DE69121301T2

DE69121301T2 - Kollagenkonstruktionen

Info

Publication number: DE69121301T2
Application number: DE69121301T
Authority: DE
Inventors: Robert Michael Carr; Paul David Kemp; John Gregory Maresh
Original assignee: Organogenesis Inc
Current assignee: Organogenesis Inc
Priority date: 1990-04-06
Filing date: 1991-04-05
Publication date: 1997-01-02
Anticipated expiration: 2011-04-06
Also published as: EP0457430A2; JPH04227264A; CA2039910C; JP3221690B2; DE69121301D1; US5256418A; DK0457430T3; ATE141171T1; ES2093077T3; EP0457430B1; EP0457430A3; CA2039910A1; GR3021312T3

Description

TECHNISCHER HINTERGRUND

Diese Erfindung betrifft Kollagenstrukturen und Verfahren zur Herstellung und Verwendung derartiger Strukturen. Diese Erfindung betrifft ferner Gewebeäquivalente, die verbesserte Eigenschaften haben, und Verfahren zur Herstellung und Verwendung derartiger Gewebeäquivalente. Diese Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung von hochkonzentrierten Kollagenlösungen.
Kollagen wird gewöhnlich als die Hauptproteinkomponente der extrazellulären Matrix gefunden. Bei Säugetieren bildet Kollagen manchmal bis zu 60% des Gesamtkörperproteins. Es umfaßt den Großteil der organischen Materie von Haut, Sehnen, Knochen und Zähnen und tritt in Form von faserigen Einschlüssen in den meisten anderen Körperstrukturen auf. Kollagen ist ein relativ schwaches Immunogen, teilweise bedingt durch die Maskierung von möglichen antigenen Determinanten durch die Helixstruktur. Diese Helixstruktur macht Kollagen auch gegen die Proteolyse resistent. Kollagen ist eine natürliche Substanz für die Zellhaftung und die wichtigste Zuglast aufnehmende Komponente des Skelett- und Muskelsystems.
Aufgrund der vorstehend genannten Eigenschaften findet Kollagen Anwendung bei der Herstellung von implantierbaren Prothesen als ein Substrat für das Zellwachstum und bei der Herstellung von Lebendgewebeäquivalenten. Umfangreiche Arbeiten wurden durchgeführt, um Kollagenstrukturen für derartige Anwendungen zu entwickeln, darunter Strukturen zur Verwendung in Forschung und Entwicklung, Gewebe- und Organreparatur und/oder -ersatz. Kollagen ist die Hauptproteinkomponente derartiger Kollagenstrukturen.
Viele Verfahren sind bekannt zur Organisierung von Kollagen in Strukturen, wie etwa injizierbare Pasten, Lebendgewebeäquivalente, Filme, Schwämme und dergleichen. Diese Verfahren schließen die Bildung von Kollagenfibrillen für injizierbare Pasten und Blutgefäßprothesen ein, z.B. US-Patente Nr. 4,252,759, 4,787,900, 4,319,363 und 3,425,418, die Bildung von Kollagenfilmen, z.B. US-Patent Nr. 3,014,024, und die Bildung von Schwämmen, z.B. US-Patent Nr. 4,320,201.
Ein weiteres Verfahren zur Bildung von Kollagenstrukturen beinhaltet die Kontraktion von Kollagengelen durch ein kontraktiles Mittel, wie z.B. Fibroblastenzellen, glatte Muskelzellen oder Blutplättchen, um Lebendgewebeäquivalente zu bilden. Derartige Gewebeäquivalente sind in den US-Patenten Nr. 4,485,096, 4,485,097, 4,539,716, 4,546,500, 4,604,346, 4,835,102 und 4,837,379 und EP-A-0 361 957 aufgezeigt (im folgenden insgesamt als "die Patente" bezeichnet). Diese Gewebeäquivalente schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Äquivalente von Epithelgewebe und Bindegewebe, wie z.B. Haut, Knorpel, Knochen, Blutgefäße ein, und umfassen lebende Zellen und extrazelluläre Matrixmoleküle, hauptsächlich Kollagen, und können optional mit Komponenten versehen sein, die typischerweise nicht in normalem Gewebe gefunden werden. Derartige Gewebeäquivalente haben einen breiten Einsatzbe reich, darunter Anwendungen in Forschung und Entwicklung, Gewebe- und Organersatz und -tests.
Bei diesen bekannten Verfahren wird die Kollagenstruktur aus relativ verdünnten Kollagenlösungen, z.B. etwa 5 bis 10 mg/ml, durch Lufttrocknung oder Neutralisierung organisiert. Die Kollagenstrukturen, die durch diese Verfahren hergestellt werden, haben typischerweise eine geringe Kollagendichte und wenige Kollagen/Kollagenwechselwirkungen. Diese Eigenschaften neigen dazu, die strukturelle Integrität derartiger Strukturen zu verringern. Darüberhinaus haben viele bekannte Verfahren der Herstellung von Kollagenstrukturen auch den Nachteil der fehlenden Flexibilität sowie hinsichtlich des Ausmaßes der Kontrolle des Prozesses zur Bildung einer Struktur mit der gewünschten Form.
Es ist höchst erstrebenswert, daß die Festigkeit derartiger Strukturen ausreichend ist, um die einfache Handhabung zu erlauben und Belastbarkeit zu schaffen, insbesondere bei Anwendungen, die mit einer beträchtlichen mechanischen Handhabung oder Zug- oder pulsierender Belastung verbunden sind. Demge mäß ist es wünschenswert, Kollagenstrukturen zu bilden, die eine dichtere fibrilläre Struktur haben, die eher der in vivo gefundenen gleicht. Es wird angenommen, daß in vivo Kollagen aus sehr konzentrierten Lösungen organisiert wird. Somit werden verbesserte Kollagenstrukturen und Verfahren zur Herstellung derartiger Strukturen gesucht.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine Draufsicht auf eine Vorrichtung zur Verwendung in vorliegender Erfindung.
Fig. 2 ist eine Schnittansicht der Vorrichtung von Fig. 1 entlang der Linie II-II.
Fig. 3 ist eine Schnittansicht der Vorrichtung von Fig. 2 entlang der Linie III-III.
Fig. 4 ist eine ausgeschnittene Ansicht einer weiteren Vorrichtung zur Verwendung in vorliegender Erfindung.

KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung schafft Kollagenstrukturen und Verfahren zur Herstellung derartiger Kollagenstrukturen. Die Kollagenstrukturen gemäß vorliegender Erfindung haben verbesserte Eigenschaften einschließlich einer gesteigerten Festigkeit und einer dichteren fibrillären Struktur, die mehr der in vivo gefundenen gleicht.
Es wurde unerwartet festgestellt, daß Kollagenstrukturen an der Grenzfläche einer Kollagenlösung und eines permeablen Elements gebildet werden können, welches permeable Element in Kontakt mit einem Wirkstoff ist, welcher eine selektive Massenübertragung von Lösungsmittel von der Kollagenlösung bewirkt, z.B. hat in wasserigen Lösungen der Wirkstoff typischerweise einen höheren osmotischen Druck als die Kollagenlösung. Zur einfachen Bezeichnung werden derartige Mittel im folgenden als "Konzentrierungsmittel" bezeichnet. Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen wird angenommen, daß in wässeriger Lösung die Struktur gebildet wird, während sich das Kollagen mittels der Entwicklung eines osmotischen Gradienten an dem permeablen Element konzentriert.
In einer bevorzugten Ausführungsform zur Bildung einer Kollagen enthaltenden Struktur gemäß vorliegender Erfindung umfaßt das Verfahren die Schritte:
(a) Vorsehen einer Kollagen enthaltenden Lösung benachbart zu einem permeablen Element, wobei das permeable Element in Kontakt mit einem Konzentrierungsmittel ist; und
(b) Halten der Kollagenlösung, des permeablen Elements und des Konzentrierungsmittels unter Bedingungen, die ausreichen, um die Bildung der Kollagenstruktur an dem permeablen Element zu ermöglichen.
Obgleich die durch vorstehend beschriebenes Verfahren hergestellten Strukturen eine ausreichende strukturelle Integrität für bestimmte Anwendungen haben können, ist ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung die Bildung von Fibrillen in den hochkonzentrierten Kollagenstrukturen.
Demgemäß umfaßt in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform das vorstehend beschriebene Verfahren den zusätzlichen Schritt des Veranlassens der Bildung von Fibrillen in der Kollagenstruktur. Die Bildung derartiger Fibrillen kann veranlaßt werden, wenn sich die Kollagenstruktur an dem permeablen Element ausbildet, oder es kann die Bildung in der hochkonzentrierten Struktur veranlaßt werden. Es wird angenommen, daß das Veranlassen der Bildung von Fibrillen, nachdem die Kollagenstruktur eine Kollagenkonzentration von etwa 50 bis 100 mg/ml erreicht hat, Strukturen schafft, die eine fibrilläre Organisation von Kollagen aufweisen, die der in vivo gefundenen eher gleicht, als dies bisher erzielt wurde. Die Fibrillenbildung wird durch Steigerung der lonenstärke des Konzentrierungsmittels, des pH oder der Temperatur oder eine Kombination daraus erreicht.
Die Verfahren gemäß vorliegender Erfindung schaffen sehr konzentrierte Kollagenstrukturlösungen (in der Größenordnung von 100 mg/ml), in welchen die Bildung einer dichten fibrillären Struktur veranlaßt werden kann, die der in vivo gefundenen ähnlicher ist. Es erscheint, daß die Bildung von fibrillären Kollagenstrukturen in Übereinstimmung mit vorliegender Erfindung der Art und Weise näher ist, wie Kollagen in vivo organisiert ist, als andere bekannte Verfahren zur Bildung von Kollagenstrukturen. Offensichtlich wird Kollagen in vivo aus sehr konzentrierten Kollagenlösungen organisiert, die in vitro schwierig handzuhaben sind. Demgemäß schafft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Konzentrierung einer Kollagenlösung, umfassend:
(a) Kontaktieren einer Kollagenlösung mit einem permeablen Element, welches permeable Element mit einem Mittel zum Konzentrieren des Kollagens in Kontakt ist;
(b) Halten der Kollagenlösung und des Konzentrierungsmittels unter Bedingungen, die ausreichen, um das Erreichen einer Konzentration von etwa 50 bis 100 mg/ml der Kollagenlösung zu ermöglichen. Obgleich etwa 50 bis 100 mg/ml ein bevorzugter Bereich ist, wird erwartet, daß Kollagenlösungen sowohl höherer als auch niedrigerer Konzentration für bestimmte Anwendungen nützlich sind.
Die Form der Kollagenstrukturen gemäß vorliegender Erfindung wird teilweise durch das permeable Element bestimmt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden rohrförmige Kollagenstrukturen unter Verwendung einer Vorrichtung gebildet, die eine innere und eine äußere Kammer hat, wobei die Grenzfläche zwischen der inneren und der äußeren Kammer ein rohrförmiges permeables Element umfaßt, welches Verfahren die Schritte umfaßt.
(a) Vorsehen der Kollagen enthaltenden Lösung mit einem pH von etwa 2 bis 4 in der äußeren Kammer;
(b) Vorsehen des Konzentrierungsmittels in der inneren Kammer; und
(c) Halten der Kollagenlösung, des permeablen Elements und des Konzentrierungsmittels unter Bedingungen, die ausreichen, um die Bildung der rohrförmigen Kollagenstruktur an dem permeablen Element zu ermöglichen.
Die Verfahren gemäß vorliegender Erfindung können problemlos gestoppt und erneut gestartet werden. Demgemäß können auch mehrschichtige Kollagenstrukturen durch die vorliegende Erfindung geschaffen werden. Derartige Strukturen können jede gewünschte Form haben, wobei flache und rohrförmige Strukturen bevorzugt sind. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird eine mehrschichtige rohrförmige Kollagenstruktur unter Verwendung einer Vorrichtung hergestellt, die eine innere und eine äußere Kammer hat, wobei die Grenzfläche zwischen der inneren und der äußeren Kammer ein rohrförmiges permeables Element umfaßt, welches Verfahren die Schritte umfaßt.
(a) Vorsehen einer ersten Lösung, die Kollagen bei einem pH von etwa 2 bis 4 enthält, in der äußeren Kammer;
(b) Vorsehen eines Konzentrierungsmittels in der inneren Kammer;
(c) Halten der ersten Kollagenlösung, des permeablen Elements und des Konzentrierungsmittels unter Bedingungen, die ausreichen, um die Bildung der rohrförmigen Kollagenstruktur an dem permeablen Element zu ermöglichen;
(d) Ersetzen der ersten Kollagenlösung durch eine zweite Lösung, die Kollagen umfaßt; und
(e) Halten der zweiten Kollagenlösung, des permeablen Elements und des Konzentrierungsmittels unter Bedingungen, die ausreichen, um die Bildung einer zweiten rohrförmigen Struktur außerhalb der ersten rohrförmigen Struktur zu ermöglichen; und
(f) Wiederholen der Schritte (d) und (e) , falls zusätzliche Schichten von rohrförmiger Kollagenstruktur erwünscht sind.
Diese Verfahren bietet die Möglichkeit, durchgehend die Kollagenmischung zu wechseln, um eine Kollagenstruktur zu erzeugen, die, falls erwünscht, von einer Schicht zur nächsten eine unterschiedliche Zusammensetzung hat. Beispielsweise kann in mehrschichtige Strukturen der vorliegenden Erfindung eine Schicht mit steuerbarer Dicke, die angiogene Faktoren, entzündungshemmende Wirkstoffe, chemotaktische Wirkstoffe oder Kollagenaseinhibitoren enthält, ohne weiteres eingebaut werden.
Besonders bevorzugte Kollagenstrukturen, die durch die vorliegende Erfindung geschaffen werden, schließen Lebendgewebeäquivalente ein, die sich hinsichtlich der Organisation von den in den Patenten aufgezeigten Gewebeäquivalenten unterscheiden und gegenüber diesen Vorteile bieten. Gewebeäquivalente, die aus den hierin aufgezeigten Kollagenstrukturen hergestellt sind, werden nachfolgend nur zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung verwendet und sollen nicht die vorliegende Erfindung in irgendeiner Weise einschränken.
Bei der Herstellung von Gewebeäquivalenten gemäß den Patenten geliert Kollagen und erzeugt kurze, dünne Fibrillen, die durch Kontraktion des Gels durch ein kontraktiles Mittel konzentriert werden. Das resultierende Gewebeäquivalent hat eine geringere Kollagendichte und weniger Kollagen/Kollagenwechselwirkungen als Gewebeäquivalente gemäß der vorliegenden Erfindung.
Während gemäß den Patenten hergestellte Gewebeäquivalente für viele Anwendungsbereiche akzeptabel sind, ist es erstrebenswert, für bestimmte Anwendungsgebiete Gewebeäquivalente mit erhöhter Festigkeit zu haben. Demgemäß sind die Gewebeäquivalente gemäß vorliegender Erfindung, die unter Verwendung von Kollagenstrukturen hergestellt werden, die aus hochkonzentrierten Kollagenlösungen gebildet werden und eine verbesserte Festigkeit bieten, für bestimmte Anwendungen bevorzugt, z.B. Anwendungen, bei welchen das Gewebeäquivalent einer Zugoder pulsierenden Spannung ausgesetzt ist.
Die zur Herstellung der Gewebeäquivalente nach der Lehre der vorliegenden Erfindung verwendeten Materialien können optional Fibrinogen, ein Mittel wie z.B. Thrombin, das die Bildung von Fibrin aus Fibrinogen verursacht, Fibrin, ein Mittel wie z.B. Faktor XIII, der die Vernetzung von Fibrinogen und Kollagen bewirkt, ein oder mehrere Kontraktionsmittel, lebende Zellen, Nährmedien und Additive einschließen.
Die Konfiguration der Vorrichtung zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung ist von der Art der erzeugten Kollagenstruktur sowie von deren beabsichtiger Verwendung abhängig.
Gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellte Gewebeäquivalente werden allgemein als flache Platte, ein hohles Rohr oder ein Netzwerk von hohlen Rohren geformt. Sie können jedoch in jeder gewünschten Form geformt werden. Beispielsweise ist es in einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wünschenswert, die natürliche Geometrie des Gewebeäquivalents zu ändern. Beispielsweise kann ein Hautgewebeäquivalent eher als ein Zylinder als in Form einer Platte geformt werden und die Schichten von Blutgefäßgewebeäquivalenten können in Umkehrung der Reihenfolge von natürlichen Blutgefäßen geformt werden.
Obgleich die unter Verwendung der Kollagenstrukturen gemäß vorliegender Erfindung gebildeten Lebengewebeäquivalente durch ein Verfahren gebildet werden, daß sich von dem in den Patenten aufgezeigten unterscheidet, sind allgemeine Verfahren zur Bildung von geschichteten Gewebeäquivalenten, Bereitstellen von Zellen für derartige Gewebeäquivalente und Vorrichtungen, die in den Patenten aufgezeigt sind, bei der praktischen Ausführung der vorliegenden Erfindung nützlich. Beispielsweise sind menschliche Blutgefäßgewebeäquivalente, die mehrschichtige Rohre umfassen, welche unter Verwendung von Kollagengelen und kultivierten Gefäßzellen hergestellt werden, in den US-Patenten Nr. 4,539,716 und 4,546,500 aufgezeigt und die darin gelehrten Verfahren sind allgemein in den Verfahren gemäß vorliegender Erfindung anwendbar.
Blutgefäßgewebeäquivalente, die unter Verwendung der vorliegenden Erfindung hergestellt sind, können für verschiedene Arten von Blutgefäßen unter Verwendung von Zellen hergestellt werden, die aus den geeigneten Quellen kultiviert wurden. Arterielle Blutgefäßgewebeäquivalente umfassen ferner Zellen, die aus den entsprechenden Schichten einer Arterie kultiviert wurdenc Kapillare Blutgefäßäquivalente umfassen ferner kapillare Endothelzellen und Perizyten anstelle der Adventitiafibroblasten. Venöse Blutgefäßgewebeäquivalente umfassen ferner Zellen, die aus Venen kultiviert wurden und werden mit dünneren äußeren Schichten als arterielle Blutgefäßgewebeäquivalente hergestellt. Zur Untersuchung von bestimmten Kränkheiten werden Zellen, die von Patienten mit der bestimmten Krankheit kultiviert wurden, in das Blutgefäßgewebeäquivalent inkorporiert.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine rohrförmige Kollagenstruktur mit einer Einfachschicht von Endothelzellen ausgekleidet, welche die Intima von Blutgefäßgewebeäquivalenten bildet. Äußere Schichten können dann aus glatten Muskelzellen in einem Kollagengitter gegossen werden, welches die Media der Blutgefäßgewebeäquivalente bildet. Die glatten Muskelzellen tragen Kollagen, Elastin und weitere Moleküle zur Matrix bei. In einigen Ausführungsformen werden weitere extrazelluläre Matrixkomponenten, wie z.B. Hyaluronsäure, für bestimmte Anwendungen optional hinzugefügt. Die äußere Schicht des Blutgefäßgewebeäquivalents kann aus Adventitiafibroblasten in einem Kollagengitter hergestellt werden und bildet die Adventitia des Blutgefäßgewebeäquivalents. Ein Stützelement, z.B. ein synthetisches Netz, kann auch optional in das Blutgefäßgewebeäquivalent eingeschlossen werden, wobei das Netz typischerweise in der Kollagenstruktur vorhanden ist, um das Blutgefäßgewebeäquivalent zu festigen und das Vernähen eines Blutgefäßgewebeäquivalents mit einem natürlichen Blutgefäß zu erleichtern. Ein entfembares schützendes undurchdringliches Element, z.B. eine Kunststoffumhüllung, die der abluminalen Oberfläche benachbart ist, kann auch optional vorgesehen werden.
Es versteht sich, daß die Reihenfolge der Schichten in den Blutgefäßgewebeäquivalenten gemäß vorliegender Erfindung in umgekehrter Reihenfolge der typischerweise in dem natürlichen Blutgefäß gefundenen organisiert sein kann. Beispielsweise können die Endothelzellen, die die Intima von normalen Blutgefäßen umfassen, so angeordnet sein, daß sie an der Außenseite einer rohrförmigen Kollagenstruktur sind.
Zu den Hauptvorteilen von Kollagenstrukturen gemäß vorliegender Erfindung gegenüber vorher beschriebenen Kollagenstrukturen, insbesondere gegenüber den in den Patenten beschriebenen Gewebeäquivalenten, zählen Variationen der physikalischen Eigenschaften der Struktur in einem größeren Ausmaß durch Einstellen der Herstellungsbedingungen. Ferner erzeugt die hohe Konzentration von Kollagen äußerst starke Kollagenstrukturen, die auch eine hervorragende Anbindung für Endothel- oder Epithelzellen bieten. Ferner bieten die Verfahren der vorliegenden Erfindung eine bessere Steuerung des Prozesses zur Erzielung der gewünschten Form sowie der gewünschten Zusammensetzung.
Die Kollagenstrukturen gemäß vorliegender Erfindung sind als Zellwachstumssubstrate und zur Herstellung von implantierbaren Prothesen und verbesserten Gewebeäquivalenten nützlich.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung schafft Kollagenstrukturen und Verfahren zur Herstellung derartiger Strukturen. Obgleich die durch die vorliegende Erfindung geschaffenen Strukturen und Verfahren durch den Aufbau von rohrförmigen und flachen Kollagenstrukturen dargelegt werden, ist die Erfindung nicht darauf beschränkt. Es versteht sich, daß die Form derartiger Strukturen in Abhängigkeit von der letztendlichen Verwendung der Struktur auszuwählen ist.
Die vorliegende Erfindung schafft Verfahren zur Herstellung von Kollagenstrukturen. Derartige Verfahren umfassen die Schritte:
(a) Vorsehen einer Lösung, die einem permeablen Element benachbart Kollagen enthält, wobei das permeable Element mit einem Konzentrierungsmittel in Kontakt ist; und
(b) Halten der Kollagenl:sung, des permeablen Elements und des Konzentrierungsmittels unter Bedingungen, die ausreichen, um die Bildung der Kollagenstruktur an dem permeablen Element zu ermöglichen.
Bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung wird eine Kollagenlösung in Kontakt mit einem permeablen Element plaziert, das wiederum in Kontakt mit einem Konzentrierungsmittel steht. Dieser Kontakt muß in beiden Fällen nicht direkt sein, es kann z.B. ein Stützelement für die Kollagenstruktur zwischen der Kollagenlösung und dem permeablen Element angeordnet sein. Der Kontakt muß jedoch ausreichen, um die selektive Massenübertragung von Lösungsmittel von der Kollagenlösung und die Bildung der Struktur zu ermöglichen, z.B. in wässerigen Lösungen die Entwicklung eines osmotischen Gradienten und die Bildung der Struktur.
In einigen besonders bevorzugten Ausführungsformen umfaßt das vorstehend beschriebene Verfahren den weiteren Schritt des Veranlassens der Bildung von Fibrillen in der Kollagenstruktur entweder während oder nach der Bildung derselben. In anderen besonders bevorzugten Ausführungsformen schließen die Verfahren gemäß vorliegender Erfindung die weiteren Schritte der Vernetzung von Fibrillen in der Kollagenstruktur ein. In anderen bevorzugten Ausführungsformen kann das Verfahren auch den Schritt des Veranlassens der Bildung von Poren in der Kollagenstruktur enthalten und/oder die Texturierung einer oder mehrerer Oberflächen der Struktur.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Kollagenstrukturen unter Verwendung einer Vorrichtung gebildet, die eine innere und eine äußere Kammer hat, wobei die Grenzfläche zwischen der inneren und der äußeren Kammer ein permeables Element umfaßt, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:
(a) Vorsehen einer Kollagen enthaltenden Lösung mit einem pH von etwa 2 bis 4 in der äußeren Kammer;
(b) Vorsehen des Konzentrierungsmittels in der inneren Kammer; und
(c) Halten der Kollagenlösung, des permeablen Elements und des Konzentrierungsmittels unter Bedingungen, die ausreichen&sub1; um die Bildung der Kollagenstruktur an dem permeablen Element zu ermöglichen.
Alternativ kann die Kollagenstruktur der inneren Kammer zugeführt werden und das Konzentrierungsmittel der äußeren Kammer, um eine Kollagenstruktur an der inneren Oberfläche des permeablen Elements zu bilden.
Die Form der Struktur wird zum großen Teil durch die Konfiguration des permeablen Elements bestimmt. Während die vorliegende Erfindung anhand von rohrförmigen und flachen Strukturen erläutert wird, versteht es sich, daß ein breiter Bereich von Konfigurationen durch Variieren der Form des permeablen Elements erreicht werden kann und durch die Lehre der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wird. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden rohrförmige Kollagenstrukturen unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorrichtung gebildet, bei welcher das permeable Element rohrförmig ist.
In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird der Herstellungsprozess der Struktur gestoppt und mit beispielsweise einer unterschiedlichen Kollagenlösung erneut begonnen, um eine geschichtete Struktur zu erzeugen. Demgemäß werden auch mehrschichtige Kollagenstrukturen jeder gewünschten Form durch die vorliegende Erfindung geschaffen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird eine mehrschichtige rohrförmige Kollagenstruktur unter Verwendung einer Vorrichtung hergestellt, die eine innere und eine äußere- Kammer hat, wobei die Grenzfläche zwischen der inneren und der äußeren Kammer ein rohrförmiges permeables Element umfaßt, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:
(a) Vorsehen einer ersten Lösung, die Kollagen bei einem pH von etwa 2 bis 4 enthält, in der äußeren Kammer;
(b) Vorsehen eines Konzentrierungsmittels in der inneren Kammer;
