CN115397852A - 工程化抗il-2抗体 - Google Patents

工程化抗il-2抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN115397852A
CN115397852A CN202180028914.7A CN202180028914A CN115397852A CN 115397852 A CN115397852 A CN 115397852A CN 202180028914 A CN202180028914 A CN 202180028914A CN 115397852 A CN115397852 A CN 115397852A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
amino acid
antibody
acid sequence
ser
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202180028914.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115397852B (zh
Inventor
因巴尔·阿米特
伊泰·莱文
盖伊·尼姆罗德
莎伦·费奇曼
列乌特·巴拉克福克斯
马雷克·斯特拉布尔
蒂莫西·怀恩特
迈克尔·哲宁
奥尔加·布卢夫施泰因耶莫雷耶夫
耶赫兹克尔·萨松
诺姆·格罗斯曼
纳塔莉亚·莱维汀
亚奈·奥弗兰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Oros Biosciences
Original Assignee
Oros Biosciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oros Biosciences filed Critical Oros Biosciences
Priority to CN202310897633.6A priority Critical patent/CN117143233A/zh
Publication of CN115397852A publication Critical patent/CN115397852A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115397852B publication Critical patent/CN115397852B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39591—Stabilisation, fragmentation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/246—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本文描述了具有修饰的氨基酸序列的工程化抗IL‑2抗体。工程化抗体将赋予IL‑2‑抗IL‑2抗体复合物修饰的受体结合特异性，抑制IL‑2与CD25的结合。工程化抗IL‑2抗体将促进效应免疫细胞亚群的扩增并且减少由IL‑2引起的不合意的影响。因此，工程化抗IL‑2抗体将可用于治疗诸如癌症和感染的疾病。

Description

工程化抗IL-2抗体
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年2月16日提交的美国临时申请第62/977,292号和2021年1月20日提交的美国临时申请第63/139,315号的优先权的权益，所述美国临时申请全部通过引用以其整体并入本文。
序列表声明
本申请包含序列表，所述序列表已经以ASCII格式电子地提交并且在此通过引用以其整体并入。于2021年2月14日生成的ASCII副本被命名为P-593094-PC-SEQ-14FEB21_ST25.txt并且大小为64.6千字节。
发明领域
本公开内容总体上涉及抗体领域。在一种实施方案中，本公开内容描述了将赋予IL-2修饰的受体结合特异性的工程化抗IL-2抗体的制备和用途。
背景
白细胞介素2(IL-2)是一种15.4kDa的具有四螺旋束结构的I型细胞因子。自30多年前发现以来，IL-2在免疫系统的调节中的重要性已经被多次说明。IL-2主要由抗原活化的CD4+T细胞产生和分泌。在较小程度上，IL-2还由CD8+T细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突细胞和肥大细胞产生。
IL-2信号传导具有两种相反的作用。IL-2可以通过效应细胞的活化来增强免疫应答并诱导其增殖。另外，IL-2可以通过CD4+调节性T(Treg)细胞的活化和增殖下调免疫应答。为了促进这些功能，IL-2通过与以下两种形式的IL-2受体结合来介导其作用：i)由IL-2Rα(CD25)链、IL-2Rβ(CD122)链和共同的IL-2Rγ(γc，CD132)链组成的三聚体受体，或ii)仅由IL-2Rβ亚基和IL-2Rγ亚基组成的二聚体受体。二聚体受体和三聚体受体两者能够经由STAT5途径传递IL-2结合信号传导。然而，IL-2结合αβγ受体三聚体比βγ受体二聚体紧密100倍。已经展示，hIL-2与αβγ三聚体的结合亲和力为大约10pM，而hIL-2与βγ二聚体的亲和力为1nM。
与IL-2受体的二聚体形式和三聚体形式的亲和力的差异是负责保持体内免疫稳态的关键机制之一。三聚体受体的活化与Treg中FoxP3介导的转录相关，Treg在其膜上表达更多的αβγ三聚体IL-2受体。相比之下，IL-2与βγ二聚体的结合与NK细胞和记忆表型(MP)CD8+细胞的活化相关，所述NK细胞和记忆表型(MP)CD8+细胞表达相对高水平的βγ二聚体和非常低水平的αβγ三聚体IL-2受体。由于在正常生理条件下，IL-2的自然水平是相对低的，因此IL-2的主要功能似乎是通过充当Treg活化和增殖因子来促进免疫耐受。另一方面，在免疫系统被活化后，IL-2水平升高，并且随后IL-2能够结合βγ二聚体并促进记忆表型效应T细胞(MP)CD8+和NK细胞的活化和增殖。
自20世纪90年代早期以来，高剂量IL-2疗法用于治疗黑色素瘤和转移性肾细胞癌，具有10％-15％响应率。虽然有效，但这种方法尚未被用于其他癌症，因为IL-2依赖性不良作用如潜在致命的血管渗漏综合征(VLS)使许多患者无法考虑接受这种疗法。所施用的IL-2的短半衰期要求非常频繁的施用，导致循环IL-2的水平反复急升，从而加剧不良作用。最后，由于野生型IL-2不是选择性的，因此它还可能增强Treg细胞的非期望的活化。
