JPH03279335A - 免疫複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は治療上有効な生理活性物質と該物質の生体内に
おける分布容積を約０．５倍以下に減少させうるモノク
ローナル抗体との免疫複合体に関する。

従来の技術 生理活性物質はヒトないしは動物などの疾病の治療に有
効であるが、反面使用方法を誤ると疾病が治療できない
ばかりか、重篤な副作用をひきおこし、場合によっては
、ヒトないしは動物を死に至らしめることも起こり得る
。したがって、生理活性物質を生体に投与し、ヒトない
しは動物などの疾病を治療するためには、該生理活性物
質を必要な場所に、適当な濃度で、適当な時間だけ存在
させることを十分考慮する必要がある。そのためには多
くの場合、１）使用方法を最適なものとするか、２）本
来の生理活性物質の製剤処方で工夫するか、３）生理活
性物質本体の構造を修飾することによってまったく別の
化合物とするといったことがなされる。

ｌ）使用方法の工夫の例としては投与方法の変更（静脈
内投与、皮下投与、筋肉内投与、経ロ投与など）を挙げ
ることができるが、薬物の分布、半減期そのものを変え
ることはできない。２）製剤処方の例としてはリポソー
ムとマイクロカプセルを挙げることができるが、いずれ
もベシクル中に薬物ないしは薬物溶液を内封させたもの
であり、おもに薬物の徐故によって生体内で適当な濃度
を保つよう試みたものである。しかしながら、薬物その
ものの半減期や分布を変えることは一般にはむずかしい
。３）生理活性物質本体の構造を修飾する場合には、生
体内半減期、分布、代謝などの性質を変えることができ
るが、生理活性物質本体の薬理作用が質、量ともまった
く変わってしまうこともある。

以下に、たとえばインターロイキン−２（以下、ＩＬ−
２と略称することもある。）を例として具体的に従来の
技術を説明する ＩＬ−２はレクチンまたは抗原で活性化されたＴＪＩ胞
によって生成される可溶性蛋白質で、ＮＫ細胞、キラー
Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、Ｂ細胞の増殖・分化を促進す
るなどの作用によって細胞性免疫を強化し、免疫の低下
した状態を正常に戻すのに有用である。ＩＬ−２のこの
免疫活性は、癌、細菌またはウィルス感染、自己免疫疾
患、免疫不全等に対する治療に有用である。

しかしながら、ＩＬ−２は生物学的半減期が小さく、分
布容積が大きい。例えばｒＬ−２は人に投与した場合の
血液中からの消失半減期は６．９分（Ｍ、　Ｔａｏｔｚ
ｅ　ｅｔ　ａｌ、、ジャーナル・オブ・イムノロジー（
Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｉ＋ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）
、　１３５　、２８６５−２８７５　（１９８５））と
報告されている。ＩＬ−２の分布容積の計算がなされた
例は少ないが、Ｉ　Ｌ−２を投与したときの投与初期の
血漿中濃度が低く、その原因として血漿中以外に細胞外
液にも分布することが一つの原因として推定されている
（Ｃ，Ｂｉｎｄｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｒ１ｔｉｓｈ　
　Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆＣａｎｃｅｒ　４７　、　１
２３　１３３（１９８３））。このようにサイトカイン
は生体からの消失が早く、分布容積が大きく、実際の治
療に際しては充分な作用を発揮しにくい、あるいは大量
の投与量を必要とすることが予想される。大量に生体に
投与した場合には生体全体にＩ　Ｌ−２が分布し、副作
用が大きくなることが予想される。

このようなＩＬ−２の性質を改善する目的で治療スケジ
ュールを改善する。例えば全投与量を変えずに、投与回
数を増すことによって血中での作用時間を増すことが試
みられている（大津ら、キャンサー・イムノロジー・ア
ンド・イムノセラビー（Ｃａｎｃｅｒ　　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ　　ａｎｄ　　１ｗｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）
、１旦、　７１−８０　（１９８９））。またＩ　Ｌ−
２の血液中での半減期を大きくさせる目的で、！Ｌ−２
にポリエチレングリコールを結合させる方法がある（画
材ら、特開昭６０−２２６８２１号公報、あるいはＮ、
　Ｋａｔｒｅ　ａｔ　ａｌ、、　ＰＣＴ／ＵＳ　８６／
　０１２５２　（Ｗ０８７００１０５６Ａ））。しかし
この場合には分布容積はＩＬ−２のそれと変わらないの
で、生体全体にＩＬ−２が分布し、投与量が同じ場合に
は副作用は減少しないことも予想される。

ウロキナーゼ生理活性物質は人尿または、人腎細胞組織
培養により網製されており、プラスミノーゲンを加水分
解して直接プラスミンを生成し、フィブリンを溶解する
。制ガン剤との併用、脳血栓および末梢動・静脈閉塞症
や急性心筋梗塞の治療に広く用いられている。プラスミ
ノーゲンの直接的なアクチベーターであり、投与量は日
本では通常約２４００〜約２４万ＩＵ／日が用いられる
。

人には、瞬間的に或は持続的に動脈内ないしは静脈内に
注入されることが行われている。さらにウロキナーゼに
は高分子型ウロキナーゼ、低分子型ウロキナーゼ、プロ
ウロキナーゼが知られている。

最大の薬効を得る目的で、全投与量を変えずに、治療ス
ケジュールを改善し、血中濃度を一定に保つ試みが行わ
れることもある。例えば、人には瞬間的に或は１０分程
度にわたって、全投与量の１０％を静脈内に投与し、さ
らに４時間にわたって残り９０％を静脈内に持続注入す
ることによって、血中濃度を一定とし、最大の効果を得
ようとする方法である。しかしこの場合には分布容積は
ウロキナーゼのそれと変わらないので、生体全体にウロ
キナーゼが分布し、投与量が同じ場合には副作用は減少
しないことも予想される。

ウロキナーゼの標的である血栓が血管内に存在すること
を考えると、血中にウロキナーゼを長時間高い血中濃度
で存在させるためには、ウロキナーゼの半減期を増加さ
せ、分布容積を約０．５倍以下に著しく小さくするよう
な試みが求められている。

一方、モノクローナル抗体を選択して、インター７エロ
ンーαの半減期を長くするようなモノクローナル抗体−
インターフェロン−α免疫複合体を作製する方法が報告
されている（プリングら、特許出願公表昭６０−５０２
１０４、ＰＣＴ／ＵＳ８４１０１３８９　（ＷＯ８５１
００９７４）Ｃａ、ｎｃｅｒ　　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、
　　４５゜２４２１−２４２４．１９８５）。上記特表
昭６０−５０２１０４およびＷＯ３５１００９７４にお
いては、インターフェロン−αを静脈内投与したときの
分布容積は２０．８ｉＩＩ２であり、モノクローナル抗
体・インターフェロン−α免疫複合体を投与したときの
分布容積は１９．２−とほとんど変化がないことが示さ
れている。　上記Ｃａｎｃｅｒ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈに
はインターフェロン−σを静脈内投与したときの分布容
積は１７．２ｍであるのに比し、モノクローナル抗体・
インターフェロン−α免疫複合体を投与したときの分布
容積は１１．９としており、従って、該免疫複合体の場
合には分布容積は０．６９倍にしか減少していない。こ
の程度の減少では、薬効の増強効果はあったとしても著
しいものではない。

生体内での生理活性物質の存在場所、濃度、時間の関係
を解析する方法としてファーマコキネチックスがよく用
いられ、得られたパラメーターは、生体内での生理活性
物質の存在場所、濃度、時間の関係を表わしている。例
えば生理活性物質を血中に静脈内投与し、生理活性物質
の血中濃度を最も簡単なワンコンパートメントモデルで
ファーマコキ不チカルに解析すると生理活性物質の生体
内での分布に関係する分布容積と半減期に関係する′消
失速度定数が得られる。

またモノクローナル抗体の一種である二重特異性抗体は
既に上記７リンケらの方法あるいは他でも試みられてい
るが、生体内での分布容積を変化させるような抗体につ
いては未だ報告されていない。

発明が解決しようとする課題 生理活性物質の分布容積を該生理活性物質単独の場合よ
り著しく減少させうるような生理活性物質−モツクロー
ナル抗体免疫複合体ができれば、血中濃度を高くしてよ
り有効にその効果を発揮することができ、また副作用を
軽減することができる。

課題を解決するための手段 本発明者らは、生体に投与したときの生理活性物質の分
布容積を該物質単独投与の場合より減少させうるモノク
ローナル抗体−生理活性物質の複合体につき研究を重ね
た結果、生理活性物質の分布容積を約０．５倍以下に減
少させ得る免疫複合体が生理活性物質の生体内での血中
濃度を高めることができ、薬効を著しく増強することが
できるという知見を得、そのような免疫複合体を得るこ
とに成功し、本発明を完成した。