(c) Halten der ersten Kollagenlösung, des permeablen Elements und des Konzentrierungsmittels unter Bedingungen, die ausreichen, um die Bildung der rohrförmigen Kollagenstruktur an dem permeablen Element zu ermöglichen;
(d) Ersetzen der ersten Kollagenlösung durch eine zweite Lösung, die Kollagen umfaßt; und
(e) Halten der zweiten Kollagenlösung, des permeablen Elements und des Konzentrierungsmittels unter Bedingungen, die ausreichen, um die Bildung einer zweiten rohrförmigen Struktur außerhalb der ersten rohrförmigen Struktur zu ermöglichen; und
(f) Wiederholen der Schritte (d) und (e), falls zusätzliche Schichten von rohrförmiger Kollagenstruktur erwünscht sind.
In weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umschließt die Zusammensetzung der Schichten der Struktur einen breiteren Bereich und kann ferner beispielsweise angiogene Faktoren, Antientzündungsmittel, chemotaktische Mittel und/oder Kollagenaseinhibitoren enthalten.
Das permeable Element kann aus jedem Material ausgewählt sein, das mit Kollagenchemie kompatibel ist und das für Kollagen im wesentlichen undurchdringlich ist. Bevorzugte per- meable Elemente schließen Membranen und stark poröse Elemente, wie z.B. Keramik oder rostfreier Stahl, ein, die eine Porengröße haben, die im wesentlichen Kollagen zurückhält. Bei Verwendung eines permeablen Elements, das relativ flexibel ist, beispielsweise Dialyseröhren oder Nuclepore-Membra nen, ist es gewöhnlich bevorzugt, die Kollagenlösung unter einem niedrigen hydrostatischen Druck in der inneren Kammer vorzusehen, um die Form des permeablen Elements aufrechtzuerhalten. Wenn es jedoch erwünscht ist, die Kollagenlösung in der äußeren Kammer bei Verwendung eines flexiblen permeablen Elements vorzusehen, kann das permeable Element mit einem Stützelement, z.B. einer Feder im Fall von rohrförmigen Strukturen versehen sein, um die gewünschte Form aufrechtzuerhalten.
Kollagen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann aus jeder geeigneten Quelle erhalten werden, typischerweise Haut und Sehnen, durch Verfahren, die Säure- oder Enzymextraktion einbeziehen. Eine bevorzugte Kollagenzusammensetzung zur Verwendung hierin wird aus einer neuen Quelle erhalten, der gemeinsamen Fingerstreckersehne, durch ein neues Extrak tionsverfahren, welche beiden in der EP-A-0 419 111 beschrieben sind. obgleich sowohl Monomere als auch Mischungen von Monomeren und Kollagenfibrillen in der praktischen Anwendung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind Monomere für viele Anwendungen bevorzugt.
Kollagenlösungen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung haben allgemein eine Konzentration von etwa 5 bis 10 mg/ml bei einem pH von etwa 2 bis 4 und können optionale Komponenten, wie z.B. neutrale und geladene Polymere, zu welchen ohne Einschränkung Polyvinylalkohol und Hyaluronsäure zählen, enthalten. Ein bevorzugtes Lösungsmittel für das Kollagen ist verdünnte Essigsäure, z.B. 0,05% bis 0,1%. Die Kollagenlösung ist monomer oder eine Mischung von Monomeren und Kollagenpolymeren höherer Ordnung, z.B. Dimere bis zu und einschließlich Fibrillen.
Die Kollagenstrukturen der vorliegenden Erfindung haben eine Kollagenkonzentration von etwa 50 bis 100 mg/ml, bevorzugt etwa 100 mg/ml. Konzentrationen außerhalb dieses Bereiches können jedoch für einige Anwendungen bevorzugt sein.
Die Bildung von Fibrillen in der Kollagenstruktur wird entweder während oder nach deren Bildung veranlaßt. In bevorzugten Ausführungsformen werden Fibrillen gebildet, nachdem die Kollagenkonzentration der Struktur etwa 50 bis 100 mg/ml erreicht hat. Die Bildung der Fibrillen wird durch Erhöhen des pH, der Temperatur oder der Salzkonzentration der Kollagenstruktur oder durch eine Kombination davon veranlaßt, wie in den nachfolgenden Beispielen erläutert ist. Beispielsweise kann die Steigerung des pH zum Veranlassen der Fibrillenbildung durch eine allmähliche Diffusion von Salz von dem Konzentrierungsmittel durch die permeable Membran in die Kollagenlösung (siehe nachfolgendes Beispiel 2 ) oder durch Lufttrocknung der geformten Struktur zum Verdampfen der Säure, die während der Bildung in der Struktur festgehalten wurde (siehe nachfolgendes Beispiel 4), erreicht werden. Die Lufttrocknung der geformten Kollagenstruktur verursacht auch die Steigerung der Kollagenkonzentration der Struktur. Ein derartiges Trocknen wird bei einer solchen Temperatur und einem solchen pH ausgeführt, daß das Kollagen nicht in bedeutendem Umfang denaturiert wird.
In einem besonders bevorzugten Verfahren der Fibrillenbildung wird die Struktur von der Vorrichtung zusammen mit dem permeablen Element entfernt, an welchem sie gebildet wurde, nachdem die Struktur eine Kollagenkonzentration von etwa 50 bis 100 mg/ml erreicht hat. Die Struktur wird dann über Nacht bei 2 bis 8ºC luftgetrocknet. Der pH steigt allmählich an, wenn die in der Struktur während der Bildung eingeschlossene Säure verdampft. Die Kollagenstruktur wird dann in isotoner Salzlösung rehydriert, auf 37ºC erwärmt und von dem permeablen Element getrennt. Das Verfahren ist in Beispiel 4 nachfolgend dargestellt.
Kollagenstrukturen werden typischerweise vernetzt, nachdem die Bildung von Fibrillen in der Struktur veranlaßt wurde. Dies kann durch eine beliebige Anzahl von Verfahren bewirkt werden, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, darunter Lufttrocknung, Lyophilisierung oder Kontakt mit einem Aldehyd, wie z.B. Formaldehyd oder Glutaraldehyd. Die Vernetzung sollte so ausgeführt werden&sub1; daß die Versprödung der Struktur minimiert wird.
Die Berstfestigkeit von rohrförmigen Kollagenstrukturen gemäß vorliegender Erfindung, in welchen die Bildung von Fibrillen veranlaßt wurde und diese vernetzt wurden, beträgt etwa 300 bis 1000 mm Hg, vorzugsweise etwa 500 bis 1000 mm Hg. Rohrförmige Strukturen, die eine Berstfestigkeit über 1000 mm Hg haben, werden ebenfalls durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung gebildet.
Die Berstfestigkeit von rohrförmigen Kollagenstrukturen gemäß vorliegender Erfindung wird weiter durch die Inkorporierung eines Stützelements, wie etwa eines synthetischen Netzes, in diesen verbessert.
Konzentrierungsmittel zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ermöglichen eine selektive Massenübertragung von Lösungsmittel von der Kollagenlösung. In wässrigen Systemen haben derartige Konzentrierungsmittel typischerweise einen höheren osmotischen Druck als derjenige der Kollagenlösung. Be vorzugte Konzentrierungsmittel schließen wasserlösliche Polymere, wie z.B. Polyethylenglykol oder DEXTRAN ein. Salzlösungen, wie z.B. phosphatgepufferte Salzlösung ("PBS"), sind besonders bevorzugt, wobei Phosphat mit einer Konzentration von etwa 0,001 bis 0,02 M vorliegt. Die Salzkonzentration des Konzentrierungsmittels in Verfahren, bei welchen die Bildung der Fibrillen während der Bildung der Struktur an dem permeablen Element veranlaßt wird, ist typischerweise 0,07 bis 0,30 M. Dieses Verfahren ist in Beispiel 2 nachfolgend erläutert, in welchem eine Kollagenstruktur an einem rohrförmigen permeablen Element gebildet wird, welches eine Dialyseröhre oder eine rohrförmige Nuclepore-Membran umfaßt. Ein bevorzugtes Konzentrierungsmittel umfaßt 20% Gew./V. Polyethylenglykol, Molekulargewicht 8000, in PBS. Ein anderes bevorzugtes Konzentrierungsmittel umfaßt 20% Gew./V. DEXTRANRIN PBS.
Bei Ausführungsformen, bei welchen die Bildung der Fibrillen nach der Bildung der Struktur veranlaßt wird, umfaßt das Konzentrierungsmittel typischerweise ein biokompatibles Polymer mit einer Konzentration von etwa 5 bis 20%, Phosphatpuffer mit etwa 0,001 bis 0,2 M und Natriumchlorid mit etwa 0,075 bis 0,15 M. Es wird erwartet, daß sowohl die niedrigeren als auch die höheren Konzentrationen von Natriumchlorid in dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nützlich sind.
Bei Ausführungsformen, bei welchen die Kollagenstrukturen ge mäß vorliegender Erfindung mit Poren versehen sind, kann dies auf eine Anzahl von Arten erzielt werden, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, darunter die Inkorporierung eines Polymers in der Struktur. Derartige Polymere sind in Lösungsmitteln löslich, die nicht in einem bedeutenden zer störerischen Ausmaß auf die Kollagenstruktur wirken. Poren werden gebildet, während das Polymer aus der Struktur unter Verwendung von Lösungsmitteln gelöst wird, in welchen das Polymer, jedoch nicht die Kollagenstruktur löslich ist. Polyvinylalkohol, ein bevorzugtes Polymer für die Porenbildung, wird aus der Kollagenstruktur unter Verwendung von Wasser gelöst. Poren können auch durch Lyophilisierung der Kollagenstruktur gebildet werden.
Kollagenstrukturen gemäß vorliegender Erfindung können "texturiert" werden, falls erwünscht, z.B. durch mechanisches Aufdrucken von Mustern oder durch Säureätzung. Die Texturierung von Strukturen kann in bestimmten Fällen erwünscht sein, z.B. zur Förderung der Anhaftung, des Wachstums und/oder des Einwanderns von eingepflanzten Zellen. Eine derartige Texturierung wird typischerweise vor der Vernetzung der Kollagenfibrillen ausgeführt.