已经发现，某些抗体可以与IL-2结合，并且调节与βγ二聚体IL-2受体或αβγ三聚体IL-2受体的结合。与这些抗体复合的IL-2将具有相对较长的半衰期，并且这些IL-2复合物将活化效应细胞或免疫细胞的特定亚群。例如，抗体S4B6-小鼠IL-2复合物在体内优先地活化小鼠效应细胞，而抗体JES6.1-小鼠IL-2复合物在体内优先地活化小鼠T调节细胞。已经阐明了JES-6.1抗体的调节机制。已经表明，JES6.1-mIL-2复合物在体外结合CD25但不结合CD122。
增加的IL-2已经被认为在病毒感染中起作用。SARS-CoV-2是呼吸道病毒冠状病毒科(coronaviridae)的正链RNA病毒。该病毒通过结合肺和胃肠组织上的血管紧张素转换酶2(ACE2)进入宿主。感染过程的特征在于～7-14天的潜伏期，随后出现干咳、发热和呼吸短促的症状。高达20％的有症状的个体发展成严重症状，并且平均3％的病例因肺衰竭而致命。关于冠状病毒家族成员的较早研究证明，冠状病毒感染导致调节性T淋巴细胞的增加，这可能导致延迟的病毒清除。对COVID-19患者的较近期的研究表明，ICU中的患者比非ICU患者具有更高水平的IL-2、IL-7、IL-10、GSCF、IP10、MCP1、MIP1A和TNF-α，这表明免疫病理在严重疾病中的作用。使用来自SARS-CoV2感染的患者的外周血白细胞的免疫学特征对白细胞稳态改变的直接证据进行的调查指示，与一些慢性感染类似，在COVID-19中，对CD4+T细胞的功能的损伤促进CD8+T细胞的过度活化和可能随后的耗竭。这些对T细胞亚群的干扰最终可能减弱宿主的抗病毒免疫。因此，减缓病毒生长或增强免疫应答以消除病毒载量同时减少一些相关的免疫病理的治疗方法将是大有益处的。
对病毒的免疫应答由免疫系统的先天臂(innate arm)和后天臂(acquired arm)两者组成。先天系统使用toll样受体(TLR)和视黄酸诱导基因I(RIG-I)蛋白来感知病毒RNA/DNA并诱导初始应答。这种应答包括产生抗病毒细胞因子(诸如干扰素α)、将免疫系统带到感染部位的趋化因子和动员巨噬细胞/树突细胞臂。自然杀伤(NK)细胞(先天淋巴样的)在不存在MHC I类表达的情况下直接杀伤病毒感染的细胞。即使当病毒已经干扰MHC I类呈递系统，也会发生这种情况。
此外，在感染应答期间，NK细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)，从而增加细胞上MHC I类的表达并增强获得性免疫系统的应答能力。获得性免疫系统由T细胞(CD4和CD8)和B细胞组成。CD4+T细胞在抗原呈递细胞上的MHC-II的背景下识别病毒抗原，以既放大免疫应答(通过细胞因子)又诱导B细胞类别转换和随后产生抗病毒抗体。CD4细胞，特别是Th1细胞的活化还释放IFN-γ，从而增强病毒抗原的呈递。CD8+T细胞对在MHC-I的背景下呈递病毒肽的病毒感染的细胞表现出直接裂解作用。免疫应答的初始诱导阶段通常需要7-10天以扩增T细胞群体并产生清除病毒所需的细胞。
IL-2是T细胞和NK细胞的扩增和活化的关键介导物。IL-2通常被认为在T细胞活化所需的次级信号中起主要作用。二聚体(βγ)IL-2受体和三聚体(αβγ)IL-2受体复合物的表达显示出谱系选择性，因为含有CD25(α亚基)的三聚体受体被发现在调节性T细胞和活化的短寿命细胞毒性效应T细胞亚群上高度表达，而二聚体受体被发现在幼稚T细胞、记忆T细胞和NK细胞上高度表达。因此，幼稚T细胞、记忆T细胞和NK细胞可以经由IL-2与二聚体受体结合来接收信号传导。调节性T细胞依赖于高亲和力的三聚体受体复合物来增强其功能，这包括隔离IL-2使其不与记忆T细胞和幼稚T细胞结合，并且从而降低这些细胞群体的功能。IL-2的作用机制在图1中描述。
效应T细胞亚群也表达三聚体IL-2受体复合物。虽然这些细胞是高度活跃的，但IL-2与效应T细胞亚群的结合诱导活化诱导的细胞死亡(activation-induced celldeath，AICD)。此外，已经表明CD25在肺内皮和血管内皮上表达。这种表达与使用高剂量IL-2的小鼠模型中的肺水肿和血管渗漏有相关性。表明CD25在肺细胞上的表达是高剂量IL-2疗法的肺毒性的原因。另外，虽然肺内皮细胞在稳态条件下表达CD25，但CD25在这些细胞上的表达水平在用IL-2注射小鼠后在体内增加。已经表明，敲除非免疫细胞上的CD25或通过使用IL-2和抗IL-2抗体的免疫复合物(IL-2/mAb)干扰IL-2的CD25结合表位能够防止IL-2诱导的肺水肿和血管渗漏综合征。在经遗传修饰成缺乏T细胞和B细胞并且经亚致死辐照以去除剩余的免疫细胞(NK、单核细胞、DC和粒细胞)的小鼠中还展示，添加高剂量IL-2导致显著的肺水肿，这指示非免疫组分。
关于IL-2在清除肺的病毒感染能力中的双重作用已经存在许多研究。已经证明，IL-2是CD8+T细胞扩增以用于病毒清除所必需的。还已经表明，IL-2可以介导肺水肿。例如，在流感病毒肺感染的小鼠流感模型中已经展示，记忆CD4+T细胞产生高水平的IL-2，并且这种IL-2的存在使疾病恶化。调节性T细胞对于减少病毒感染对肺组织的病理损伤是重要的。已经假设并展示，通过Treg控制CD8+效应细胞的一种机制是通过经由Treg上的CD25三聚体受体对IL-2进行高亲和力消耗。这实际上从扩增的效应细胞中去除IL-2，并且随后限制效应细胞的可用性并潜在地减少病毒清除。Treg也可能通过使IL-2与CD25+内皮细胞隔离开来限制IL-2对肺内皮的影响。结果可能取决于Teff/Treg的比率。高水平的Teff(效应T细胞)可以导致病毒清除，但也可以导致由免疫活化的细胞分泌的过量水平的IL-2，因此导致肺水肿。相比之下，高Treg扩增可以减少肺水肿的病理，但也减少病毒清除并导致延长的病毒感染。
来自COVID-19患者的近期数据表明，较高的病毒载量导致较差的结果；因此，病毒清除的减少将与较坏的结果相关。在小鼠模型中，使用甲型流感病毒(IAV)感染模型展示了Treg在减少病毒清除方面的作用，其中感染IAV的小鼠在肺、脾和淋巴结中示出较高水平的Treg，以及在肺组织中示出较高水平的病毒载量。甚至在感染开始后6周也观察到了这种情况。表明甲型流感诱导Treg扩增以避免被免疫应答清除。为了评价增强免疫应答是否将增加对肺中IAV感染的清除，研究人员使用了先前感染IAV的小鼠，并且随后用触发强烈的细胞毒性T淋巴细胞应答的淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)感染小鼠。IAV感染的肺中的广泛的免疫应答还导致肺水肿和广泛的肺组织损伤。保护免受严重肺水肿通过在施用LCMV之前用抗CD25阻断抗体治疗携带IAV的小鼠来实现。这些数据表明，在Treg已经减缓病毒清除的情况下增强免疫应答可以诱导病毒清除。此外，表明阻断IL-2与CD25+细胞的结合降低病毒清除期间免疫介导的肺水肿的风险。
