zeit verschlechtert. Der größte Anstieg der Cellulose-Ausbeute wird beobachtet, wenn das Schutzmittel dem Kulturmedium unmittelbar vor dem Gebrauch zugesetzt wird. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschriebenen Experimente offenbaren auch, daß eine Lagerung des Polyacrylamid enthaltenden Polymers in Form einer wäßrigen Lösung vor der Zugabe zu dem Kulturmedium das Vermögen des Schutzmittels zur Erhöhung der Cellulose-Ausbeute nicht negativ zu beeinträchtigen scheint.
Außerdem offenbaren die Experimente, daß eine Sterilisation des Schutzmittels in Gegenwart von Mais-Einweichflüssigkeit (corn steep liquor; CSL) signifikant das Vermögen des Schutzmittels zur Erhöhung der Cellulose-Ausbeute reduziert. Daher ist es bevorzugt, das gewünschte Schutzmittel unabhängig von der CSL zu sterilisieren und das Schutzmittel getrennt von dem Kulturmedium zu lagern.
Der effektive Bereich des pH-Wertes zum Kultivieren der Cellulose produzierenden Mikroorganismen gemäß der Erfindung liegt zwischen 4 und 6, wobei ein bevorzugter Bereich bei 4,5 bis 5,5 liegt, am meisten bevorzugt bei einem pH-Wert von 5,0. Der pH- Wert kann gesteuert werden mit Hilfe von Puffern wie beispielsweise Citrat oder 3,3- Dimethylglutarsäure (DMG), die dem Kulturmedium zugesetzt werden, oder mittels der Zugabe einer Base oder Säure zum Medium in einer Menge, die ausreichend ist, um den pH-Wert im gewünschten Bereich zu halten.
Um die Biomasse zu bestimmen, die nach einem der oben genannten Fermentationsverfahren produziert wurde, wird ein bekanntes Volumen der Brühe zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wird verworfen. Das Pellet wird erneut in 30 bis 40 ml kalter Kochsalz-Lösung suspendiert. Die resuspendierte Lösung wird dann 15 bis 25 min bei 10.000 bis 15.000 g (4 ºC) zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird abgenommen und verworfen. Diese Verfahrensfolge wird mit entionisiertem Wasser (bei Raumtemperatur) wiederholt. Das Pellet wird unter Vakuum bei 80 ºC 24 h lang getrocknet. Das getrocknete Pellet, das Cellulose und Zellen einschließt, wird gewogen. Die Biomasse ist definiert als Masse (in Gramm) getrockneter Cellulose und Zellen pro Volumen Brühe (in Liter).
Nach einem der oben genannten Fermentationsverfahren hergestellte Cellulose kann aus der Fermentationsbrühe unter Anwendung herkömmlicher Ernte- bzw. Gewinnungstechniken gewonnen werden. Allgemein kann jede Verfahrensweise zur Abtrennung der Cellulose aus der Brühe verwendet werden; ein Zentrifugieren ist jedoch bevorzugt. Jede Charge Fermentationsbrühe, die den Cellulose erzeugenden Mikroorganismus, gebrauchte Medien und Cellulosen enthält, wird zentrifugiert. Wenn die Cellulose-Konzentration zu berechnen ist, muß das Volumen des überstehenden Mediums bestimmt werden. Das überstehende Medium wird danach verworfen. Das Feststoffe einschließlich der Mikroorganismen und Cellulose umfassende Pellet wird aufgehoben. Das Pellet wird einige Male mit kalter Kochsalz-Lösung gewaschen, um Reste an Medium zu entfernen. Das aufgehobene Material wird mit einer Alkali-Lösung wie beispielsweise einer 0,1 M NaOH-Lösung oder KOH- Lösung bei 60 bis 65 ºC behandelt. Das mit Alkali behandelte Material wird anschließend zentrifugiert. Das Pellet wird für Cellulose-Messungen aufgehoben, und der Überstand wird zur Bestimmung der Zellkonzentration verwendet. Das Pellet wird drei- oder viermal mit entionisiertem Wasser gewaschen und zentrifugiert, in einem Vakuum-Ofen getrocknet und zur Bestimmung der Cellulose-Masse gewogen. Die Zellkonzentration wird aus der Proteinkonzentration im Überstand abgeschätzt, wobei Zellen mit 65 % Protein angenommen werden.
In den verschiedenen Beispielen, die nachfolgend angegeben werden, wird Bezug genommen auf bestimmte Messungen. Die unmittelbar nachfolgenden Definitionen beschreiben, wie die Messungen durchgeführt und die Zahlenwerte berechnet wurden.
Die auf das Volumen bezogene Produktivität ist definiert als Gesamtmasse Cellulose produziert pro Volumenmenge an eingesetztem Medium pro Einheit Fermentationszeit (g/l/h) von der Inokulation bis zum Ernten der Batch-Kulturen.
Die Cellulose-Ausbeute ist definiert als Änderung der Cellulose-Konzentration (g/l), dividiert durch die Menge an eingesetztem Substrat (g/l). Die Menge an eingesetztem Substrat kann gemessen werden zwischen zwei beliebigen Zeitpunkten.
Die korrigierte Ausbeute ist die Cellulose-Ausbeute, die hinsichflich der Menge an Substrat und/oder Produkt korrigiert wurde, die während der Fermentation zugesetzt oder abgenommen wurden. Eine Volumen-Korrektur wird auch in die Berechnung der korrigierten Ausbeute eingebracht.
Die im Hinblick auf diese Änderungen korrigierte Cellulose-Ausbeute kann berechnet werden unter Verwendung der folgenden Gleichung:
worin
G = Glucosemenge (g), die zwischen den Zeitpunkten ti-1 und ti zugesetzt wurde;
T = Zeit (h);
VF = Volumen des Fermenters (l);
S = Glucose-Konzentration (g/l);
P = Cellulose-Konzentration (g/l);
VS = Volumen der Probe (1) zwischen den Zeitpunkten ti-1 und ti;
VA = Flüssigkeitsvolumen (1) zwischen den Zeitpunkten ti-1 und ti (Glucose; Base und Mais-Einweichflüssigkeit (CSL)); und
Y = Cellulose-Ausbeute (g/g).
Polymere in ihrer einfachsten Form sind große Moleküle, die aufgebaut sind aus sich wiederholenden Monomereinheiten. Tausende von Monomereinheiten in einer einzelnen Polymereinheit können genauso wie Kettenglieder in einer Kette verknüpft sein. Beispielsweise dient das Monomeracrylamid (C&sub3;H&sub5;NO) als wiederkehrende Einheit von Polyacrylamid (C&sub3;H&sub5;NO)n, worin n 10.000 pro Molekül oder größer sein kann. Im allgemeinen ergeben Verfahrensweisen zur Messung des Molekulargewichts von Polymeren einen mittleren Wert. Diese Verfahrensweisen basieren auf konzentrationsbedingten Eigenschaften von Lösungen, die von der Wirkung her die Zahl von Molekülen in einer bekannten Material-Masse zählen und dadurch das Zahlenmittel des Molekulargewichts angeben, also Mn. Mn ist definiert durch die Gleichung
worin Ni die Zahl der Moleküle eines bestimmten Gewichts Mi ist.
Andere Verfahrensweisen der Bestimmung des Molekulargewichts wie beispielsweise di( Lichtstreuung dienen zur Messung des Beitrags eines Moleküls als einer Massenlunktion. Diese Verfahrensweisen liefern das Gewichtsmittel des Molekulargewichts, Mw, das wie nachfolgend definiert ist:
Die folgenden Beispiele werden zu Veranschaulichungszwecken angegeben, und es ist nicht beabsichtigt, mit diesen die Erfindung in irgendeiner Weise zu beschränken. In diesen Beispielen sind alle in Prozent angegebenen Angaben auf das Gewicht bezogene Angaben wenn die Angaben für Feststoffe gemacht werden, und auf das Volumen bezogene Angaben wenn sie für Flüssigkeiten gemacht werden. Alle Temperaturen sind in ºC angegeben solange dies nicht anderweitig angegeben ist.
In den folgenden Beispielen werden eine ganze Anzahl von Kulturmedien angegeben Solange nichts anderes angegeben ist, ist die Formulierung der Medien die folgende: Vitaminmischung
Die Zusammensetzung von Mais-Einweichflüssigkeit (corn steep liquor) variiert in Abhängigkeit vom Lieferanten und der Art der Behandlung. Eine typische Probe einer Mais- Einweichflüssigkeit (Typ E804), wie sie von der Firma Corn Products Unit, CPC North America, Stockton, Kalifornien, erhalten wurde, ist nachfolgend beschrieben:

Beispiel 1

Auswirkungen des Bewegens in Untersuchungen in Kolben

In dieser Studie wurde untersucht, ob unterschiedliche Bedingungen des Bewegens in Kolbe das Zellwachstum und die Cellulose-Produktion beeinflussen. Man ließ die Bakterienkeime in R70-3-Medien mit 0,5 %igen (w/v) Hefeextrakten (technische Qualitätsstufe) Amberex 1003, Firma Universal Foods (TYE), 30 g/l Glucose, 25 mM 3,3-Dimethylglutarsäure (DMG) und 0,1 % (v/v) Cellulase (Firma Genencor) wachsen. Cellulase wurde zugesetzt um die erzeugte Cellulose abzubauen und so zu ermöglichen, daß die Zellen in Form von Einzelzellen-Suspensionen wachsen. In der Stufe der Produktion wurde die Cellulase herausverdünnt, um eine Störung der Cellulose-Produktion zu verhindern. Ein eingefrorenes Röhrchen mit Acetobacter des Stamms 1306-21 wurde zum Inokulieren der Zuchtlösung verwendet (50 ml Medium in einem 250 ml-Flachboden-Kolben). Diese wurde dann über Nacht bei 30 ºC und 125 Upm inkubiert.
Das Basis-Medium für das Experiment war das Medium R70-3 mit 2 % (v/v) Mais- Einweichflüssigkeit (CSL), 10 g/l Glucose und 25 mM DMG. Untersuchungen bei Geschwindigkeiten von 125 und 200 Upm wurden durchgeführt mit Schüttlem, die eine Schüttelweite von 2 in hatten. Untersuchungen bei 375 Upm wurden durchgeführt mit einem New Brunswick-Schüttler mit einer Schüttelweite von 1 in. Die Kolben wurden von den Schüttlern zum Zeitpunkt 1 und 3 Tag(e) heruntergenommen und auf den Gehalt an Zellen und Cellulose analysiert.
Das Zellwachstum und die Cellulose-Produktion am Tag 3, der das Ende des Zellwachstums und der stationären Phase darstellt (bezogen auf den Glucoseverbrauch) sind in Tabelle 1 angegeben. Die Bedingungen des Bewegens haben einen starken Einfluß auf das Verhältnis Cellulose zu Zellen und auf die Cellulose-Ausbeute. Nach 3 Tagen des Inkubierens war das Zellwachstum ähnlich in den vier getesteten Systemen (ähnliche Zell-Ausbeute). Die Verhältnisse Cellulose zu Zellen sanken in der folgenden Reihenfolge:
125 Upm (ohne Einbauten) > 125 Upm > 200 Upm > 375 Upm. Der Beitrag der CSL zur Cellulose-Produktion auf 2 % CSL allein beträgt 0,48 g/l (Cellulose-Produktion auf 2 % CSL; ohne Glucose). Eine partielle Korrektur für diesen Effekt von CSL erfolgte durch Abziehen dieses Wertes bei den Cellulose-Ergebnissen. Die Cellulose-Ausbeute ist hoch bei niedriger Stufe der Bewegung (0,38 g/g) und niedrig bei hohem Wert der Bewegung (0,15 g/g). Die Reihenfolge der Cellulose-Ausbeutewerte war: 125 Upm (ohne Einbauten) > 125 Upm > 200 Upm > 375 Upm. Tabelle 1 Auswirkung des Bewegens auf die Cellulose-Ausbeute und das Zellwachstum (Stamm 1306-21 in R70-3 plus 2 % CSL, 25 mM DMG und 1 % Glucose; Ergebnisse am Tag 3)
Anmerkungen: (a) ND = nicht bestimmbar (0,2 g/l)
(b) unter der Annahme, daß 0,48 g/l Cellulose aus 2 % CSL hergestellt wurden.
Die Masse in den mit einer Geschwindigkeit von 125 Upm bewegten, keine Einbauten aufweisenden Kolben wuchs in Form recht großer Pellets (2 bis 5 mm) am ersten Tag. Diese aggregierten zu einem einzigen großen Klumpen am zweiten Tag. Die Struktur des Klumpens war eine recht lockere Aggregation der kleineren Pellets, so daß vielleicht Nährstoffe in dem Medium in den Klumpen durch Konvektionsströme eintreten könnten. Dei mit einer Geschwindigkeit von 125 Upm bewegte Kolben mit Einbauten zeigte die Erzeugung kleinerer Pellets einer Größe von etwa 1 bis 2 mm; es gab jedoch auch wenige größere Pellets. Die Pellets in dem mit 200 Upm gerührten, mit Einbauten versehenen Kolben waren kleiner und scheinen weniger gut definiert zu sein. Die Masse in dem mit 375 Upm bewegten Kolben enthielt einige wenige kleine Pellets; die Mehrheit des Materials hatte jedoch ein Trümmer-ähnliches Erscheinungsbild (0,5 bis 1 nm).
Diese Untersuchung zeigte, daß die Bedingungen des Bewegens einen sehr starken Einfluß auf die Cellulose-Produktion, das Verhältnis Cellulose zu Zellen und die Cellulose-Ausbeute haben. Dieses System wurde - wie unten beschrieben - verwendet, um die Auswirkungen von Schutzmitteln auf die Pelletform und die Auswirkungen von Scherung auf die Cellulose- Ausbeute und -Produktivität zu testen.