In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können Kollagenstrukturen ferner eine Verstärkungseinrichtung zur Erhöhung der strukturellen Integrität enthalten, z.B. ein synthetisches Netz, um das Nähen zu erleichtern. Besonders bevorzugte Verstärkungseinrichtungen schließen Netze ein, die ein oder mehrere Polyester umfassen, wie z.B. DACRON oder DACRON /LYCRA Kombination von E.I. Dupont de Nemour. Ferner sind Kollagenstrukturen gemäß vorliegender Erfindung optional mit Komponenten zur Verleihung gewünschter Eigenschaften versehen und können Komponenten enthalten, die nicht typischerweise in normalem Gewebe oder Organen gefunden werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform schließen diese Strukturen einen oder mehrere Zelltypen ein. Typischerweise werden diese Zellen in der Struktur nach der Bildung derselben durch Bepflanzen einer oder mehrerer Oberflächen der Struktur mit dem gewünschten Zelltyp oder den gewünschten Zelltypen eingeschlossen, wozu ohne Einschränkung Endothel- und Epithelzellen zählen. Im Fall von mehrschichtigen Kollagenstrukturen werden Zellen, sofern erwünscht, zwischen Schichten eingesetzt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Kollagenstrukturen mit Zellen bevölkert, um Lebendgewebeäquivalente zu bilden.
Gewebeäquivalente einschließlich Blutgefäß- und Hautgewebeäquivalente werden in nicht einschränkender Weise verwendet, um Kollagenstrukturen gemäß vorliegender Erfindung beispielhaft darzustellen, die mit Zellen versehen wurden.
In den Zeichnungen zeigen Fig. 1, 2 und 3 eine Vorrichtung zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung bei der Bildung von rohrförmigen Kollagenstrukturen. Die Vorrichtung umfaßt einen zylindrischen Behälter 10, welcher Behälter durch Abdeckeinrichtungen 70, 71 dicht geschlossen ist. Ein hohler Formkern 100, der ein permeables Element umfaßt, ist in dem Behälter 10 angeordnet und darin mittels hohler Tragelemente 83, 84 positioniert, welche abnehmbar mit den Abdeckeinrichtungen 70 bzw. 71 verbunden sind. Die Abdeckeinrichtungen 70, 71 sind mit Anschlußöffnungen 72, 73 versehen, welche wiederum mit den hohlen Tragelementen 83, 84 während der Verwendung in Verbindung stehen. Einrichtungen (nicht dargestellt) zum Zuführen eines Konzentrierungsmittels (nicht dargestellt) zu dem hohlen Formkern 100 durch die Anschlußöffnungen 72, 73 sind ebenfalls vorhanden und umfassen typischerweise eine Pumpeneinrichtung, die mit einem Vorratsbehälter des Konzentrierungsmittels verbunden ist, um Konzentrierungsmittel durch den Formkern 100 zu pumpen.
Die Abdeckeinrichtungen 70, 71 sind ferner mit Anschlußeinrichtungen 81, 82 versehen, die sich in den Behälter 10 öffnen, wenn die Vorrichtung zur Benutzung zusammengesetzt ist. Einrichtungen (nicht dargestellt), um eine Kollagenlösung dem Behälter 10 durch die Anschlüsse 81, 82 zuzuführen, sind ebenfalls vorhanden und umfassen typischerweise einen mit Kollagenlösung gefüllten Vorratsbehälter, der mit den Anschlüssen 80, 81 verbunden ist.
In einer Ausführungsform werden rohrförmige Kollagenstrukturen gemäß vorliegender Erfindung unter Verwendung der in Fig. 1, 2 und 3 gezeigten Vorrichtung wie folgt gebildet: eine Kollagen in verdünnter Essigsäure umfassende Lösung wird über Anschlüsse 80, 81 zugegeben, welche mit einem Kollagenvorratsbehälter (nicht dargestellt) verbunden sind, der das Lösungsvolumen ersetzt, während sich das Kollagen an dem permeablen Element 100 konzentriert, um eine rohrförmige Kollagenstruktur zu bilden. Ein Konzentrierungsmittel wird dem Hohlraum des Formkerns 100 über die Anschlußöffnungen 72, 73 zugeführt, die mit der Einrichtung zum Versorgen der Vorrichtung mit einem Konzentrierungsmittel verbunden sind. Eine negative Druckdifferenz zwischen der Kollagenlösung und dem Konzentrierungsmittel wird erreicht, indem das Konzentrierungsrnittel durch den Formkern 100 gezogen wird. Wenn positiver Druck verwendet wird, kann das Konzentrierungsmittel aus dem Formkern 100 hinausgedrängt werden. Die Vorrichtung und ihre Inhalte werden unter Bedingungen gehalten, die ausreichend sind, um die Bildung der Kollagenstruktur an dem Formkern 100 zu ermöglichen und die typischerweise bei 2 bis 8ºC drei bis fünf Tage lang fortgeführt werden, bis die Struktur eine Dicke von etwa 2 mm erreicht. Der Formkern wird zusammen mit der Kollagenstruktur entfernt und über Nacht luftgetrocknet, um das Kollagen weiter zu konzentrieren und die Bildung von Fibrillen in der rohrförmigen Kollagenstruktur mittels Verdampfung der in der Struktur eingeschlossenen Essigsäure, um dadurch den pH zu erhöhen, zu veranlassen. Die getrocknete rohrförmige Kollagenstruktur, die eine Dicke von etwa 0,5 bis 1 mm hat, wird anschließend in isotoner PBS rehydriert und vorn Formkern abgenommen. In die Kollagenstruktur werden anschließend geeignete Zellen eingesetzt, um ein Blutgefäßäquivalent zu bilden.
Die Vorrichtung von Fig. 1, 2 und 3 kann auch verwendet werden, um Kollagenstrukturen an der Innenfläche des hohlen Formkerns 100 zu bilden, indem die Kollagenlösung diesem durch die Anschlußöffnungen 72, 73 zugeführt wird und das Konzentrierungsmittel dem Behälter 10 durch Öffnungen 81, 82.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung (nicht in den Figuren dargestellt) wird eine Kollagenstruktur an der inneren oder ußeren Oberfläche eines flexiblen permeablen Elements, wie z.B. einer Nuclepore-Membran oder einer Dialyseröhre gebildet. Beispielsweise wird Kollagen (2,5 mg/ml in 0,05% Essigsäure) in ein permeables Rohr (entweder Dialysemembran oder Nuclepore-Filtermembran, die mit einem Zylinder verklebt ist) gegossen und das Rohr (typischerweise mit einem Durchmesser von 3 bis 8 mm) wird an einem Ende verschlossen oder mit einer Kollagenrückführungsschleife verbunden. Das Kollagen in dem Rohr wird unter positiven Druck gesetzt (entweder hydrostatisch oder Pumpe) und in eine Lösung aus Polyethylenglykol oder DEXTRANR in PBS gesetzt. Dies wird typischerweise über Nacht bei 2 bis 8ºC aufrechterhalten. Wenn Rohre mit größerem Durchmesser verwendet werden, kann die rohrförmige Kollagenstruktur aufgeschnitten und als eine Platte verwendet werden.
Fig. 4 der Zeichnungen zeigt eine weitere Vorrichtung zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung. Die Vorrichtung umfaßt eine Einrichtung, die einen äußeren Behälter 10 und einen inneren Behälter 20 hat. Der innere Behälter 20 ist mit einem Rand 15 versehen, um eine Einrichtung zum Positionieren des inneren Behälters 20 in dem äußeren Behälter 10 zu schaffen und dadurch einen äußeren Bereich 14 und einen inneren Bereich 22 zu definieren. Der innere Behälter 20 ist mit einem permeablen Element 24 versehen. Das permeable Element 24 ist abdichtend an dem inneren Behälter 20 angebracht und bildet die Bodenfläche desselben. Der Behälter 10 ist mit wenigstens einer Öffnung 21 versehen, die den Zugang zu dem äußeren Bereich 14 ermöglicht. Die in Fig. 4 gezeigte Vorrichtung wird typischerweise zur Herstellung von flachen Kollagenstrukturen verwendet
Gemäß vorliegender Erfindung wird ein Konzentrierungsmittel dem äußeren Behälter 10 zugeführt und eine Kollagenlösung wird dem inneren Behälter 20 zugeführt. Ein ausreichendes Volumen von Konzentrierungsmittel wird dem äußeren Behälter 10 zugeführt, so daß das Konzentrierungsmittel mit dem permeablen Element in Berührung kommt. Falls erwünscht, kann das Konzentrierungsrnittel während der Bildung der Kollagenstruktur mittels der Öffnung 21 ausgetauscht werden. Die Vorrichtung und ihr Inhalt werden anschließend unter Bedingungen gehalten, die die Bildung einer Kollagenstruktur gemäß vorliegender Erfindung erlauben. In derartige Strukturen können dann Zellen eingesetzt werden, um ein Gewebeäquivalent zu bilden, z.B. Keratinozyten zur Bildung eines Hautgewebeäquivalents.
In einigen Ausführungsformen ist die äußere Kammer 10 mit einer Einlaßeinrichtung und einer Auslaßeinrichtung versehen, so daß das Konzentrierungsmittel problemlos ausgetauscht oder zirkuliert werden kann.
Die Kollagenstrukturen gemäß vorliegender Erfindung wurden erfolgreich unter Verwendung von chirurgischen Standardtechniken in Säugetiere eingepflanzt. In einer Studie wurden Schaf-Blutgefäßäquivalente, die unter Verwendung einer Kollagenstruktur gemäß vorliegender Erfindung hergestellt wurden, als ein Einsetztransplantat in die oberflächliche Oberschenkelarterie von Schafen implantiert. Die Blutgefäßgewebeäquivalente wurden hergestellt, indem Endothelzellen auf der luminalen Oberfläche und glatte Muskelzellen auf der abluminalen Oberfläche von rohrförmigen Kollagenstrukturen vorgesehen wurden, die gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung erzeugt wurden. Derartige Blutgefäßgewebeäquivalente waren typischerweise etwa 5 cm lang und hatten einen Innendurchrnesser von etwa 0,45 mm. Die Dicke derartiger Blutgefäßgewebeäquivalente bei der Implantation lag im Bereich von etwa 0,3 bis 0,7 mm.
Derartige Blutgefäßgewebeäquivalentimplantate wurden bis zu dreißig Tage lang an Ort und Stelle belassen und blieben offen, wie durch Angiogramm und Dopplerultraschall gezeigt, welche Techniken dem Durchschnittsfachmann bekannt sind. Nach dem Entfernen nach dreißig Tagen hatte das Implantat nur eine geringe Fibrinplättchenablagerung an der Oberfläche.
Die Erfindung ist unter Bezug auf die folgenden Beispiele besser verständlich, die eine rein beispielhafte Natur haben und nicht zur Einschränkung des Schutzbereichs der Erfindung verwendet werden sollen.
Eine Vorrichtung ähnlich der in Fig. 1 bis 3 gezeigten, wurde in den folgenden Beispielen verwendet.