已经表明作为单剂疗法给出的IL-2增强抗病毒免疫应答。在LCMV感染的小鼠中检查T细胞的扩增期、缩减(contraction)期和记忆期期间IL-2疗法的效果表明，在扩增期期间的IL-2治疗不利于快速分裂的效应T细胞的存活，所述快速分裂的效应T细胞已经瞬时上调CD25的表达。这些效应T细胞随后被引导到AICD。相比之下，IL-2疗法在缩减期期间是高度有益的，并且导致病毒特异性T细胞的存活和活化。观察到IL-2治疗增强了静息记忆T细胞的活化和增殖。然而，IL-2疗法具有其缺点。IL-2的半衰期短，因此要求多次施用，例如每日负荷剂量随后每周给药，导致另外相关的不良事件和增加的免疫原性的风险。此外，预期施用外源性高剂量IL-2将使其与CD25阳性内皮细胞结合。事实上，肺水肿和血管渗漏综合征是肿瘤学中高剂量IL-2疗法的主要严重不良事件。开发克服这些限制的技术对于使用IL-2作为疗法是至关重要的。
本领域普通技术人员将认识到，上文讨论的关于IL-2和治疗病毒感染的原理将同样适用于IL-2和治疗细菌感染或治疗癌症。
生物分子工程领域的进展为研究人员提供了应用分子设计策略来修饰天然存在的蛋白并产生用于靶向的疾病疗法的新的分子的前所未有的机会。在一方面，不断发展的技术和对蛋白工程化的了解赋予开发免疫治疗剂诸如基于细胞因子或基于抗体的药物的能力。因此，对于开发工程化抗IL-2抗体存在需求，所述工程化抗IL-2抗体将用于调节IL-2在某些疾病状态，例如但不限于病毒感染或细菌感染以及癌症中的功能。
概述
在一个方面中，本文公开了一种分离的抗IL-2抗体，该分离的抗IL-2抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含重链互补决定区(HCDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL包含轻链互补决定区(LCDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述CDR具有以下氨基酸序列：
(a)HCDR1包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，LCDR3包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；
(b)HCDR1包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列，LCDR3包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；
(c)HCDR1包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，LCDR3包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；
(d)HCDR1包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，LCDR3包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列；或
(e)HCDR1包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列，LCDR3包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
在相关方面中，VH和VL具有以下氨基酸序列：
(a)VH包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；
(b)VH包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；
(c)VH包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；
(d)VH包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；
(e)VH包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；
(f)VH包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；
(g)VH包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；
(h)VH包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；
(i)VH包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；或
(j)VH包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
在另一个相关方面中，抗体包括IgG、IgA、IgM、IgE、IgD、Fv、scFv、Fab、F(ab′)2、微抗体，双抗体、三抗体、纳米抗体或单结构域抗体。
在另外的相关方面中，抗体包含重链，该重链包含降低与Fcγ受体结合的突变。在还另外的相关方面中，抗体包含重链序列和轻链序列，
(a)所述重链序列在SEQ ID NO:68中列出并且所述轻链序列在SEQ ID NO:69中列出；
(b)所述重链序列在SEQ ID NO:70中列出并且所述轻链序列在SEQ ID NO:71中列出；或
(c)所述重链序列在SEQ ID NO:72中列出并且所述轻链序列在SEQ ID NO:73中列出。
在相关方面中，本文公开了一种组合物，该组合物包含如本文描述的抗IL-2抗体和药学上可接受的载体。在另外的相关方面中，组合物被配制成pH在约pH 5.0-6.0之间，并且包含选自组氨酸缓冲液和柠檬酸盐缓冲液的缓冲液。在还另外的相关方面中，组合物还包含蔗糖、甲硫氨酸或PS80中的至少一种或其任何组合。在又另外的相关方面中，该组合物还包含IL-2。