Beispiel 2

Erster Screening-Test von Schutzmitteln

Die hier beschriebenen Untersuchungen schließen einen Überblick über potentielle Schutzmittel gegen Belastung durch Scherung und eine Bewertung der am meisten wirksamen Schutzmittel ein.
Es wurden vier getrennte Experimente mit 25 ml Medium in 125 ml-Flachboden-Kolben durchgeführt. Das Basis-Medium für alle Experimente war R70-3 plus 2 % CSL, 10 g/l Glucose und 25 mM DMG. Experiment B enthielt 0,05 % Polypropylenglycol (als Antischaummittel), und die Experimente C und D enthielten 0,05 ml/l Tween 80 zur Reduzierung von Wachstum an den Wandungen der Kolben.
Es wurde dasselbe Züchtungsverfahren durchgeführt, wie es in Beispiel 1 offenbart ist.
Die Stärke des Wachstums in jedem Experiment wurde durch Messungen der Biomasse bestimmt, die durchgeführt wurden, nachdem die Kolben 3 Tage lang bei 30 ºC und 375 Upm (Schüttelweite: 1 in) inkubiert worden waren. Dies entspricht dem Ende des Wachstums in einem durch Glucose limitierten Medium. Die mit 125 Upm bewegten Kontrollkolben wurden bei 30 ºC auf einem Schüttler mit einer Schüttelweite von 2 in inkubiert.
Für Experiment A wurden die Schutzmittel entweder separat sterilisiert und aseptisch zugegeben, oder sie wurden dem Medium zugesetzt, bevor dieses sterilfiltriert wurde. Für die Experimente B, C und D wurden die Schutzmittel mit dem Medium autoklaviert. Die geeignete Materialmenge wurde in eine leere Milch-Verdünnungsflasche gefüllt, und es wurden Citrat, KH&sub2;PO&sup4;, (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, MgSO&sub4; und entionisiertes Wasser zugesetzt. Der pH- Wert wurde mit HCL auf 5 eingestellt, und die Lösungen wurden autoklaviert. Die Vitamine, Spurenmetalle, CSL, DMG und Glucose wurden aseptisch zugesetzt. Diese Vorgehensweise war nötig, da sich viele der in den Experimenten B, C und D getesteten Substanzen in den für den Test eingesetzten Konzentrationen nicht sterilfiltrieren lassen.
Es wurden die folgenden Substanzen getestet:
- Agar (Rohflocken-Agar der Firma Meer Corporation); in Mengen von 2 g/l mit dem Medium autoklaviert;
- Alginsäure (Firma Sigma); in einer Menge von 1 g/l dem Medium zugesetzt und für Experiment A sterilfiltriert; in Mengen von 1 und 5 gil mit dem Medium in Experiment B autoklaviert;
- Alginsäure (Firma Atomergic Chemetals Corp.) 10 %ige (w/v) Lösung, die autoklaviert und aseptisch zugesetzt wurde; die getesteten Konzentrationen waren 1 und 5 g/l (Alginsäure ist die deutsche Bezeichnung für alginic acid);
- Carbopol 934P (Firma B.F. Goodrich); in Mengen von 1 und 3 g/l mit dem Medium autoklaviert;
Carboxymethylcellulose (Firma Sigma); in Mengen von 1 und 5 g/l mit dem Medium autoklaviert;
- Guar-Gummi (Firma Sigma); in Mengen von 1 und 5 g/l mit dem Medium autoklaviert;
- Xanthan-Gummi (Firma Sigma); in Mengen von 1 und 5 g/l mit dem Medium autoklaviert;
- Gummi arabicum (Firma Atomergic Chemetal Corp.); in Mengen von 1 und 5 g/l mit dem Medium autoklaviert;
- Indulin AT (Firma Westvaco Chemical); als 10 %ige (w/v) Lösung autoklaviert und aseptisch zugesetzt; die getesteten Konzentrationen waren 1 und 5 g/l (Indulin AT ist ein Lignin-Polymer);
- Maltose (Firma Sigma); in Mengen von 1 und 5 g/l dem Medium zugesetzt und sterilfiltriert;
- Methylcellulose; in Form einer 10 %igen Vorrats-Lösung autoklaviert und aseptisch zugesetzt; die Konzentrationen im Test waren 1 und 5 g/l;
- Pektinsäure (Firma Atomergic Chemetals Corp.); in Mengen von 1 und 5 g/l mit dem Medium autoklaviert;
- Pluronic; in Form einer 10 %igen (w/v) Vorrats-Lösung sterilfiltriert und aseptisch zugesetzt; die getesteten Konzentrationen waren 1 und 5 g/l;
- Polyethylenglykol (Molekulargewicht 6.000; Firma BDH Chemicals); dem Medium zugesetzt und sterilfiltriert; die getesteten Konzentrationen waren 1 und 5 g/l;
- Polyethylenoxid (Molekulargewicht 100.000; Firma Aldrich); in Mengen von 0,3 und 3,0 g/1 mit dem Medium autoklaviert;
- Polygalacturonsäure (Firma Atomergic Chemetals Corp.); in Mengen von 1 und 5 g/l mit dem Medium autoklaviert (Polygalacturonsäure ist der deutsche Name für polygalacturonic acid);
- Polyvinylalkohol (Typ II; Firma Sigma); dem Medium zugesetzt und sterilfiltriert; die Konzentrationen im Test waren 1 und 5 g/l;
- Kartoffelstärke (Firma Kalamazoo Paper Chemicals); in Mengen von 1 und 5 g/l mit dem Medium autoklaviert;
- Kartoffelprotein (Firma Kalamazoo Paper Chemicals); in Mengen von 1 und 5 g/l mit dem Medium autoklaviert;
- Reten 210 (Firma Hercules, Inc.); in Mengen von 0,1 und 1,0 g/l mit dem Medium autoklaviert (Reten 210 ist ein kationisches Copolymer aus Acrylamid und einem quaternären Ammonium-Monomersalz);
- Reten 420 (Firma Hercules, Inc.); in Mengen von 0,1 und 1,0 g/l mit dem Medium autoklaviert (Reten 420 ist ein nicht-ionisches Polyacrylamid);
- Reten 423 (Firma Hercules, Inc.); in Mengen von 0,1 und 1,0 g/l mit dem Medium autoklaviert (Reten 423 ist ein anionisches Copolymer von Natriumacrylat und Acrylamid);
- Traganth (Firma Atomergic Chemetals Corp.); in Mengen von 1 und 5 g/l mit dem Medium autoklaviert (Traganth ist der deutsche Name für tragacanth gum);
- Tween 80 (Firma Sigma); sterilfiltriert und aseptisch zugesetzt (0,05 bis 5 ml/l);
- Molke (Firma Sheffield); in Mengen von 1 und 5 g/l mit dem Medium autoklaviert
- Xylan (Firma Sigma); in Mengen von 1 und 5 g/l mit dem Medium autoklaviert.
In den vier Experimenten waren die für die Biomasse ermittelten Werte der Kontrolle bei einer Schüttelgeschwindigkeit von 375 Upm miteinander in Übereinstimmung (der Bereich war 2,96 bis 3,13 g/l). Die zur Kontrolle eingesetzten Kolben bei Umdrehungsgeschwindigkeiten von 125 Upm ergaben üblicherweise Werte um 4,8 bis 5,0 g/l; lediglich Experiment B zeigte einen Wert von 4,34 g/l. Die Störung durch unlösliche Komponenten im Medium in Bezug auf die Werte der Biomasse wurde für einige der Systeme bestimmt. Das sterile Medium wurde zentrifugiert, und das Pellet wurde gewaschen und in dem Vakuum-Ofen getrocknet. Das Gewicht des Materials wurde von dem Gewicht der Biomasse abgezogen. Dieser Wert wird als korrigierter Wert der Biomasse bezeichnet.
Tabelle 2 ist eine summarische Tabelle aller vier Experimente.
Der End-pH-Wert der 5 g/l Alginsäure und 3 g/l Carbopol enthaltenden Kolben war 4,2 bzw. 4,5. Der End-pH-Wert in allen anderen Kolben lag im Bereich von 4,7 bis 5,2. Daher schien es, daß der pH-Wert kein signifikanter Faktor in einem der Experimente war.
Tabelle 2 zeigt, daß die Reten -Polyacrylamide und Xanthan-Gummi die höchsten Werte der Stimulation ergaben. Die Polymere Reten 423 und Reten 420 ergaben die höchsten Werte der Biomasse-Produktion (die Werte der Biomasse waren ähnlich den Kontrollwerten der Versuche bei 125 Upm). Tabelle 2 Summarische Zusammenfassung der Screening-Versuche für Schutzmittel (R703 plus 2 % CSL und 10 g/l Glucose; Ergebnisse am Tag 3 bei 375 Upm)
Anmerkung: * Biomasse-Werte korrigiert um die von dem Schutzmittel stammende Fällung

