JPH02209898A - 修飾インターロイキン―２ - Google Patents

修飾インターロイキン―２

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JPH02209898A
JPH02209898A JP1282432A JP28243289A JPH02209898A JP H02209898 A JPH02209898 A JP H02209898A JP 1282432 A JP1282432 A JP 1282432A JP 28243289 A JP28243289 A JP 28243289A JP H02209898 A JPH02209898 A JP H02209898A
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JP
Japan
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fragment
modified
immunoglobulin
amino group
crosslinking agent
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JP1282432A
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English (en)
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Yasutaka Igari
猪狩　康孝
Kazuhiro Doken
道券　一浩
Jun Sato
純 佐藤
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Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Chemical Industries Ltd
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、生体内にて安定性の高い修飾インターロイキ
ン−２に関する。
（従来の技術） インターロイキン−２（以下、ＩＬ−２と略称すること
もある。）はレクチンまたは抗原で活性化されたＴ細胞
によって生成される可溶性蛋白質で、液性および細胞性
免疫を強化し、免疫の低下した状態を正常に戻すのに有
用である。ＩＬ−２のこの免疫活性は、癌、細菌または
ウィルス感染、自己免疫疾患、免疫不全等に対する治療
に有用である。
しかしながら、Ｉ　Ｌ−２は人に投与した場合の血液中
からの消失半減期は６．９分と報告されている（組Ｔａ
ｏｔｚｅ　ｅｔ　ａｌ、、ジャーナル・オブ・イム。
）１ジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ）、　１３５　。
２８６５−２８７５（１９８５））ように生体からの消
失が早（、実際の治療に際しては充分な作用を発揮しに
くい、あるいは大量の投与量を必要とすることが予想さ
れる。
そこで、ＩＬ−２の血液中での安定性を増大させるため
に、Ｉ　Ｌ−２にポリエチレングリコールを結合させる
方法がある（画材ら、特開昭６０＝２２６８２１号公報
、あるいはＮ、　Ｋａｔｒｅ　ｅｔ　ａｌ、。
特表昭６２−５０３１７１）。
一方、最近、Ｋａｗａｓｅらによって、ＩＬ−２と抗癌
モノクロナル抗体（以下、モノクロナル抗体をｒＭａｂ
Ｊと略称することもある。）を併用するとＩＬ−２によ
る抗腫瘍効果が増大することが報告された（Ｋａｗａｓ
ｅ　ｅｔ　ａｌ、、キャ７サー・ｌＪ＋−ｆ（Ｃａｎｃ
ｅｒ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、４８．１１７３　１１７
９（１９８８乃。
（発明が解決しようとする課題） ！Ｌ−２の生理活性を損なわず血液中での安定性を増大
させることができれば、より有効にその効果を発揮する