本発明は、生理活性物質と、生体内での該物質の分布容
積を該物質単独の場合より約０．５倍以下に減少させう
るモノクローナル抗体との免疫複合体である。

生理活性物質は生理活性をもつ物質で、生物体の生活活
動を維持し恒常性を保つと共に、発展させるために必要
な物質である。疾病の際にはこのような生理活性物質を
利用することによって、生物体の機能を正常な状態にま
で改善することが可能である。

本発明の生理活性物質としては、たとえばサイトカイン
、細胞成長因子、ホルモン、酵素等のタンパク、ペプチ
ドや、これらの生理活性を有するミュータント、フラグ
メント等が挙げられる。これらのアンタゴニストやアゴ
ニストも挙げることができる。またステロイ下類やその
アンタゴニストやアゴニストも挙げることができる。ま
た、アラキドン酸カスケードも挙げることができる。サ
イトカインの例としてはたとえばマクロファージを抗原
で活性化して得るインターロイキン−１、抗原でＴ細胞
を活性化するインターロイキン−２、Ｔ細胞のうち特定
のクローンで産生されるインターロイキン−３、その他
、Ｔ細胞によって産生されるインターロイキン−４や、
Ｔ細胞代替因子（ＴＲＦ、またはＢ細胞分化因子（ＢＣ
ＤＦ））、抗原特異的サプレッサー因子（ＴｓＦ）、可
溶性免疫反応抑制因子（Ｓ　Ｉ　ＲＦ）、サプレッサー
誘導因子（ＳＩＦ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−
γ）、Ｂ細胞より産生されるＢ細胞増殖因子（ＢＣＧＦ
）、Ｂ細胞分化促進因子（ＢＣＤＦ）、Ｂ細胞増殖抑制
因子（ＳＢＦ）、あるいは、Ｂ細胞やＴ細胞から産生さ
れるといわれるマクロファージ活性化因子（ＭＡＦ）、
マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、白血球遊走阻
止因子（ＬＩＦ）、リンホトキシン（ＬＴ）、マクロフ
ァージなどによって産生されるインターフェロン−ａ（
ＩＦＮ　　ａ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ　−ＣＳ
　Ｆ　）、マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ
５Ｆ）、単球コロニー刺激因子（Ｍ−Ｃ３Ｆ）、繊維芽
細胞から産生されるインターフェロン−β（ＩＦＮ−β
）などが挙げられる。これらの他にはインターロイキン
−５やインターロイキン−６などの他のインターロイキ
ン類、マクロファージ走化性因子（ＭＣＦ）、リンパ球
遊走因子（ＬＣＦ）などのような走化性因子、血管透過
性因子（ＶＰＦ）などの炎症性リンホカイン、細胞障害
性Ｔ細胞から産生されるパーホリン、リンパ球由来のリ
ンホトキシンなどの殺腫瘍因子なども挙げられる。また
、細胞成長因子のおもなものとしては、繊維芽細胞、平
滑筋細胞をおもな標的とする血小板由来細胞成長因子（
ＰＤＧＦ）、繊維芽細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、
上皮細胞、軟骨細胞をおもな標的とする上皮細胞成長因
子（ＥＧＦ）　、繊維芽細胞、平滑筋細胞、血管内皮細
胞、上皮細胞をおもな標的とする繊維芽細胞成長因子（
ＦＧＦ）、神経細胞をおもな標的とする神経成長因子（
ＮＧＦ）、軟骨細胞をおもな標的とする神経成長因子（
ＩＣＦ−ＩおよびＩＧＦ■）、赤血球を増殖させるエリ
スロポエチンなどがあげられる。ホルモンの例としては
ティッシュ・プラスミノーゲン・アクチバータ−（ＴＰ
Ａ）、インスリン、アンジオテンシン１１アンジオテン
シン■、アンジオテンシン■、アンジオテンシン■イン
ヒビター、心房性ナトリウム利尿ペプチド、プラジキニ
ン、カルシトニン、コルチコトロピン、タイツルフィン
、キョートルフイン、エンドルフィン、エンケファリン
、セクレチン、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、黄体
形成ホルモン放出ホルモン、二二一口テンシン、副甲状
腺ホルモン、オキシトシン、バンプレシン、バットシン
、ソマトスタチン、チロトロピン放出ホルモン（ＴＲＨ
）、ヒト成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、プロラク
チン、フルチコトロビン、アゴニストの例としては、た
とえばリュープロレリンが挙げられる。

ステロイドの例としては、プロゲストロン、ニストロジ
エン、副腎皮質ホルモン、アルドステロン、デキサメサ
ゾン、エストロン、エストラジオール、ジヒドロテスト
ステロンなどが挙げられる。またステロイド類のアンタ
ゴニストの例としてはジヒドロテストステロンのアンタ
ゴニストであるオキセンドロンが挙げられる。アラキド
ン酸カスケードの例としては、プロスタグランデインＥ
２が挙げられる。

酵素としては、ウロキナーゼ、スーパーオキシドディス
ムターゼ、アスパラギナーゼなどが挙げられる。

生理活性物質としては、サイトカインおよび酵素が好ま
しく、なかでもインターロイキン−２およびウロキナー
ゼ、プロウロキナーゼが好ましい。

以下に、Ｉ　Ｌ−２を詳細に説明する。生理活性物質が
ＩＬ−２の場合、該Ｉ　Ｌ−２としては、哺乳動物由来
のものであればいずれでもよいが、ＩＬ−２の全分子で
もよく、また部分的なフラグメントペプチドであっても
よい。またここで言う■Ｌ−２はヒト細胞由来のＩ　Ｌ
−２複合体、遺伝子工学的手法によって微生物、動物細
胞から得られたＩ　Ｌ−２複合体等製造方法に制限はな
い。また、遺伝子工学手法によって一部のアミノ酸置換
を行ったもの、および、Ｎ末端側、Ｃ末端側にアミノ酸
残基を付加ないし欠損したもの等、本来のヒトＩ　Ｌ−
２複合体を基本的な分子骨格とするものも含まれる。

さらに詳しくは、該ＩＬ−２としては、ＩＬ−２と同様
の活性を有する物質、すなわち、Ｔ細胞をその機能を維
持したまま継代維持しうる作用を有する物質が挙げられ
る。具体的には、例えば特開昭６１−７８７９９号公報
の第１図に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
（Ｉ）（ヒトＩＬ−２）や、その生物学的もしくは免疫
学的活性に必要な一部分のアミノ酸配列からなるポリペ
プチドでもよい。上記ポリペプチドとしては、例えばポ
リペプチド（Ｉ）のアミノ末端から１個のアミノ酸（Ｅ
ＰＣ公開　９１５３９号公報）または４個のアミノ酸を
欠くもの（特開昭６０−１２６０８８号公報）やカルボ
キシル末端部の数個のアミノ酸を欠くものなどが挙げら
れる。さらに該ポリペプチド（１）の構成アミノ酸の一
部が欠損しているか他のアミノ酸に置換されたもの、例
えば１２５位のシスティン残基がセリン残基に置換され
たもの［特開昭５９−９３０９３号公報］でもよい。

とりわけ、特開昭６１−７８７９９号公報の第１図に示
されるアミノ酸配列を有するヒトＩＬ−２を用いるのが
好ましく、この場合そのアミノ末端にさらにメチオニン
残基（Ｍｅｔ）を有するものと有さないものとの混合物
［特開昭６０−１１５５２８号公報、特開昭６１−７８
７９９号公報１であってもよく、またアミノ末端にＭｅ
ｔを有さずアラニア　（Ａ　ｌａ）で始まるもの［特開
昭６１−７８７９９号公報〕でもよい。また、糖鎖を有
しているものであってもよい。

さらに、ウロキナーゼについて説明する。ウロキナーゼ
は高分子型ウロキナーゼ、低分子型ウロキナーゼ、プロ
ウロキナーゼが知られている。この他のウロキナーゼフ
ラグメントであってもよいし、ヒト以外の他の哺乳動物
由来のものであってもよい。またここで言うウロキナー
ゼは遺伝子工学的手法によって微生物、動物細胞から得
られるウロキナーゼ等に制限はない。また遺伝子工学的
手法によって一部のアミノ酸置換を行ったムティンおよ
びＮ末端、Ｃ末端側にアミノ酸残基等を付加ないし欠損
したもの等本来のウロキナーゼを基本的な分子骨格とす
るものも含まれる。

本発明で用いられるモノクローナル抗体は、生理活性物
質との免疫複合体とし、該免疫複合体を生体に投与した
際に該物質の生体内での分布容積を該物質単独投与の場
合より約０．５倍以下に減少させうるものであればいず
れでもよい。