Beispiel 3

Zusätzliche Screening-Untersuchung an Schutzmitteln

Die in diesem Beispiel beschriebenen Untersuchungen schließen einen weiteren Überblick über Polyacrylamid-Schutzmittel (Experiment A) und die Ermittlung der am meisten wirksamen Schutzmittel aus dieser Untersuchung (Experiment B) ein.
Beide Experiment-Reihen wurden in 125 ml Flachboden-Kolben durchgeführt, die bei 30 ºC inkubiert und bei 375 Upm (Schüttelweite 1 in) bewegt wurden.
Das Medium war R70-3 plus 2 % (v/v) CSL, 10 g/l Glucose, 25 mM DMG und 0,05 % (v/v) Tween 80. Die einzelnen Komponenten wurden in Flaschen eingewogen, und Lösungen der Haupt-Salze wurden zugesetzt (Citrat, KH&sub2;PO&sub4;, MgSO&sub4;, (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;). Die Lösungen wurden 20 min autoklaviert, und danach wurden die anderen Komponenten aseptisch zugesetzt (CSL, DMG, Spurensalze, Vitamine, Tween 80, Glucose). Das Tween 80 war in dem Medium zugegen, um ein Verhindern des Wachstums an den Wandungen in den Kolben zu unterstützen. Das Medium wurde dann in 125 ml-Flachboden-Kolben verteilt.
Das Beimpfungsverfahren erfolgte in der gleichen Weise, wie dies in Beispiel 1 offenbart ist.
Der Stamm 1306-21 wurde für beide Experimente verwendet. Der Impfkolben wurde mit einem gefrorenen Röhrchen des Stammes 1306-21 inokuliert und über Nacht bei 30 ºC und einer Geschwindigkeit von 125 Upm (Schüttelweite: 2 in) inkubiert. Das Impfmedium war R70-3 plus 0,5 % (w/v) TYE, 30 g/1 Glucose, 25 mM DMG und 0,1 % (v/v) Cellulase (Firma Genencor). Jeder Testkolben wurde mit 5 % inokuliert. Die Kolben wurden 3 Tage lang bei 30 ºC und 375 Upm (Schütteiweite: 1 in) inkubiert. Die Glucose-Konzentration wurde unter Verwendung des Instruments Yellow Spring Instrument (YSI) am dritten Tag gemessen, und alle Kolben hatten eine Glucose-Konzentration von 0,1 g/l oder weniger.
Alle Polyacrylamide wurden in einer Konzentration von 0,4 g/l in Experiment A getestet. In Experiment B, d.h. der Kalibrierungsuntersuchung, wurden die am meisten versprechenden Polyacrylamid-Schutzmittel aus Experiment A in Konzentrationen von 0,2, 0,4 und 1,0 g/l getestet, um ihre am höchsten wirksame Konzentration abzuschätzen.
Die Ergebnisse von Experiment A sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Überblick über den Einfluß der Schutzmittel auf die Biomasse-Produktion von Stamm 1306-21 (in R70-3 plus 2 % CSL, 10 g/l Glucose, 0,05 % Tween 80 und 0,4 g/l Polyacrylamid-Schutzmittel; Ergebnisse am Tag 3 bei 375 Upm)
Anmerkung: * Einzelkolben
Tabelle 3 zeigt, daß die getesteten anionischen Polyacrylamide (Reten 423 und Magnifloc 833A) die Biomasse-Produktion in größtem Umfang verstärkten. Von den getesteten nichtionischen Polyacrylamiden verstärkten ohne Ausnahme die Produkte Reten 420, Magnifloc 985N, Cyanamer N-300 und das nicht-ionische Polyacrylamid der Firma Aldrich die Biomasse-Produktion.
Die Ergebnisse von Experiment B, dem Kalibrationsexperiment, sind nachfolgend gezeigt. Tabelle 4 Abgleich der Schutzmittel mit der Biomasse-Produktion beim Stamm 1306-21 (in R70-3 plus 27 % CSL, 10 g/l Glucose, 0,05 % Tween 80 und Polyacrylamid-Schutzniittel; Ergebnisse am Tag 3 bei 375 Upm)
Anmerkung: * Das Medium wurde für ungefahr 35 Tage gelagert, wobei das Schutzmittel darin enthalten war.
Wie die Angaben in Tabelle 4 veranschaulichen, erscheint die bevorzugte Konzentration für die Polyacrylamid-Schutzmittel in den im Kolben angesetzten Kulturen nahe bei 1 g/l zu sein. Außerdem sind auch die Produkte Polytec 31 und Polytec 36 als Schutzmittel wirksam.
Es wurden noch weitere Screening-Tests durchgeführt. Die Ergebnisse all dieser Screening- Tests, in denen verschiedene Schutzmittel bei einer Konzentration von 0,4 g/l getestet wurden, sind in Tabelle 5 zusammengestellt. Die Biomasse-Werte sind ausgedrückt als Prozentwert der Biomasse-Meßwerte des Kontrollwertes bei 125 Upm. Mehrfache Angaben von Biomasse-Werten für ein Schutzmittel zeigen an, daß mehrere Experimente durchgeführt wurden. Tabelle 5 Vergleich von Schutzinitteln: Auswirkung auf die Biomasse-Produktion, auf die ionische Klassifikation und das Molekulargewicht Fortsetzung Tabelle 5
Anmerkungen: (a) die Klassifikation der lonizität basiert auf den Angaben der Hersteller;
(b) die Angaben des Molekulargewichts basieren entweder auf den Spezifikationen der Hersteller oder auf eigenen Messungen für das Gewichtsmittel des Molkulargewichts.
Die nicht-ionischen Polyacrylamide scheinen allgemein gute Schutzmittel zu sein. Fermentationsprozesse, die in Gegenwart nicht-jonischer Polyacrylamide durchgeführt und bei 375 Upm bewegt wurden, hatten allgemein Biomasse-Konzentrationen von 82 bis 91 % der Biomasse-Konzentration des Kontrollwertes bei 125 Upm. Fermentationsverfahren, die ohne Schutzmittel durchgeführt und bei 375 Upm bewegt wurden, hatten Biomasse- Konzentrationen von nur 58 bis 61 % der Werte der Biomasse-Konzentration des Kontrollwertes bei 125 Upm.
Es bestanden erhebliche Schwankungen im Vermögen der anionischen Polyacrylamide, die Biomasse-Produktion bei hohen Bewegungsgeschwindigkeiten zu steigern. Fermentationsverfahren, die in Gegenwart anionischer Polyacrylamide durchgeführt wurden, ergaben Biomasse-Konzentrationen, die im Bereich von 62 bis 105 % der Werte der Biomasse- Konzentrationen für die Kontrolifermentation bei 125 Upm lagen.
Allgemein scheinen Polymere mit hohem Molekulargewicht bessere Schutzmittel zu sein. Außerdem sind kationische Polyacrylamide mit niedrigem Molekulargewicht und mit hoher und mittlerer kationischer Ladung allgemein keine guten Schutzmittel.