ことができ、また、大量投与による副作用を軽減するこ
とができる。
（課題を解決するための手段） 本発明者らはＩＬ−２の生理活性が維持され、かつ生体
内におけるＩＬ−２の安定性が増大する修飾体について
鋭意検討した結果、Ｉ　Ｌ−２をイムノグロブリン（以
下、１ｇと略称することもある。）またはそのフラグメ
ントとの結合体とすることにより、生体に投与すると生
体内におけるＩ　Ｌ−２の安定性が増大し、生体内にお
ける持続時間が延長されるという知見を得、これに基づ
いてさらに研究した結果、本発明を完成した。
本発明は、（１）、インターロイキン−２をイムノグロ
ブリンまたはその抗体活性を有するフラグメントに化学
結合せしめた修飾インターロイキン２゜ （２）、インターロイキン−２のアミノ基とイムノグロ
ブリンを還元して生成するメルカプト基とを架橋剤を介
して結合させるこ七を特徴とする修飾インターロイキン
−２の製造法。
（３）、ＩＬ−２のアミノ基とイム／グロブリンまたは
その抗体活性を有するフラグメントのアミノ基に導入さ
れたチオール基とを架橋剤を介して結合させることを特
徴とする修飾Ｉ　Ｌ−２の製造法。
（４，）、１Ｌ−２のアミノ基とイムノグロブリンまた
はその抗体活性を有するフラグメントを還元して生成す
るメルカプト基とを架橋剤を介して結合させてなる修飾
ＩＬ−２，および （５）、ＩＬ−２のアミノ基とイムノグロブリンまたは
その抗体活性を有するフラグメントのアミノ基に導入さ
れたチオール基とを架橋剤を介して結合させてなる修飾
１１．−２である。
本発明において用いられるＩ　Ｌ−２としては、ｆ　Ｌ
−２と同様の活性を有する物質、すなわち、Ｔ細胞をそ
の機能を維持したまま継代維持しうる作用を有する物質
が挙げられる。具体的には、例えば第１図に示されるア
ミノ酸配列を有するポリペプチド（１）（ヒトＩＬ−２
）や、その生物学的もしくは免疫学的活性に必要な一部
分のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよい。上記
ポリペプチドとしては、例えばポリペプチド（Ｉ）のア
ミノ末端から１個のアミノ酸（ＥＰＣ公開　９１５３９
号公報）または４個のアミノ酸を欠くもの（特開昭６０
−１２６０８８号公報）やカルボキシル末端部の数個の
アミノ酸を欠くものなどが挙げられる。さらに該第１図
で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（Ｉ）の
構成アミノ酸の一部が欠損しているか他のアミノ酸に置
換されたもの、例えば１２５位のシスティン残基がセリ
ン残基に置換されたもの［特開昭５９−９３０９３号公
報］でもよい。
とりわけ、本発明においては第１図に示されるアミノ酸
配列を有するヒトＩ　Ｌ−２を用いるのが好ましく、こ
の場合そのアミノ末端にさらにメチオニン残基（Ｍｅｔ
）を有するものと有さないものとの混合物［特開昭６０
−１１５５２８号公報、特開昭６１−７８７９９号公報
コであってもよく、またアミノ末端にＭｅｔを有さずア
ラニン（Ａｌａ）で始まるもの［特開昭６１−７８７９
９号公報］号公報−。また、糖鎖を有しているものであ
ってもよい。
本発明において用いられるｒｇは天然のヒトのものでも
動物のもの（例、ヒト腫瘍をマウスに免疫して得られる
マウスの抗腫瘍抗体）でもよいし、遺伝子工学の手法を
用いて作製される人工的な抗体あるいは抗体様分子でも
よい。ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でも
よい。該■ｇの例としては、例えば血液成分中にあるヒ
トｔｇｃ１〜ｒｇＧ４の４つのサブクラスのＩｇＧおよ
びＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤなどが挙げられるが、このう
ちＩｇＧが特に好ましい。
イムノグロブリン（Ｉ　ｇ）はインタクトのままでもよ
いし、抗体の認識部位であるフラグメントたとえばＦ　
ａｂ、　Ｆ　ｅｂ’、Ｆ　（ａｂ’）ｔでもよい。また
