DE69102265T2 - Immunkomplexe. - Google Patents

Immunkomplexe.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Immun-Komplexe biologisch aktiver Substanzen, die therapeutisch wirksam sind, und auf monoklonale Antikörper, die das Verteilungsvolumen der biologisch aktiven Substanzen in vivo auf das 0,5-fache oder weniger reduzieren.
  • Das Verteilungs-Volumen oder das Volumen der Verteilung ist ein Maß des scheinbaren Raumes im Körper, der zum Enthalten eines Wirkstoffs oder einer biologischen aktiven Substanz verfügbar ist. Das Volumen der Verteilung bezieht sich auf die Wirkstoffmenge im Körper zur Konzentration des Wirkstoffs im Blut oder Plasma in Abhängigkeit von der gemessenen Flüssigkeit [L. Goodman und E. Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, (1985), MacMillan Publishing Company, New York, NY, S. 22-28].
  • Biologisch aktive Substanzen sind zur Behandlung menschlicher oder tierischer Erkrankungen wirksam. Falls diese Substanzen jedoch falsch verwendet werden, werden nicht nur die Krankheiten nicht behandelt, sondern es werden ernste Nebenwirkungen erzeugt. In einigen Fällen rufen derartige Nebenwirkungen bei Menschen oder Tieren den Tod hervor. Wenn demgemäß biologisch aktive Substanzen zum Behandeln menschlicher oder tierischer Erkrankungen verabfolgt werden, ist es notwendig, sorgfältig in betracht zu ziehen, daß die biologisch aktiven Substanzen an ihren Wirkungsstellen nur während geeigneter Zeiträume in geeigneten Konzentrationen vorhanden sind. Zu diesem Zweck werden in vielen Fällen die folgenden Verfahren eingesetzt:
  • (1) Die Verfahren zum Verwenden der biologisch aktiven Substanzen werden optimiert,
  • (2) die medizinischen Verschreibungen der biologisch aktiven Substanzen werden verbessert oder
  • (3) die biologisch aktiven Substanzen selbst werden zu gänzlich verschiedenen Verbindungen strukturell modifiziert.
  • Beispiele der Optimierung von (1) schließen Änderungen bei den Verabreichungswegen ein (wie etwa intravenöse, subkutane, intramuskuläre und orale Verabreichungen). Die Verteilung und Halbwertszeit der Wirkstoffe können jedoch nicht verändert werden.
  • Als Beispiele der Verbesserungen bei in (2) beschriebenen medizinischen Verschreibungen können Liposomen und Mikrokapseln verwendet werden. In beiden Fällen werden die Wirkstoffe oder Wirkstofflösungen in Vesikeln verkapselt und es wird versucht, geeignete Konzentrationen in vivo hauptsächlich durch eine verzögerte Freisetzung der Wirkstoffe zu erhalten. Es ist jedoch allgemein schwierig, die Halbwertszeit und die Verteilung der Wirkstoffe selbst zu ändern.
  • Wenn die biologisch aktiven Substanzen selbst wie in (3) beschrieben strukturell modifiziert werden, können sich die Eigenschaften, wie etwa die Halbwertszeit, die Verteilung und der Metabolismus in vivo ändern. Die pharmakologische Wirkung der biologisch aktiven Substanzen selbst wird jedoch gelegentlich in Quantität und Qualität gänzlich geändert.
  • Zum Beispiel ist Interleukin-2 (nachfolgend auch kurz IL-2 genannt) eine derartige biologisch aktive Substanz. IL-2 ist ein lösliches Protein, das durch ein Lectin oder ein Antigen aktivierte T-Zellen gebildet wird, und verstärkt die Zellimmunität mit der Wirkung der Vermehrungsförderung und der Differenzierung von NK-Zellen, Killer-T-Zellen, Helfer-T-Zellen und B-Zellen. Deshalb steht IL-2 zum Umkehren eines gesunkenen Immunitätszustandes zu einem normalen Zustand zur Verfügung. Diese immunologische Aktivität des IL-2 ist zur Behandlung von Krebs, bakteriellen oder viralen Infektionskrankheiten, Autoimmunerkrankungen, Immunschwäche oder dergleichen nützlich.
  • IL-2 besitzt jedoch eine kurze biologische Halbwertszeit und ein großes Verteilungsvolumen. Zum Beispiel wird berichtet, daß die Halbwertszeit von IL-2 bei der Entfernung aus dem Blut 6,9 Minuten beträgt, wenn es an Menschen verabfolgt wird [M. Taotze et al., Journal of Immunology 135, 2865-2875 (1985)]. Obschon es wenige Beispiele gibt, bei welchen das Verteilungsvolumen von IL-2 berechnet wird, ist die Anfangskonzentration des IL-2 im Plasma niedrig, wenn das IL-2 verabfolgt wird. Obschon man nicht an eine bestimmte Theorie gebunden zu werden wünscht, kann die niedrige Anfangskonzentration von IL-2 im Plasma durch die Annahme erklärt werden, daß das IL-2 sowohl in der extrazellulären Flüssigkeit als auch im Plasma verteilt wird [C. Bindon et al., British Journal of Cancer 47, 123-133 (1983)]. Cytokine werden auf diese Weise rasch aus den Organismen ausgeschieden und besitzen ein großes Verteilungsvolumen. Es wird daher erwartet, daß in Fällen einer klinischen Behandlung IL-2 keine befriedigende Wirkung zeigt oder hohe Dosen erfordert. Wenn IL-2 Organismen in großen Mengen gegeben wird, wird erwartet, daß das IL-2 über den gesamten Organismus verteilt wird, was zu erhöhten Nebenwirkungen führt.
  • Ein Weg zum Verbessern derartiger Eigenschaften von IL-2 ist, den Therapieplan zu verbessern. Zum Beispiel ist versucht worden, die Wirkungszeit im Blut durch Erhöhen der Zahl der Verabreichungen ohne Ändern der Gesamtdosis zu erhöhen [Otsu et al., Cancer Immunology and Immunotherapy 30, 71-80 (1989)]. Weiter ist zum Zweck des Erhöhens der Halbwertszeit des IL-2 im Blut das Verfahren des Kombinierens von Polyethylenglykol mit dem IL-2 vorgeschlagen worden [Nishimura et al., japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 60-226821/1985, die der EP-154 316 entspricht, oder N. Katre et al., PCT/US86/01252 (WO87/00056A)]. In diesen Fällen ist jedoch das Verteilungsvolumen dasselbe wie das von IL-2. Es wird daher erwartet, daß das IL-2 über den gesamten Organismus verteilt wird, was zu keiner Abnahme der Nebenwirkungen führt, wenn dieselbe Menge IL- 2 gegeben wird.
  • Urokinase, eine biologisch aktive Substanz wird aus menschlichem Urin oder Gewebekulturen menschlicher Nephrozyten hergestellt und hydrolysiert Plasminogen unter direktem Bilden von Plasmin und löst Fibrin. Diese Substanz wird in Kombination mit Antikrebs-Wirkstoffen oder zur Behandlung zerebraler Thrombose, peripherer Arterien- oder Venenverschluß und akutem Herzinfarkt breit verwendet. Urokinase ist ein direkter Aktivator für Plasminogen und wird in Japan üblicherweise in einer Dosis von etwa 2400 bis etwa 240000 IE/Tag verwendet. In Bezug auf Menschen wird sie unmittelbar oder fortgesetzt in Arterien oder Venen injiziert. Urokinase mit hohem Molekulargewicht, Urokinase mit niedrigem Molekulargewicht und Prourokinase sind als Urokinase bekannt.
  • Um die Wirkstoffhöchstwirkung zu erhalten, wird manchmal versucht, den Therapieplan zu verbessern, um die Urokinase-Blutkonzentrationen ohne Ändern der Gesamtdosis konstant zu halten. Zum Beispiel werden Menschen 10% der gesamten Dosis auf einmal oder während 10 Minuten intravenös gegeben und die übrigen 90% werden während 4 Stunden ununterbrochen weiter in die Venen injiziert, wodurch es beabsichtigt ist, die Blutkonzentration zum Erhalten der Maximalwirkung konstant zu halten. In diesem Fall ist das Verteilungsvolumen jedoch dasselbe wie dasjenige von Urokinase. Es wird daher erwartet, daß Urokinase über den gesamten Organismus verteilt wird, was zu keiner Abnahme der Nebenwirkungen führt, wenn dieselbe Menge Urokinase gegeben wird.
  • In Anbetracht dessen, daß Thromben, die Ziele von Urokinase sind, in Blutgefäßen vorkommen, ist es erwünscht, die Halbwertszeit von Urokinase zu erhöhen und dadurch das Verteilungsvolumen auf etwa das 0,5-fache oder weniger zu reduzieren, um zu gewährleisten, da die Urokinase im Blut während eines langen Zeitraums in hohen Konzentrationen vorhanden ist.
  • Auf der anderen Seite sind Verfahren zum Herstellen derartiger monoklonaler Antikörper-Interferon-α-Immun-Komplexe, welche die Halbwertszeit von Interferon-α verlängern, durch Selektieren monoklonaler Antikörper berichtet worden [Frinke et al., japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 60-502104; PCT/US84/01389 (WO85/00974), und Cancer Research 45, 2421-2424 (1985)]. Die vorstehend beschriebene japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 60-502104 und WO85/00974 zeigen, daß das Verteilungsvolumen 20,8 ml beträgt, wenn Interferon-α intravenös gegeben wird, und daß dieses Verteilungsvolumen wenig verschieden von dem Verteilungsvolumen von 19,2 ml ist, wenn der monoklonaler Antikörper-Interferon-α-Immun-Komplex verabfolgt wird. Die vorstehend beschriebene Cancer Research berichtet, daß das Verteilungsvolumen 11,9 ml beträgt, wenn der monoklonaler Antikörper-Interferon-α-Immun-Komplex intravenös verabfolgt wird, verglichen damit, daß das Verteilungsvolumen 17,2 ml beträgt, wenn Interferon-α intravenös verabfolgt wird. Im Fall des Immun-Komplexes wird das Verteilungsvolumen daher nur auf das 0,69-fache reduziert. Dieser Reduktionsgrad des Verteilungsvolumens führt zu einer ungenügenden Erhöhung der Wirkstoffwirkung.
  • Die Pharmakokinetik wird oft als Verfahren zum Analysieren der Beziehung zwischen Adsorption, Verteilung und Entfernung biologisch aktiver Substanzen in vivo verwendet. Die sich daraus ergebenden Parameter stellen die Beziehungen zwischen der Verteilung, den Konzentrationen und Zeiten der biologisch aktiven Substanzen in vivo dar. Wenn zum Beispiel eine biologisch aktive Substanz intravenös verabfolgt wird und die Blutkonzentration der biologisch aktiven Substanz durch das am meisten idealisierte Abteilungs-Modell pharmakokinetisch analysiert wird, bei dem die gesamte Wirkstoffverabreichung direkt in eine einzelne Abteilung erfolgt, ist es möglich, das Verteilungsvolumen, das mit der Verteilung der biologisch aktiven Substanz in vivo in Bezug steht, und die Geschwindigkeitskonstante der Entfernung, die mit der Halbwertszeit in Bezug steht, zu berechnen.
  • Der bispezifische Antikörper, eine Art monoklonaler Antikörper, ist bereits in dem vorstehend beschriebenen Verfahren von Frinke et al. und in anderen Verfahren versucht worden. Es ist bis jetzt jedoch kein Antikörper beschrieben worden, der das Verteilungsvolumen in vivo ändert.