Beispiel 1:

Herstellung einer um ein poröses Element gebildeten und bei Raumtemperatur getrockneten Kollagenstruktur
1. Die Vorrichtung wurde in vertikaler Stellung gehalten, d.h. die Abdeckeinrichtung 70 befindet sich während der Bildung der Struktur an der Oberseite und die Abdeckeinrichtung 71 an der Unterseite der Vorrichtung. Die äußere Kammer 10, die einen porösen keramischen Formkern mit 4,5 mm Durchmesser mit einer Porengröße von 1,5 µm (Coors Ceramics Co.) enthielt, wurde mit 2,5 mg/ml Kollagen in 0,5% Essigsäure bei 2 bis 8ºC gefüllt, das wie in der EP-A-0 419 111 beschrieben hergestellt wurde.
2. Ein annähernd 60 ml Kollagen enthaltender Vorratsbehälter wurde dann an der oberen Anschlußeinrichtung 81 angebracht. Die Funktion dieses Vorratsbehälters ist das Ersetzen des Volumens, das während der Bildung der Kollagenstruktur verloren wird.
3. 200 ml einer Lösung von 20% Polyethylenglykol MW 8000 (Sigma Chemical Co.) in isotoner phosphatgepufferter Salzlösung bei 2 bis 8ºC wurden dann 96 Stunden lang bei 2 bis 8ºC unter vermindertem Druck durch den keramischen Formkern zirkuliert.
4. Die Vorrichtung wurde dann zerlegt und der die Kollagenstruktur enthaltende Formkern sorgfältig entfernt und 18 bis 24 Stunden bei Raumtemperatur getrocknet.
5. Die Kollagenstruktur wurde dann in isotoner Salzlösung bei Raumtemperatur mindestens zwei Stunden lang rehydriert.
6. Die rehydrierte Kollagenstruktur wurde anschließend sorgfältig durch Umstülpung von dem porösen keramischen Formkern abgenommen.
7. Die Berstfestigkeit von wie vorstehend beschrieben gebildeten Kollagenstrukturen wurde mit der Berstfestigkeit von Blutgefäßäquivalenten verglichen, die gemäß den Patenten gebildet wurden (im nachfolgenden "BVE"). Die Resultate eines derartigen Tests zeigen Berstfestigkeiten von 750, 460 bzw. 760 mm Hg für die Strukturen im Vergleich zu 310 mm Hg für die BVE.