本発明で用いられるモノクローナル抗体は、さらに免疫
複合体としたときに、血中における半減期を延長しない
ものでもよく、また延長するものでもよい。

本発明の免疫複合体は、分布容積が約０．５倍以下に減
少されているので、生理活性物質の副作用が減少される
ことが期待される。

また、本発明の免疫複合体において、半減期を延長する
ものは、生理活性物質の持続的効果が期待される。

該モノクローナル抗体は、生理活性物質あるいはその誘
導体を免疫原として得られた該モノクローナル抗体産生
ハイブリドーマを製造し、該ハイブリドーマを培養する
ことにより得られる。

本発明で用いられるモノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマの作製にあたっては、該モノクローナル抗体が生理
活性物質に特異的でかつ該生理活性物質と免疫複合体を
形成し、該免疫複合体を生体に投与したときの分布容積
が生理活性物質単独の場合より減少させうるモノクロー
ナル抗体を産生ずるようなものであればいずれのもので
もよい。

なお、該モノクローナル抗体は、生理活性物質の生理活
性を中和するものでもよい。

該ハイブリドーマの作製に用いられる免疫原としては、
上述した生理活性物質や、それらの誘導体［たとえば該
物質と同様の作用を有するそれらのミュータント、フラ
グメント］、該物質のアンタゴニスト、アゴニストある
いはその誘導体［たとえばこれらと同様の作用を有する
ミュータント、フラグメント］などを挙げることができ
る。該誘導体においては、特にフラグメントが好ましい
。

また、該免疫原としては、該生理活性物質を熱変性した
ものでもよく、該熱変性したものが好ましいことがある
。

上記した免疫原をそのまま、あるいはこれにキャリア蛋
白を結合させて、動物（例、ウサギ、ラット、マウス、
モルモットなど）を免疫し抗体産生細胞を得る。

該キャリア蛋白としては、たとえば牛血清アルブミン（
ＢＳＡ）、オバルブミン（ＯＶＡ）、キーホールリンベ
ットヘモシアン（ＫＬＨ）、タイログロブリンなどがあ
げられる。

キャリア蛋白との結合には例えば生理活性物質のシステ
ィンの部分が用いられる。すなわちキャリア蛋白を予め
、例えばＮ−（γ−マレイミドブチリルオキシサクシニ
ミド）（以下、ＧＭＢＳと略記することがある）でマレ
イミド化あるいはＮサクシニミジル−３−（２−ピリジ
ルジチオ）プロピオネート（以下、５ＰＤＰと略記する
ことがある）などでジチオピリジル化することにより、
上記生理活性物質のＣｙｓのＳＨ基を介してキャリア蛋
白に化学結合することが可能である。

抗体産生ハイブリドーマの作製については、上記の生理
活性物質もしくはその誘導体あるいはこれらとキャリア
蛋白との縮合物を常法に従い動物に免疫し、得られる抗
体産生細胞を骨髄腫細胞などと融合させる方法が用いら
れる。免疫動物としては、例えばウサギ、ラクト、マウ
ス、モルモットなどが用いられるが、モノクローナル抗
体製造の場合にはマウスが特に好ましく用いられる。接
種方法としては、通常実施される方法に従えばよく、例
えば、マウスに１回約１−１００μｇ、好ましくは約ｌ
θ〜２５μｇを等容量（０，１ｄ）の生理食塩水および
７０インドの完全アジュバントで乳化して、背部の皮下
あるいは腹腔内に２〜３週毎に約３〜５日後種する方法
がとられる。

これらの免疫動物、例えばマウスから抗体価の高い個体
を選び、最終免疫約３〜５日後に牌臓およびあるいはリ
ンパ節を採取し、さらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫
細胞と融合させる。融合操作は既知の方法に従い実施で
き、融合促進剤としてはポリエチレングリコール（以下
、ＰＥＧと略することがある）やセンダイウィルスなど
が挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。骨髄
腫細胞としてはＭＳ−１，Ｐ３Ｕ１，５Ｐ２１０なと、
特にＰ３Ｕｌが好ましく用いられる。例えば牌臓細胞と
骨髄腫細胞との好ましい比率は約ｌ：１−１０：１でこ
れに分子量約１．０００〜６゜０００のＰＥＧが約ｌＯ
〜８０％の濃度で添加され、約２０〜３７℃、好ましく
は約３０〜３７℃で約３〜ＩＯ分インキュベートするの
が良い。

本発明のハイブリドーマのスクリーニングには種々の方
法が使用できる。例えば、マイクロプレートに生理活性
物質を吸着させたのち、ハイブリドーマ培養上清を添加
し、プレートに結合した抗生理法性物質特異抗体を検出
する酵素免疫測定法（以下、ＥＩＡと略記することがあ
る）により培養上溝中の抗体価を測定する。ＨＡＴ（ヒ
ポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）添加培地で
選別、育種された抗体活性陽性のハイブリドーマは直ち
にクローニングに供されるが、通常これは限界希釈法な
どで容易に実施される。クローニング化されたハイブリ
ドーマを選択し、目的とするモノクローナルな抗生理法
性物質特異抗体産生ハイブリドーマを取得することがで
きる。

生理活性物質または、生理活性物質とモノクローナル抗
体を投与した時の薬動力学パラメーターは常法に従って
求めることができる。すなわち該生理活性物質の水溶液
を動物に静脈内投与し、投与一定時間後に採血し、遠沈
後得られた血漿中の該生理活性物質濃度を定量し、この
結果を薬動力学パラメーター解析ソフト、例えばＡＰＡ
Ｓを用いて、解析することによって分布容積Ｖｄを得る
ことができる。

例えば、ＩＯμｇのりコンビナンドＩＬ−２（ｒＩＬ−
２）を含有する免疫複合体の０．１−の生理食塩水溶液
をマウスに静脈内投与し、投与後１５゜３０分、１．３
．６時間後に眼からヘバリナイズしたキャピラリーチュ
ーブで採血し、遠沈後得られた血漿中のｒＩＬ−２濃度
をＥＩＡで測定する。

血漿中濃度の薬動力学パラメーター解析ソフト、例えば
ＡＰＡＳ（山間　清、谷用原裕介（Ｋ。

Ｙａｍａｏｋａ、　Ｙ、　Ｔａｎｉｇａｗａｒａ）マイ
コンによる薬物速度論入門、南江堂　ｐ、１５９．１９
８３）を用いて、ｌ−コンパートメントモデル式 ％式％ に近似することができる。ここでＣは血漿中１１Ｋ、Ｃ
１は時間０に外挿した血漿中初期濃度、ｔは投与後の時
間、ｋは消失速度定数を示す。さらに分布容積Ｖｄは投
与量をＣ１で除することｌこよって得られる。半減期は
、０．６９３をｋで除することによって得られる。

解析方法の簡便法としては縦軸に血漿中濃度、横軸に時
間をとった対数グラフ上に、測定点をとり、直線に近似
した時の縦軸の切辺（血漿中濃度）で投与量を除するこ
とによっても得られる。まＩこ血漿中濃度が１／２とな
るのに要する時間を求めることによって半減期を得るこ
とができる。

動物としてマウスの代わりに、ラットを用い、１００μ
ｇのｒｌＬ−２を含有する免疫複合体を同様に投与する
ことも可能であり、採血部位としては、通常の方法であ
れば、例えば尾静脈より採血しても構わない。また、血
漿の代わりに血清を用いても同様にパラメーターを求め
ることができる。

ｒｌＬ−２以外の本発明でいう生理活性物質についても
上記と同様に行なうことができる。

本発明においては、生体内での生理活性物質の分布容積
を該物質単独の場合より約０．５倍以下に減少させうる
モノクローナル抗体が用いられる。

さらに、約０．０５〜０．５倍に減少させうるものが好
ましく、約０．１〜０．５倍に減少させうるものがさら
に好ましく、約０．１〜０．３倍に減少させうるものが
特に好ましい。

分布容積、消失半減期は、このように動物に静脈内投与
した時の経時的な血液、血清、または血漿中の生理活性
物質濃度を解析することで得られ、生理活性物質の分布
、排泄、代謝などを反映している。このように薬動力学
パラメーターは生体と生理活性薬物の関係によって決ま
るが、投与方法とはまったく無関係である。いいかえる
ならば、薬動力学パラメーターは、静脈内投与以外の投
与方法、例えば皮下注射、筋肉内注射、または経口投与
などを用いても生理活性物質の分布、排泄、代謝などに
その特徴を示すことが一般的である。