Beispiel 4

Auswirkungen der Polyacrylamid-Schutzmittel bei der Hochdichte-Fermentation

Experiment A:

Es war bereits vorher gezeigt worden, daß die Produkte Reten 420 und Reten 423 die Biomasse-Produktion erhöhen, wenn sie Fermentationsverfahren von Acetobacter im Kolben zugesetzt wurden. Die vorliegende Untersuchung wurde mit dem Ziel angelegt, zu untersuchen, ob die Cellulose-Ausbeuten durch Verwendung dieser Polyacrylamide in der Hochdichte-Fermentation erhöht werden können.
Das Medium, das zum Züchten der Vorstufen der Mikroorganismen und der Mikroorganismen verwendet wurde, war das Medium R70-3 mit 0,5 % (w/v) TYE, 3 % (w/v) Glucose, 25 mM DMG, 0,05 % Schauminhibitor (Polypropylenglykol) und 0,10 % (v/v) Cellulase (Firma Genencor). Für jeden 2.000 ml-Kolben wurden 350 ml Medium verwendet.
Für die Mikroorganismen-Vorstufen wurde ein Kolben mit einem eingefrorenen Röhrchen (ungefähr 1,8 ml) Vorrats-Lösung inokuliert. Der Kolben wurde bei 30 º C und 125 Upm in einem Inkubator mit einer Schüttelweite von 2 in 1 Tag lang inkubiert.
Für die Mikroorganismen wurde jeder Kolben mit 35 ml der Vorstufen-Kultur inokuliert und bei 30 ºC 125 Upm 1 Tag lang inkubiert. Diese Mikroorganismen-Kulturen ergaben bei OD&sub6;&sub8;&sub0;-Messungen einen Wert von 1,5 bis 2.
Das Medium für die Fermenter-Versuche war das Medium R70-3 plus 3 % Glucose und 4 % (v/v) CSL. Die CSL wurde vor dem Gebrauch mit NaOH auf einen pH-Wert von 5, titriert und zentrifugiert, um unlösliche Substanzen zu entfernen. Die anfangliche Konzentration an (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; betrug 12,5 mM. Glucose, Vitamine und Spurenelemente wurden separat sterilisiert. Sofern Schutzmittel zugegeben wurden, wurden diese mit dem Medium sterilisiert. Die Konzentrationen an Glucose und Ammoniak wurden während der Versuchsläufe durch Zugaben während der Fermentation bei Uberschuß-Werten gehalten. Der pH-Wert wurde durch automatische Zugabe von 4 N H&sub2;SO&sub4; oder 4 N NH&sub4;OH bei 5,0 eingesteuert. Die Zugabe von Glucose wurde an die Anforderung für Base gekoppelt, wofür ein ungefahres Verhältnis von 1 g Glucose zu 1,2 Mol Base angewendet wurde.
Die Menge an verwendetem Inokulum betrug etwa 4 % (v/v).
Die verwendeten Fermenter waren 14 l Chemap-Fermenter, die mit Rushton-Flügelrührern ausgestattet waren. Die Temperatur wurde auf 30 ºC gesteuert. Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff wurde auf 60 % der Luftsättigung eingestellt. Das Bewegen erfolgte manuell kontrolliert, um so für eine adequate Durchmischung zu sorgen, und lag im Bereich von 600 Upm (zu Beginn) bis 1.200 Upm in Richtung auf das Ende des Reaktionslaufs. Die Belüftung wurde nach Bedarf kontrolliert mit an Sauerstoff angereicherter Luft.
In den ein Schutzmittel enthaltenden Fermentern wurde 1 g/l Reten 420 oder Reten 423 vor der Sterilisation zugesetzt. Die Sterilisationszeit betrug 45 min.
Tabelle 6 faßt summarisch die Ergebnisse dieser Untersuchung zusammen. Tabelle 6 Auswirkung der Gegenwart von Reten 420 und Reten 423 im Fennentationsmedium (Stamm 1306-21 in R703 plus 4 % CSL)
Der Zusatz der Polyacrylamide Reten 420 und Reten 423 zum Fermentationsmedium erhöhte die Cellulose-Ausbeute und die auf das Volumen bezogene Produktivität.
Beide Reten -Versuche ergaben am Ende Cellulose-Ausbeuten von 0,20 g/g. Dieser Wert ist geringfügig höher als der Wert des Kontroll-Laufs. Die Ausbeuten bei den Reten enthaltenden Durchläufen waren bei mittleren Cellulose-Konzentrationen höher als die Ausbeute bei dem Kontroll-Lauf. Der 1 g/l Reten 420 enthaltende Durchlauf ergab eine Ausbeute von 0,24 bis 0,25 g/g bis zu 8,3 g/l Cellulose, bevor sie auf 0,20 g/g abfiel. Der Durchlauf mit 1 g/l Reten 423 ergab eine Ausbeute von 0,27 g/g bei 6,9 g/l Cellulose. Die auf das Volumen bezogene Cellulose-Produktivität am Ende dieser Durchläufe betrug 0,30 g/l/h beim Kontroliwert und 0,36 g/l/h bei Reten 420 und Reten 423.