  • Falls ein biologisch aktiver Substanz-monoklonaler Antikörper- Immun-Komplex erhalten werden kann, der das Verteilungsvolumen der biologisch aktiven Substanz bedeutender erniedrigen kann als die biologisch aktive Substanz allein, kann die Blutkonzentration unter wirksamerem Zeigen deren Wirkung erhöht werden und die Nebenwirkungen können verringert werden.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die gegenwärtigen Erfinder haben verschiedene Komplexe aus einem monoklonalen Antikörper und einer biologisch aktiven Substanz untersucht, die das Verteilungsvolumen biologisch aktiver Substanzen mehr verringern können, wenn sie Organismen verabfolgt werden, als wenn die Substanzen allein verabfolgt werden. Als Ergebnis haben die gegenwärtigen Erfinder die Information erhalten, daß Immun-Komplexe, die das Verteilungsvolumen biologisch aktiver Substanzen auf das 0,5-fache oder weniger reduzieren können, die Blutkonzentration der biologisch aktiven Substanzen in vivo unter bedeutsamem Erhöhen der Wirkstoffwirkung erhöhen können und waren beim Erhalten derartiger Immun-Komplexe erfolgreich, wodurch die vorliegende Erfindung vollendet wurde.
  • Die vorliegende Erfindung stellt einen Immun-Komplex bereit, umfassend eine biologisch aktive Substanz und einen monoklonalen Antikörper, wobei der monoklonale Antikörper fähig ist, das Verteilungs-Volumen der Substanz auf das 0,5-fache oder weniger zu reduzieren, verglichen mit dem Fall, in dem die Substanz allein verwendet wird.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Fig.1-1 und 1-2 sind graphische Darstellungen, die Chromatogramme zeigen, welche durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) in Beispiel 2 erhalten wurden. Fig. 1-1 ist eine graphische Darstellung, die Chromatogramme zeigt, welche erhalten wurden, wenn auf handelsübliches Maus-IgG die HPLC mittels einer GS-520-Säule angewandt wird. Fig. 1-2 ist eine graphische Darstellung, die ein Chromatogramm zeigt, das erhalten wurde, wenn auf einen gereinigten monoklonalen anti-rhIL-2-Antikörper die HPLC mittels einer GS-520-Säule angewandt wird;
  • Fig. 2-1, 2-2 und 2-3 sind graphische Darstellungen, die Chromatogramme zeigen, welche durch HPLC mittels einer GS-520-Säule in Beispiel 3 erhalten wurden. Fig. 2-1, 2-2 und 2-3 zeigen die Ergebnisse des monoklonalen anti-rhIL-2-Antikörpers, von rhIL-2 und eines Immun-Komplexes des rhIL-2 beziehungsweise des monoklonalen anti-rhIL-2-Antikörpers (Molverhältnis 1:2);
  • Fig. 3 ist eine graphische Darstellung, welche die Beziehung zwischen der Serum-rhIL-2-Konzentration und der Zeit darstellt, welche erhalten wird, wenn im Versuchsbeispiel 1 eine gemischte Lösung (Gewichtsverhältnis: 1:5) von rhIL-2 und unspezifischem Maus-IgG verabfolgt wird, beziehungsweise wenn der Immun-Komplex aus rhIL-2 und monoklonalem Antikörper verabfolgt wird;
  • Fig. 4 ist eine graphische Darstellung, welche die Beziehung zwischen der Plasma-rhIL-2-Konzentration und der Zeit darstellt, welche erhalten wird, wenn im Versuchsbeispiel 3 eine gemischte Lösung (Gewichtsverhältnis: 1:5) des rhIL-2 und des unspezifischen Maus-IgG verabfolgt wird, beziehungsweise wenn der Immun- Komplex aus rhIL-2 und monoklonalem Antikörper verabfolgt wird;
  • Fig. 5 ist eine graphische Darstellung, welche die Beziehung zwischen der Plasma-Urokinase-Konzentration und der Zeit darstellt, welche erhalten wird, wenn im Versuchsbeispiel 6 ein Urokinase-monoklonaler Antikörper-Immun-Komplex verabfolgt wird, beziehungsweise wenn Urokinase allein verabfolgt wird, und
  • Fig. 6 ist eine graphische Darstellung, welche die Beziehung zwischen der Plasma-Urokinase-Konzentration und der Zeit darstellt, welche erhalten wird, wenn im Versuchsbeispiel 7 ein Urokinase-monoklonaler Antikörper-Immun-Komplex verabfolgt wird, beziehungsweise wenn Urokinase allein verabfolgt wird.
    • BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die biologisch aktiven Substanzen sind Substanzen mit einer biologischen Aktivität, die zum Aufrechterhalten der Lebenstätigkeit von Organismen, zum Erhalten der Hämostase und zum Entwickeln der Aktivität von Organismen notwendig sind. Im Fall einer Erkrankung, ist es möglich, die Funktionen der Organismen durch die Verwendung derartiger biologisch aktiver Substanzen zu normalen Bedingungen zu verbessern.
  • Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten biologisch aktiven Substanzen schließen zum Beispiel Proteine wie etwa Cytokine, Zellwachstumsfaktoren, Hormone und Enzyme, Peptide und Mutanten und Fragmente derselben mit einer biologischen Aktivität ein. Die Substanzen schließen ferner Antagonisten und Agonisten derselben ein. Sie schließen ferner Steroide, Antagonisten und Agonisten derselben und Arachidonat-Kaskaden ein.
  • Beispiele von Cytokinen schließen durch Aktivieren eines Makrophagen mit einem Antigen erhaltenes Interleukin-1, durch aktivierte T-Zellen mit einem Antigen erhaltenes Interleukin-2 (IL-2), durch einen spezifischen T-Zellen-Klon produziertes Interleukin-3, durch T-Zellen produziertes Interleukin-4, T- Zellen-ersetzender Faktor (TRF), B-Zellen-differenzierender Faktor (BCDF), antigener spezifischer Suppressor-Faktor (TsF), löslicher, Immunantwort-hemmender Faktor (SIRF), Suppressorinduzierender Faktor (SIF), Interferon-y (IFN-y), aus B-Zellen hergestellter B-Zellen-Wachstumsfaktor (BCGF), die B-Zellen- Differenzierung vergrößernder Faktor (BCDF), B-Zellen-Wachstum-Hemmfaktor (SBF), Makrophagen-aktivierender Faktor (MAF), von dem es heißt, daß er aus B-Zellen oder T-Zellen hergestellt wird, Makrophagen-Migration-Hemmfaktor (MIF), Leukozyten-Migration-Hemmfaktor (LIF), Lymphotoxin (LT), Interferon-α (INF- α), das Granulozyten-Koloniewachstum stimulierender Faktor (G- CSF), das Makrophagen-Koloniewachstum stimulierender Faktor (GM- CSF), Monozyten-Koloniewachstum stimulierender Faktor (M-CSF) und aus Fibroblasten hergestelltes Interferon-β (IFN-β) ein.
  • Außerdem schließen Cytokine auch Interleukine wie etwa Interleukin-5 und Interleukin-6, chemotaktische Faktoren, wie etwa chemotaktischer Makrophagen-Faktor (MCF) und chemotaktischer Lymphozyten-Faktor (LCF), inflammatorische Lymphokine, wie etwa vaskulärer Durchlässigkeitsfaktor (VPF), aus zytotoxischen T- Zellen hergestelltes Perforin und tumorizide Faktoren wie etwa von Lymphozyten stammendes Lymphotoxin ein.
  • Die Zellwachstumsfaktoren schließen hauptsächlich von Plättchen stammenden Zellwachstumsfaktor (PDGF), der hauptsächlich Fibroblasten und glatte Muskelzellen zum Ziel hat, Epitheliumszellen-Wachstumsfaktor (EGF), der hauptsächlich Fibroblasten, glatte Muskelzellen, vaskuläre Endotheliumszellen, Epitheliumszellen und Chondrozyten zum Ziel hat, Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), der hauptsächlich Fibroblasten, glatte Muskelzellen, vaskuläre Endotheliumszellen und Epitheliumszellen zum Ziel hat, Nervenwachstumsfaktor (NGF), der hauptsächlich Nervenzellen zum Ziel hat, Nervenwachstumsfaktor (IGF-I und IGF-II), der hauptsächlich Chondrozyten zum Ziel hat, und Erythropoietin-vermehrende Erythrozyten ein.
  • Beispiele der Hormone schließen Gewebeplasminogen-Aktivatoren (TPA), Insulin, Angiotensin I, Angiotensin II, Angiotensin III, Angiotensin II-Hemmer, atriale natriumdiuretische Peptide, Bradykinin, Calcitonin, Corticotropin, Dynorphin, Kyotorphin, Endorphin, Enkephalin, Secretin, Wachstumshormon-freisetzenden Faktor (GRF), Luteinisierungshormon-freisetzendes Hormon (LH- RH), Neurotensin, parathyroides Hormon (PTH), Oxytocin, Vasopressin, Vasotocin, Somatostatin, Thyrotropin-freisetzendes Hormon (TRH), menschliches Wachstumshormon, Thyroid-stimulierendes Hormon und Prolactin ein. Beispiele von Agonisten derselben schließen Leuprorelin ein.
  • Beispiele der Steroide schließen Progesteron, Estrogen, adrenocorticotropes Hormon, Aldosteron, Dexamethason, Estron, Estradiol und Dihydrotestosteron ein. Beispiele der Antagonisten der Steroide schließen Oxenedoron ein, welches ein Antagonist von Dihydrotestosteron ist.
  • Beispiele der Arachidonat-Kaskade schließen Prostaglandin E&sub2; ein.
  • Die Enzyme schließen Urokinase, Superoxid-Dismutase, Asparaginase und Adenosin-Deaminase ein.
  • Als biologisch aktive Substanzen sind Cytokine und Enzyme bevorzugt. Insbesondere werden IL-2, Urokinase und Prourokinase bevorzugt verwendet. Das IL-2 wird nachstehend im einzelnen beschrieben.
  • Wenn IL-2 als biologisch aktive Substanz verwendet wird, kann jedes verwendet werden, solange es aus einem Säuger stammt. Das gesamte Molekül des IL-2 oder Teilfragment-Peptide können auch verwendet werden. Das hier definierte IL-2 schließt aus menschlichen Zellen stammende IL-2-Komplexe und IL-2-Komplexe ein, die aus Mikroorganismen oder tierischen Zellen durch gentechnologische Techniken erhalten wurden, und ist durch die Herstellungsverfahren nicht beschränkt. Das IL-2 schließt ferner Substanzen mit ursprünglichen menschlichen IL-2-Komplexen als molekulare Grundgerüste ein, wie etwa Substanzen, in welchen die Aminosäuren teilweise durch gentechnologische Techniken substituiert sind, und Substanzen, in welchen die Aminosäurereste den N-terminalen Seiten und/oder den C-terminalen Seiten zugefügt oder davon entfernt sind.
  • Genauer schließt das IL-2 Substanzen mit einer der von IL-2 ähnlichen Aktivität ein, nämlich Substanzen mit der Aktivität, den Erhalt des Durchganges von T-Zellen zu ermöglichen, während deren Funktionen erhalten werden. Genau können zum Beispiel Polypeptid (I) (Human-IL-2) mit der in Fig. 1 der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung Nr. 61-78799/1986, die der EP-176 299 entspricht, dargestellten Aminosäuresequenz und ein Polypeptid mit einem Teil der für seine biologische oder immunologische Aktivität notwendigen Aminosäuresequenz verwendet werden. Beispiele derartiger Polypeptide schließen ein Polypeptid ein, dem ein Aminosäurerest am Aminoende des Polypeptid (I) fehlt (europäische Patentveröffentlichung Nr. 91539), ein Polypeptid, dem 4 Aminosäurereste an dessen Aminoende fehlen (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 60- 126088/1985), und ein Polypeptid, dem mehrere Aminosäurereste an dem Teil des Carboxyl-Endes fehlen. Weiter kann ein Teil der Aminosäurerestbestandteile des vorstehenden Polypeptids (I) entfernt oder durch eine unterschiedliche Aminosäure oder unterschiedliche Aminosäuren ersetzt sein. Zum Beispiel kann der Cystinrest an Position 125 durch einen Serinrest ersetzt werden (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 59-93093/1984, die dem US-Patent Nr. 4 518 584 entspricht).