在一个方面中，本文提供了一种编码抗IL-2抗体的重链可变区的分离的多核苷酸序列，其中VH氨基酸序列在SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:36的氨基酸序列中列出。在相关方面中，本文提供了一种载体，该载体包含编码SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:36的氨基酸序列中列出的VH氨基酸序列的多核苷酸序列。在还另一个相关方面中，本文提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包含载体，该载体包含编码SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:36的氨基酸序列中列出的VH氨基酸序列的多核苷酸序列。
在一个方面中，本文提供了一种编码抗IL-2抗体的轻链可变区的分离的多核苷酸序列，其中VL氨基酸序列在SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:37的氨基酸序列中列出。在相关方面中，本文提供了一种载体，该载体包含编码SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:37的氨基酸序列中列出的VL氨基酸序列的多核苷酸序列。在还另一个相关方面中，本文提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包含载体，该载体包含编码SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:37的氨基酸序列中列出的VL氨基酸序列的多核苷酸序列。
在一个方面中，本文提供了一种编码抗IL-2scFv的分离的多核苷酸序列，其中多核苷酸序列在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35中列出。在相关方面中，本文提供了一种载体，该载体包含编码scFv的多核苷酸序列，其中多核苷酸序列在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:31、SEQID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35中列出。在还另一个相关方面中，本文提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包含载体，该载体包含编码scFv的多核苷酸序列，其中多核苷酸序列在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35中列出。
在一个方面中，本文公开了一种治疗受试者中的疾病或状况的方法，该方法包括向受试者施用包含如本文详细描述的抗IL-2抗体的组合物的步骤，其中所述抗体促进免疫细胞亚群的差异生长并且减少由IL-2引起的不合意的影响，从而治疗所述受试者中的所述疾病或状况。
在相关方面中，组合物包含抗IL-2抗体和IL-2，或与IL-2复合的抗IL-2抗体。
在另一个相关方面中，疾病包括病毒感染、细菌感染或癌症。在另外的相关方面中，病毒感染由以下引起：SARS CoV-2；诺如病毒；轮状病毒；甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒或戊型肝炎病毒；狂犬病毒；西尼罗河病毒；肠道病毒；埃可病毒；柯萨奇病毒；单纯疱疹病毒(HSV)；HSV-2；水痘-带状疱疹病毒；蚊媒病毒；虫媒病毒；圣路易斯脑炎病毒(St.Louis encephalitis virus)；加利福尼亚脑炎病毒(Californiaencephalitis virus)；淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒；人类免疫缺陷病毒(HIV)；脊髓灰质炎病毒；寨卡病毒；风疹病毒；巨细胞病毒；人类乳头瘤病毒(HPV)；肠道病毒D68；严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒；中东呼吸综合征冠状病毒；爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)；流感病毒；呼吸道合胞病毒；多瘤病毒(包括JC病毒；BK病毒)；埃博拉病毒；登革热病毒；或其任何组合。
在另一个相关方面中，状况包括弱免疫系统，并且所述治疗预防性地增强免疫系统，或者所述状况包括IL-2诱导的肺水肿或IL-2诱导的血管渗漏。
在另一个相关方面中，状况包括增加所述受试者中癌症的可能性的遗传易感性。在另外的相关方面中，遗传易感性包括基因产物的表达或活性的改变，所述基因包括肿瘤抑制基因或错配修复(MMR)基因或其组合。在另一个另外的相关方面中，遗传易感性包括基因产物的表达或活性的改变，所述基因包括BRCA1、BRAC2、MLH1、MSH2、MSH6、PMS1、PMS2、TP53或CHEK2或其组合。
在另一个相关方面中，免疫细胞包括幼稚T细胞、记忆T细胞、CD8+T细胞、NK细胞或自然杀伤T细胞中的一种或更多种。
在又另一个相关方面中，由IL-2引起的不合意的影响包括调节性T细胞的活化、CD25+T效应细胞的凋亡、IL-2诱导的肺水肿、肺炎或IL-2诱导的血管渗漏中的一种或更多种。
在另外的相关方面中，抗IL-2抗体抑制IL-2与CD25的结合。
在又另一个另外的相关方面中，受试者还用靶向一种或更多种免疫检查点的一种或更多种免疫检查点抑制剂治疗。在还另外的相关方面中，受试者在用所述抗IL-2抗体治疗的同时、在用所述抗IL-2抗体治疗之前或在用所述抗IL-2抗体治疗之后用所述免疫检查点抑制剂治疗。在另一个相关方面中，免疫检查点包括PD-1、PDL-1、CTLA-4、TIGIT、TIM-3、B7-H3、CD73、LAG3、CD27、CD70、4-1BB、GITR、OX40、SIRP-α(CD47)、CD39、ILDR2、VISTA、BTLA或VTCN-1。
在一个方面中，本文提供了一种对受试者进行免疫接种的方法，其中所述免疫接种包括施用包含佐剂的疫苗，所述佐剂包括IL-2抗体佐剂，所述抗IL-2抗体包括如本文公开的抗IL-2抗体。在相关方面中，IL-2抗体佐剂包括抗IL-2抗体和IL-2，或者包括与IL-2复合的抗IL-2抗体。在另外的相关方面中，受试者具有减弱的免疫系统。