Experiment B:

Dieses Experiment wurde angelegt zur Abschätzung der Auswirkung von Magnifloc 833A Polytec 31 und Polytec 36 auf die Cellulose-Produktion bei der Hochdichte-Fermentation. Das Medium und die Mikroorganismen-Herstellung waren dieselben wie diejenigen, wie sie für Experiment A offenbart wurden. Die Polyacrylamide wurden in einer Konzentration voll 1 g/l getestet. Jedes von Ihnen wurde dem jeweiligen Fermenter vor der Sterilisation zugesetzt.
Die CSL wurde dem Fermenter nach den Schutzmitteln zugesetzt. Die Brühe wurde dann nach dem Standard-Protokoll sterilisiert.
Die Ergebnisse sind summarisch in Tabelle 7 zusammengefaßt. Tabelle 7 Auswirkungen von Magnfloc 833A, Polytec 31 und Polytec 36 im Fermentationsmedium (Stamm 1306-21 in R70-3 plus 46 % CSL)
Anmerkung: Die Kontrollwerte sind in Tabelle 6 angegeben
Die Zugabe der Polyacrylamide Magnifloc 833A, Polytec 31 und Polytec 36 zum Fermentationsmedium erhöhte die Cellulose-Ausbeute bei hohen Cellulose-Konzentrationen. Zum Kontroll-Lauf wird auf Tabelle 6 verwiesen. Das Bewegungs-Protokoll, das für den Kontroll-Lauf verwendet wurde, war ähnlich dem, das im Zusammenhang mit Polytec 31 und Polytec 36 verwendet wurde. Die auf das Volumen bezogene Cellulose-Produktivität war in jedem der Fermenter, der ein Polyacrylamid enthielt, höher als in dem Kontroll Fermenter, in dem kein Polyacrylamid zugegen war. Die Zugabe von Magnifloc 833A verbesserte auch die Durchmischungs-Eigenschaften der Brühe, wie sich aus dem Vermögen zur Aufrechterhaltung einer effektiven Durchmischung bei niedrigen Bewegungsgeschwindigkeiten (in Upm) ergibt. Weitere Untersuchungen mit Magnifloc 833A zeigten, daß dit Ergebnisse im Hinblick auf die Cellulose-Ausbeute und die Produktivität schwanken können (siehe Tabelle 9).

Beispiel 5

Auswirkungen von Floxan EA-1340 auf die Cellulose-Produktion bei der Hochdichte-Fermentation

In dieser Untersuchung wurde die Auswirkung verschiedener Konzentrationen des Polyacrylamid-Schutzmittels Floxan EA-1340 auf die Cellulose-Produktion bei der Hochdichte-Fermentation untersucht Floxan EA-1340 ist ein anionisches Polyacrylamid in einer Öl-in-Wasser-Emulsion.
Man züchtete eine Vorstufe und Mikroorganismen des Stammes 1306-21 auf Standard- Cellulose für diese Fermentations-Experimente. Es wurde ebenfalls ein Standard-Fermentationsmedium verwendet.
Das Produkt Floxan EA-1340 wurde in Konzentrationen von etwa 0,5, 1 und 3 g/l und wurde jedem Fermenter vor dem Sterilisieren zugesetzt. In den Testläufen, in denen Floxan EA-1340 in Konzentrationen von 0,5 und 1 g/l enthalten war, wurde das Floxan dem bei Raumtemperatur befindlichen Medium zugesetzt. In dem Tesflauf, der 3 g/l Floxan EA- 1340 enthielt, wurde das Polyacrylamid zugesetzt, nachdem das Medium auf 40 ºC erhitzt worden war. Ein PPG-Schauminhibitor (5 ml) wurde den 0,5 g/l und 3 g/l Floxan enthaltenden Durchläufen vor dem Sterilisieren zugesetzt. 10 ml Dow B-Schauminhibitor wurden allen drei Fermentern zum Zeitpunkt 11,4 h zugesetzt. Tabelle 8 stellt summarisch die Ergebnisse aller dieser Durchläufe zusammen. Tabelle 8 Bewertung von Floxan EA-1340 in dem Fermentationsmedium (Stamm 1306-21 in R70-3 plus 4 % CSL)
Figur 1 zeigt den Auftrag der Cellulose-Konzentration gegen die Zeit für Fermentationsversuche, die in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von Floxan EA-1340 durchgeführt wurden. Wie in Tabelle 8 und in Figur 1 gezeigt ist, erhöhten die Zugaben von Floxan EA- 1340 in Mengen von 0,5,1,0 und 3 g/l die Cellulose-Ausbeute bei moderaten und hohen Cellulose-Konzentrationen. Die auf das Volumen bezogene Cellulose-Produktivität in Gegenwart von 0,5 und 1,0 g/l Floxan EA-1340 war signifikant höher als der Kontroll-Wert ohne Floxan EA-1340. Bei Floxan EA-1340-Konzentrationen von etwa 3 g/1 traten ernsthafte Durchmischungsprobleme im späteren Teil des Durchlaufs in dem Fermenter auf Etwa 1,0 g/1 Floxan EA-1340 scheint eine optimale Konzentration zu sein, da bei dieser Konzentration die Cellulose-Ausbeute und die auf das Volumen bezogene Produktivität erhöht sind, während behindernde Durchmischungsprobleme vermieden werden.
Tabelle 9 zeigt eine Zusammenstellung der Daten für alle Schutzmittel, die in Chemap Fermentern getestet wurden. Ein Vergleich erfolgte bei verschiedenen Konzentrationen, in Mischungen oder unter Anwendungen unterschiedlicher Sterilisationsverfahren; d.h. CSL wurde separat von dem Schutzmittel sterilisiert. Die auf das Volumen bezogene Produktivität wurde berechnet unter der Annahme einer anfänglichen Zellkonzentration von 1 g/l. Dies erfolgte zur Normierung der Ergebnisse der verschiedenen Durchläufe auf dieselbe Größe des Inokulums. Tabelle 9 Auswirkungen der Schutzmittel auf die Cellulose-Produktion bei der Hochdichte-Fermentation Fortsetzung der Tabelle 9
Reten 423, Polytec 36, Reten 420, Polytec 31 und Floxan EC-2000 schienen die Cellulose-Ausbeute und -Produktivität zu erhöhen. Die Wirkung von Magnifloc 833A auf die Cellulose-Ausbeute und -Produktivität schwankt. Die konsistente Wirkung bei diesem Schutzmittel ist die Verbesserung der Durchmischungs-Eigenschaften der Brühe. Cyanamer P-21 und Magnifloc 985N haben keine signifikante Wirkung auf die Cellulose-Ausbeute und -Produktivität. Floxan EA-1340 ergab die besten Ergebnisse im Hinblick auf die Cellulose- Ausbeute und -Produktivität. Ein Sterilisieren des Floxan-Polyacrylamids getrennt von der CSL erhöht die Cellulose-Ausbeute (beschrieben in Beispiel 7). Mischungen der Polyacrylamide Floxafle EA-1340 und Magnifloc 833A erhöhten die Cellulose-Ausbeute und -Produktivität nicht auf Werte, die mit dem Polyacrylamid Floxan EA-1340 allein erhalten worden waren. Jedoch wurden die Durchmischungs-Eigenschaften mit diesen Mischungen von Schutzmitteln gegenüber denen bei Verwendung des Polyacrylamids Floxan EA-1340 allein verbessert. Allgemein waren die Ergebnisse der Tests im Fermenter konsistent mit den Ergebnissen der Screening-Tests im Kolben (siehe Tabelle 5) und bestätigen die Relevanz der Screening-Tests im Kolben.