  • Insbesondere wird Human-IL-2 mit der in Fig. 1 der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung Nr. 61-78799/1986, die der EP-176 299 entspricht, dargestellten Aminosäuresequenz vorzugsweise verwendet. In diesem Fall kann das IL-2 ein Gemisch eines Polypeptids mit einem Methioninrest (Met) an dem Aminoende und ein Polypeptid ohne Met (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 60-115528/1985, die der EP-145 390 entspricht und die japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 61- 78799/1986) oder ein Polypeptid ohne Met an dem Amino-Ende und von einem Alaninrest (Ala) ausgehend sein (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 61-78799/1986). Weiter kann das IL-2 ein Polypeptid mit einer Zuckerkette oder Zuckerketten sein.
  • Als nächstes wird nachstehend Urokinase beschrieben. Urokinase mit hohem Molekulargewicht, Urokinase mit niedrigem Molekulargewicht und Prourokinase sind als Urokinase bekannt. Andere Urokinasefragmente und von anderen Säugern als dem Menschen stammende Urokinase kann ebenfalls verwendet werden. Die hier definierte Urokinase ist nicht auf Urokinase beschränkt, die durch gentechnologische Techniken aus Mikroorganismen oder tierischen Zellen erhalten wurde. Die Urokinase schließt ferner Substanzen, die ursprüngliche Urokinase als Molekülgrundgerüst besitzen, wie etwa Muteine, in welchen die Aminosäuren teilweise durch gentechnologische Techniken ersetzt sind, und Substanzen ein, in welchen Aminosäurereste den N-terminalen Seiten und/oder C- terminalen Seiten zugefügt oder davon entfernt sind.
  • Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten monoklonalen Antikörper werden als Immun-Komplexe mit den biologisch aktiven Substanzen verwendet. Jeder monoklonale Antikörper kann verwendet werden, solange er das Verteilungsvolumen der Substanz in vivo um etwa das 0,5-fache oder weniger reduzieren kann, wenn der Immun-Komplex einem Organismus verabfolgt wird.
  • Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten monoklonalen Antikörper können die Bluthalbwertszeit verlängern oder nicht verlängern, wenn sie als Immun-Komplex verwendet werden.
  • Von den Immun-Komplexen der vorliegenden Erfindung wird erwartet, daß sie die Nebenwirkungen der biologisch aktiven Substanzen verringern, weil das Verteilungsvolumen auf das 0,5- fache oder weniger verringert ist.
  • Weiter wird bei den Immun-Komplexen der vorliegenden Erfindung von den die Halbwertszeit verlängernden Immun-Komplexen erwartet, daß sie die Wirkung der biologisch aktiven Substanzen fortführen.
  • Die monoklonalen Antikörper werden durch Herstellen von Hybridomzellen zum Produzieren der monoklonalen Antikörper, welche durch Verwenden der biologisch aktiven Substanzen oder deren Derivate als Immunogene erhalten werden, und anschließend Kultivieren der Hybridomzellen erhalten.
  • Beim Herstellen der in der vorliegenden Erfindung verwendeten, monoklonale Antikörper produzierenden Hybridomzellen können alle Hybridomzellen verwendet werden, solange sie monoklonale Antikörper produzieren, die für die biologisch aktiven Substanzen spezifisch sind, Immun-Komplexe mit den biologisch aktiven Substanzen bilden und das Verteilungsvolumen der biologisch aktiven Substanzen mehr verringern, wenn die Komplexe Organismen verabfolgt werden, als wenn die Substanzen allein verabfolgt werden.
  • Die monoklonalen Antikörper können die biologische Aktivität der biologisch aktiven Substanzen neutralisieren.
  • Die zum Herstellen der Hybridomzellen verwendeten Immunogene schließen die vorgenannten biologisch aktiven Substanzen und Derivate derselben (zum Beispiel Mutanten und Fragmente derselben, die zu den vorstehenden Substanzen ähnlich wirken) und Antagonisten und Agonisten der vorstehenden Substanzen und Derivate derselben (zum Beispiel Mutanten und Fragmente derselben, die dazu ähnlich wirken) ein. Bei den Derivaten sind die Fragmente besonders bevorzugt.
  • Als Immunogene können hitzedenaturierte, biologisch aktive Substanzen verwendet werden und werden in einigen Fällen bevorzugt verwendet.
  • Tiere (zum Beispiel Kaninchen, Ratten, Mäuse und Meerschweinchen) werden mit den vorgenannten Immunogenen, so wie sie sind oder mit Trägerproteinen kombiniert, immunisiert, um Antikörperproduzierende Zellen zu erhalten.
  • Beispiele derartiger Trägerproteine schließen Rinderserumalbumin (BSA), Ovalbumin (OVA), Schlüsselloch-Limpet-Hämocyanin (KLH) und Thyroglobulin ein.
  • Zur Kombination der biologisch aktiven Substanzen mit den Trägerproteinen werden zum Beispiel Cysteinteile der biologisch aktiven Substanzen verwendet. Die Trägerproteine werden zuvor zum Beispiel durch N-(y-Maleimidobutyryloxysuccinimid) (nachstehend auch kurz als GMBS bezeichnet) maleimidiert oder durch N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (nachstehend auch kurz als SPDP bezeichnet) dithiopyridyliert, wodurch die vorstehenden, biologisch aktiven Substanzen chemisch mit den Trägerproteinen über die in den biologisch aktiven Substanzen enthaltenen SH-Gruppen der Cys-Reste kombiniert werden können.
  • Die Antikörper-produzierenden Hybridomzellen werden durch das Verfahren des Immunisierens von Tieren mit den vorstehenden biologisch aktiven Substanzen, Derivaten derselben oder kondensierten Produkten derselben mit den Trägerproteinen gemäß bekannter Verfahren und fusionieren der sich daraus ergebenden, Antikörper-produzierenden Zellen mit Myelomzellen hergestellt. Als die zu immunisierenden Tiere werden zum Beispiel Kaninchen, Ratten, Mäuse und Meerschweinchen verwendet. Wenn die monoklonalen Antikörper hergestellt werden, sind jedoch Mäuse besonders bevorzugt. Die Beimpfung wird gemäß bekannter Verfahren ausgeführt. Zum Beispiel werden etwa 1 bis 100 ug, vorzugsweise etwa 10 bis 25 ug, die in demselben Volumen (0,1 ml) Kochsalzlösung und komplettem Freundschen Adjuvans emulgiert sind, einmal alle 2 bis 3 Wochen insgesamt etwa 3 bis 6 Mal in jeder der Mäuse subkutan an ihrem Rückenteil oder intraperitoneal eingeimpft.
  • Einzelne Tiere mit einem hohen Antikörpertiter werden aus diesen immunisierten Tieren wie etwa Mäusen ausgewählt und die Milzen und/oder Lymphzellen werden daraus etwa 3 bis 5 Tage nach der letzten Immunisierung gesammelt. Anschließend werden die darin enthaltenen, Antikörper-produzierenden Zellen mit den Myelomzellen fusioniert. Das Fusionierungsverfahren kann gemäß bekannter Verfahren ausgeführt werden. Fusionierungsbeschleuniger schließen Polyethylenglykol (nachstehend auch kurz als PEG bezeichnet) und den Sendai-Virus ein. Insbesondere wird vorzugsweise PEG verwendet. Die Myelomzellen schließen NS-1, P3U1 und SP2/0 ein und vorzugsweise wird P3U1 verwendet. Zum Beispiel beträgt das Verhältnis der Zahl der Milzzellen zu derjenigen der Myelomzellen vorzugsweise etwa 1:1 bis 10:1. Es ist bevorzugt, daß PEG mit einem Molekulargewicht von etwa 1000 bis 6000 in einer Konzentration von etwa 10 bis 80% dazugesetzt wird und die Inkubation bei etwa 20 bis 37 ºC, vorzugsweise bei etwa 30 bis 37 ºC, während etwa 3 bis 10 Minuten durchgeführt wird.
  • In der vorliegenden Erfindung können die Hybridomzellen durch verschiedene, in der Technik bekannte Verfahren gescreent werden. Zum Beispiel wird der Antikörpertiter eines Kulturüberstands durch einen Enzymimmuntest (nachstehend kurz als EIA bezeichnet) gemessen, welcher das Absorbierenlassen der biologisch aktiven Substanz durch eine Mikrotiterplatte und anschließend das Hinzufügen des Hybridom-Kulturüberstands dazu zum Nachweisen eines mit der Platte verbundenen spezifischen antibiologisch-aktive-Substanz-Antikörpers umfaßt. Die Hybridomzellen mit einer positiven Antikörperaktivität, welche selektiert und in HAT-Medium (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) gezüchtet worden sind, werden sofort dem Klonieren unterzogen. Üblicherweise wird dies leicht durch eine Grenzverdünnungsanalyse durchgeführt. Die klonierten Hybridomzellen werden selektiert, wodurch die gewünschten, einen spezifischen anti-biologisch-aktive-Substanz-Antikörper produzierenden Hybridomzellen erhalten werden können.
  • Die pharmakokinetischen Parameter, die gegeben sind, wenn die biologisch aktive Substanz oder eine Kombination der biologisch aktiven Substanz und des monoklonalen Antikörpers verabreicht werden, können durch in der Technik bekannte Verfahren bestimmt werden. Eine wäßrige Lösung der biologisch aktiven Substanz wird Tieren intravenös verabfolgt und das Blut wird nach einem bestimmten Zeitraum nach der Verabreichung gesammelt. Nach der Zentrifugation wird die Konzentration der biologisch aktiven Substanz in dem sich daraus ergebenden Plasma bestimmt und dieses Ergebnis wird durch Verwenden einer pharmakokinetische Parameter analysierende Software, wie etwa das automatisierte pharmakokinetische Analysesystem (APAS) analysiert, wodurch das Verteilungsvolumen Vd erhalten werden kann.
  • Zum Beispiel werden 0,1 ml einer Kochsalzlösung des Immun-Komplexes, die 10 ug rekombinantes IL-2 (rIL-2) enthält, Mäusen intravenös verabfolgt, und 15 und 30 Minuten und 1, 3 und 6 Stunden nach dem Geben der Dosis wird Blut mit einem heparinisierten Kapillarröhrchen aus ihrem supraorbitalen Veriplexus gesammelt. Nach der Zentrifugation wird die Konzentration des rIL-2 in dem sich daraus ergebenden Plasma durch EIA bestimmt. Die Plasma- rIL-2-Konzentration kann durch die folgende Ein-Abteilungsmodell-Formel mittels einer pharmakokinetische Parameter analysierende Software für die Plasmakonzentration, wie etwa APAS [K. Yamaoka und Y. Tanigawara, Primer of Pharmacokinetics by Microcomputers, S. 159, Nankodo (1983)] näherungsweise bestimmt werden:
  • C = C e-kt
  • worin C die Plasmakonzentration darstellt, C die anfängliche Plasmakonzentration darstellt, die durch Extrapolation der Zeit auf 0 erhalten wurde, t die Zeit nach dem Geben der Dosis darstellt und k die Geschwindigkeitskonstante der Entfernung darstellt. Weiter kann das Verteilungsvolumen Vd durch Dividieren der Dosis durch C erhalten werden. Die Halbwertszeit kann durch Dividieren von 0,693 durch k erhalten werden.