、還元性ＳＨ基のあるものが好ましい。さらに、還元性
　ＳＨ基は、チオール基導入剤で導入されたものであっ
てもよい。
なかでも、フラグメントたとえばＦ　ａｂ、　Ｆ　ａｂ
’あるいはＦ　（ａｂ’）ｔが好ましく、特に、Ｆ　ａ
ｂ’もしくはＦ　（ａｂ’）ｔが好ましい。該フラグメ
ントを用いた場合には；°生体内で本発明の修飾Ｉ　Ｌ
−２に対する抗体の生成を少なくすることができるので
、ＩＬ−２の活性を持続させることができる。
Ｉ　Ｌ−２とＩｇＧまたはその抗体活性を有するフラグ
メント（以下、フラグメントと略記することもある。）
とを結合するに際しては、架橋剤を介して行ってもよい
。
該架橋剤としては、たとえば、ＥＭＣＳタイプとしてた
とえばＮ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）サクシ
ニミド（ＥＭＣＳ）、３−マレイミドベンゾイックアシ
ッド・Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル（ＭＢＳ）
、ｍ−マレイミドベンゾイルスルホサクシンイミドエス
テル（スルホ−ＭＢＳ）、Ｎ−（３−マレイミドプロピ
オニルオキ／）サクシニミド、Ｎ−（γ−マレイミドブ
チリルオキシ）サクシニミド（ＣＭＢＳ）、Ｎ−（β−
マレイミドプロピオニルオキシ）サクシニミド（ＢＭＰ
Ｓ）、サクシニミジル　４−（Ｎ−マレイミドメチル）
シクロへ牛サンー１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、
スルホサクシニミジル　４−（Ｎ−マレイミドメチル）
シクロへ牛サンー１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭ
ＣＣ）、サクシニミジル　４−（ｐマレイミドフェニル
）ブチレート（ＳＭＰＢ）。
スルホサクシニミジル　４−（ｐ−マレイミドフェニル
）ブチレート（スルホ−ＳＭＰＢ）、５ＰＤＰタイプと
してたとえばＮ−サクシニミジル　３−（２−ピリジル
ジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）、５ＩＡＢタイ
プとしてたとえばＮ−サクシニミジル（４−ヨードアセ
チル）アミノベンゾエート（ＳｔＡＢ）、　　スルホサ
クシニミジル（４−ヨードアセチル９アミノベンゾエー
ト（スルホ−３ＩＡＢ）などが挙げられる。
また、イムノグロブリンまたはそのフラグメントのアミ
ノ基にチオール基を導入する際に用いるチオール基導入
剤としては、たとえば、Ｎ−サクシニミジル−８−アセ
チルチオアセテート（ＳＡＴＡ）、サクシニミジル−３
−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、
Ｓ−アセチル　メルカプトサクシニックアンハイドライ
ド（ＳＡＭＳＡ）−ズどが挙げられる。
上記イムノグロブリンまたはその抗体活性を有するフラ
グメントを還元してメルカプト基を生成させるには、還
元剤たとえばジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メル
カプトエタノール、エタノールアミノなどを用い、通常
約Ｏ〜５０℃で還元反応を行なう。溶媒としては、水性
溶媒を用いる。
例えばｐＨ７，０以上の緩衝液を用いるのが好ましい。
還元反応系における溶液中の還元剤の濃度は、通常約０
．５＋ｓＭ〜５０１１ＩＭが好ましい。
前記チオール基の導入は、Ｉｇやそのフラグメントのア
ミノ基にチオール基導入剤を反応させることにより行な
われる。チオール基の導入剤は、１ｇやそのフラグメン
トに対して、モル比が約１＝１から約１００：１となる
量を用いるのがよい。
また、この時の導入剤の濃度は高い方が好ましく約０．
Ｏ１〜１００μｍｏ（１／−の範囲がよい。反応は、通
常は約０〜５０℃で、好ましくは約１０〜３０℃で行な
われる。
！　Ｌ−２のアミノ基とイムノグロブリンまたはその抗
体活性を有するフラグメントを還元して生成するメルカ