上記した本発明のモノクローナル抗体産生ノ＼イブリド
ーマの培養は通常、液体培地中、または動物の腹腔内（
例えば、マウス等補乳動物の腹腔内）で公知の方法によ
り実施できる。培養液および腹水中の抗体の精製につい
ては生化学的手法を組み合わせて用いることによりでき
る。例えば、細胞培養液もしくは腹水を遠心分離し、上
溝を取り出し、塩析（通常は硫酸アンモニウムもしくは
硫酸ナトリウムを用いる）を実施し、得られた蛋白沈澱
物を適当な溶液に溶解し、透析後カラムクロマトグラフ
ィー（イオン交換カラム、ゲルろ過カラム、プロティン
Ａ１ヒドロキシアパタイトカラム等）に付し、目的とす
る抗体を分離精製することができる。塩析の代わりに５
μｍのフィルターでろ過し、ゲルろ過によって適当な溶
液に置換した後、上記と同様なカラムクロマトグラフィ
ーに付すことも可能である。以上のような分離精製操作
により、例えば１リツトルの培養上清からタンパク重量
比で８０％以上の純度の、さらに９０％以上の純度のモ
ノクローナル抗体を約３〜２０ｍｇ。

さらに約５〜２００ｍｇ得ることができる。また、２０
−の腹水液からは同様のモノクローナル抗体が約５〜３
００ｍｇ得られることがあり、また、３〜ｌｏｏｍｇも
しくは約３〜２０ｍｇ得られることもある。

以上のようにして得られたモノクローナル抗体はタンパ
ク質として均一である。

上記モノクローナル抗体は、イムノグロブリンＧである
ことが好ましい。また、本発明で用いられるモノクロー
ナル抗体としては、蛋白分解酵素（ペプシン等）処理に
より、生理活性物質に対する結合能を保持するＦ　ａｂ
、　　Ｆ　ａｂ’、Ｆ（ａｂ’）ｔなどのフラグメント
としてもよい。

上記製造法に従って作製した種々のモノクローナル抗体
と生理活性物質とをモル比で約１＝２となるようにたと
えば燐酸緩衝生理食塩水中で混合した免疫複合体の中か
ら、マウスに生理活性物質とモノクローナル抗体との免
疫複合体を醇脈注射した時の分布容積が生理活性物質溶
液の分布容積よりも小さくなる免疫複合体を構成するモ
ノクローナル抗体を選択し、さらに該モノクローナル抗
体を産生ずるハイブリドーマを選択した。この時の分布
容積は、前に述べた方法で求めることができる。

またモノクローナル抗体の選択にあたっては、モノクロ
ーナルと生理活性物質との免疫複合体の分布容積が生理
活性物質の分布容積の１＝２以下となるように選択する
のが好ましい。

またこのモノクローナル抗体がマウスＩｇＧである場合
には、該抗体の抗原認識部位を含む可変領域をコードす
るＤＮＡを取得し、これに遺伝子操作技術（Ｚ、　５ｔ
ｅｐｌｅｖｓｋｉら：プロシーデイングス・オプ・ナシ
ョナル・アカデミ−・サイエンス　ニーニスニー（Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）
、８５　、４８５２　（１９８ｇ））を用いてヒトｔｇ
Ｃの定常領域をコードする遺伝子を結合させ、マウス−
ヒトキメラ抗体を作製することもできる。かかるキメラ
抗体はヒトへの投与に際し、抗原性が小さいため有利に
用いられる。

本発明の抗生理法性物質モノクローナル抗体と該生理活
性物質との混合によって、必要とする免疫複合体が得ら
れる。免疫複合体を得るための混合のモル比は約ｌ：２
であることが好ましいが、投与に際しては必要に応じて
、抗生理法性物質モノクローナル抗体あるいは該生理活
性物質を増すことによって、モル比を約１０：１から約
１：５０、好ましくは約５＝１から約１＝５０まで変え
ることも可能である。好ましくはモル比を約１０：ｌ〜
約１：１０．約ｌ：１から約１＝１０あるいは約５：ｌ
から約１＝５とするのが好ましい。

混合方法としては、水溶液としで混合し免疫複合体とす
ることが好ましい。粉末状の抗生理法性物質モノクロー
ナル抗体と該生理活性物質とを混合しておき、投与前溶
解時に免疫複合体とする方法も実質的にこの方法の一部
である。溶解した免疫複合体は真空乾燥の方法によって
固体とし、用時溶解して用いることもできる。さらに混
合方法として、抗生理法性物質モノクローナル抗体と該
生理活性物質とを別個に生体に投与して、生体内で実質
的に免疫複合体とする方法も挙げられる。

さらに本発明は、上述した免疫複合体を含有してなる生
理活性薬剤を提供するものである。

すなわち上述のようにして得られた本発明の免疫複合体
はそれ自体あるいは適宜の薬理学的に許容され得る賦形
剤、希釈剤などと混合したのち、必要ならば例えばメン
ブランフィルタ−等によるろ過滅菌を行い、そのまま液
体注射剤とすることもできる。あるいは必要により適宜
の薬理学的に許容され得る賦形剤、希釈剤などと混合し
たのち、必要ならば例えばメンブランフィルタ−等によ
るろ過滅菌を行った溶液を真空乾燥して粉末注射剤とし
、用時に水ないしは生理食塩水等で溶解して用いること
ができる。

また抗生理法性物質モノクローナル抗体のみの溶液にも
同様に上記の操作を行い、液体注射剤６よび粉末注射剤
とすることができる。

賦形剤としては、例えばマニトールを用いることができ
る。希釈剤としては通常、水を用い、上記の賦形剤ある
いは安定化剤、無痛化剤、保存剤等を適宜配合して、注
射剤としての特性を高めることもできる。

上記安定化剤の例としてはたとえばＨ３Ａ（ヒト血清ア
ルブミン）などが、等張化剤としてはたとえば食塩、ブ
ドウ糖、マンニトール、ソルビトルなどが、ｐＨ調節剤
としてはたとえば塩酸、水酸化ナトリウムなどが、安定
化剤としてはたとえばピロ亜硫酸ナトリウム、ロンガリ
ット、メタ亜硫酸水素ナトリウムなどが、無痛化剤とし
てはたとえば塩酸キシロカイン、クロロブタノール、塩
酸プロ力インなどが、保存剤としてはたとえばベンジル
アルコール、フェノール、バラオキシ安息香１ｍメチル
、パラオキシ安息香酸プロピルなどがそれぞれ挙げられ
る。

これらの免疫複合体は溶液でも製剤とすることができる
が、真空乾燥などによって粉末とし開時溶解することも
できる。粉末化した製剤は取扱いやすいので好ましい製
剤である。真空乾燥法の例としては凍結乾燥法を挙げる
ことができる。凍結乾燥をする際には零下１０℃以下に
冷却されたサンプルを用いて、実験室ではフラスコ中で
、工業的にはトレイを用いて、あるいはバイアル中で凍
結乾燥させることが好ましい。

ここで凍結乾燥法の代わりに、サーバント社（Ｓｅｒｖ
ａｎｔ）のスピードバックコンセントレータ−を用いて
乾燥試料を得ることもできる。この場合温度は約０〜３
０℃が好ましい。真空圧は約２０ｍｍＨｇ以下で行われ
る。さらに好ましくは、約１０ｍＨｇ以下が好ましい。

乾燥させるべき水溶液中には、緩衝作用を持つ塩例えば
リン酸塩類を加えることによりｐＨを約３．０〜１Ｏ１
０とするのが好ましい。あるいは投与時点での注射剤の
浸透圧を生体と等張とするために、通常注射剤として用
いられている、塩化ナトリウム、グルコースなどの等張
化剤を加えておくことが好ましい。しかし、等張化剤を
乾燥以前に加えないで、溶解の際に適当な浸透圧を持つ
塩水溶液、グルコース溶液、代用血しょうなどで溶解す
ることが可能である。必要ならば、チメロサールなどの
保存剤を加えることもできる。また、蛋白の安定化の目
的で安定化剤として、ヒト血清アルブミン（ＨＳ　Ａ）
を加えることも可能である。

このように乾燥して得られた製剤は長期間安定な製剤と
して、開時に水、塩水溶液、グルコース溶液、代用血し
ょうなどで溶解し、注射剤とすることが可能である。

また、前記担体等、安定化剤等を添加した注射剤として
もよい。

このように、本発明の薬剤としては、乾燥品で粉末であ
るものが好ましい。

以上述べた方法で治療上有効な生理活性物質と該物質の
分布容積を減少させうるモノクローナル抗体との免疫複
合体が得られる。

また、該免疫複合体を含有してなる生理活性薬剤が得ら
れる。

本発明の免疫複合体に用いるモノクローナル抗体は、毒
性が極めて低いものであるので、当該複合体も毒性の低
いものである。

本発明の免疫複合体は、それを構成する当該生理活性物
質と同様の目的に使用することができる。

たとえば、当該生理活性物質が、癌、免疫異常、炎症、
ホルモン調節異常、高血圧または心疾患などの治療に用
いることができる場合に、本発明の免疫複合体をそれと
同様の目的に用いることができる。