  • Zum Erhalten des Verteilungsvolumens Vd werden die Messungen auf halblogarithmisches Papier mit der Plasmakonzentration als Ordinate und der Zeit als Abszisse aufgetragen und die Dosis wird durch den Abschnitt (Plasmakonzentration) auf der Ordinate geteilt, nachdem die aufgetragene Linie durch eine gerade Linie angenähert ist. Die Halbwertszeit kann durch Bestimmen der Zeit erhalten werden, welche die Plasmakonzentration zum Reduzieren um 50% benötigt.
  • Beim Verwenden von Ratten anstelle von Mäusen als Tiere, die eine Verabreichung erhalten, ist es ebenfalls möglich, den 100 ug rIL-2 enthaltenden Immun-Komplex ähnlich zu geben. Das Blut kann zum Beispiel aus der Schwanzvene entnommen werden, solange übliche Verfahren eingesetzt werden. Auch wenn Serum anstelle von Plasma verwendet wird, können die Parameter ebenfalls bestimmt werden.
  • Was die anderen biologisch aktiven Substanzen als rIL-2 betrifft, die in dieser Erfindung definiert sind, können die Parameter ähnlich zu dem vorstehenden Verfahren bestimmt werden.
  • In der vorliegenden Erfindung werden die monoklonalen Antikörper verwendet, welche das Verteilungsvolumen der biologisch aktiven Substanzen in vivo auf etwa das 0,5-fache oder weniger reduzieren, verglichen mit dem Fall, in dem die Substanzen allein verwendet werden. Weiter werden die Antikörper verwendet, die das Verteilungsvolumen vorzugsweise auf etwa das 0,05- bis 0,5- fache, bevorzugter auf das etwa 0,1- bis 0,5-fache und insbesondere bevorzugt auf etwa das 0,1- bis 0,3-fache reduzieren können.
  • Das Verteilungsvolumen und die Halbwertszeit der Entfernung werden somit durch analysieren der Konzentration der biologisch aktiven Substanzen im Blut, Serum oder Plasma mit der Zeit erhalten, wenn die Substanzen den Tieren intravenös verabfolgt werden und sie spiegeln die Verteilung, die Entfernung, den Metabolismus und dergleichen der biologisch aktiven Substanzen wider. Somit werden die pharmakokinetischen Parameter durch die Beziehung zwischen den Organismen und den biologisch aktiven Wirkstoffen bestimmt und haben nichts mit dem Verabreichungsweg zu tun. Mit anderen Worten zeigen die pharmakokinetischen Parameter im allgemeinen die Eigenschaften bei der Verteilung, der Entfernung, dem Metabolismus und dergleichen der biologisch aktiven Substanzen, selbst wenn andere Verabreichungswege als der intravenöse, zum Beispiel subkutane Injektion, intramuskuläre und orale Verabreichungswege eingesetzt werden.
  • Die vorgenannten, monoklonale Antikörper produzierenden Hybridomzellen werden üblicherweise in einem flüssigen Medium oder in der Bauchhöhle eines Tieres (zum Beispiel ein Säuger wie etwa eine Maus) gemäß in der Technik bekannter Verfahren kultiviert. Der in der Kulturlösung oder in den Aszites enthaltene Antikörper kann mittels kombinierter biochemischer Techniken gereinigt werden. Zum Beispiel werden die Zellkulturlösung oder die Aszites unter Entnehmen eines Überstands zentrifugiert, welcher der Salzfällung (üblicherweise mittels Ammoniumsulfat oder Natriumsulfat) unterzogen wird. Die sich daraus ergebende Proteinfällung wird in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst und die sich daraus ergebende Lösung wird dialysiert. Anschließend kann der gewünschte Antikörper durch Säulenchromatographie, wie etwa Ionenaustauschchromatographie, Gelpermeationschromatographie, Protein-A-Chromatographie oder Hydroxylapatit-Säulenchromatographie, isoliert und gereinigt werden. Es ist ebenfalls möglich, den Antikörper durch filtrieren des Überstands durch ein 5-um- Filter anstelle der Salzfällung, ersetzen des Lösungsmittels durch ein geeignetes Lösungsmittel durch Gelfiltration und anschließend unterziehen einer der vorstehend beschriebenen ähnlichen Säulenchromatographie zu erhalten. Durch die vorstehend beschriebenen Isolierungs- und Reinigungsverfahren können zum Beispiel etwa 3 bis 20 mg und weiter etwa 5 bis 200 mg des monoklonalen Antikörpers mit einer Reinheit von wenigstens 80 Gew.-% Protein und weiter kann eine Reinheit von wenigstens 90% aus 1 Liter Kulturüberstand erhalten werden. Etwa 5 bis 300 mg eines ähnlichen Antikörpers können aus 20 ml Aszites erhalten werden und manchmal können 3 bis 100 mg oder etwa 3 bis 20 mg Antikörper erhalten werden.
  • Der wie vorstehend beschrieben erhaltene Antikörper ist als Protein homogen.
  • Es ist bevorzugt, daß der vorstehende monoklonale Antikörper Immunglobulin G ist. Weiter können die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Antikörper Fragmente wie etwa Fab, Fab' und F(ab')2 sein, die durch Behandeln von IgG mit Proteasen wie etwa Pepsin hergestellt wurden. Die Fragmente besitzen die Fähigkeit an die biologisch aktiven Substanzen zu binden.
  • Die die Immun-Komplexe der vorliegenden Erfindung bildenden monoklonalen Antikörper werden aus Immun-Komplexen selektiert, die durch Mischen der verschiedenen monoklonalen Antikörper erhalten werden, welche gemäß den vorgenannten Herstellungsverfahren mit den biologisch aktiven Substanzen, zum Beispiel in phosphatgepufferter Kochsalzlösung unter Ergeben eines Molverhältnisses von etwa 1:2, hergestellt wurden, und Hybridomzellen, welche die monoklonalen Antikörper produzieren werden weiter selektiert. Das Verteilungsvolumen zu diesem Zeitpunkt kann durch die vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
  • Beim Selektieren der monoklonalen Antikörper ist es bevorzugt, die Antikörper so zu selektieren, daß das Verhältnis der Immun- Komplexe, welche die monoklonalen Antikörper und die biologisch aktiven Substanzen umfassen, zu dem der biologisch aktiven Substanzen 1:2 oder weniger wird.
  • Wenn dieser monoklonale Antikörper Maus-IgG ist, wird eine DNA- Sequenz erhalten, die für eine variable Region kodiert, welche eine Antigen-Erkennungsstelle des Antikörpers enthält, und ein Gen, das für eine konstante Region von Human-IgG kodiert, wird damit mittels der Genmanipulationstechnik [Z. Steplewski et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4852 (1988)] kombiniert, wodurch ein chimärer Maus-Mensch-Antikörper hergestellt werden kann. Ein derartiger chimärer Antikörper wird Menschen wegen seiner niedrigen Antigenität vorzugsweise verabfolgt.
  • Die erforderlichen Immun-Komplexe der vorliegenden Erfindung können durch Mischen der monoklonalen anti-biologisch-aktive- Substanz-Antikörper mit der biologisch aktiven Substanz erhalten werden. Das Molverhältnis der Antikörper zu den biologisch aktiven Substanzen zum Erhalten der Immun-Komplexe beträgt vorzugsweise etwa 1:2. Wenn die Komplexe verabfolgt werden, ist es jedoch auch möglich, das Molverhältnis von etwa 10:1 bis etwa 1:50, vorzugsweise von etwa 5:1 bis etwa 1:50, durch Erhöhen der Menge der monoklonalen anti-biologisch-aktive-Substanz-Antikörper oder der biologisch aktiven Substanzen zu verändern. Das Molverhältnis beträgt vorzugsweise etwa 10:1 bis etwa 1:10, bevorzugter etwa 1:1 bis etwa 1:10 und am bevorzugtesten etwa 5:1 bis etwa 1:5. Als Mischverfahren ist es bevorzugt, daß sie zum Herstellen der Immun-Komplexe in Form einer wäßrigen Lösung gemischt werden. Diese Verfahren schließen im wesentlichen das Verfahren des Lösens eines Gemischs des pulverigen monoklonalen anti-biologisch-aktive-Substanz-Antikörpers und der zuvor hergestellten biologisch aktiven Substanz vor dem Dosieren unter Bilden des Immun-Komplexes ein. Die gelösten Immun-Komplexe können durch Vakuumtrocknen verfestigt und wenn sie gebraucht werden, gelöst werden. Die Mischverfahren schließen ferner das Verfahren des getrennten Gebens des monoklonalen anti-biologisch-aktive-Substanz-Antikörpers und der biologisch aktiven Substanzen an Organismen und im wesentlichen das Bilden des Immun-Komplexes in dem Organismus ein.
  • Weiter stellt die vorliegende Erfindung biologisch aktive Wirkstoffe oder pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, welche die vorgenannten Immun-Komplexe enthalten.
  • Die wie vorstehend beschrieben erhaltenen Immun-Komplexe der vorliegenden Erfindung können als solche als flüssige Injektionen oder nach ihrem Mischen mit pharmazeutisch annehmbaren Arzneistoffträgern, Verdünnungsmitteln und dergleichen, nötigenfalls gefolgt von der mechanischen Sterilisation durch Membranfilter als flüssige Injektionen verwendet werden. Ferner werden Lösungen der Immun-Komplexe nach ihrem Mischen mit pharmazeutisch annehmbaren Arzneistoffträgern, Verdünnungsmitteln und dergleichen, nötigenfalls gefolgt von der mechanischen Sterilisation durch Membranfilter unter Herstellen eines Pulvers für Injektionen vakuumgetrocknet, welches in Wasser oder Kochsalzlösung aufgelöst wird, wenn es verwendet wird.
  • Weiter können Lösungen, die nur die monoklonalen anti-biologisch-aktive-Substanz-Antikörper enthalten, Verfahren unterzogen werden, die den vorstehend beschriebenen ähnlich sind, um flüssige Injektionen und Pulver für Injektionen herzustellen.
  • Als Arzneistoffträger kann zum Beispiel Mannit verwendet werden. Als Verdünnungsmittel wird üblicherweise Wasser eingesetzt. Die Eigenschaften als Injektionen können durch geeignetes Einarbeiten der vorstehenden Arzneistoffträger, Stabilisatoren, Schmerzlinderungsmittel, Konservierungsmittel und dergleichen verbessert werden.
  • Beispiele der vorstehenden Stabilisatoren schließen menschliches Serumalbumin (HSA) ein. Isotone Mittel schließen zum Beispiel Natriumchlorid, Glukose, Mannit und Sorbit ein. Beispiele von pH-regulierenden Mitteln schließen Salzsäure und Natriumhydroxid ein. Beispiele der Stabilisatoren schließen Natriumpyrosulfit, Rongalit und Natriumhydrogenmetasulfit ein.
  • Beispiele der Schmerzlinderungsmittel schließen Xylocainhydrochlorid, Chlorbutanol und Procainhydrochlorid ein. Die Konservierungsmittel schließen zum Beispiel Benzylalkohol, Phenol, p- Hydroxybenzoesäuremethylester und p-Hydroxybenzoesäurepropylester ein.