Beispiel 6

Analyse der Polyacrylamide

Die Konzentration der nicht-ionischen, anionischen und kationischen Polyacrylamide wurde durch Größenausschluß-Chromatographie unter Verwendung einer 7,6 x 300 mm TSK-Säule gemessen, die mit 17 µm großen Kugeln aus G6000PW bis G3000PW gepackt war. Proben mit einer Menge von etwa 50 µl wurden in die Säule injiziert und mit einer Geschwindigkeit von 1,0 ml/min mit 0,2 M Na&sub2;SO&sub4; eluiert. Der Nachweis erfolgte durch UV-Absorption bei 200 nm.
Die in Tabelle 10 präsentierten Daten zeigen, daß eine signifikante Reduktion des Gewichtsmittels des Molekulargewichts und des Zahlenmitteis des Molekulargewichts von Polyacrylamiden nach der Sterilisation in Gegenwart der Haupt-Salze des R70-3-Mediums plus 4 % CSL auftreten. Keine Reduktion des Gewichtsmittels des Molekulargewichts oder des Zahlenmittels des Molekülargewichts von Floxan EA-1340 wurde während der Sterilisation in Wasser bei einem pH-Wert von 5,0 beobachtet. Tabelle 10 Wirkung der Sterilisation auf das Molekulargewicht der Polyacrylamide
Anmerkung: * Die Polyacrylamide wurden sterilisiert in Fermentern in Gegenwart der Hauptsalze des R70-3-Mediums plus 4 % CSL. Das Sterilisationsverfahren ist in Beispiel 4 gezeigt.

Beispiel 7

Einfluß des Alters des Mediums, des Alters der Floxan EA-1340-Lösung und der Sterilisationsverfahren auf die Biomasse-Produktion

Die Ziele dieser Untersuchung waren, die Auswirkungen des Alters des Mediums, des Alters der Floxan -Lösungen und der Sterilisationsverfahren auf das Vermögen von Floxan EA- 1340 zur Erhöhung der Biomasse-Produktion zu untersuchen.
Alle Experimente wurden in dem Medium R70-3 mit 2 % (v/v) CSL, 10 g/l Glucose, 25 mM DMG und 0,005 % (v/v) Tween 80 durchgeführt. Solange nichts anderes angegeben ist, war die Konzentration von Floxan EA-1340 in jedem Experiment 1 g/l.
Der Stamm 1306-21 wurde für jedes Experiment verwendet, und alle Vorstufen-Kulturen und Hauptkulturen wurden in dem Medium R70-3 plus 0,5 % (w/v) TYE, 30 g/l Glucose, 25 mM DMG und 0,1 % (v/v) Cellulase (Firma Genencor) durchgeführt.
Im Experiment A wurden die Auswirkungen des Alters des Mediums auf die Biomasse- Produktion untersucht. Die Werte für die Biomasse wurden verglichen bei Versuchen mit Kulturen, die in frischem Medium gezüchtet worden waren (mit und ohne Schutzmittel) und die in einem 35 Tage alten Medium gezüchtet worden waren (mit und ohne Schutzmittel).
Die Ergebnisse sind nachfolgend summarisch zusammengefaßt. Tabelle 11 Wirkung des Alters des Mediums auf die Biomass-Produktion des Stamms 1306-21 (in R70-3 plus 2 % CSL und 10 g/l Glucose; Ergebnisse am Tag 3 bei 375 Upm)
Anmerkung: * Dasselbe Medium wurde in beiden Experimenten verwendet.
Experiment A zeigte, daß das Medium, das mit Floxan EA-1340 darin gelagert wurde, mit der Zeit verschlechtert wurde, während keine Verschlechterung beobachtet wurde bei dem Medium ohne Floxan EA-1340.
In Experiment B wurde die Wirkung der Sterilisation des Schutzmittels in Gegenwart verschiedener Komponenten des Mediums getestet. Das Standard-Protokoll, das in früheren Experimenten verwendet wurde, bestand darin, das Floxan EA-1340 in Gegenwart der vier Hauptsalze (Citrat, KH&sub2;PO&sub4;, (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; und MgSO&sub4;) zu autoklavieren und danach die CSL, Spurensalze, DMG usw. in Form steriler Zusätze zuzugeben. In diesem Experiment wurde Floxan EA-1340 mit verschiedenen Komponenten des Mediums autoklaviert und dann im Hinblick auf sein Vermögen zur Erhöhung der Cellulose-Ausbeute getestet. Im Experiment B wurden 0,4 g/l Floxan EA-1340 verwendet, und alle Medien waren einen Tag alt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 angegeben. Tabelle 12 Wirkung der Sterilisation des Schutzniittels auf die Biomasse-Produktion (Stamm 1306-21 in R70-3 plus 2 % CSL, 10 g/l Glucose und 0,4 g/l Floxan EA-1340; Ergebnisse am Tag 3 bei 375 Upm)
Experiment B zeigt, daß ein Sterilisieren des Floxans in Gegenwart von CSL eine signifikante Verringerung des Vermögens des Schutzmittels hervorruft, die Cellulose- Produktion zu verstarken. Floxan , das in Gegenwart von Salzen sterilisiert wurde, scheint das Vermögen zur Erhöhung der Biomasse-Produktion zu erhalten.
Im Experiment C wurde die Wirkung des Alters der Floxan EA-1340-Lösungen auf die Biomasse-Produktion getestet. Floxan EA-1340-Lösungen wurden hergestellt und sterilisiert und man ließ sie über verschiedene Zeiträume altern, bevor man sie in Fermentationsprozessen in Kolben verwendete. Tabelle 13 zeigt die Ergebnisse dieses Experiments. Tabelle 13 Auswirkung des Alters der Schutzniittel-Lösungen auf die Biomasse-Produktion (Stamm 1306-21 in R70-3 plus 2 % CSL, 10 g/l Glucose und 1 g/l Floxan EA-1340; Ergebnisse vom Tag 3 bei 375 Upm)
Das Vermögen von Floxan EA-1340 zur Verstärkung der Biomasse-Produktion wurde nicht verringert bei Lagerung des Floxans in einer wäßrigen Lösung. Die Kulturen, denen die älteren Schutzmittel-Lösungen zugesetzt wurden, ergaben leicht höhere Meßwerte der Biomasse als die Kulturen, in denen frische Schutzmittel-Lösungen verwendet wurden. Dies kann jedoch nicht als signifikante Schwankung angesehen werden. Der Durchlauf in einem Chemap-Fermenter, in dem das Schutzmittel Floxan EA-1340 getrennt von der CSL sterilisiert wurde, ergab höhere Werte der Cellulose-Ausbeute (0,29 g/g) im Vergleich zu ähnlichen Durchläufen (zwei, in denen das Schutzmittel mit der CSL sterilisiert wurde (siehe Tabelle 9)).
Andere Modifikationen der oben beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung, die Fachleuten im Bereich der mikrobiellen Fermentation und in verwandten technischen Gebieten offensichtlich sind, sind beabsichtigterweise innerhalb des Umfangs der folgenden Patentansprüche.