したがって、本発明の免疫複合体もしくはそれを含有す
る薬剤を、哺乳動物（例、マウス、ラット、イヌ、ネコ
、ブタ、ウシ、サル、ヒトなど）に静脈内、皮下、筋肉
内、腹腔内などに投与することができる。

本発明の免疫複合体の投与量は、生理活性物質としての
量が該生理活性物質の公知の投与量となる量あるいはそ
れ以下の量が挙げられる。

上記した抗生理法性物質モノクローナル抗体と該生理活
性物質とを別個に生体に投与して、生体内で実質的に免
疫複合体とするには、たとえば当該モノクローナル抗体
を前記と同様にして注射剤に成形したものを、哺乳動物
（例、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、サル
、ヒトなど）の静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内などに投
与しておき、次に該生理活性物質を前記と同様にして注
射剤に成形したものを静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内な
どに投与する。この場合二つの投与ルートは異なっても
よい。

該抗生理法性物質モノクローナル抗体と該生理活性物質
とのモル比は好ましくは約１０：ｌ〜約１＝５０、さら
に好ましくは約５＝１〜約ｌ：５０、さらに好ましくは
約１＝１〜約１：ｌＯあるいは約５：ｌ−１：５である
。生理活性物質または抗生理法性物質モノクローナル抗
体の投与量は、対照となる疾患、症状あるいは投与ルー
ト等によって異なるが、生理活性物質の量は、該生理活
性物質の公知の投与量となる量ないしはそれ以下の量が
挙げられる。

例えば、該生理活性物質が抗癌作用を有する場合に、本
発明の免疫複合体を癌患者に静脈内投与する場合には、
該生理活性物質として約０．１ｐｇからｌｏｎｇ、好ま
しくは１２ｇから１ｍｇが用いられる。

生理活性物質がウロキナーゼである場合、例えば血栓症
患者に静脈内投与する場合には、１日あたり、該ウロキ
ナーゼとして約０．Ｏ１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、好ましく
は約０．０２〜０．２ｍｇ／ｋｇが用いられる。

以下に実施例、実験例を挙げて、本発明をさらに詳細に
説明するが、これらが本発明の範囲を制限するものでな
い。

後述の実施例、実験例で用いられたｒｈＩＬ２は、形質
転換体エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃ
ｏｌｉ）Ｎ４８３０／ｐＴＢ２８５（ＩＦＯ１４４３７
、ＦＥＲＭ　　ＢＰ−８５２）を用い、特開昭６０−１
１５５２８号公報あるいは特開昭６１−７８７９９号公
報に記載の方法と同様の方法で製造されたＮ末端にメチ
オニンを有するものと有しないものとの混合物である。

上記形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ　
　Ｎ　４８３０／ｐＴＢ２８５は、昭和６０年４月２５
日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ
１４４３７として寄託され、また本微生物は、昭和６０
年４月３０日から通商産業省工業技術院微生物工業技術
研究所（ＦＲＩ）に受託番号ＦＥＲＭＰ−８１９９とし
て寄託され、該寄託はブダペスト条約に基づく寄託に切
換えられて受託番号ＦＥＲＭ　　ＢＰ−８５２として同
研究所（ＦＲＩ）に保管されている。

また、後述の実施例１で得られたマウスハイブリドーマ
ＨＲＬＩ−５２は平成２年１月２９日からＩＦＯｉ：受
託番号Ｉｐｏ　　５０２２２として寄託され、また本ハ
イブリドーマは平成２年　１月３１日からＦＲＩに受託
番号ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２７４７として寄託されている
。

後述の参考例で用いられたハイブリドーマは、ヨーロッ
パ特許出願公開第３６３７１２号公報に記載された方法
で製造することができ、次に示す寄託が行われている。

ＩＦＯ 動物細胞　　　　　　　ＩＦＯ番号 マウスハイブリドーマ　　５０１７６ ０ＫＩ−３（１９８８年９月２１日） マウスハイブリドーマ　　５０１７７ Ｕ　Ｋ　１−８７　　　　　　（１９８８年９月２１日
）マウスハイブリドーマ　　５０２０８ ＵＫＩ−６（１９８９年８月９日） ＦＲＩ ＦＥＲＭ番号 ＢＰ−２０８３ （１９８８年１０月４日） ＢＰ−２０８４ （１９８８年ＩＯ月４日） ＢＰ−２５４８ （１９８９年８月１１日） 実施例１　マウス抗ヒトＩ　Ｌ−２モノクロ一ナル抗体
産生ハイブリドーマの作製 ■免疫原の調製 ｒｈｌＬ−２１ｍｇ／ｄ生理食塩水溶液を９０°Ｃで３
分間加熱処理し、変性ヒト■Ｌ−２を調製した。凍結保
存後、免疫原として用いた。

■免疫 熱変性ｒｈＩＬ−２１ｍｇ／−生理食塩水懸濁液に等量
の７０インド完全アジユバントを加え、マウス（子、ｎ
−１０：　０．１ｍｇ１０．２ｍ／？ウス）の背部およ
び腹部皮下への免疫を開始した。追加免疫は免疫原に等
量の７０イント不完全アジユバントを加えて、２〜３週
毎に５回接種し実施した。

■細胞融合 最終免疫後３日で牌臓を摘出し、牌臓細胞懸濁液を常法
により調製した（約１０８個）。ついでマウス骨髄腫細
胞（Ｐ３Ｕ１）２Ｘ１０’個を添加し、ＰＥＧ６０００
を用いてケーラーとミルスタインの方法［不一チャ−（
Ｎａｔｕｒｅ）、２５６，４９５（１９７５）］に準じ
て細胞融合に供した。

融合終了後、細胞混液をヒポキサンチン・アミノグチリ
ンおよびチミジンを含む、いわゆるＨＡＴ培地中に懸濁
し、ｌＯ日間培養した。以降は、親細胞の選択が終了次
第、ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたＨＴ培地に
代え、培養を続けた。

■ハイブリドーマの選択およびクローニング固相にｒｈ
ＩＬ−２を吸着させたマイクロプレートを用い、ＥＬ　
Ｉ　ＳＡ法でハイブリドーマ培養上清の抗体価を測定し
た。融合１０日から２０日後でハイブリドーマの出現を
認め、かつｒｈｌＬ２に特異結合する抗体がみられた。

特に結合活性の強いハイブリドーマについて、限界希釈
法によるクローニングに供した。

クローン化したハイブリドーマの培養上清を同様にＥＩ
Ａのスクリーニングに供し、ｒｈｌＬ−２結合能の強い
ものを選択した。

ハイブリドーマを用いて、後述の実施例３．４と同様に
して種々のｒｈｌＬ２との免疫複合体を得て、さらにこ
れを実施例２に示した方法と同様にしてマウスに投与し
たときの分布容積を計算し、ｒｈＩＬ２の分布容積を減
少させる抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニン
グした。

これらの結果、ｒｈＩＬ２に特異結合し、この免疫複合
体をマウスに投与しｔ；ときのｒｈＩＬ−２の分布容積
を減少させる抗体を産生ずるマウスハイブリドーマＨＲ
ＬＩ−５２（ＩＦＯ５０２２２、ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２
７４７）が得られた。この免疫グロブリンクラス、サブ
クラスはオークターロー−法による測定で、いずれもｒ
ｇｃ、であった。

実施例２　抗体調製 Ｂａ１ｂ／Ｃ（早）マウスにミネラルオイルを腹腔内投
与し、１週後、実施例１で得られたマウスハイブリドー
マＨＲＬＩ−５２（ＩＦＯ　　５０２２２、ＦＥＲＭ　
　ＢＰ−２７４７）を１０’個腹腔内投与した。ハイブ
リドーマ投与１０日後から２週後にかけて腹水を採取し
た。得られた腹水１００−を遠心分離し、上溝を取り出
し、５μｍのフィルターでろ過し、ＰＤ−１０（ファル
マシア社）を用いたゲルろ過によって，ｌｏｍＭ　　Ｍ
ＥＳ緩衝液に置換した後、液体クロマトグラフィー（Ａ
ＢＸカラム１、Ｊ．　Ｔ．　Ｂａｋｅｒ）を用いて、目
的とする抗体１１４ｎ＋ｇを得た。得られた抗体を液体
クロマトグラフィー（カラム：　Ａｓａｈｉｐａｋ　　
Ｇ　Ｓ　−　５２０、旭化成、移動相：　Ｄｕｌｂｅｃ
ｃｏ燐酸緩衝生理食塩水液、流速：　ｌ　ｄ／ｗｉｎ，
検出：　Ｏ　Ｄ　＊ａ。）にかけると第１図に示すよう
な単一のピークが得られた。

この保持時間は市販のマウスＩ　ｇＧ　（Ｃｈｒｏｍｐ
ｕｒｅＭｏｕｓｅ　　ＩｇＧ　、　　ｗｈｏｌｅ　　ｍ
ｏｌｅｃｕｌｅ　、　　Ｊａｃｋｓｏｎｌｍｍｕｎｏｒ
ｅｓｅａｒｃｈ　　Ｌａｂ．　Ｉｎｃ．）のそれと一致
した。