  • Obschon diese Immun-Komplexe als Lösungszubereitung verwendet werden können, können die durch Vakuumtrocknen gepulverten Komplexe bei ihrem Verwenden ebenfalls gelöst werden. Gepulverte Zubereitungen sind wegen ihrer leichten Handhabung bevorzugt. Beispiele des Vakuumtrocknens schließen die Lyophilisierung ein. Wenn die Lyophilisierung durchgeführt wird, ist es bevorzugt, daß auf -10ºC oder niedriger gekühlte Proben in Kolben im Laboratorium und in Schalen oder Glasflaschen industriell lyophilisiert werden.
  • Die Proben können auch durch Verwenden eines SpeedVac-Konzentrators (SAVANT) anstelle der Lyophilisierung getrocknet werden. In diesem Fall beträgt die Temperatur etwa 0 bis 30ºC . Der Vakuumdruck beträgt etwa 20 mm Hg oder weniger und vorzugsweise etwa 10 mm Hg oder weniger.
  • Es ist bevorzugt, den pH durch Zusetzen von Salzen mit Pufferwirkung wie etwa Phosphate zu den zu trocknenden Lösungen auf etwa 3,0 bis 10,0 einzustellen. Um den osmotischen Druck der Injektionen zur Dosierungszeit mit den Organismen isoton zu machen, ist es bevorzugt, daß die üblicherweise für Injektionen verwendeten isotonen Mittel, wie etwa Natriumchlorid und Glukose, den Lösungen vorher zugesetzt werden. Es ist jedoch möglich, die Proben in Salzlösungen, Glukoselösungen oder Plasmaersatzstoffen mit einem geeigneten osmotischen Druck zu lösen, wenn sie verwendet werden, ohne den Lösungen vor dem Trocknen die isotonen Mittel zuzusetzen. Auch Stabilisatoren wie etwa Thimerosal können nötigenfalls zugesetzt werden. Zum Zweck des Stabilisierens von Proteinen ist es auch möglich, Human-Serumalbumin (HSA) als Stabilisator zuzusetzen.
  • Die auf diese Weise erhaltenen getrockneten Zubereitungen sind über einen langen Zeitraum stabil und können in Wasser, Salzlösungen, Glukoselösungen oder Plasmaersatzstoffen zum Herstellen von Injektionen gelöst werden, wenn sie verwendet werden.
  • Weiter können Injektionen die vorgenannten Träger, Stabilisatoren und dergleichen zugesetzt werden.
  • Es ist somit bevorzugt, daß die Zubereitungen dieser Erfindung getrocknete, pulverige Produkte sind.
  • Gemäß den vorstehend beschriebenen Verfahren werden die Immun- Komplexe der therapeutisch wirksamen, biologisch aktiven Substanzen und der monoklonalen Antikörper erhalten, welche das Verteilungsvolumen der vorstehenden Substanzen reduzieren können.
  • Ferner werden die biologisch aktiven Wirkstoffe erhalten, welche die vorstehenden Immunsubstanzen enthalten.
  • Die zu den Immun-Komplexen der vorliegenden Erfindung verwendeten monoklonalen Antikörper sind von bemerkenswert niedriger Toxizität, so daß die Immun-Komplexe ebenfalls von niedriger Toxizität sind.
  • Die Immun-Komplexe der vorliegenden Erfindung können zu Zwecken verwendet werden, die denjenigen der biologisch aktiven Substanzen ähnlich sind, welche die Immun-Komplexe bilden. Wenn die biologisch aktiven Substanzen zum Beispiel zur Behandlung von Krebs, Immunschwäche, Entzündung, Kontrolle einer Hormonabnormalität, Bluthochdruck, Herzerkrankungen oder dergleichen verwendet werden, können die Immun-Komplexe der vorliegenden Erfindung für einen dem vorstehend beschriebenen ähnlichen Zweck verwendet werden.
  • Dementsprechend können die Immunkomplexe der vorliegenden Erfindung oder die sie enthaltenden Wirkstoffe Säugern, wie etwa Mäuse, Ratten, Hunde, Katzen, Schweine, Rind, Affen und Menschen, intravenös, subkutan, intramuskulär oder intraperitoneal verabfolgt werden.
  • Die Immun-Komplexe der vorliegenden Erfindung werden in einer solchen Dosierung verabfolgt, daß sich die Dosierung der biologisch aktiven Substanzen auf eine bekannte Dosierung oder weniger beläuft. Die Dosis kann geeignet eingestellt werden und wird letztendlich durch den behandelnden Arzt oder Tierarzt bestimmt. Eine derartige Dosis der beanspruchten Immunkomplexe wird hier als "wirksame Menge" bezeichnet.
  • Wenn der monoklonale anti-biologisch-aktive-Substanz-Antikörper und die biologisch aktive Substanz den Organismen zum Bilden des Immun-Komplexes in den Organismen getrennt verabfolgt werden, wird der vorstehende monoklonale Antikörper, der wie vorstehend beschrieben in die Form einer Injektion gebracht wurde, zuvor Säugern, wie etwa Mäuse, Ratten, Hunde, Katzen, Schweine, Rind, Affen und Menschen, intravenös, subkutan, intramuskulär oder intraperitoneal verabreicht und anschließend wird die biologisch aktive Substanz, die wie vorstehend beschrieben in die Form einer Injektion gebracht wurde, intravenös, subkutan, intramuskulär oder intraperitoneal verabfolgt. In diesem Fall können die beiden Verabreichungswege voneinander verschieden sein.
  • Das Molverhältnis der monoklonalen anti-biologisch-aktive-Substanz-Antikörper zu den biologisch aktiven Substanzen beträgt vorzugsweise etwa 10:1 bis etwa 1:50, bevorzugter etwa 5:1 bis etwa 1:50, und am bevorzugtesten etwa 1:1 bis etwa 1:10 oder etwa 5:1 bis etwa 1:5. Obschon die Dosierung der biologisch aktiven Substanzen oder der monoklonalen anti-biologisch-aktive- Substanz-Antikörper in Abhängigkeit von der betreffenden Krankheit, dem Symptom, dem Verabreichungsweg und dergleichen abhängt, werden die biologisch aktiven Substanzen in einer bekannten Dosierung oder weniger verabfolgt.
  • Wenn die biologisch aktive Substanz zum Beispiel eine Antikrebswirkung besitzt und der Immun-Komplex der vorliegenden Erfindung Krebspatienten intravenös verabfolgt wird, wird die biologisch aktive Substanz bei Menschen in einer Menge von etwa 0,1 ug bis 10 mg je Mensch und vorzugsweise in einer Menge von 1 ug bis 1 mg je Mensch verwendet; bei anderen Säugern wird die Substanz in einer Menge von etwa 0,002 ug bis 0,2 mg je kg und vorzugsweise in einer Menge von 0,02 ug bis 0,02 mg je kg verwendet.
  • Wenn die biologisch wirksame Substanz Urokinase ist und der Komplex Thrombosepatienten intravenös verabfolgt wird, wird die Urokinase in einer täglichen Menge von etwa 0,01 bis 0,5 mg/kg und vorzugsweise in einer täglichen Menge von etwa 0,02 bis 0,2 mg/kg verabfolgt.
  • Die Immun-Komplexe der vorliegenden Erfindung reduzierten das Verteilungsvolumen der biologisch aktiven Substanzen in vivo auf das 0,5-fache oder weniger, so daß die Blutkonzentration unter Verstärken der Wirksamkeit der biologisch aktiven Substanzen bedeutsam erhöht wird. Außerdem werden die Nebenwirkungen durch Belassen der biologisch wirksamen Substanzen in dem Gefäßsystem, hauptsächlich dem Blutsystem, verringert.
  • Verschiedene Krankheiten, wie etwa Krebs, Immunschwäche, Entzündung, Kontrolle einer Hormonabnormalität, Bluthochdruck und Herzerkrankungen können durch Geben der Immun-Komplexe an Säuger wirksamer behandelt werden.
  • In den Fällen von Urokinase und Prourokinase können die Immun- Komplexe aus Urokinase und monoklonalem Antikörper erhalten werden, welche die Halbwertszeit der Entfernung der Wirkstoffe in vivo verlängern ohne ihre biologische Aktivität zu verschlechtern, und reduzieren das Verteilungsvolumen deutlich um das 0,5-fache oder weniger, verglichen mit dem Fall, in dem Urokinase oder Prourokinase allein verwendet werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Blutkonzentration höher gehalten werden und deren Wirkung kann wirkungsvoller gezeigt werden. Weiter können die Nebenwirkungen verringert werden.
  • Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend mit den folgenden Beispielen, Referenzbeispielen und Versuchsbeispielen im einzelnen beschrieben.
  • In den folgenden Beispielen und Versuchsbeispielen verwendetes rhIL-2 ist ein Gemisch eines mit einem Methioninrest am N-Ende und eines ohne Methioninrest, welche durch ein dem in der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung Nr. 60-115528/1985, die der EP-145 390 entspricht, oder der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung 61-78799/1986, die der EP-176 299 entspricht, beschriebenes ähnliches Verfahren mittels der Transformanten Escherichia coli N4830/pTB285 (IFO 14437, FERM BP-852) hergestellt werden.
  • Die vorstehend beschriebene Transformante E. coli N4830/pTB285 wurde beim Institute For Fermentation, Osaka, Japan (IFO) unter der Zugangsnummer IFO 14437 am 25. April 1985 hinterlegt. Diese Mikroorganismen wurden ferner beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan (FRI), unter der Zugangsnummer FERM BP-8199 am 30. April 1985 hinterlegt. Diese Hinterlegung wurde in eine Hinterlegung unter dem Budapester Vertrag überführt und der Mikroorganismus wird beim FRI unter der Zugangsnummer FERM BP-852 aufbewahrt.
  • Im nachstehend angeführten Beispiel 1 erhaltene Maus-Hybridomzelle HRL1-52 wurden beim IFO am 29. Januar 1990 unter der Zugangsnummer IFO 50222 hinterlegt. Diese Hybridomzelle wurde ferner am 31. Januar 1990 beim FRI unter der Zugangsnummer FERM BP-2747 hinterlegt.
  • In den nachstehend angeführten Referenzbeispielen verwendete Hybridomzellen können durch das in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 363712 beschriebene Verfahren hergestellt werden und wurden wie folgt hinterlegt. tierische Zelle Maus-Hybridom (21. September 1988) (9. August 1989) (4. Oktober 1988)
    • Beispiel 1 Herstellung von monoklonalem Maus-anti-Human-IL- 2-Antikörper produzierenden Hybridomzellen (1) Immunogen-Herstellung
  • Eine Kochsalzlösung von 1 mg/ml rhIL-2 wurde zum Herstellen denaturierten Human-IL-2 3 Minuten bei 90ºC wärmebehandelt. Nach Lagern im gefrorenen Zustand wurde sie als Immunogen verwendet.
    • (2) Immunosierung
  • Einer Suspension von 1 mg/ml des wärmedenaturierten rhIL-2 in Kochsalzlösung wurde dieselbe Menge Freundsches komplettes Adjuvans zugesetzt und es wurde begonnen, Mäuse (Weibchen, n = 10) mit dem sich daraus ergebenden Gemisch an ihrem Rücken und Unterleib zu immunisieren (0,1 mg/0,2 ml/Maus). Eine ergänzende Immunisierung wurde durch 5-maliges Beimpfen der Mäuse mit einem Gemisch des Immunogens und derselben Menge Freundschem inkomplettem Adjuvans in 2-3-wöchigen Intervallen durchgeführt.