プト基とを架橋剤を介して結合させるには、架橋剤とし
てＥＭＣＳタイプを用いる場合には、該アミノ基をマレ
イミド化し、マレイミド基にメルカプト基を反応させる
。該マレイミド化は、Ｉ　Ｌ−２と架橋剤を反応させる
ことにより行われる。架橋剤はＩ　Ｌ−２に対して約ｌ
：ｌから約１００：ｌの量を用いるのがよい。またこの
反応液中のＥＭＣ３濃度は約０．５〜２０μｍＯ１２／
ｄの範囲がよい。反応温度は通常０°Ｃ〜５０℃で行わ
れ、好ましくは、１０℃〜３０℃の範囲で行い、反応時
間は２０〜６０分程度で行うのが良い。
このようにして得られた反応物に上記メルカプト基を反
応させるには、マレイミド化した反応物とメルカプト基
を生成させたイムノグロブリンまたはそのフラグメント
との比を約ｌ；１から約５：Ｉの範囲で混合するのが好
ましい。反応湿度は通常０°Ｃ〜５０°Ｃで行い、反応
時間は２０〜６０分程度行うのがよい。
架橋剤として５ＰＤＰタイプを用いる場合には、該アミ
ノ基にピリジンジスルフィド基を導入し、これにメルカ
プト基を反応させる。該アミノ基にピリジンジスルフィ
ド基を導入するにはＩ　Ｌ−２と架橋剤を反応させるこ
とにより行われる。架橋剤は、ｌ　Ｌ−２に対して約ｌ
：ｌから約１００：１の量を用いるのがよい。またこの
反応液中の５ＰＤＰタイプの架橋剤の濃度は約０．５〜
２０μｍｏＱ／ｒｎｌの範囲がよい。反応温度は通常Ｏ
°Ｃ〜５０℃で行われ、好ましくは、１０℃〜３０℃の
範囲で行い、反応時間は２０〜６０分程度行うのがよい
。
このようにして得られた反応物にメルカプト基を反応さ
せるには、ピリジンジスルフィド基を導入した反応物と
メルカプト基を生成させたイムノグロブリンまたはその
フラグメントとの比を約１＝１から約５：１の範囲で混
合するのが好ましい。
反応温度は通常Ｏ℃〜５０’Ｃで行い、反応時間は２０
〜６０分程度行うのがよい。
架橋剤として５ＩＡＢタイプを用いる場合には、該アミ
ノ基に活性ハロゲン基を導入し、活性ハロゲン基とメル
カプト基を反応させる。活性ハロゲン基を導入するには
、ｒ　Ｌ−２と架橋剤を反応させることにより行われる
。架橋剤は１．Ｌ−２に対して約１：１から約１００：
Ｉの量を用いるのがよい。反応温度は通常約Ｏ℃〜５０
℃で行われ、好ましくは約１０°Ｃ〜３０’Ｃの範囲で
行い、反応時間は約２０分〜６０分行う。
このようにして得られた反応物に上記メルカプト基を反
応させるには活性ハロゲン化した反応物とメルカプト基
を生成させたイムノグロブリンまたはそのフラグメント
の比を約１；ｌから約５：１の範囲で混合するのが好ま
しい。反応温度は通常０°Ｃ〜５０°Ｃで行い反応時間
は２０〜６０分程度行うのがよい。
ｒ　ｔ、−２のアミノ基とイムノグロブリンまたはその
抗体活性を有するフラグメントのアミノ基に導入された
チオール基とを架橋剤を介して結合させる場合のＩ　Ｌ
−２のアミノ基と架橋剤との反応、およびチオール基と
架橋剤との反応は、前記したｒ　Ｌ−２のアミノ基と架
橋剤との反応およびメルカプト基と架橋剤との反応と同
様に行なうことができる。
このようにして、修飾Ｉ　Ｌ−２が得られる。
このようにして得られた修飾ＩＬ−２は、徐放性注射剤
として用いることができる。また、該修飾Ｉ　Ｌ−２を
、各種担体と共に製剤化することにより、徐放性注射剤
用組成物として用いることができる。
本発明の修飾ｒ　Ｌ−２は、低毒性であるので、公知の
ｒ　Ｌ−２と同様の目的・対象に、同様の用法・用量に
より使用することができる。また、徐放を目的とする場
合に、該期間に相当する量の約１／１〜ｌ／１００の量
で効果を奏することもある。
本発明で用いるｒ　Ｌ−２は、低毒性である。たとえば
、遺伝子工学手法で製造され、特開昭６０−１１５５２
８号公報に記載の方法で精製され、次いで特開昭６１−
７８７９９号公報に記載の方法で分離され、そのアミノ
酸配列が第１図で示され、その比活性が約３．５Ｘ１０
’単位／ｍｇであるＩ　Ｌ−２は、カニクイザルの静脈
内に投与した場合、６　ｍｇ／　ｋｇの単回投与では死
亡例は見られない。