在相关方面中，免疫接种方法包括对患有包括增加所述受试者中癌症的可能性的遗传易感性的状况的受试者进行免疫接种。在另外的相关方面中，遗传易感性包括基因产物的表达或活性的改变，所述基因包括肿瘤抑制基因或错配修复(MMR)基因或其组合。在另一个另外的相关方面中，遗传易感性包括基因产物的表达或活性的改变，所述基因包括BRCA1、BRAC2、MLH1、MSH2、MSH6、PMS1、PMS2、TP53或CHEK2或其组合。
附图简述
本专利或专利申请文件包含至少一幅以彩色制作的图。具有彩色附图的本专利或专利申请公布的副本将在依请求和支付必要费用后由主管局提供。
当结合附图阅读时，可以通过参考以下详细描述来最好地理解工程化抗IL-2抗体的生成和使用方法两者，以及其目的、特征和优点的本公开内容，在附图中：
图1.呈现了IL-2作用机制及其在控制免疫应答中的双重作用的示意图。
图2.呈现了抗IL-2抗体引导的免疫疗法的示意图。
图3A和图3B呈现了COVID-19感染的进展和潜在的抗IL-2疗法作为辅助干预的示意图。图3A修改自Shi Y等人,(2020)COVID-19 infection:the perspectives on immuneresponses.Cell Death&Differentiation第27卷,第1451–1454页(doi:10.1038/s41418-020-0530-3),图1。
图4A-图4D呈现了与人类IL-2(图4A)、小鼠IL-2(图4B)结合的JES6.1抗体，以及与人类IL-2(图4C)和小鼠IL-2(图4D)结合的JES6.1RMC抗体的代表性SPR传感图。
图5A-图5C呈现了以scFv形式表达JES6.1抗体的YSD克隆的IL-2结合的结果。X轴荧光水平对应于Jes6.1的scFv表达水平，Y轴荧光水平对应于人类IL-2或小鼠IL-2的结合。图5A示出了不具有IL-2的阴性对照。图5B示出了与1000nM人类IL-2一起的JES6.1 YSD克隆。图5C示出了与100nM标记的JES6.1一起孵育的表达小鼠IL-2的YSD。
图6A呈现了分离的酵母表面展示克隆与IL-2(0.1nM)的结合。平均荧光强度(Em655nM)针对酵母表面表达水平进行归一化。阴性YSD克隆用500nM hIL-2标记。
图6B呈现了YSD克隆与OX40/PD-1/TNFR2的混合物的非特异性结合。该克隆用500nM混合物标记。TNFR2结合酵母克隆用作阳性对照。
图7示出了BDG17.023 IgG的纯化。抗体在PBS缓冲液中以0.5ml/min在GEsuperdex 200 10/300 increase(CV＝25ml)上运行。前伸峰(0.38CV)对应于聚集体的典型特征，并且保留大约12.9ml的第二峰(0.51CV)是普通人类IgG的典型特征。
图8A-图8B呈现了BDG17.023 IgG与hIL-2(图8A)和mIL-2(图8B)的结合动力学。
图9以SPR响应迹线呈现了通过BDG17.023-IL-2复合物的受体鉴别。将BDG17.023固定到CM5芯片，并且hIL-2(60RU)、CD122(20RU)和CD25(0RU)如用箭头所指示地流动。
图10A-图10D呈现了用JES6.1-mIL-2复合物和BDG17.023-hIL-2复合物处理的小鼠的脾免疫细胞群体。图10A示出了来自用JES6.1-mIL-2复合物处理的小鼠的免疫细胞群体的百分比。图10B示出了用JES6.1-mIL-2复合物处理的小鼠的记忆表型效应T细胞(MP)CD8+/Treg比率。图10C示出了来自用BDG17.023-hIL-2复合物处理的小鼠的免疫细胞群体的百分比。图10D示出了用BDG17.023-hIL-2复合物处理的小鼠的MP CD8+/Treg比率。
图11呈现了JES6.1、克隆1(17.021)、克隆2(17.022)、克隆4(17.023)、克隆5(17.030)和克隆6(17.035)的重链可变区的氨基酸序列的比对。
图12呈现了JES6.1、克隆1(17.021)、克隆2(17.022)、克隆4(17.023)、克隆5(17.030)和克隆6(17.035)的轻链可变区的氨基酸序列的比对。
图13A和图13B呈现了人源化克隆17.014、克隆17.038、克隆17.043、克隆17.053和克隆17.054的重链可变区(图13A)和轻链可变区(图13B)的氨基酸序列的比对。黑色三角形表示IMGT CDR位置。粗体/斜体字体分别表示ABR/CDR位置。
图14A-图14G.所指示的抗体与人类IL-2的结合动力学。抗IL-2抗体克隆BDG17.038(图14A)、BDG 17.043(图14B)、BDG17.053(图14C)、17.054(图14D)、BDG17.066(图14E)、BDG17.067(图14F)和BDG17.069(图14G)与人类IL-2的结合动力学的表面等离子体共振(SPR)传感图迹线。BDG 17.038、BDG 17.043、BDG 17.066、BDG 17.067和BDG 17.069的结合动力学通过多循环方法来确定。BDG 17.053和BDG 17.054的结合动力学通过单循环方法来确定。
图15A-图15B.所指示的抗体与食蟹猴IL-2的结合动力学。抗IL-2抗体克隆BDG17.067(图15A)和BDG17.069(图15B)与食蟹猴IL-2的结合动力学的表面等离子体共振(SPR)传感图迹线。
图16A-图16G.所指示的IgG的熔点的差示扫描荧光法(DSF)分析。浅绿色虚线指示T开始(Tonset)，并且粗体绿色虚线指示Tm1且在适用的情况下指示Tm2。分析的抗IL-2克隆为BDG17.038(图16A)、BDG17.043(图16B)、BDG 17.053(图16C)、BDG 17.054(图16D)、BDG17.066(图16E)、BDG17.067(图16F)和BDG17.069(图16G)。
图17A-图17B呈现了通过追踪SPR响应对所指示的抗体/IL-2复合物的受体鉴别。将抗体固定到CM5芯片，并且hIL-2、CD122和CD25如用箭头所指示地流动。图17A呈现了将化合物注射到SPR芯片的示意性顺序，其代表了与人类IL-2(hIL2)复合、与CD122结合但不与CD25结合的顺序抗IL-2抗体。图17B-图17G呈现了SPR响应：BDG17.038(图17B)、BDG017.043(图17C)、17.054(图17D)、BDG17.066(图17E)、BDG17.067(图17F)和BDG17.069(图17G)。