モノクローナル抗体のｒｈＩＬ２への結合能は一般的に
公知のＥＬ　Ｉ　ＳＡ法で確認した。すなわち、イムノ
プレートにｒｈｌＬ−２を吸着させたのち、当該モノク
ローナル抗体を添加した。次にＨＲＰ標識抗マウスＩｇ
Ｇを添加し、オルトフェニレンジアミンの発色により、
ｒｈＩＬ−２への結合能を確認した。

実施例３　免疫複合体の調製（液体） 実施例２で得られた抗Ｉ　Ｌ−２モノクロ一ナル抗体１
＋＊ｇ／ｄの１ｗｔｌに対してｒｈ　Ｉ　Ｌ　−　２　
　１　ｍｇ／−の０．０５ｍ、０、ｌ−、０．２−、ま
たはｌ−をそれぞれ加えて抗Ｉ　Ｌ−２モノクロ一ナル
抗体：ｒｈｌＬ　　２のモル比が約２：１．ｌ：１，ｌ
：２、１：１０となるようにした。これらの混合物をＨ
ＰＬＣ（カラム：　Ａｓａｈｉｐａｋ　　Ｇ　Ｓ　−　
５　２　０　）で解析したところ、抗ＩＬー２モノクロ
ーナル抗体１モルに対してｒｈＩＬ２が約２モルの量で
免疫複合体を形成することが判明した。免疫複合体の上
記のモル比は約ｌ：２であることがわかった。

抗Ｉ　Ｌ−２モノクロ一ナル抗体１　ｍｇ／−の１顧に
対してＩＬ−２　　１■ｇ／−の０　、２７１を混合す
ることによって、免疫複合体（モル比的１＝２）を調製
した。前述のＨＰＬＣ（カラム：　ＡｓａｈｉｐａｋＧ
Ｓ−５２０）にかけると非結合ｒｈＩＬ２、非結合型モ
ノクローナル抗体は存在しなかった（第２図）。

この時の免疫複合体のＥＩＡ活性をみるとｒｈｌＬ−２
と同等の活性があった。

得られた免疫複合体の生物活性をＭＴＴ法（Ｈｉｒｏｋ
ｏ　Ｔａｄａ　　ｅＬ　　ａｌ　、ジャーナル・オブ・
イムノロジカルメソッズ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ）、９　３　、
　　１　５　７　−　１　６　５　（１９８６））で調
べると、免疫複合体のｒｈＩＬ２あたりの比活性はｒｈ
ｌＬ−２そのものの比活性と同じであった。つまり、免
疫複合体はｒｈ［Ｌ２の生物活性を中和しないことが判
明した。

実施例４　免疫複合体の調製（固体） 抗ＩＬー２モノクローナル抗体１　ｍｇ／−の１−とｒ
ｈｌＬ−２　　１１１Ｉｇ／ｄの０．２−を混合し、セ
ントリバックコンセントレーターで水を蒸発させ免疫複
合体の固体を得た。この時のセントリバックコンセント
レータ−のロータ一部分には加温しなかっｔ；。冷却ト
ラップ部分は一９０℃とし、真空ポンプで５　ｍｍＨｇ
以下となるように減圧した。これに蒸留水ｌｄを加え再
溶解した。この時のＥＩＡ活性をみるとｒｂｌＬ−２と
同等の活性があった。

この例限りでなく免疫複合体の固体を調製するときは抗
ＩＬ−２モノクローナル抗体１モルに対してｒｈｌＬ−
２約２モルの割合で液体混合しセントリバックコンセン
トレータ−あるいは凍結乾燥機により水分を蒸発させて
免疫複合体の固体を得ることができる。そして蒸留水で
再溶解することもできる。

実施例５　　Ｆ（ａｂ″）２の調製（液体）抗Ｉ　Ｌ−
２モノクロ一ナル抗体とＳｉｇａ＋ａ社のペプシンを混
合し、ｐＨ３，５，３７℃で１８時間反応させた。反応
を停止後プロティンＡカラムで抗ＩＬ−２モノクローナ
ル抗体のＦ（ａｂ’）２を得た。

この抗ＩＬ〜２モシクローナル抗体のＦ（ａｂ’）、は
実施例２に示されＱＥＬ　Ｉ　ＳＡ法により、ｒｈｌＬ
−２結合能を示した。

実施例６　　ｒｈｌ　Ｌ　−２Ｆ（ａｂ’）ｉ免疫複合
体の調製（液体） 実施例５で得られた抗ＩＬ−２モノクローナル抗体のＦ
（ａｂ’）、　１モルに対してｒｈｌＬ　　２を２モル
加Ｌ、ｒｈＩ　Ｌ−２抗ＩＬ−２モノクロ一ナル抗体Ｆ
（ａｂ’）、の免疫複合体を得た。

得られた免疫複合体はＥＩＡ法およびＭＴＴ法で調べる
と、ｒｈｌＬ−２としての活性を保持していた。

実施例７　　Ｆ（ａｂ’）ｚ免疫複合体の調製（固体）
液体で得られた抗ＩＬ−２複合体モノクローナル抗体Ｆ
　（ａｂ″）２とｒｈｌＬ　　２との免疫複合体からセ
ントリバックコンセントレータ−で水分を蒸発させてＦ
（ａｂ’）ｇとｒｈｌＬ−２との固体状の免疫複合体を
得た。

得られた免疫複合体はＥＩＡ法およびＭＴＴ法で調べる
と、ｒｈＩＬ−２としての活性を保持していた。

実施例８　　Ｆ（ａｂ’）２免疫複合体の調製（固体）
液体で得られた抗ＩＬ−２モノクローナル抗体Ｆ　（ａ
ｂ’　）　ｘとｒｂｌＬ２との免疫複合体から凍結乾燥
機で水分を蒸発させてＦ　（ａｂ’　）、とｒｂｌＬ２
との固体状の免疫複合体を得た。

実施例９ 単球コロニー刺激因子（Ｍ−Ｃ５Ｆ）を用いて実施例１
．２と同様にして、抗Ｃ５Ｆモノクローナル抗体を得て
、実施例３と同様にして、Ｃ３Ｆ−抗Ｃ３Ｆモノクロー
ナル抗体免疫複合体が得られる。

実施例ＩＯ チロトロピン放出ホルモン（ＴＲＨ）を用いて実施例１
，２と同様にして、抗ＴＲＨモノクローナル抗体を得て
、実施例３と同様にして、ＴＲＨ−抗ＴＲＨモノクロー
ナル抗体免疫複合体が得られる。

実施例１１ オキセンドロンを用いて実施例１．２と同様にして、抗
オキセンドロンモノクローナル抗体を得て、実施例３と
同様にして、オキセンドロン−抗オキセンドロンモノク
ローナル抗体免疫複合体が得られる。

実施例１２ エンケファリンを用いて実施例１，２と同様にシテ、抗
エンケファリンモノクローナル抗体を得て、実施例３と
同様にして、エンケファリン−抗エンケファリンモノク
ローナル抗体免疫複合体が得られる。

実施例１３ エリスロボエチンを用いて実施例１．２と同様にして、
抗エリスロボエチンモノクローナル抗体を得て、実施例
３と同様にして、エリスロボエチンー抗エリスロボエチ
ンモノクローナル抗体免疫複合体が得られる。

実施例１４ リュープロレリンを用いて実施例１，２と同様にして、
抗すュープロレリンモノクローナル抗体を得て、実施例
３と同様にして、リュープ口レリンー抗リュープロレリ
ンモノクローナル抗体免疫複合体が得られる。

実験例１　ラット投与（ｉｖ） 実施例３で得られた免疫複合体をラットにｒｈｌＬ−２
に換算して１００μｇ静脈内投与した。経時的に採血し
、ｒｈＩＬ２の血清中濃度を測定した（第３図に−・−
で示す。）。対照実験として抗Ｉ　Ｌ−２複合体モノク
ローナル抗体の代わりに市販マウスＩｇＧとｒｈｌＬ−
２を混合したもの（第３図において一〇−で示す。）を
ラットにｒｈｌＬ−２として１００μｇ静脈投与した。

この時の結果を第３図に示す。

得られたｒｈｌＬ−２の血清中濃度の経時変化をファル
マコキネチカルに解析したところ免疫複合体投与時のｒ
ｈｌＬ−２の分布容積が対照に較べて約７分の１（約０
．１４倍）であった。すなわち、ｒｈＩＬ−２の血液中
濃度が約７倍高かった。これに対して、この免疫複合体
投与時のｒｈｌＬ　　２の消失速度定数は対照と変らな
かった。すなわち、イムノコンプレックスとしても半減
期の変らなかったことを示す。