このように、［Ｌ−２は低毒性であるので、安全に投与
することができる。
１ｇおよびそのフラグメントは、低毒性であり、これら
の結合体である修飾Ｉ　Ｌ−２も低毒性である。
本発明の修飾ＩＬ−２を生体に投与した場合には代謝・
排泄が遅いのでＩ　Ｌ−２の持続的効果が期待されるた
め、非経口的に投与する際には常用量（ＩＬ−２として
約２〜１００Ｕ／ｋｇとなる量）よりも多い量を用いて
もよいが、常用量よりも少ない量で充分である。
ＩＵ（単位）とは、任意に定めた標準品ｌｄ中のｒ　ｔ
、−２活性であり、約２８．６ｎｇの純粋な組み換え型
ｒ　ｉ、−２に相当する。なお、Ｉ　Ｌ−２活性の測定
ならびに１単位の定義に関しては、特開昭６０−１１５
５２８号公報に記載の方法による。
本発明の修飾Ｉ　Ｌ−２製剤は、哺乳動物（例、マウス
、ネコ、イヌ、牛、馬、羊、山羊、家兎、ヒト）の免疫
疾患や腫瘍の予防、治療に用いられる。
このように安定性が増大された本発明の修飾ＩＬ−２は
、注射用組成物にして投与することができる。
注射用組成物においては、適宜、Ｉ　Ｌ−２の安定化剤
［Ｈ３Ａ（ヒト血清アルブミン）１１等張化剤（例、食
塩、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトール）、ｐＨ調
節剤（例、塩酸、水酸化ナトリウム）、安定化剤（例、
ピロ亜硫酸ナトリウム、ロンガリット、メタ亜硫酸水素
す）　ＩＪウム）、無痛化剤（例、塩酸キシロカイン、
クロロブタノール、塩酸プロ力イン）。
保存剤（例、ベンジルアルコール、フェノール、パラオ
キシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル）等
を配合し、注射剤としての特性を高めることもできる。
本発明の修飾Ｉ　Ｌ−２を含有する注射用組成物は、注
射投与した時に修飾ｆ　Ｌ−２が長期間にわたり血液中
に存在し、しかもＩｔ、−２の生理活性を長期にわたり
保有するものである。
このようにして得られた注射用製剤は、たとえば、静脈
内、皮下、筋肉内、腫瘍内、その他局所的にも投与する
ことができる。
後述の実施例において用いられたＩ　Ｌ−２は、形質転
換体エシェリヒア・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃ
ｏｌｉ）Ｎ４８３０／ｐＴＢ２８５（ＩＦＯ１４４３７
、ＦＥＲＭ　　ＢＰ−８５２）を用い、特開昭６０−１
１５５２８号公報あるいは特開昭６１７８７９９号公報
に記載の方法と同様の方法で製造されたＮ末端にメチオ
ニンを有するものと有しないものとの混合物である。
上記形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ　
　Ｎ　４８３０／ｐＴＢ２８５は、昭和６０年４月２５
日から財団法人発酵研究所（Ｉ　ＦＯ）に受託番号ＩＦ
Ｏ１４４３７として寄託され、また本微生物は、昭和６
０年４月３０日から通商産業省工業技術院微生物工業技
術研究所（ＦＲＩ）に受託番号ＦＥＲＭＰ−８１９９と
して寄託され、該寄託はブダペスト条約に基づく寄託に
切換えられて受託番号ＦＥＲＭ　　ＢＰ−８５２として
同研究所（ＦＲＩ）に保管されている。
本願明細書および図面において、アミノ酸を略号で表示
する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　　Ｃｏｍｍ１−ｓｓｉ
ｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏ１ｅｎｃｌ
ａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略
号に基づくものであり、その例を次に挙げる。また、ア
ミノ酸に関し光学異性体がありうる場合は、特に明示し
なければＬ一体を示すものとする。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１ （１）遺伝子工学的手法によって得られたＩＬ−２２，