Beispiel 2:

Herstellung einer innerhalb eines porösen Elements unter Verwendung von Polyethylenglykol bei neutralem pH gebildeten und bei Raumtemperatur getrockneten Kollagenstruktur.

1. Ein Zylinder mit 5 mm Durchmesser aus Polycarbonatmembran (Porengröße 5 µm) (Nuclepore Corp.) wurde gebildet, indem die Membran um einen 5 mm Glasstab gelegt wurde und eine Naht unter Verwendung einer Impulsschweißeinrichtung (TEW Electric Heating Equipment Co., Inc.) warmverschweißt wurde.
2. Der Zylinder wurde an einem Ende durch Luer-fittings verschlossen und das andere Ende wurde mit einem 6 ml Vorratsbehälter mit 2,5 mg/ml Kollagen in 0,05% Essigsäure bei 2 bis 8ºC verbunden.
3. Das Füllen des Zylinders durch das Kollagen wurde ermöglicht und dieser aufrecht in einem Behälter angeordnet, der 6 L 20% Polyethylenglykol MW 8000 (Sigma Chemical Co.) in isotoner phosphatgepufferter Salzlösung mit pH 7 bei 2 bis 8ºC enthielt.
4. Das Polyethylenglykol wurde unter Verwendung eines Magnetrührstabes und eines Motors zirkuliert. Die Vorrichtung wurde 36 Stunden lang auf 2 bis 8ºC gehalten.
5. Die Membran wurde sorgfältig entfernt und ein 3 mm Glasstab in das Innere der gebildeten rohrförmigen Kollagenstruktur eingeführt.
6. Die Trocknung des Kollagenrohres für 18 bis 24 Stunden bei Raumtemperatur wurde ermöglicht.
7. Die Kollagenstruktur wurde in isotoner phosphatgepufferter Salzlösung bei Raumtemperatur mindestens zwei Stunden lang rehydriert.
8. Die rehydrierte Kollagenstruktur wurde anschließend sorgfältig von dem porösen keramischen Formkern durch Umstülpung abgenommen.
9. Die Berstfestigkeit von wie vorstehend beschrieben hergestellten Kollagenstrukturen wurde getestet und mit Blutgefäßäquivalenten (BVE) verglichen, die gemäß den Patenten hergestellt wurden. Die Resultate eines derartigen Tests zeigten Berstfestigkeiten von 700, 480 bzw. 800 mm Hg für drei Strukturen im Vergleich zu einer Berstfestigkeit von 310 mm Hg für das BVE.

Beispiel 3:

Herstellung einer innerhalb eines porösen Elements gebildeten und bei 2 bis 8ºC getrockneten Kollagenstruktur.
Die Struktur wurde wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, daß das 20% Polyethylenglykol in einer isotonen Lösung von 0,05% Essigsäure war.

Beispiel 4:

Herstellung einer um ein poröses Element gebildeten und bei 2 bis 8ºC getrockneten Kollagenstruktur.
1. Die Kollagenstruktur wurde wie in Beispiel 1, Schritt 1 bis 3 beschrieben hergestellt.
2. Die Trocknung der Kollagenstruktur bei 2 bis 8ºC für 18 bis 24 Stunden wurde ermöglicht.
3. Die Kollagenstruktur wurde anschließend in isotoner Salzlösung 18 bis 24 Stunden lang bei 2 bis 8ºC rehydriert.
4. Die Erwärmung der rehydrierten Kollagenstruktur auf 37ºC für acht Stunden wurde anschließend ermöglicht.
5. Die rehydrierte Kollagenstruktur wurde anschließend sorgfältig von dem porösen keramischen Forrnkern durch Umstülpung abgenommen.

Beisiel 5:

Herstellung einer innerhalb eines porösen Elements geformten und bei 2 bis 8ºC getrockneten Kollagenstruktur.

1. Die Kollagenstruktur wurde wie in Beispiel 2, Schritt 1 bis 3 oder in Beispiel 3 beschrieben hergestellt.
2. Die Trocknung der Kollagenstruktur für 18 bis 24 Stunden bei 2 bis 8ºC wurde ermöglicht.
3. Die Kollagenstruktur wurde anschließend in isotoner Salzlösung 18 bis 24 Stunden bei 2 bis 8ºC rehydriert.
4. Die Erwärmung der rehydrierten Kollagenstruktur auf 36ºC für acht Stunden wurde anschließend ermöglicht.
5. Das poröse Element wurde dann sorgfältig entfernt.

Beispiel 6:

Herstellung von porösen Kollagenstrukturen durch Lyophilisierung.

Kollagenstrukturen, die gemäß Beispiel 1, Schritt 1 bis 3, Beispiel 2, Schritt 1 bis 5, Beispiel 3 und Beispiel 4, Schritt 1 bis 5 gebildet wurden, können durch Einfrieren der Struktur auf -20ºC und Trocknen durch Lyophilisierung (The Virtis Co., Inc.) getrocknet werden.

Beispiel 7:

Herstellung von porösen Kollagenstrukturen durch Inkorporierung von Polyvinylalkohol.

Die Kollagenstruktur wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, daß die Kollagenlösung mit 10 mg/ml Mono-Sol Serie 7-000 Polyvinylalkohol (Chris-Craft Industrial Products Inc.) ergänzt wurde. Der Polyvinylalkohol wurde aus der Struktur entfernt, um darin Poren zu formen, indem die Struktur mit Wasser behandelt wurde.

Beispiel 8:

Herstellung einer Kollagenstruktur, die ein Netzstützelement aufweist.

Derartige Strukturen wurden wie in Beispiel 1 bis 5 beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, daß ein DACRON -Netz über den Formkern in den vorstehenden Beispielen 1 und 4 gezogen wurde oder innerhalb des permeablen Elements in den Beispielen 2, 3 und 5 gehalten wurde. Der Netzdurchmesser war vorzugsweise an die Größe des permeablen Elements angepaßt und war in dichtem Kontakt mit diesem. Das Netz wurde dann in den Körper der Kollagenstruktur inkorporiert.
Kollagenstrukturen wurden wie in vorstehendem Beispiel 1 und 2 hergestellt, wobei weiter ein Netz eingeschlossen wurde. Die Berstfestigkeit derartiger Strukturen wurde getestet und die Resultate von drei derartigen Tests werden mit der Berstfestigkeit eines BVE verglichen. Drei Strukturen, die nach Beispiel 1 mit einen Netz hergestellt wurden, zeigten Berst festigkeiten von 840, 750 bzw. 550 mm Hg. Zwei nach Beispiel 2 hergestellte Strukturen mit einem Netz zeigten Berstfestigkeiten von 460 und 530 mm Hg. Im Vergleich zeigte das BVE eine Berstfestigkeit von 310 mm Hg.

Beispiel 9:

Einsetzen von Zellen in eine Kollagenstruktur zu Bildung eines Blutgefäßäquivalents.

Kollagenstrukturen wurden nach den vorstehenden Beispielen 1 und 2 gebildet und anschließend wurden Zellen durch ein dem nachfolgend beschriebenen ähnliches Verfahren eingesetzt:
1. Die rehydrierte Kollagenstruktur wurde in eine Vorrichtung ähnlich der in Fig. 1 bis 3 gezeigten anstelle des permeablen Elements 100 eingesetzt und mit Seidennähten fixiert.
2. Der abluminale Raum wurde mit einer Suspension von glatten Schaf-Muskelzellen (2 x 10 /ml) in MCDB-107 Medium (Hazelton Labs.) mit 2% Serum, 1% Glutamin, 5 ug/ml Insulin, 0,1 ug/ml Heparinbindungswachstumsfaktor-1 (Upstate Biomedical), 0,5% Penicillin/Streptomycin, 10 ug/ml Transferrin gefüllt.
3. Die Form wurde 24 Stunden bei 0,5 upm bei 37ºC in Umdrehung versetzt.
4. In dem Lumen wurden Endothelzellen bei 1 x 10 /m² als eine Suspension in MCDB-107, 10% Serum, 1% Glutamin, 0,5% Penicillin/Streptomycin, 5 ug/ml Insulin, 0,1 ug/ml Heparinbindungswachstumsfaktor-1 und 10 ug/ml Transferrin eingesetzt.
5. Die Form wurde drei Stunden lang mit 0,5 upm in Umdrehung versetzt.
6. Ein MCDB-107, 10% Serum, 1% Glutamin, 0,5% Penicillin/Streptomycin, 0,5 ug/ml Insulin, 0,1 ug/ml Heparinbindungswachstumsfaktor-1 und 10 ug/ml Transferrin enthaltendes Medium wurde anschließend durch das Lumen mit 0,3 ml/min. mindestens 48 Stunden lang perfundiert.
Derartige Blutgefäßgewebequivalente wurden, wie vorstehend beschrieben, in Schafe implantiert.