実験例２　マウス（１ｖ） 実施例４で得られたｒｈＩＬ２と杭Ｉ　Ｌ−２モノクロ
一ナル抗体との免疫複合体を水に溶解しマウスにｒｈｌ
Ｌ−２に換算してＩＯμｇを静脈内投与した。経時的に
採血し、ｒｈｌＬ−２の血漿中濃度を測定した。対照実
験としてｒｈＩＬ−２−抗■Ｌ−２モノクローナル抗体
複合体の代わりに市販マウスＩｇＧとｒｈＩＬ２を混合
したものをマウスにｒｈＩＬ−２としてＩＯμｇを静脈
内投与した。

得られたｒｈｌＬ−２の血漿中濃度の経時変化を７アル
マコキネチカルに解析した。結果を第１表に示す。

第１　表ｒｈｌＬ−２と抗ｒｈｌＬ−２モノクローナル
抗体との免疫複合体のマウスにおける薬動力学パラメー
ターパラメーター　　　　　ｒｈＩＬ−２免疫複合体分
布容積（ｄ／ｋｇ）　　　　　６００　　　　　　７０
消失速度定数（１／ｈ）　　　　　　２　　　　　　　
２第１表に示したように解析結果から、免疫複合体のｒ
ｈｌＬ−２の分布容積は対照に較べて約８分の１（約０
．１２倍）であることがわかった。このことは実験に用
いた免疫複合体を投与した際には、ｒｈＩＬ２の水溶液
投与の場合と比較して、ｒｈＩＬ２の分布が変わったこ
とを示している。

また、この免疫複合体投与時のｒｈｌＬ−２の消失速度
定数は対照実験と比較して変らず半減期が変らないこと
を示す。

実験例３　マウス（ｓｃ） 実施例４で得られた免疫複合体を水に溶解し、ｒｈｌＬ
−２に換算してｌＯμｇをマウスに皮下投与した。経時
的に採血し、ｒｈｌＬ−２の血液中濃度を測定し、結果
を第４図に示す。第４図において一〇−はｒｈ　Ｉ　Ｌ
　−２の結果を、−・−は免疫複合体の結果をそれぞれ
示す。この時の血中濃度は、第４図に示したように、２
４時間以上の間、０．３ｎｇ／ｄ以上の高い値を示した
。

実験例４　マウス抗腫瘍効果 マウス（Ｂｕｌｂ／Ｃ、７Ｗ、早）に腫瘍（Ｍｅｔｈ−
Ａ）を移植し、移植後７日目より、１２日間毎日１回、
実施例４で得られた免疫複合体を水に溶かし、ｒｈＩ　
Ｌ−２に換算してｌＯ／Ｉｇ／マウス／１日を皮下投与
した。対照実験として抗Ｉ　Ｌ−２複合体モノクローナ
ル抗体の代わりにｒｈｌＬ−２を１０μｇ／マウスの皮
下に投与した。コントロール群のマウスには薬物を投与
しなかった。移植後２１１日目マウスより腫瘍を摘出し
その重量を測定し、コントロール群の腫瘍重量に対する
比（Ｔ／Ｃ）を求めたところ、ｒｈＩＬ−２投与時のＴ
／Ｃは５７％であったのに対して、免疫複合体投与時の
Ｔ／Ｃは１６％であった。このことは、免疫複合体はｒ
ｈｌＬ−２の有効性を大幅に高めていることを示す。

上記実験例１，２から明らかなごとく、本発明の免疫複
合体は動物内に投与した時のｒｈｌＬ−２の分布容積は
巣独で投与した時と比較して減少し、ｒｈＩＬ２の分布
が変わったことが示された。また上記実験例３．４に明
らかなように、この免疫複合体を投与することによって
、ｒｈＩＬ−２の有効性を大幅に高めていることが示さ
れた。

実施例１５ 抗夏Ｌ−２モノクローナル抗体を過剰に配合した免疫複
合体の調製（固体）： 実施例２で得られた抗Ｉ　Ｌ−２モノクロ一ナル抗体１
０ｍｇ／−の１ｍｌとｒｈＩＬ　　２　１＋ｍｇ／−の
０．２−を室温で十分に混合し、免疫複合体含有の注射
薬とし、セントリバックコンセントレータ−で室温下、
コールドトラップ温度−８０℃、５Ｔｏｒｒ以下で水を
蒸発させモノクローナル抗体：ｒｈｌＬ　　２が約５：
１（モル比）の免疫複合体含有の粉末状の製剤を得た。

これに蒸留水ｌ−を加え再溶解した。この時のＥＩＡ活
性をみると「ｈＩ　Ｌ−２と同等の活性があった。

実験例５ マウス（ｓｅ） 実施例１５で得られた免疫複合体含有の粉末状の製剤に
蒸留水１ｍを加え再溶解し、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔ
ｅ　　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　　５ａｌｉｎｅ　）で希釈し
たのち、ｒｈｔＬ２に換算してｌＯμｇをマウスに皮下
投与した。投与３時間後のｒｈＩＬ−２の血清中濃度は
、実施例４で得られた免疫複合体をマウスに皮下投与し
た時（実験例３）のそれの約３．５倍であった。

実施例１６ 顆粒球コロニー刺激因子（（１，−Ｃ５Ｆ）を用いて実
施例１，２と同様にして、抗Ｇ−Ｃ５Ｆモノクローナル
抗体を得て、実施例３と同様にして、Ｇ−Ｃ５Ｆ−抗Ｇ
−Ｃ３Ｆモノクローナル抗体免疫複合体が得られる。

参考例１ 予め０．５−鉱油を腹腔内投与したＢａ１ｂ／Ｃマウス
に５ＸＩＯ＠個の抗ウロキナーゼＭ　ｏ　Ａｂ産生キイ
ブリドーマＵＫＩ−３，ＵＫＩ−８７またはＵＫＩ６を
腹腔内接種した。約１０〜１５日後に腹水の貯留がみと
められた。抗体の精製は常法により、４５〜５０％飽和
硫酸アンモニウムで分画後、ＤＥＡＥ−セルロースおよ
びプロティンＡカラムクロマトグラフィーに供し、対応
する抗ウロキナーゼＭ　ｏ　Ａ　ｂ抗体ＵＫＩ−３，Ｕ
Ｋｌ−８７またはＵＫＩ−６を得た。これらの抗体はＨ
ＰＬＣ（カラム：Ａｓａｈｉｐａｋ　　Ｇ５５２０、溶
離液：ＰＢＳ　　ｌ＋ｍ／ｍ１ｎ）で１０゜９分に溶出
し、市販のマウスＩｇＧの保持時間と一致した。

参考例２　フィブリン溶解反応中和試験ウロキナーゼ溶
液（最終濃度２５ｎｇ／ｌ１ｌＩ２）に被検抗体希釈液
を添加し、３７℃で１時間反応後反応混合液をフィブリ
ンアガロースプレートのｌウェル当たり５μα注入した
。３７℃で２〜６時間後にフィブリンの溶解斑（直径）
を測定し、ＵＫｌの酵素活性に対する被検抗体希釈液に
含まれるＭｏＡｂの中和能を測定した。

参考例３　ウロキナーゼ酵素活性中和試験ウロキナーゼ
溶液（最終濃度１．７μｇ／−）に被検抗体液を添加し
室温で３０分間反応後、合成ペプチド基質Ｓ　　２４４
４（１ｍＭ、ピログルタミル・グリシル・アルギニル・
バラニトロアニリド、カビ社製）を添加した。さらに３
７℃で１５分反応後、遊離したパラ・ニトロアニリド（
４０５ｎｍにおける吸光度）を測定した。

参考例４　　ＵＫのＥＩＡ測定法 １次抗体としてヤギ抗ＵＫ抗体、２次抗体としてＨＲＰ
結合ウサつ抗ＵＫ（Ｆａｂ’）を用いるサンドイッチＥ
ＩＡ法によりＵＫ濃度を定量した。

実施例１７　免疫複合体の調製（液体）ＥＰ−３６３７
１２に記載の抗つロキナーゼＭｏＡｂ抗体ＵＫＩ−３１
０ｍｇ／−の０．６３−に対して高分子型ウロキナーゼ
（日本製薬製造）１ｍｇ／−の０，７ｍｌを混合するこ
とによって、抗ウロキナーゼＭ　ｏ　Ａ　ｂ抗体ＵＫＩ
−３：ウロキナーゼのモル比が３：ｌとなるように燐酸
緩衝生理食塩水中で混合し、免疫複合体を得た。この免
疫複合体を１次抗体として抗マウスＩｇＧ、２次抗体と
してＨＲＰ結合ウサつ抗ＵＫ　（Ｆａｂ゛）を用いるサ
ンドインチＥＩＡ法での定量値が参考例４での定量値と
変わらないことから、ウロキナーゼはすべて免疫複合体
で存在することが判明した。