０ｍｇ／ｌｎ１の燐酸緩衝生理食塩水０．５ＭｌにＥＩ
ｖｆＣＳの４０ｍｇ／Ｍ／、のテトラハイドロフラン（
Ｔ　ＨＦ　）溶液５μＮを撹拌下滴下し、Ｉ　Ｌ−２を
マレイミド化した。過剰のＥＭＣＳをセファデックスＧ
−２５で除去した。一方、３ｎｕａｏｌジチオスレイト
ール（ＤＴＴ）と１．５ｍｍｏｌ　　ＥＤＴＡの０．０
５ｍｏｌ燐酸１カリウム（ｐＨ＝８．０）水溶液り鑓に
１８ｍｇ／！のヒトＩｇＧ水溶液０．５−を撹拌しつつ
添加した。ヒｌ１ｇＧを還元し、過剰の低分子化合物を
セファデックスＧ−２５で除去した。
還元したヒトＩｇＧ溶液にマレイミド化したＩＬ−２溶
液を加え、室温で２時間撹拌後、４℃で一夜放置した。
この溶液をセファクリルＳ−２００でゲル濾過して、結
合物を分別したく第２図）。
第２図において、ｌはＩＬ−２−ＩｇＧの結合物のピー
クを、■は分解物のピークを、■はＩＬ−２のピークを
それぞれ示す。結合物の分子量をＳＤＳ　　ＰＡＧＥで
調べると約１５万近辺にバンドが見られた。また、この
結合物についてＩＬ−２のＥＩＡ活性をみるとその活性
は保持されていた。さらに、生物活性をＮＫＣ３細胞の
増殖による色素ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾ
ール−２イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブ
ロマイド）の取り込みで評価すると、その活性のあるこ
とも確認された。
（２）上記（１）で得た結合物をラットにＩ　Ｌ−２と
して７５ｎｇを皮下および静脈内投与して、経日的に血
液を採取した。この血液中のＩ　Ｌ−２濃度をＥｒＡで
測定すると７日にわたりＩＬ−２が検出されたく第３図
）。第３図において、−・−は静脈内投与による結果を
、−〇−は皮下投与による結果をそれぞれ示す。Ｉ　Ｌ
−２の水溶液をラットに静脈内投与すると、６時間後に
は血液中では検出できなくなる。これに対しＩｇＧ−１
ｔ、−２の結合物は長期にわたる良好な持続性を示した
。
実施例２ 実施例１と同様（こしてヒ）ＩｇＧの代わりにマウスの
Ｂ−１６メラノーマに対するＩｇＧモノクロナル抗体（
「抗ＢＩ６メラ／−マ抗体Ｊと略称することもある。）
を用いて結合物を合成した。この結合物はＩ　Ｌ−２の
ＥＩＡ活性を示した。
なお、該マウスのＢ−１６メラノーマに対する■ｇＧモ
ノクロナル抗体は、次のようにして製造された。
抗Ｂ１６メラノ一マ抗体産生ハイブリドーマ（ＭＭ２−
９８６）［ジャーナル・オブ・サージカル・リサーチ（
Ｊ、　ｏｒ　Ｓｕｒｇｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　
３８１３８３−３９０（１９８５）に記載の方法と同様
の方法で製造することができる。なお、用いたハイブリ
ドーマＭＭ２−９８６は、該文献の著者の一人である高
見剛氏から入手した。］をブリスタン処理したマウス（
ＣＢＦＩ）腹腔内に移植した。腹腔内でＭＭ２−９８６
を増殖させ、抗Ｂ１６メラノ一マ抗体を含有する腹水を
採取した。この腹水からモノクロナル抗体精製カラムＡ
　Ｂ　ｘ（Ｊ、　Ｔ。
Ｂａｋｅｒ　ｌｎｃ、ｊＪ、ｓ、Ａ、　）を用いて抗Ｂ
１６メラノ一マ抗体を得た。
実施例３ 実施例１と同様にして、ＥＭＣＳとＩ　Ｉ、−２とのモ
ル比を４：ｌとし、その合計の濃度をＥＭＣＳとして０
．０５μｔｓｏｌ／ｍｌとして、反応させ、結合物を得
た。
実施例４ 実施例１と同様にして、８ＭＣ３とＩ　Ｌ−２とのモル
比を１０：ｌとし、その合計の濃度を８ＭＣ３として１
．３　ｔｘ　ｔａｏＩ／ｄとして反応＝させ、結合物を
得た。
実施例５ 実施例１と同様にして、ＥＭＣＳとＩＬ−２とのモル比
を１００：ｌとし、その合計の濃度を８ＭＣ３として６
．５μｍｏｌ／−として反応させ、結合物を得た。
実施例６ 実施例５と同様にし、８ＭＣ３の代わりにＳ　ＰＤＰを
用いて結合物を得た。
実施例７ 実施例４と同様にして、ヒト■ｇＧの代わりにハイブリ
ドーマＭＭ２−９８６が産生じた抗マウスＢ−１６メラ