图18A和图18B示出了抗人类IL-2抗体(克隆17.043和17.054)在体内展示出有效的免疫刺激作用。抗IL-2抗体/hIL-2复合物增加了效应细胞群体，而没有观察到对调节性T细胞的影响。图18A示出了C57BL/6小鼠被每天施用与0.5μg的hIL-2预复合的抗IL-2抗体(10μg)持续四天。图18B示出了C57BL/6小鼠被每天施用与1.25μg的hIL-2预复合的抗IL-2抗体(25μg)持续四天。在第5天，分离脾细胞，并且通过流式细胞术来分析免疫细胞群体。呈现了每个实验组(每组n＝6)的平均值。淋巴细胞根据侧向散射参数和前向散射参数进行门控，并且随后的免疫细胞亚群如下进行门控：Treg(CD45+、CD3+、CD4+、CD25+、FoxP3+)、CD8T细胞(CD45+、CD3+、CD8+、CD122+、CD25-)、NKT-细胞(CD45+、CD3+、CD49b+、NK1.1+)、NK细胞(CD45+、CD3-、CD49b+、NK1.1+)。
图19A和图19B示出了抗人类IL-2抗体(克隆17.043和17.054)在体内展示出有效的剂量依赖性免疫刺激作用。图19A示出了C57BL/6健康小鼠被每天施用抗IL-2抗体/hIL-2复合物(分别为25μg/1.25μg)持续四天。在第5天，分离脾细胞，并且通过流式细胞术来分析免疫细胞群体。图19B示出了抗人类IL-2抗体以剂量依赖性方式展示出有效的体内免疫刺激作用。如所指示的，C57BL/6健康小鼠被每天施用增加剂量的抗IL-2抗体/hIL-2复合物。在第5天，分离脾细胞，并且使用流式细胞术分析免疫细胞群体。淋巴细胞根据侧向散射参数和前向散射参数进行门控，并且随后的免疫细胞亚群如下进行门控：Treg(CD45+、CD3+、CD4+、CD25+、FoxP3+)、CD8 T细胞(CD45+、CD3+、CD8+、CD122+、CD25-)、NKT-细胞(CD45+、CD3+、CD49b+、NK1.1+)、NK细胞(CD45+、CD3-、CD49b+、NK1.1+)。
图20A和图20B示出了抗人类IL-2抗体(克隆17.043和17.054)展示出体内安全剂量方案。图20A示出了C57BL/6健康小鼠被每天施用抗IL-2抗体/hIL-2复合物(分别为10μg/0.5μg)持续四天。图20B示出了C57BL/6健康小鼠被每天施用抗IL-2抗体/hIL-2复合物(分别为25μg/1.25μg)持续四天。在实验结束时，小鼠被称重，并且相对于在研究开始时每只小鼠的体重计算体重变化的百分比。呈现了每个实验组(每组n＝6)的体重(BW)变化的平均百分比。
图21A和图21B示出了抗IL-2抗体(克隆17.043和17.054)在I/O耐受性肿瘤模型中抑制肿瘤生长并具有可耐受的安全性谱。C57BL/6健康小鼠在第0天接种B16F10黑色素瘤肿瘤细胞。在第5天，将小鼠随机分成实验组(每组10只)，并且每天施用抗IL-2抗体/hIL-2复合物(分别为20μg/1μg)或PBS持续4天。图21A示出了每个实验组的肿瘤体积的变化。图21B示出了每个实验组的体重的变化。相对于在研究开始时每只小鼠的体重计算体重变化百分比。
图22A-图22G示出了分析抗IL-2抗体克隆BDG 17.069的不同制剂的结果。图22A呈现了在T＝0时的BDG 17.069参数。图22B呈现了在T＝0时和在40℃孵育持续1周和2周之后BDG 17.069外观、pH、蛋白浓度和亚视觉颗粒形成。图22C呈现了在T＝0时和在40℃孵育持续1周和2周之后的BDG 17.069SEC、caliper-SDS和毛细管等电聚焦分析。图22D呈现了在T＝0时和在300rpm搅拌持续3天后的BDG 17.069外观、pH、蛋白浓度和亚视觉颗粒形成。图22E呈现了在T＝0时和在300rpm搅拌持续3天后的BDG 17.069SEC、caliper-SDS和毛细管等电聚焦分析。图22F呈现了在T＝0时和在五次冷冻/解冻循环之后的BDG 17.069外观、pH、蛋白浓度和亚颗粒形成。图22G呈现了在T＝0时和在五次冷冻/解冻循环之后的BDG17.069SEC、caliper-SDS和毛细管等电聚焦分析。
详细描述
本公开内容提供了工程化抗人类IL-2抗体，该工程化抗人类IL-2抗体以高亲和力(例如，12.7pM至48pM)将人类IL-2结合至预先确定的结合表位。抗体以完全防止CD25结合但保留IL-2与CD122的结合的方式与IL-2结合，从而通过直接活化和扩增效应细胞而不与CD25表达细胞(例如，调节性T细胞、短寿命细胞毒性T细胞、肺内皮细胞和血管内皮细胞)相互作用来调节对免疫刺激的免疫应答。因此，抗体/IL-2复合物将通过扩增和活化效应细胞诸如NK细胞、中枢记忆T细胞和病毒或肿瘤特异性T细胞，同时抑制IL-2活化诱导的对于病毒/肿瘤清除重要的短寿命CD25+细胞毒性T细胞的细胞死亡来驱动稳健的免疫应答以清除病毒载量或肿瘤。抗体/IL-2复合物还将减少由免疫系统的调节臂引起的免疫抑制。此外，抗体/IL-2复合物将防止IL-2与血管和肺CD25表达细胞的不期望的相互作用，从而防止病毒性肺感染模型中常见的IL-2诱导的血管渗漏和IL-2诱导的肺水肿的严重综合征。在一些实施方案中，本文描述的工程化抗IL-2抗体的活性取决于它们被设计成结合至的预先确定的表位。
技术人员将理解，在某些实施方案中，如本文使用的术语“抗IL-2抗体”与术语“抗人类IL-2抗体”可互换，其具有全部相同的性质和含义。类似地，如通篇使用的，在某些实施方案中，术语“IL-2”与术语“人类IL-2”可互换，其具有全部相同的性质和含义。
在一些实施方案中，本文描述的抗人类IL-2抗体抑制IL-2与IL-2受体α(IL-2Rα，即CD25)亚基的结合，并且因此抑制与三聚体IL-2Rαβγ受体的结合。在某些实施方案中，抑制IL-2与三聚体IL-2受体(IL-2Rαβγ)的结合的抗IL-2抗体不抑制IL-2与二聚体IL-2受体(IL-2Rβγ)的结合。
图2呈现了抗IL-2抗体引导的免疫疗法的示意图。将IL-2靶向不同的细胞群体可以用于调节对免疫抑制或对免疫活化的免疫应答。本文公开的抗人类IL-2抗体被设计成以高亲和力结合阻断IL-2与CD25结合的IL-2表位。因此，IL-2被防止与短寿命CD8+细胞毒性T细胞或表达高水平的CD25的调节性T细胞结合，但被重新引导成优先地与效应T细胞结合以刺激增强的免疫应答，以改进病毒或细菌清除。此外，由于也阻断了IL-2与CD25表达内皮细胞的结合，因此也将防止IL-2诱导的肺水肿和血管渗漏。