また参考例４のＵＫのＥＩＡ定量で抗ウロキナーゼ免疫
複合体の定量がウロキナーゼの巣独の場合と同様に行え
ることが判った。また参考例２および参考例３の方法で
得られた免疫複合体の生物活性を測定すると、免疫複合
体のウロキナーゼの比活性はウロキナーゼそのものの比
活性と同じであった。つまり、免疫複合体はウロキナー
ゼの生物活性を中和しないことが判明した。

実施例１８　免疫複合体の調製（固体）実施例１７の免
疫複合体を凍結乾燥により水分を蒸発させて免疫複合体
の固体を得た。これに蒸留水ｌ−を加え再溶解した。こ
の時の参考例４と同様の方法でＥＩＡ活性をみるとウロ
キナーゼと同等の活性があった。

実施例１９　　Ｆ（ａｂ’）ｚの調製（液体）抗ウロキ
ナーゼＭ　ｏ　Ａ　ｂ抗体ＵＫＩ−３とＳｉｇｍａ社の
ペプシンを混合し、ｐＨ３，５゜３７℃で１８時間反応
させた。反応を停止後プロティンＡカラムで抗ウロキナ
ーゼＭ　ｏ　Ａ　ｂ抗体ＵＫｌ　　３Ｆ（ａｂ’）＊を
得た。このＦ（ａｂ’）、はウロキナーゼ結合能を有し
ていた。

抗ウロキナーゼＭｏＡｂＵＫ　ｌ−３Ｆ（ａｂ’）ｚと
高分子型ウロキナーゼ（日本製薬製造）をモル比で３：
ｌとなるように燐酸緩衝生理食塩水中で混合し、免疫複
合体を得た。この時の参考例４と同様の方法でＥＩＡ活
性をみるとウロキナーゼと同等の活性があった。

実施例２０　　Ｆ（ａｂ’）ｚ免疫複合体の調製（固体
）実施例１９の免疫複合体を凍結乾燥機により水分を蒸
発させて免疫複合体の固体を得た。これに蒸留水１ＴＩ
ｔｔを加え再溶解した。

実施例２１　免疫複合体の調製（液体）ＥＰ−３６３７
１２に記載の抗つロキナーゼＭｏＡｂ抗体ＵＫＩ−８７
１０ｍｇ／−の０．６３−に対して高分子型ウロキナー
ゼ（日本製薬製造）１ｍｇ／−の０．７−を混合するこ
とによって、抗つロキナーゼＭｏＡｂ抗体ＵＫＩ−８７
：ウロキナーゼのモル比が３：ｌとなるように燐酸緩衝
生理食塩水中で混合し、免疫複合体を得た。

実施例２２　免疫複合体の調製（液体）ＥＰ−３６３７
１２に記載の抗つロキナーゼＭｏＡｂ抗体ＵＫＩ−６１
０ｍｇ／ｄの０．７ｍを混合することによって、抗ウロ
キナーゼのモル比が３：１となるように燐酸緩衝生理食
塩水中で混合し、免疫複合体を得た。

実施例２３　免疫複合体の調製（液体）ＥＰ−３６３７
１２に記載の抗つロキナーゼＭｏＡｂ抗体ＵＫｉ３に対
して二本鎖低分子型ウロキナーゼ（ＪＣＲ社）を３：ｌ
となるように燐酸緩衝生理食塩水中で混合し、免疫複合
体を得た。

実施例２４　免疫複合体の調製（液体）ＥＰ−３６３７
１２に記載の抗つロキナーゼＭｏＡｂ抗体ＵＫＩ−３に
対してプウロキナーゼを３：ｌとなるように燐酸緩衝生
理食塩水中で混合し、免疫複合体を得た。

実験例６　ラット投与（ｉｔ　） 実験例１７で得られた免疫複合体をラット（ｎ−５）に
ウロキナーゼに換算して１００μｇ静脈投与した。経時
的に採血し、ウロキナーゼの血漿中濃度を測定した。対
照実験としてウロキナーゼのみを１００μｇ静脈投与し
た。この時の結果を第５図に示す。第５図において、・
はウロキナーゼのみの、Ｏは免疫複合体の結果をそれぞ
れ示す。

得られたウロキナーゼの血漿中濃度の経時変化を７アル
マコキネチカルに解析したところ免疫複合体のウロキナ
ーゼの半減期（７２分）は対照実験の半減期（２８分）
の約２．６倍に増加し、分布容積（２７ｍ）は対照実験
（９１ｍ）に較べて約０．３倍に減少した。

実験例７　ラット（ｓ　ｃ） 実施例１７で得られた免疫複合体をラット（ｎ−５）に
ウロキナーゼとして１００μｇ皮下投与した。経時的に
採血し、ウロキナーゼの血漿中濃度を測定した。この時
の血漿中濃度は、第６図に示したように、４８時間以上
の間、Ｏ，ｌ／７ｇ／−以上の高い値を示した。なお、
第６図において、○は免疫複合体の、口はウロキナーゼ
のみの結果をそれぞれ示す。

発明の効果 本発明の免疫複合体は生理活性物質の生体内での分布容
積が約０．５倍以下に減少されているので、血中濃度を
高くし生理活性物質の有効性が著しく高められたもので
ある。さらに、生理活性物質を血中を中心とする脈管系
にとどめることにより副作用が減少される。

この免疫複合体を哺乳動物に投与することによって、癌
、感染、免疫異常、炎症、高血圧、ホルモン調節異常、
心疾患などの各種の疾患をより有効に治療することがで
きる。

ウロキナーゼおよびプロウロキナーゼの場合は、それら
の生理活性を損なわずに生体内での該薬物の消失半減期
を大きくし、分布容積を該ウロキナーゼないしはプロウ
ロキナーゼ単独の場合より０゜５倍以下に著しく減少さ
せるようなウロキナーゼモ　ツクローナル抗体免疫複合
体が得られ、この発明によって、血中濃度をより高く保
ち、より有効にその効果を発揮することができ、また副
作用を軽減することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例２で得られた、ＨＰＬＣのクロマトグ
ラムを示す。すなわち、第１−１図は市販マウスＩｇＧ
をＧ５−５２０カラムを用いたＨＰＬＣのクロマトグラ
ムである。第１−２図は精製した抗ｒｈｌＬ−２モノク
ローナル抗体をＧ５５２０カラムを用いたＨＰＬＣのク
ロマトグラムである。 第２図は、実施例３で得られたＧ５−５２０カラムを用
いたＨＰＬＣでのクロマトグラムを示す。 すなわち、第２−１図は抗ｒｈＩＬ−２モノクローナル
抗体の、第２−２図はｒｈＩＬ−２の、第２３図はｒｂ
ｌＬ２と抗ｒｈｌＬ−２モノクローナル抗体との免疫複
合体（モル比ｌ：２）の結果をそれぞれ示す。 第３図は、実験例１で得られた。ｒｈＩＬ−２と非特異
のマウスｔｇｃの混合液（重量比１：５）を投与した場
合とｒｂｌＬ−２・モノクローナル抗体免疫複合体を投
与した場合との血清中濃度の結果をそれぞれ示す。 第４１３！７は、実験例３で得られた、ｒｂｌＬ２と非
特異のマウスＩｇＧの混合液（重量比ｌ：５）を投与し
た場合と、ｒｂｌＬ２・モノクローナル抗体免疫複合体
を投与した場合との血漿中濃度の結果をそれぞれ示す。 第５図は、実験例６で得られた、ウロキナーゼ・モノク
ローナル抗体免疫複合体を投与したときと、ウロキナー
ゼのみを投与したときの血漿中濃度の結果を示す。 第６図は、実験例７で得られた、ウロキナーゼ・モノク
ローナル抗体免疫複合体を投与したときと、ウロキナー
ゼのみを投与したときの血漿中濃度を示す。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）生理活性物質と、生体内での該物質の分布容積を
   該物質単独の場合より約０．５倍以下に減少させうるモ
   ノクローナル抗体との免疫複合体。
2. （２）請求項１記載の免疫複合体を含有してなる生理活
   性薬剤。
3. （３）乾燥品で粉末である請求項２記載の薬剤。
4. （４）生理活性物質がサイトカインである請求項１記載
   の免疫複合体。
5. （５）サイトカインがインターロイキン−２である請求
   項４記載の免疫複合体。
6. （６）生理活性物質が酵素である請求項１記載の免疫複
   合体。
7. （７）酵素がウロキナーゼである請求項６記載の免疫複
   合体。
8. （８）モノクローナル抗体がイムノグロブリンＧである
   請求項１記載の免疫複合体。
9. （９）モノクローナル抗体がイムノグロブリンＧの抗体
   活性を有するフラグメントである請求項１記載の免疫複
   合体。