ノーマモノクロナル抗体を用いて結合物を得た。
実施例８ 実施例７と同様にして、抗マウスＢ−１６メラノーマモ
ノクロナル抗体の代わりに抗マウスＢ−１６メラノーマ
モノクロナル抗体のＦａｂ’ヲ用いて結合物を得る。
なお、抗マウスＢ−１６メラノーマモノクロナル抗体の
Ｆ　ａｂ’は、次の方法で製造される。
ハイブリドーマＭＭ２−９８６が産生じた抗Ｂ１６メラ
ノ一マモノクロナル抗体（？　ウ７．　Ｉ　ｇＧ）を３
７℃でｐＨ４，５，１６時間ペプシンを用いて反応させ
る。反応後、ｐＨ８，０に調製しセファデックスＧ−１
５０（ファルマシア社製）でＦ　（ａｂ’）ｔを分離精
製する。濃縮後、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）で
緩衝液交換しメルカブトエチラミンで還元スる。セファ
デックスＧ−２５（ファルマシア社製）でＦ　ａｂ’を
分離精製する。
実施例９ 実施例１と同様にして、ヒトＩｇＧの代わりにヒ）［ｇ
ＧＦａｂ’を用いて結合物を得た。この結合物について
Ｉ　Ｌ−２の活性をみるとその活性は保持されていた。
なお、抗ヒ）ｒｇＧのＦ　ａｂ’は、次の方法で製造さ
れた。
市販のヒトＩｇＧを３°７°ＣでｐＨ４，５，１６時間
ペプシンを用いて反応させた。反応後、ｐＨ６，０に調
製しセファクリルＳ−２００（ファルマシア社製）でＦ
　（ａｂ’　）ｔを分離精製した。濃縮後、０．１ＭＩ
Ｊン酸緩衝波緩衝液６．０）で緩衝液交換し０．１Ｍメ
ルカプトエチラミンで還元した。セファデックスＧ−２
５（ファルマシア社製）でＦａｂ“を分離精製した。
実施例１０ マウスＩｇＧ１０ｏ＋ｇとＳ　Ａ　Ｔ　Ａ　（Ｎ−ｓｕ
ｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌＳ−ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏ−ａｃ
ｅｔａｔｅ）　８０　Ｉｔ　ｇとを燐酸緩衝液（ｐＨ６
，０）中で反応させた後、セファデックスＧ−２５で精
製し次に１Ｍヒドロキシルアミノ水溶液中で還元するこ
とによってマウスＩｇＧにチオール基を生成せしめた。
セファデックスＧ−２５で精製後、γ−ＩＬ−２２１１
１ｇとＥＭＣＳの反応物とを反応させ、マウスＩｇＧと
γ−ｒ　Ｌ−２との結合物を得た。これを、セファクリ
ルＳ−２００と抗Ｉ　Ｌ−２抗体を用いるアフィニティ
ーカラムで精製した。この結合物のｒ　Ｌ−２活性をＥ
ＩＡサンドインチ法で調べたところ、ＩＬ−２として約
７μｇ／−であった。この結合物のＩＬ−２として９０
０ｎｇを、マウスに静脈内投与したところ血中に持続し
、３日後の血漿中にもＩＬ−２活性としてｌｏｎｇ／ｌ
Ｒ１存在した。
実施例１１ ヒトＩｇＧのＦ　（ａｂ’　）ｚフラグメントは常法（
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ＋　　
Ｃ２０９３２７（１９８３））により、ヒトＩｇＧをペ
プシン処理することによって得た。Ｆ　（ａｂ’　）ｅ
　　４　ｍｇとＳＡＴＡ（Ｎｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ
−３−ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏ−ａｃｅｔａｔｅ）３２μ
ｇを燐酸緩衝液（ｐＨ６，０）中で反応させた後、セフ
ァデックスＧ−２５で精製し次に１Ｍヒドロキシルアミ
ノ水溶液中で還元することによってヒトＦ（ａｂｏ）、
にチオール基を生成せしめた。セファデックスＧ−２５
で精製後、７−ＩＬ−２１ｍｇと８ＭＣ３の反応物とを
反応させ、Ｆ（ａｂ’）ｔとγ−ＩＬ−２との結合物を
得た。これをセフアクリルＳ−２００と抗ＩＬ−２抗体
を用いるアフィニティーカラムで精製した。この結合物
のＩＬ−２活性をＥＲＡサンドイッチ法で調べたところ
、ＩＬ２として約２μｇ／ｌｄであった。この結合物の
ＩＬ−２として３００ｎｇを、マウスに静脈内投与した