在一种实施方案中，本公开内容提供了一种用抗IL-2抗体治疗疾病(例如，病毒感染、细菌感染或癌症)或状况(例如，由IL-2引起的不合意的状况，例如但不限于肺水肿)的方法，所述抗IL-2抗体被设计成增强T细胞免疫应答并防止由IL-2引起的急性肺炎的严重水肿症状。抗IL-2抗体将在预先确定的表位处以高亲和力特异性结合人类IL-2，这阻断IL-2与IL-2受体的α链(CD25)结合，同时保留与受体的主要信号传导β链和γ链复合物(CD122/CD132)的结合。因此，在这样的抗体的存在下，IL-2将被引导到负责病毒/肿瘤清除的免疫细胞，并且远离减缓免疫应答或引起水肿的细胞。这种IL-2/抗体免疫复合物的形成将引导IL-2排他地结合并活化幼稚T淋巴细胞和记忆性T淋巴细胞、NK细胞和自然杀伤T淋巴细胞，同时防止调节性T细胞的活化和短寿命CD25+细胞毒性T效应细胞的凋亡。总之，最终结果是有效的免疫应答，例如病毒或肿瘤清除。此外，这种治疗将防止由IL-2与内皮CD25表达细胞结合引起的毒性。因此，在一种实施方案中，用本文公开的抗IL-2抗体靶向IL-2将是用于由病毒或细菌感染引起的呼吸系统疾病的有效治疗。在另一种实施方案中，用本文公开的抗IL-2抗体的治疗将有效防止由IL-2与内皮CD25表达细胞结合引起的毒性，例如肺水肿或IL-2诱导的血管渗漏。更重要的是，增强IL-2免疫刺激对独立于特定病原体(例如，病毒抗原)的免疫效应细胞的一般免疫活化和扩增将是对抗由未知病原体引起的未来病毒或细菌大流行病的有效策略(图3A和图3B)。
在一种实施方案中，本文公开的方法将可用于对抗由SARS Co-V2引起的感染。SARS Co-V2与允许病毒进入和复制的肺细胞的血管紧张素转换酶2结合。对肺的病毒感染的免疫应答由免疫系统的先天臂和后天臂两者组成。与许多呼吸道病毒的情况一样，预期SARS-CoV2从肺的清除取决于T细胞免疫应答。细胞因子IL-2对于T细胞的扩增是至关重要的，并且在对病毒的免疫应答中起重要作用。然而，除了IL-2的促刺激作用之外，IL-2还通过其与表达CD25受体的内皮结合来诱导一些不良副作用如肺水肿和血管渗漏综合征。
图3A和图3B呈现了COVID-19感染的进展和潜在的抗IL-2疗法作为辅助干预的示意图。图3A示出了入侵的SARS Co-V2引起不严重的症状，并且在潜伏期之后引发保护性免疫应答。感染的成功消除依赖于受感染的个体的健康状况。对病毒的免疫应答差的个体将难以清除病毒，而具有过于稳健的免疫应答的个体可能导致肺水肿和其他细胞因子介导的不良作用。因此，期望增强免疫应答并防止肺水肿的策略。虽然高浓度的IL-2对于病毒清除将是有益的，特别是在早期阶段，但高水平的IL-2可以通过IL-2和CD25表达内皮细胞的相互作用导致IL-2诱导的肺水肿和血管渗漏。图3B示出了被设计成结合并阻断CD25/IL-2相互作用的抗人类IL-2抗体被预计增强免疫效应细胞的扩增，以改进病毒清除并减少IL-2与内皮细胞上表达的CD25结合的负面影响，从而防止IL-2诱导的肺水肿和血管渗漏。
图1呈现了IL-2的作用机制及其在控制免疫应答中的双重作用的示意图。左图示出了IL-2由三个结合表位位点(α、β、γ)组成，所述结合表位位点与具有不同亲和力的不同形式的IL2-R(CD25、CD122和CD132)相互作用。右图示出了不同的IL-2R复合物在不同的T细胞群体上表达，并且它们对IL2的不同亲和力允许在低局部浓度的IL-2的条件下的免疫抑制以及当IL-2局部浓度升高时的免疫刺激。
在以下详细描述中，阐述了许多具体细节以便提供对本文公开的抗体的透彻理解。然而，本领域技术人员将理解，在某些情况下，可以在没有这些具体细节的情况下实践本文公开的抗体的制备和使用。在其他情况下，没有详细描述熟知的方法、程序和组分，以便不使本文所呈现的公开内容模糊。
在整个本申请中，引用了多项参考文献或出版物。这些参考文献或出版物的公开内容特此通过引用以其整体并入本申请中，以便更完整地描述本发明所属技术领域的状态。
如本文使用的，术语“抗体”可以与术语“免疫球蛋白”可互换地使用，其具有全部相同的性质和含义。抗体结合结构域或抗原结合位点可以是抗体的片段或抗体的一个或更多个片段的遗传工程化产物，该片段参与与靶抗原的特异性结合。“特异性结合”意指该结合对于感兴趣的抗原是选择性的，并且可以与不想要的或非特异性的相互作用区分开。例如，当平衡解离常数≤10-5M、10-6M或10-7M时，抗体被称为特异性结合IL-2表位。在一些实施方案中，平衡解离常数可以≤10-8M或10-9M。在一些另外的实施方案中，平衡解离常数可以≤10-10M、10-11M或10-12M。在一些实施方案中，平衡解离常数可以在≤10-5M至10-12M的范围内。
如本文使用的，术语“抗体”涵盖保留结合特异性的一种或更多种抗体片段，包括但不限于IgG、重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、Fab片段、F(ab')2片段、scFv片段、Fv片段、纳米抗体、微抗体、双抗体、三抗体、四抗体和单结构域抗体(参见，例如，Hudson和Souriau,Nature Med.9:129-134(2003))。还涵盖人源化的、灵长类化的和嵌合的抗体，如这些术语在本领域中通常理解的。
如本文使用的，术语“重链可变区”可以与术语“VH结构域”或术语“VH”可互换地使用，其具有全部相同的含义和性质。如本文使用的，术语“轻链可变区”可以与术语“VL结构域”或术语“VL”可互换地使用，其具有全部相同的含义和性质。技术人员将认识到，关于抗体的“重链可变区”或“VH”涵盖重链的片段，该片段包含介于被称为框架区的侧翼延伸之间的三个互补决定区(CDR)。框架区比CDR更高度保守，并且形成支持CDR的支架。类似地，技术人员还将认识到，关于抗体的“轻链可变区”或“VL”涵盖轻链的片段，该片段包含介于框架区之间的三个CDR。
如本文使用的，术语“互补决定区”或“CDR”指的是重链可变区或轻链可变区的高变区。从N末端开始，重链多肽或轻链多肽中的每一个具有表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”的三个CDR。许多抗原-抗体复合物的晶体学分析已经证明，CDR的氨基酸残基与结合的抗原形成广泛的接触，其中最广泛的抗原接触是与重链CDR3。因此，CDR区主要负责抗原结合位点的特异性。在一种实施方案中，抗原结合位点包括六个CDR，包括来自重链可变区和轻链可变区中的每一个的CDR。
如本文使用的，术语“框架区”或“FR”指的是框住重链可变区或轻链可变区的CDR的四个侧翼氨基酸序列。一些FR残基可以接触结合的抗原；然而，FR残基主要负责将可变区折叠成抗原结合位点。在一些实施方案中，负责折叠可变区的FR残基包括直接与CDR相邻的残基。在FR内，某些氨基残基和某些结构特征是非常高度保守的。在这方面，所有可变区序列都包含约90个氨基酸残基的内部二硫键环。当可变区折叠成抗原结合位点时，CDR被展示为形成抗原结合表面的突出环基序。普遍认识到，存在FR的保守的结构区，无论精确的CDR氨基酸序列如何，所述FR的保守的结构区影响CDR环的折叠形状成为某些“标准的”结构。此外，已知某些FR残基参与稳定抗体重链和轻链的相互作用的非共价结构域间接触。