Claims

1. Verfahren zur Bildung einer Kollagen enthaltenden Struktur, welches Verfahren die Schritte umfaßt:

(a) Herstellen einer Lösung, die einem permeablen Element -benachbart Kollagen enthält, wobei das permeable Element in Kontakt mit einem Konzentrierungsrnittel ist; und

(b) Halten der Kollagenlösung, des permeablen Elements und des Konzentrierungsmittels unter Bedingungen, die ausreichen, um die Bildung der Kollagenstruktur an dem permeablen Element zu ermöglichen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend den Schritt, daß die Bildung von Fibrillen in der Kollagenstruktur veranlaßt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei welchem das Konzentrierungsmittel einen osmotischen Druck hat, der höher ist als derjenige der Kollagenlösung.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei welchem das Konzentrierungsmittel ein Polymer umfaßt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, bei welchem das Konzentrierungsmittel wenigstens einen der Stoffe Polyethylenglykol oder DEXTRAN enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 4, bei welchem das Konzentrierungsmittel ein Polymer in einer Salzlösung enthält.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei welchem das Konzentrierungsrnittel eine Lösung aus Polyethylenglykol oder DEXTRAN in Natriumchlorid umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei welchem das Konzentrierungsmittel eine Lösung von 20% Gewicht/Volumen Polyethylenglykol, das ein Molekulargewicht von etwa 8000 hat, in phosphatgepufferter Salzlösung umfaßt.

9. Verfahren nach Anspruch 2, bei welchem das Konzentrierungsmittel ein Polymer in einer Salzlösung umfaßt und die Bildung der Fibrillen mittels der Steigerung des pH und der Ionenstärke des Konzentrierungsmittels veranlaßt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 2, bei welchem die Bildung der Fibrillen in der Kollagenstruktur durch Steigerung von wenigstens zwei Werten aus (a) dem pH, (b) der Salzkonzentration oder (c) der Temperatur der Kollagenstruktur veranlaßt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei welchem das permeable Element eine Membran umfaßt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, bei welchem die Membran ein poröses Material aus Keramik oder rostfreiem Stahl, eine Dialyseröhre oder eine poröse Polycarbonatmembran umfaßt.

13. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, ferner umfassend den Schritt des Versehens der Kollagenstruktur mit Zellen.

14. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, ferner umfassend den Schritt der Bildung von Poren in der Kollagenstruktur.

15. Verfahren nach Anspruch 14, bei welchem die Poren mittels der Inkorporierung eines Polymers in die Kollagenstruktur gebildet werden und das Verfahren ferner den Schritt des Entfernens des Polymers aus der Kollagenstruktur umfaßt.

16. Verfahren nach Anspruch 15, bei welchem das Polymer Polyvinylalkohol oder Hyaluronsäure ist.

17. Verfahren nach Anspruch 2, bei welchem die Kollagenstruktur eine Berstfestigkeit von etwa 300 bis 1000 mm/hg hat.

18. Verfahren nach Anspruch 2, bei welchem die Kollagenstruktur eine Berstfestigkeit hat, die höher ist als 1000 mm/hg.

19. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei welchem die Kollagenlösung eine Konzentration von etwa 5 bis 10 mg/ml Kollagen und einen pH von etwa 2 bis 4 hat.

20. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei welchem die Kollagenstruktur mit einem Stützelement versehen ist.

21. Verfahren nach Anspruch 20, bei welchem das Stützelement ein Polyester umfaßt.

22. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei welchem die Kollagenlösung mindestens einen der Stoffe aus einem angiogenen Faktor, einem Antientzündungsmittel, einem chemotaktischen Mittel oder einem Kollagenasehemmstoff umfaßt.

23. Verfahren zur Bildung einer rohrförmigen Kollagenstruktur gemäß Anspruch 1 oder 2 unter Verwendung einer Vorrichtung, die eine innere und eine äußere Kammer hat, wobei die Grenzfläche zwischen der inneren und der äußeren Kammer ein rohrförmiges permeables Element umfaßt, welches Verfahren die Schritte umfaßt:

(a) Vorsehen der Kollagen enthaltenden Lösung in der äußeren Kammer;

(b) Vorsehen des Konzentrierungsmittels in der inneren Kammer; und

(c) Halten der Kollagenlösung des permeablen Elements und des Konzentrierungsmittels unter Bedingungen, die ausreichen, um die Bildung der Kollagenstruktur an dem permeablen Element zu ermöglichen.

24. Verfahren zur Bildung einer rohrförmigen Kollagenstruktur gemäß-Anspruch 1 oder 2 unter Verwendung einer die eine innere und eine äußere Kammer hat, wobei die Grenzfläche zwischen der inneren und der äußeren Kammer ein rohrförmiges permeables Element umfaßt, welches Verfahren die Schritte umfaßt:

(a) Vorsehen der Kollagen enthaltenden Lösung in der inneren Kammer;

(b) Vorsehen des Konzentrierungsmittels in der äußeren Kammer; und

(c) Halten der Kollagenlösung, des permeablen Elements und des Konzentrierungsrnittels unter Bedingungen, die ausreichen, um die Bildung der Kollagenstruktur an dem permeablen Element zu ermöglichen.

25. Verfahren zur Bildung einer mehrschichtigen rohrförmigen Kollagenstruktur unter Verwendung einer Vorrichtung, die eine innere und eine äußere Kammer hat, wobei die Grenzfläche zwischen der inneren und der äußeren Kammer ein rohrförmiges permeables Element umfaßt, welches Verfahren die Schritte umfaßt.

(a) Vorsehen einer ersten Lösung, die Kollagen bei einem pH von etwa 2 bis 4 enthält, in der äußeren Kammer;

(b) Vorsehen eines Konzentrierungsmittels in der inneren Kammer;

(c) Halten der ersten Kollagenlösung, des permeablen Elements und des Konzentrierungsmittels unter Bedingungen, die ausreichen, um die Bildung der rohrförmigen Kollagenstruktur an dem permeablen Element zu ermöglichen.

(d) Ersetzen der ersten Kollagenlösung durch eine zweite Lösung, die Kollagen umfaßt; und

(e) Halten der zweiten Kollagenlösung, des permeablen Elements und des Konzentrierungsmittels unter Bedingungen, die ausreichen, um die Bildung einer zweiten rohrförmigen Struktur außerhalb der ersten rohrförmigen Struktur zu ermöglichen; und

(f) Wiederholen der Schritte (d) und (e), falls zusätzliche Schichten von rohrförmiger Kollagenstruktur erwünscht sind.

26. Rohrförmige Struktur, gebildet gemäß dem Verfahren nach Anspruch 25, bei welchem die Struktur mit lebenden Zellen versehen ist, um ein Blutgefäß- oder Hautgewebeäquivalent zu bilden.

27. Verfahren zur Bildung einer flachen Kollagenstruktur durch Verwendung einer Vorrichtung, die einen inneren und einen äußeren Behälter hat, wobei die Grenzfläche zwischen der inneren und der äußeren Kammer ein flaches permeables Element umfaßt, welches Verfahren die Schritte umfaßt:

(a) Vorsehen einer Kollagen enthaltenden Lösung in der inneren Kammer;

(b) Vorsehen eines Konzentrierungsmittels in der äußeren Kammer; und

(c) Halten der Kollagenlösung, des permeablen Elements und des Konzentrierungsmittels unter Bedingungen, die ausreichen, um die Bildung der flachen Struktur an dem permeablen Element zu ermöglichen.

28. Flache Struktur, gebildet gemäß dem Verfahren nach Anspruch 27, bei welchem die Struktur mit lebenden Zellen versehen ist, um ein Blutgefäß- oder Hautgewebeäquivalent zu bilden.

29. Gewebeäquivalent, umfassend eine Struktur, die gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 und mit einem oder mehreren Zelltypen gebildet ist.