    • (3) Zellfusion
  • Die Milzen wurden den Mäusen 3 Tage nach der letzten Immunisierung entnommen und eine Milzzellensuspension (etwa 10&sup8; Zellen enthaltend) wurde durch ein in der Technik bekanntes Verfahren hergestellt. Anschließend wurden 2 x 10&sup7; Maus-Myelomzellen (P3U1) dazugesetzt und die Zellfusion wurde durch Verwenden von PEG 6000 gemäß dem Verfahren von Köhler und Milstine [Nature 256, 495 (1975)] durchgeführt. Nachdem die Zellfusion abgeschlossen war, wurde die Zellgemischlösung in HAT-Medium, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthielt, suspendiert und 10 Tage kultiviert. Unmittelbar nachdem die Selektion der Elternzellen beendet war, wurde das Medium gegen HT-Medium, das durch Entfernen von Aminopterin aus HAT-Medium hergestellt wurde, ausgetauscht und die Kultivierung wurde fortgesetzt.
    • (4) Selektion und Klonierung von Hybridomzellen
  • Mittels einer Mikrotiterplatte, auf welcher das rhIL-2 durch eine Festphase absorbiert war, wurde der Antikörpertiter des Kulturüberstands der Hybridomzellen durch einen ELISA gemessen. Das Auftreten der Hybridomzellen wurde 10 bis 20 Tage nach der Fusion beobachtet und ein Antikörper, der spezifisch mit dem rhIL-2 band, wurde gefunden. Die Hybridomzellen mit einem besonders hohen Antikörpertiter wurden durch das Grenzverdünnungsverfahren kloniert.
  • Der Kulturüberstand der klonierten Hybridomzellen wurde zum Selektieren von Hybridomzellen mit einer hohen Bindungsfähigkeit mit dem rhIL-2 auf ähnliche Weise durch den EIA gescreent.
  • Unter Verwenden der Hybridomzellen wurden Immun-Komplexe mit verschiedenen Mengen rhIL-2 auf eine den nachstehend angeführten Beispielen 3 und 4 ähnliche Weise erhalten und die sich daraus ergebenden Komplexe wurden weiter den Mäusen auf eine der in Beispiel 2 dargestellten ähnliche Weise verabfolgt. Das Verteilungsvolumen zu diesem Zeitpunkt wurde berechnet und Hybridomzellen, die einen Antikörper produzierten, der das Verteilungsvolumen von rhIL-2 reduzierte, wurden gescreent.
  • Als Ergebnis wurden die Maus-Hybridomzellen HRL1-52 (IFO 50222, FERM BP-2747) erhalten, die mit dem rhIL-2 spezifisch banden und das Verteilungsvolumen des rhIL-2 reduzierten, wenn dessen Immun-Komplex Mäusen verabfolgt wurde. Seine Immunglobulin- Klasse und Unterklasse wurden durch den Ouchterlony-Test untersucht. Von beiden wurde gefunden, daß sie IgG&sub1; sind.
    • Beispiel 2 Antikörper-Herstellung
  • Jeder Balb/C-Maus (weiblich) wurden 0,5 ml Mineralöl intraperitoneal verabfolgt. Nach einer Woche wurden 10&sup6; in Beispiel 1 erhaltene Maus-Hybridomzellen (HRL1-52) (IFO 50222, FERM BP- 2747) intraperitoneal dazugesetzt. Nach 10 Tagen bis 2 Wochen nach der Verabreichung der Hybridomzellen wurden die Aszites gesammelt. 100 ml der sich daraus ergebenden Aszites wurden unter entnehmen eines überstandes zentrifugiert. Der überstand wurde durch ein 5-um Filter filtriert und der Austausch gegen 10 mM MES-Puffer wurde durch Gelfiltration mittels PD-10 (Pharmacia) durchgeführt. Anschließend wurde die sich daraus ergebende Lösung der Flüssigkeitschromatographie (ABR-Säule, J.T. Baker) unterzogen, wodurch 114 mg des gewünschten Antikörpers erhalten wurden. Auf den sich daraus ergebenden Antikörper wurde die Flüssigkeitschromatographie angewandt (Säule: Asahipak GS-520, Asahi Chemical Industry; Transferphase: Dulbecco phosphatgepufferte Kochsalzlösung; Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min; Nachweis: OD&sub2;&sub8;&sub0;). Als Ergebnis wurde ein in Fig. 1 dargestellter einzelner Peak erhalten. Diese Retentionszeit stimmte mit der von handelsüblichem Maus-IgG überein (Chrompure Maus-IgG, ganzes Molekül, Jackson Immunoresearch Lab., Inc.).
  • Die Bindungsfähigkeit des monoklonalen Antikörpers mit dem rhIL- 2 wurde durch den in der Technik allgemein bekannten ELISA bestätigt. Nachdem der rhIL-2 durch eine Immunplatte absorbiert war, wurde der monoklonale Antikörper dazugesetzt. Anschließend wurde der HRP-markierte anti-Maus-IgG dazugesetzt und die Bindungsfähigkeit mit dem rhIL-2 wurde durch die Farbentwicklung von o-Phenylendiamin bestätigt. Beispiel 3 Immun-Komplex-Herstellung (flüssig) 1 ml der in Beispiel 2 erhaltenen Lösung von 1 mg/ml des monoklonalen anti-IL-2-Antikörpers wurden 0,05 ml, 0,1 ml, 0,2 ml oder 1 ml einer Lösung von 1 mg/ml des rhIL-2 zugesetzt, um ein Molverhältnis des monoklonalen anti-IL-2-Antikörpers zu dem rhIL-2 von etwa 2:1, 1:1, 1:2 oder 1:10 zu ergeben. Die Analyse dieser Gemische durch HPLC (Säule: Asahipak GS-520) zeigte, daß ein Immun-Komplex durch etwa 2 Mol des rhIL-2 auf 1 Mol des monoklonalen anti-IL-2-Antikörpers gebildet wurde und daß das vorstehende Molverhältnis in dem Immun-Komplex etwa 1:2 war.
  • Ein Immun-Komplex wurde durch Mischen von 0,2 ml der Lösung von 1 mg/ml des IL-2 mit 1 ml der Lösung von 1 mg/ml des monoklonalen anti-IL-2-Antikörpers hergestellt. Die Anwendung der vorgenannten HPLC (Säule: Asahipak GS-520) auf den sich daraus ergebenden Immun-Komplex bewies, daß kein ungebundenes rhIL-2 und kein ungebundener monoklonaler Antikörper vorlagen (Fig. 2).
  • Zu diesem Zeitpunkt besaß der Immun-Komplex eine derjenigen des rhIL-2 gleichwertige EIA-Aktivität.
  • Die biologische Aktivität des sich daraus ergebenden Immun-Komplexes wurde durch das MTT-Verfahren [H. Tada et al., Journal of Immunolocical Methods 93, 157-165 (1986)] untersucht. Als Ergebnis war die spezifische Aktivität des Immunkomplex je rhIL-2 mit derjenigen von rhIL-2 selbst identisch. Dies zeigte, daß der Immun-Komplex die biologische Aktivität des rhIL-2 nicht neutralisierte.
    • Beispiel 4 Immun-Komplex-Herstellung (fest)
  • Mit 0,2 ml der Lösung von 1 mg/ml des rhIL-2 wurde 1 ml der Lösung von 1 mg/ml des monoklonalen anti-IL-2-Antikörpers gemischt und Wasser wurde durch einen Centriback-Konzentrator unter Erhalten eines festen Immunkomplexes eingedampft. Während dieser Zeit wurde der Rotorteil des Centriback-Konzentrators nicht erhitzt. Der Kühlfallenteil wurde auf -90ºC eingestellt und der Druck wurde durch eine Vakuumpumpe auf 5 mm Hg oder weniger verringert. Anschließend wurde zum Auflösen 1 ml Wasser dazugesetzt. Zu diesem Zeitpunkt besaß der Immun-Komplex eine derjenigen des rhIL-2 gleichwertige EIA-Aktivität.
  • Während man durch dieses Beispiel nicht begrenzt ist, können die festen Immun-Komplexe in einer Flüssigkeit durch Mischen des rhIL-2 mit den monoklonalen anti-IL-2-Antikörpern in einem Molverhältnis von etwa 2:1 und Eindampfen des Wassers mit einem SpeedVac-Konzentrator (SAVANT) oder einem Lyophilisator hergestellt werden.
    • Beispiel 5 Herstellung von F(ab')&sub2; (flüssig)
  • Der monoklonale anti-IL-2-Antikörper und Pepsin (Sigma) wurden gemischt und miteinander 18 Stunden bei 37 ºC bei pH 3,5 umgesetzt. Nachdem die Reaktion beendet wurde, wurde das Reaktionsprodukt einer Protein-A-Säule ausgesetzt, um F(ab')&sub2; des monoklonalen anti-IL-2-Antikörpers zu erhalten. Das F(ab')&sub2; des monoklonalen anti-IL-2-Antikörpers zeigte durch den in Beispiel 2 dargestellten ELISA eine Bindungsfähigkeit mit dem rhIL-2.
    • Beispiel 6 Herstellung des rhIL-2-F(ab')&sub2;-Immun-Komplexes (flüssig)
  • 1 Mol des in Beispiel 5 erhaltenen F(ab')&sub2; des monoklonalen anti- IL-2-Antikörpers wurden 2 Mol rhIL-2 zugesetzt, wodurch ein Immun-Komplex des F(ab')&sub2; des monoklonalen rhIL-2-anti-IL-2-Antikörper-F(ab')&sub2; erhalten wurde.
  • Der sich daraus ergebende Immun-Komplex besaß eine Aktivität wie rhIL-2, wenn er durch den EIA und das MTT-Verfahren untersucht wurde.
    • Beispiel 7 Herstellung von F(ab')&sub2;-Immun-Komplex (fest)
  • Wasser wurde durch den Centriback-Konzentrator aus dem Immun- Komplex des monoklonalen anti-IL-2-Antikörper-F(ab')&sub2; und des rhIL-2, der in flüssiger Form erhalten worden war, abgedampft, wodurch ein fester Immunkomplex des F(ab')&sub2; und des rhIL-2 erhalten wurde.
  • Der sich daraus ergebende Immun-Komplex besaß eine Aktivität wie rhIL-2, wenn er durch den EIA und das MTT-Verfahren untersucht wurde.
    • Beispiel 8 Herstellung von F(ab')&sub2;-Immun-Komplex (fest)
  • Wasser wurde durch einen Lyophilisator aus dem Immun-Komplex des monoklonalen anti-IL-2-Antikörper-F(ab')&sub2; und dem rhIL-2, der in flüssiger Form erhalten worden war, abgedampft, wodurch ein fester Immunkomplex des F(ab')&sub2; und des rhIL-2 erhalten wurde.
    • Beispiel 9
  • Unter Verwenden eines das Monozyten-Kulturwachstum stimulierenden Faktors (M-CSF) wird ein monoklonaler anti-CSF-Antikörper wie bei Beispiel 1 und 2 erhalten und ein CSF-monoklonaler-anti- CSF-Antikörper-Immun-Komplex wird auf die Weise von Beispiel 3 erhalten.
    • Beispiel 10
  • Unter Verwenden von Thyrotropin-freisetzendem Hormon (TRH) wird ein monoklonaler anti-TRH-Antikörper wie bei Beispiel 1 und 2 erhalten und ein TRH-oklonaler-anti-TRH-Antikörper-Immun- Komplex wird auf die Weise von Beispiel 3 erhalten.
    • Beispiel 11
  • Unter Verwenden von Oxenedoron wird ein monoklonaler anti-Oxenedoron-Antikörper wie bei Beispiel 1 und 2 erhalten und ein Oxenedoron-monoklonaler-anti-Oxenedoron-Antikörper-Immun-Komplex wird auf die Weise von Beispiel 3 erhalten.
    • Beispiel 12
  • Unter Verwenden von Enkephalin wird ein monoklonaler anti-Enkephalin-Antikörper wie bei Beispiel 1 und 2 erhalten und ein Enkephalin-monoklonaler-anti-Enkephalin-Antikörper-Immun-Komplex wird auf die Weise von Beispiel 3 erhalten.