ところ血中に持続し３日後の血漿中にもＩＬ−２活性と
してｌｎｇ／ａｆｆ存在した。
（発明の効果） 本発明の修飾Ｉ　Ｌ−２は、充分な１１．−２活性を有
し、しかも生体内に投与した場合、ｒ　Ｌ−２が長期間
にわたり血液中に存在し、Ｉ　Ｌ−２の生理活性が長期
間にわたり発揮されるので、該修飾ｒ　ｔ、−２は、医
薬品製剤とりわけ持続性注射剤として有利に用いること
ができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、アミノ末端がＨ−Ａ　Ｉａ−であるヒトＩ　
Ｌ−２のアミノ酸配列を示す。 第２図は、実施例１（１）で得られた、結合物のゲルろ
過のパターンを示す。 第３図は、実施例１（２）で得られた、実施例１（１）
で製造された結合物の血液中の濃度をＥで測定した結果
を示す。 Ａ

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）をイムノグ
    ロブリン（Ｉｇ）またはその抗体活性を有するフラグメ
    ントに化学結合せしめた修飾ＩＬ−２。
  2. （２）、ＩＬ−２のアミノ基とイムノグロブリンまたは
    その抗体活性を有するフラグメントを還元して生成する
    メルカプト基とが架橋剤を介して結合している請求項１
    記載の修飾ＩＬ−２。
  3. （３）、ＩＬ−２のアミノ基とイムノグロブリンまたは
    その抗体活性を有するフラグメントのアミノ基に導入さ
    れたチオール基とが架橋剤を介して結合している請求項
    １記載の修飾ＩＬ−２。
  4. （４）、ＩＬ−２が組換え型ヒトＩＬ−２である請求項
    １記載の修飾ＩＬ−２。
  5. （５）、イムノグロブリンがイムノグロブリンＧである
    請求項１記載の修飾ＩＬ−２。
  6. （６）、ＩＬ−２をイムノグロブリンの抗体活性を有す
    るフラグメントに化学結合せしめた請求項１記載の修飾
    ＩＬ−２。
  7. （７）、フラグメントがＦａｂ、Ｆａｂ′またはＦ（ａ
    ｂ′）＿２である請求項６記載の修飾ＩＬ−２。
  8. （８）、フラグメントがＦａｂ′である請求項６記載の
    修飾ＩＬ−２。
  9. （９）、フラグメントがＦ（ａｂ′）＿２である請求項
    ６記載の修飾ＩＬ−２。
  10. （１０）、ＩＬ−２のアミノ基とイムノグロブリンまた
    はその抗体活性を有するフラグメントを還元して生成す
    るメルカプト基とを架橋剤を介して結合させることを特
    徴とする修飾ＩＬ−２の製造法。
  11. （１１）、ＩＬ−２のアミノ基とイムノグロブリンまた
    はその抗体活性を有するフラグメントのアミノ基に導入
    されたチオール基とを架橋剤を介して結合させることを
    特徴とする修飾ＩＬ−２の製造法。
  12. （１２）、架橋剤がＮ−（ε−マレイミドカプロイルオ
    キシ）サクシニミド（ＥＭＣＳ）である請求項１０また
    は１１記載の製造法。
  13. （１３）、架橋剤がＮ−（ε−マレイミドカプロイルオ
    キシ）サクシニミド（ＥＭＣＳ）であり、イムノグロブ
    リンまたはその抗体活性を有するフラグメントのアミノ
    基へチオール基を導入する導入剤がＮ−サクシミジル−
    Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）である請求項
    １１記載の製造法。
  14. （１４）、ＩＬ−２のアミノ基とイムノグロブリンまた
    はその抗体活性を有するフラグメントを還元して生成す
    るメルカプト基とを架橋剤を介して結合させてなる修飾
    ＩＬ−２。
  15. （１５）、ＩＬ−２のアミノ基とイムノグロブリンまた
    はその抗体活性を有するフラグメントのアミノ基に導入
    されたチオール基とを架橋剤を介して結合させてなる修
    飾ＩＬ−２。
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