Claims

1. Verfahren zur aeroben Produktion von mikrobieller Cellulose in einer bewegten Kultur mikrobieller Zellen, die in der Lage sind, Cellulose zu produzieren, und die in geeigneten Nähr-Wachstumsmedien gezüchtet werden, worin das Verfahren die Schritte umfaßt, daß man

(a) mikrobielle Zellen in Gegenwart eines Mittels züchtet, das ein Polyacrylamid enthaltendes Polymer, das ein Gewichtsmittel des Molekulargewichts im Bereich vor etwa 10&sup6; bis etwa 10&sup7; Dalton aufweist, in einer Konzentration umfaßt, die wirksam ist zur Verbesserung der Cellulose-Ausbeute aus einer bewegten Kultur; und

(b) die mikrobiell erzeugte Cellulose gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Polyacrylamid enthaltende Polymer partiell hydrolysiert ist und sowohl funktionelle Carboxylat-Gruppen als auch funktionelle Carboxamid-Gruppen enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Polyacrylamid enthaltende Polymer ein Copolymer aus Natriumacrylat und Acrylamid ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Polyacrylamid enthaltende Polymer nicht-ionisch ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Polyacrylamid enthaltende Polymer anionisch ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Polyacrylamid enthaltende Polymer kationisch ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, worin die mikrobiellen Zellen Bakterien sind.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin die Bakterien eine Acetobacter-Spezies sind.

9. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Polyacrylamid enthaltende Polymer ein steriler Zusatz zu einem sterilen Nährstoff-Medium ist, das eine Kohlenstoff-Quelle umfaßt.

10. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Polyacrylamid enthaltende Polymer in einer Öl- in-Wasser-Emulsion gemischt ist.

11. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Polyacrylamid enthaltende Polymer gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus einem anionischen Flokkulierungsmittel mit hohem Molekulargewicht (Magnifloc 833A), Polyacrylamiden mit hohem Molekulargewicht (Polytec 31, Polytec 36) und einer anionischen Polyacrylamid-Öl-in-Wasser-Emulsion (Floxan EA-1340).

12. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Polyacrylamid enthaltende Polymer in einer Konzentration von etwa 0,1 bis etwa 5 g/l verwendet wird, bezogen auf das Anfangsvolumen des Kulturmediums.

13. Verfahren nach Anspruch 1, worin die mikrobiellen Zellen rekombinante Zellen sind.

14. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Cellulose gewonnen wird durch Abtrennen der Cellulose von den Zellen unter Anwendung einer Alkali-Behandlung.

15. Verfahren nach Anspruch 14, worin die mikrobielle Kultur vor der Alkali-Behandlung zentrifugiert und erneut suspendiert wird.

16. Verfahren zur aeroben Produktion von mikrobieller Cellulose in einer bewegten Kultur mikrobieller Zellen, die zur Produktion von Cellulose befähigt sind und in einem geeigneten Nähr-Wachstumsmedium gezüchtet werden, worin das Verfahren die Schritte umfaßt, daß man

(a) mikrobielle Zellen in Gegenwart eines Mittels züchtet, das ein Polyacrylamid enthaltendes Polymer, das ein Molekulargewicht im Bereich von etwa 10&sup6; bis 10&sup7; Dalton aufweist, in einer Konzentration umfaßt, die wirksam ist zur Verbesserung der Cellulose-Ausbeute aus einer bewegten Kultur;

(b) die mikrobielle Kultur des Schritts (a) bei Geschwindigkeiten bewegt, bei denen die Cellulose-Ausbeute relativ zu analogen Fermentationsprozessen erhöht wird, in denen das Mittel nicht vorhanden ist; und

(c) die mikrobiell erzeugte Cellulose gewinnt.

17. Verfahren zur Verbesserung der Durchmischungs-Eigenschaften einer bewegten Kultur mikrobieller Zellen, worin das Verfahren das Züchten der mikrobiellen Zellen in Gegenwart eines Mittels umfaßt, das ein Polyacrylamid enthaltendes Polymer, das ein Molekulargewicht im Bereich von etwa 10&sup6; bis 10&sup7; Dalton aufweist, in einer Konzentration umfaßt, die wirksam ist zur Verbesserung der Durchmischungs-Eigenschaften der bewegten Kultur.

18. Verfahren nach Anspruch 17, worin das Polyacrylamid enthaltende Polymer ein anionisches Flokkulierungsmittel mit hohem Molekulargewicht ist (Magnifloc 833A).