    • Beispiel 13
  • Unter Verwenden von Erythropoietin wird ein monoklonaler anti- Erythropoietin-Antikörper wie bei Beispiel 1 und 2 erhalten und ein Erythropoietin-monoklonaler-anti-Erythropoietin-Antikörper-Immun-Komplex wird auf die Weise von Beispiel 3 erhalten.
    • Beispiel 14
  • Unter Verwenden von Leuprorelin wird ein monoklonaler anti- Leuprorelin-Antikörper wie bei Beispiel 1 und 2 erhalten und ein Leuprorelin-monoklonaler-anti-Leuprorelin-Antikörper-Immun-Kom plex wird auf die Weise von Beispiel 3 erhalten.
    • Versuchsbeispiel 1 Verabreichung an Ratten (iv)
  • Der in Beispiel 3 erhaltene Immun-Komplex wurde Ratten intravenös in einer 100 ug rhIL-2 gleichwertigen Dosis verabfolgt. Das Blut wurde zum Messen der Serum-rhIL-2-Konzentration mit der Zeit abgenommen. Die Ergebnisse werden durch - - in Fig. 3 angezeigt. Als Kontrollversuch wurde anstelle des IL-2-monoklonaler-anti-IL-2-Antikörpers ein Gemisch des rhIL-2 und handelsüblichen Maus-IgG Ratten intravenös in einer 100 ug rhIL-2 gleichwertigen Dosis verabfolgt. Die Ergebnisse werden durch -O- in Fig. 3 angezeigt.
  • Die auf diese Weise gemessenen Änderungen bei der Serum-rhIL-2- Konzentration mit der Zeit wurden pharmakokinetisch analysiert. Als Ergebnis zeigt sich, daß, wenn der Immun-Komplex verabfolgt wurde, das Verteilungsvolumen des rhIL-2 etwa ein Siebtel (etwa das 0,14-fache) desjenigen bei dem Kontrollversuch betrug. Die Serum-rhIL-2-Konzentration war etwa 7 Mal höher als diejenige im Kontrollversuch. Wenn auf der anderen Seite dieser Immun-Komplex verabfolgt wurde, war die Geschwindigkeitskonstante der Entfernung des rhIL-2 nicht von derjenigen im Kontrollversuch verschieden. Dies zeigt, daß die Halbwertszeit als Immunkomplex unverändert war.
    • Versuchsbeispiel 2 Verabreichung an Mäuse (iv)
  • Der Immun-Komplex des rhIL-2 und des monoklonalen anti-IL-2- Antikörpers, der in Beispiel 4 erhalten wurde, wurde in Wasser gelöst und die sich daraus ergebende wäßrige Lösung wurde Mäusen intravenös in einer 10 ug rhIL-2 gleichwertigen Dosis verabfolgt. Das Blut wurde zum Messen der Plasma-rhIL-2-Konzentration mit der Zeit abgenommen. Als Kontrollversuch wurde anstelle des IL-2-monoklonaler-anti-IL-2-Antikörper-Komplexes ein Gemisch des rhIL-2 und handelsüblichen Maus-IgG Mäusen intravenös in einer 10 ug rhIL-2 gleichwertigen Dosis verabfolgt. Die auf diese Weise gemessenen Änderungen bei der Serum-rhIL-2-Konzentration mit der Zeit wurden pharmakokinetisch analysiert. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Pharmakokinetische Parameter des Immun-Komplex von rhIL-2 und des monoklonalen anti-rhIL-2-Antikörpers Parameter Immun-Komplex Verteilungsvolumen (ml/kg) Geschwindigkeitskonstante der Entfernung (l/h) 1-Abteilung-Modell, intravenöse Verabreichung
  • Wie in Tabelle 1 dargestellt, bewiesen die Analysenergebnisse, daß das Verteilungsvolumen des rhIL-2 des Immun-Komplexes etwa ein Achtel (etwa das 0,12-fache) desjenigen in dem Kontrollversuch betrug. Dies zeigt, daß wenn der in dem Versuch verwendete Immun-Komplex verabfolgt wurde, sich die Verteilung des rhIL-2 verglichen mit dem Fall, daß die wäßrige Lösung des rhIL-2 verabfolgt wurde, änderte. Die Geschwindigkeitskonstante der Entfernung des rhIL-2 war von derjenigen im Kontrollversuch nicht verschieden. Dies zeigt, daß sich die Halbwertszeit nicht änderte.
    • Versuchsbeispiel 3 Verabreichung an Mäuse (sc)
  • Der in Beispiel 4 erhaltene Immun-Komplex wurde in Wasser gelöst und die sich daraus ergebende Lösung wurde Mäusen subkutan in einer 10 ug rhIL-2 gleichwertigen Dosis verabfolgt. Das Blut wurde zum Messen der Blut-rhIL-2-Konzentration mit der Zeit entnommen. Als Kontrollversuch wurde Mäusen anstelle des Komplexes ein Gemisch des rhIL-2 und handelsüblichen IgG in ähnlicher Weise verabfolgt. Die Ergebnisse werden in Fig. 4 dargestellt. Unter Bezug auf Fig. 4, zeigen -O- und - - die Ergebnisse für rhIL-2 beziehungsweise den Immun-Komplex. Bei dem Immun-Komplex war die Blutkonzentration wie in Fig. 4 dargestellt während 24 Stunden oder mehr 0,3 ng/ml hoch oder höher.
    • Versuchsbeispiel 4 Anti-Tumor-Wirkung in Mäusen
  • Tumorzellen (Meth-A) wurden in Mäuse (Balb/C, 7 Wochen alt, Weibchen) implantiert. Eine wäßrige Lösung des in Beispiel 4 erhaltenen Immun-Komplexes wurde in einer 10 ug rhIL-2/Maus/Tag gleichwertigen Dosis 12 Tage einmal täglich 7 Tage nach der Implantation verabfolgt. Als Kontrollversuch wurde rhIL-2 Mäusen in einer Dosis von 10 ug/Maus anstelle des IL-2-monoklonaler- anti-IL-2-Antikörper-Immun-Komplexes verabfolgt. Den Kontrollmäusen wurde keine Behandlung verabfolgt. Einundzwanzig Tage nach der Implantation wurden den Mäusen die Tumorzellen entnommen, um ihr Gewicht zu messen, und das Verhältnis (T/C) des Gewichts der den Mäusen entnommenen Tumorzellen, welchen der Immun-Komplex verabfolgt wurde, zum Gewicht der aus den Kontrollmäusen entnommenen Tumorzellen wurde bestimmt. Als Ergebnis betrug T/C 57%, wenn das rhIL-2 verabfolgt wurde. Wenn dagegen der Immun-Komplex verabfolgt wurde, betrug T/C 16%. Dies zeigt, daß der Immunkomplex die Wirksamkeit des rhIL-2 sehr verstärkt.
  • Die vorstehenden Versuchsbeispiele 1 und 2 zeigten, daß wenn die Immun-Komplexe der vorliegenden Erfindung Tieren verabfolgt wurden, das Verteilungsvolumen des rhIL-2, verglichen mit dem Fall, daß das rhIL-2 allein verabfolgt wurde, reduziert wurde, und daß sich die Verteilung des rhIL-2 änderte. Die vorstehenden Versuchsbeispiele 3 und 4 zeigten weiter, daß die Wirksamkeit des rhIL-2 durch Verabfolgen dieser Immun-Komplexe sehr verstärkt wurde.
    • Beispiel 15 Herstellung eines Immun-Komplexes (fest), in welchem der monoklonale anti-IL-2-Antikörper im Überschuß eingebaut ist
  • 1 ml einer Lösung von 10 mg/ml in Beispiel 2 erhaltenem monoklonalem anti-IL-2-Antikörper wurde mit 0,2 ml einer Lösung von 1 mg/ml des rhIL-2 bei Raumtemperatur ausreichend gemischt. Als nächstes wurde aus dem Gemisch Wasser durch einen SpeedVac- Konzentrator bei Raumtemperatur bei einer Kühlfallentemperatur von -80ºC unter 5 Torr oder weniger abgedampft, um eine pulverige Zubereitung zu erhalten, die als Immun-Komplex-haltige Injektion einen Immun-Komplex mit einem Verhältnis monoklonaler Antikörper:rhIL-2 (Molverhältnis) von etwa 5:1 enthält. Dieser Zubereitung wurde 1 ml destilliertes Wasser zugesetzt, um sie wieder aufzulösen. Zu diesem Zeitpunkt besaß der Immun-Komplex eine zu derjenigen des rhIL-2 gleichwertige EIA-Aktivität.
    • Versuchsbeispiel 5 Verabreichung an Mäuse (sc)
  • Der in Beispiel 15 erhaltenen pulverigen Immun-Komplex-haltigen Zubereitung wurde 1 ml destilliertes Wasser zugesetzt, um sie wieder zu lösen, gefolgt von der Verdünnung mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Anschließend wurde die sich daraus ergebende Lösung Mäusen subkutan in einer 10 ug rhIL-2 gleichwertigen Dosis verabfolgt. Die Blut-rhIL-2-Konzentration 3 Stunden nach der Verabreichung betrug etwa das 3,5-fache derjenigen, wenn der in Beispiel 4 erhaltene Immun-Komplex den Mäusen verabfolgt wurde (Versuchsbeispiel 3).
    • Beispiel 16
  • Unter Verwenden des das Granulozyten-Koloniewachstum stimulierenden Faktors (G-CSF) wird wie bei Beispiel 1 und 2 ein monoklonaler anti-G-SCF-Antikörper erhalten und ein monoklonaler G-CSF-monoklonaler-anti-G-CSF-Antikörper-Immun-Komplex wird auf die Weise von Beispiel 3 erhalten.
    • Referenzbeispiel 1
  • Balb/c-Mäuse, denen zuvor 0,5 ml Mineralöl intraperitoneal verabfolgt wurden, wurden mit 5 x 10&sup6; Zellen anti-Urokinase-MoAb produzierendem Hybridom UK1-3-UK1-87 oder UK1-6 intraperitoneal beimpft. Nach etwa 10 bis 15 Tagen wurde eine Aszitesansammlung beobachtet. Die Antikörper wurden durch ein in der Technik bekanntes Verfahren gereinigt. Nach der Fraktionierung mit 40 bis 50%igem gesättigtem Ammoniumsulfat wurde die Fraktion der DEAE- Cellulose-Chromatographie und Protein-A-Säulenchromatographie unter Erhalten der entsprechenden anti-Urokinase-MoAb-Antikörper UK1-3, UK1-87 oder UK1-6 unterzogen. Diese Antikörper wurden durch HPLC (Säule: Asahipak GS-520, Elutionsmittel: PBS, Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min) bei 10,9 Minuten eluiert, was mit der Retentionszeit handelsüblichen Maus-IgG übereinstimmte.
    • Referenzbeispiel 2 Fibrinolyse-Neutralisationstest
  • Eine verdünnte Lösung eines Testantikörpers wurde einer Urokinaselösung mit einer Endkonzentration von 25 ng/ml zugesetzt, gefolgt von 1 Stunde Reaktion bei 37ºC. Anschließend wurde die Reaktionslösung in einer Menge von 5 ul/Näpfchen in jedes Näpfchen einer Fibrinagaroseplatte gegossen. Nach 2 bis 6 Stunden Stehen bei 37ºC wurde die Lösungsungleichheit (Durchmesser) von Fibrin gemessen, um die Neutralisierungsfähigkeit eines in der verdünnten Lösung des Testantikörpers enthaltenen MoAb gegenüber der Enzymaktivität von UK1 zu bestimmen.
    • Referenzbeispiel 3 Urokinase-Enzymaktivität-Neutralisationstest
  • Eine Testantikörperlösung wurde einer Urokinaselösung mit einer Endkonzentration von 1,78 ug/ml zugesetzt, gefolgt von 30 Minuten Reaktion bei Raumtemperatur. Anschließend wurde das synthetische Peptidsubstrat S-2444 (1 mM, Pyroglutamylglycylarginyl-p-nitroanilid, Kavi Vitrum (Schweden)) dazugesetzt. Nachdem die Reaktion 15 Minuten bei 37ºC weiter ausgeführt wurde, wurde freigesetztes p-Nitroanilid durch die Absorption bei 405 nm bestimmt.
    • Referenzbeispiel 4 EIA von UK
  • Die UK-Konzentration wurde durch den Sandwich-EIA unter Verwenden eines Ziege-anti-UK-Antikörpers als primärem Antikörper und HRP-gebundenem Kaninchen-anti-UK (Fab') als sekundärem Antikörper bestimmt.
    • Beispiel 17 Immun-Komplex-Herstellung (flüssig)
  • 0,63 ml einer Lösung von 10 mg/ml des in der europäischen Patentanmeldung Nr. 363 712, deren Offenbarung hierin durch Verweis inbegriffen ist, beschriebenen anti-Urokinase Moab Antikörpers UK1-3 wurde mit 0,7 ml einer Lösung von 1 mg/ml Urokinase mit hohem Molekulargewicht (Nippon Seiyaku Seizo) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung so gemischt, daß sich ein Molverhältnis von anti-Urokinase MoAb Antikörper UK1-3 zu Urokinase von 3:1 ergibt, wodurch ein Immun-Komplex erhalten wird. Ein für diesen Immun-Komplex durch das Sandwichverfahren unter Verwenden von anti-Maus-IgG als primärem Antikörper und HRP-verknüpftem Kaninchen-anti-UK (Fab') als sekundärem Antikörper bestimmter Wert war von dem in Referenzbeispiel 4 erhaltenen, bestimmten Wert nicht verschieden. Diese Tatsache bewies, daß alle Urokinase als Immun-Komplex vorlag und daß weiter der anti-Urokinase-Immun- Komplex durch den in Referenzbeispiel 4 mit Urokinase allein beschriebenen EIA von UK bestimmt werden kann. Wenn die biologische Aktivität der durch die in Referenzbeispiel 2 und 3 beschriebenen Verfahren erhaltenen Immun-Komplexe bestimmt wurde, war die spezifische Aktivität von Urokinase der Immun-Komplexe derjenigen von Urokinase selbst gleich. Dies zeigte, daß die Immun-Komplexe die biologische Aktivität von Urokinase nicht neutralisierten.
    • Beispiel 18 Immun-Komplex-Herstellung (fest)
  • Wasser wurde durch Lyophilisierung aus dem in Beispiel 17 erhaltenen Immun-Komplex unter Erhalten eines festen Immun-Komplexes abgedampft. Diesem Immun-Komplex wurde 1 ml destilliertes Wasser zugesetzt, um ihn wieder zu lösen. Wenn die EIA-Aktivität zu diesem Zeitpunkt auf eine der von Referenzbeispiel 4 ähnliche Weise bestimmt wurde, besaß der Immunkomplex eine derjenigen von Urokinase gleichwertige Aktivität.
    • Beispiel 19 Herstellung von F(ab')&sub2; (flüssig)
  • anti-Urokinase MoAb Antikörper UK1-3 und Pepsin (Sigma) wurden gemischt und miteinander 18 Stunden bei pH 3,5 bei 37ºC umgesetzt. Nachdem die Reaktion beendet war, wurde das Reaktionsprodukt einer Protein A-Säule unter Erhalten von F(ab')&sub2; des anti-Urokinase MoAb Antikörpers UK1-3 ausgesetzt. Dieser F(ab')&sub2; besaß eine Bindungsfähigkeit mit Urokinase. Der anti-Urokinase MoAb UK1-3 F(ab') wurde mit Urokinase mit hohem Molekulargewicht (Nippon Seiyaku Seizo) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung so gemischt, daß sich ein Molverhältnis von 3:1 ergab, wodurch ein Immunkomplex erhalten wurde. Wenn die EIA-Aktivität zu diesem Zeitpunkt auf eine der von Referenzbeispiel 4 ähnliche Weise bestimmt wurde, besaß der Immunkomplex eine derjenigen von Urokinase gleichwertige Aktivität.
    • Beispiel 20 Herstellung von F(ab')-Immun-Komplex (fest)
  • Wasser wurde durch Lyophilisierung aus dem in Beispiel 19 erhaltenen Immun-Komplex unter Erhalten eines festen Immun-Komplexes abgedampft. Diesem Immun-Komplex wurde 1 ml destilliertes Wasser zugesetzt, um ihn wieder zu lösen.
    • Beispiel 21 Immun-Komplex-Herstellung (flüssig)
  • 0,63 ml einer Lösung von 10 mg/ml des in der europäischen Patentanmeldung Nr. 363 712 beschriebenen anti-Urokinase Moab Antikörpers UK1-87 wurden mit 0,7 ml einer Lösung von 1 mg/ml Urokinase mit hohem Molekulargewicht (Nippon Seiyaku Seizo) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung so gemischt, daß sich ein Molverhältnis von anti-Urokinase MoAb Antikörper UK1-87 zu Urokinase von 3:1 ergab, wodurch ein Immun-Komplex erhalten wurde.
    • Beispiel 22 Immun-Komplex-Herstellung (flüssig)
  • 0,63 ml einer Lösung von 10 mg/ml des in der europäischen Patentanmeldung Nr. 363 712 beschriebenen anti-Urokinase Moab Antikörpers UK1-6 wurden mit 0,7 ml einer Lösung von 1 mg/ml Urokinase mit hohem Molekulargewicht (Nippon Seiyaku Seizo) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung so gemischt, daß sich ein Molverhältnis von anti-Urokinase MoAb Antikörper UK1-6 zu Urokinase von 3:1 ergab, wodurch ein Immun-Komplex erhalten wurde.
    • Beispiel 23 Immun-Komplex-Herstellung (flüssig)
  • In der europäischen Patentanmeldung Nr. 363 712 beschriebener anti-Urokinase Moab Antikörper UK1-3 wurde mit doppelsträngiger Urokinase mit niedrigem Molekulargewicht (JCR) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung so gemischt, daß sich ein Molverhältnis von 3:1 ergab, wodurch ein Immun-Komplex erhalten wurde.
    • Beispiel 24 Immun-Komplex-Herstellung (flüssig)
  • In der europäischen Patentanmeldung Nr. 363 712 beschriebener anti-Urokinase Moab Antikörper UK1-3 wurde mit Prourokinase in phosphatgepufferter Kochsalzlösung so gemischt, daß sich ein Molverhältnis von 3:1 ergab, wodurch ein Immun-Komplex erhalten wurde.
    • Versuchsbeispiel 6 Verabreichung an Ratten (iv)
  • Der in Beispiel 17 erhaltene Immunkomplex wurde Ratten (n = 5) in einer 100 ug Urokinase gleichwertigen Dosis intravenös verabreicht. Das Blut wurde zum Messen der Plasma-Urokinasekonzentration mit der Zeit entnommen. Als Kontrollversuch wurde Urokinase Ratten in einer Dosis von 100 ug allein intravenös verabfolgt. Die Ergebnisse werden in Fig. 5 dargestellt. Unter Bezug auf Fig. 5 zeigen - - und -O- die Ergebnisse für Urokinase allein beziehungsweise den Immun-Komplex an.
  • Die Änderungen der auf diese Weise gemessenen Plasma-Urokinasekonzentration mit der Zeit wurden pharmakokinetisch analysiert. Als Ergebnis wurde die Halbwertszeit (72 Minuten) der Urokinase des Immun-Komplex um etwa das 2,6-fache derjenigen (28 Minuten) in dem Kontrollversuch erhöht und das Verteilungsvolumen (27 ml) wurde auf etwa das 0,3-fache desjenigen (91 ml) in dem Kontrollversuch reduziert.
    • Versuchsbeispiel 7 Verabreichung an Ratten (sc)
  • Der in Beispiel 17 erhaltene Immun-Komplex wurde Ratten (n = 5) in einer 100 ug Urokinase gleichwertigen Dosis subkutan verabreicht. Das Blut wurde zum Messen der Plasma-Urokinasekonzentration mit der Zeit entnommen. Als Kontrollversuch wurde die Urokinase Mäusen in ähnlicher Weise verabfolgt. Die Ergebnisse werden in Fig. 6 dargestellt. Unter Bezug auf Fig. 6 zeigen -O- und -O- die Ergebnisse für den Immun-Komplex beziehugsweise Urokinase allein an. Bei dem Immun-Komplex war die Plasmakonzentration wie in Fig. 6 dargestellt 48 Stunden oder mehr 0,1 ug/ml hoch oder höher. Bei der Urokinase allein war die Plasmakonzentration 8 Stunden nach der Verabreichung jedoch deutlich niedriger als 0,1 ug/ml.
  • Auf die folgenden Zitate wird wegen ihrer Offenbarungen unter verschiedenen Punkten in der Anmeldung Bezug genommen.
  • The Pharmacological Basis of Therapeutics, (1985), MacMillan Publishing Company, New York, NY, S. 22-28
  • Journal of Immunology 135, 2865-2875 (1985)
  • British Journal of Cancer 47, 123-133 (1983)
  • Cancer Immunology and Immunotherapy 30, 71-80 (1989)
  • japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 60-226821/1985, welche der EP-154 316 entspricht
  • PCT/US86/01252 (WO87/00/056A)
  • japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 60-502104
  • PCT/US84/01389 (WO85/00974)
  • Cancer Research 45, 2421-2424 (1985)
  • japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 61-78799/1986, welche der EP-176 299 entspricht
  • japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 60-126088/1985
  • japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 59-93093/1984, welche dem US-Patent Nr. 4 518 584 entspricht,
  • japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung Nr. 60-115528/1985, welche der EP-145 390 entspricht
  • Primer of Pharmacokinetics by Microcomputers, S. 159, Nankodo (1983)
  • Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4852 (1988) Journal of Immunological Methods 93, 157-165 (1986)

Claims (9)

1. Immun-Komplex, umfassend eine biologisch aktive Substanz und einen monoklonalen Antikörper gegen die biologisch aktive Substanz, wobei der monoklonale Antikörper fähig ist, das Verteilungs-Volumen der biologisch aktiven Substanz auf das 0,5-fache oder weniger zu reduzieren, verglichen mit dem Fall, in dem die Substanz allein verwendet wird.
2. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verabreichung an einen Wirt, umfassend eine wirksame Menge des Immun-Komplexes des Anspruchs 1.
3. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 2, die ein pulvriges getrocknetes Produkt ist.
4. Immun-Komplex nach Anspruch 1, worin die biologisch aktive Substanz ein Cytokin ist.
5. Immun-Komplex nach Anspruch 4, worin das Cytokin Interleukin-2 ist.
6. Immun-Komplex nach Anspruch 1, worin die biologisch aktive Substanz ein Enzym ist.
7. Immun-Komplex nach Anspruch 6, worin das Enzym Urokinase ist.
8. Immun-Komplex nach Anspruch 1, worin der monoklonale Antikörper zu Immunoglobulin G gehört.
9. Immun-Komplex nach Anspruch 1, worin der monoklonale Antikörper ein Fragment mit Antikörperwirkung des Immunoglobulins G ist.
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