Wu和Kabat(Tai Te Wu,Elvin A.Kabat.An analysis of the sequences of thevariable regions of bence jones proteins and myeloma light chains and theirimplications for antibody complementarity.Journal of Experimental Medicine,132,2,8(1970)；Kabat EA,Wu TT,Bilofsky H,Reid-Miller M,Perry H.Sequence ofproteins of immunological interest.Bethesda:National Institute of Health；1983.323(1983))开创了抗体肽序列的比对，并且他们在这方面的贡献是多方面的：首先，通过对可变结构域之间的序列相似性的研究，他们鉴定了跨所有脊椎动物物种中的所有抗体或多或少地同源的对应残基，因为它们采用相似的三维结构，发挥相似的功能作用，与邻近残基相似地相互作用，并且存在于相似的化学环境中。其次，他们设计了肽序列编号系统，在该系统中，同源免疫球蛋白残基被分配相同的位置号。本领域技术人员可以明确地将现在通常称为Kabat编号的内容用于任何可变结构域序列，而无需依赖于除序列本身之外的任何实验数据。第三，Kabat和Wu计算了每个Kabat编号的序列位置的可变性，这意味着当可变结构域序列被比对时，发现很少或很多可能的氨基酸。他们鉴定了嵌入在四个较少可变的连续区内的三个连续的高可变性区。Kabat和Wu正式划定了构成这些可变段(variabletract)的残基，并且将这些表示为“互补决定区”(CDR)，其指的是抗体和抗原之间的化学互补。在可变结构域的三维折叠中而不是在抗原识别中的作用被归因于剩余的较少可变的区，这些区现在被称为“框架区”。第四，Kabat和Wu建立了抗体肽和核酸序列的公共数据库，该数据库继续被维护并且是本领域技术人员熟知的。
Chothia和同事(Cyrus Chothia,Arthur M.Lesk.Canonical structures forthe hypervariable regions of immunoglobulins.Journal of Molecular Biology,196,4,8(1987))发现，Kabat CDR中的某些子部分采用了几乎相同的肽骨架构象，尽管在氨基酸序列的水平上具有大的多样性。这些子部分被表示为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别表示轻链区和重链区。这些区可以被称为Chothia CDR，其具有与Kabat CDR重叠的边界。
较近期的研究已经表明，几乎所有的抗体结合残基都落在结构一致的区内。(Kunik,V.等人,PloS Computational Biology 8(2):el002388(2012年2月)).在一些实施方案中，这些区被称为抗体结合区。已表明，这些区也可以从抗体序列中鉴定出。“Paratome”，一种用于鉴定抗体中结构一致的结构方法的实施方式，用于该目的。(Ofran,Y.等人,J.Immunol.757:6230-6235(2008))。虽然通过Paratome鉴定的残基覆盖了几乎所有的抗体结合位点，但CDR(如通过常用的CDR鉴定工具所鉴定的)遗漏了其中的重要部分。通过Paratome鉴定但没有通过任何常见的CDR鉴定方法鉴定的抗体结合残基被称为Paratome独特的残基。类似地，通过任何常见的CDR鉴定方法鉴定但没有通过Paratome鉴定的抗体结合残基被称为CDR独特的残基。Paratome独特的残基对抗体-抗原相互作用做出了至关重要的能量贡献，而CDR独特的残基具有相当小的贡献。这些结果允许更好地鉴定抗原结合位点。
Figure BDA0003892191780000211
是国际免疫遗传学信息系统
Figure BDA0003892191780000212
(international ImMunoGeneTicsinformation
Figure BDA0003892191780000213
)(参见，Nucleic Acids Res.2015年1月；43(数据库期号):D413-22.doi:10.1093/nar/gku1056.Epub 2014年11月5日免费文章.PMID:25378316LIGM:441和Dev Comp Immunol.2003年1月；27(1):55-77)。IMGT是用于免疫球蛋白和T细胞受体可变结构域以及Ig超家族V样结构域的独特编号系统(Lefranc等人,Dev Comp Immunol.27:55-77(2003))。基于比对5个或更多个IG和TcR可变区序列、考虑并结合Kabat对FR和CDR的定义、结构数据和Chothia对高变环的表征，
Figure BDA0003892191780000214
提供了用于这些IG和TcR可变结构域序列的统一的编号系统。IMGT作为用于抗体的通用编号方案被认为是本领域熟知的。
在一些实施方案中，对VH结构域和VL结构域中潜在的变体氨基酸位置的鉴定使用IMGT分析系统。在一些实施方案中，对VH结构域和VL结构域中潜在的变体氨基酸位置的鉴定使用Paratome分析系统。在一些实施方案中，对VH结构域和VL结构域中潜在的变体氨基酸位置的鉴定使用Kabat分析系统。在一些实施方案中，对VH结构域和VL结构域中潜在的变体氨基酸位置的鉴定使用Clothia分析系统。
在描述存在于VH结构域和VL结构域中的变体氨基酸位置时，在一些实施方案中使用IMGT编号。在描述存在于VH结构域和VL结构域中的变体氨基酸位置时，在一些实施方案中使用Paratome编号。在描述存在于VH结构域和VL结构域中的变体氨基酸位置时，在一些实施方案中使用Kabat编号。在描述存在于VH结构域和VL结构域中的变体氨基酸位置时，在一些实施方案中使用Clothia编号。
抗原结合序列通常位于抗体的重链可变区和轻链可变区内。在某些情况下，这些重链可变区和轻链可变区可以被操纵以产生新的结合位点，例如产生与不同抗原或与同一抗原的不同表位结合的抗体或其片段。在一些实施方案中，如本文描述的，操纵重链可变区的序列或轻链可变区的序列或两者将产生针对第二抗原的新的结合位点。
抗体可以以多种形式存在或具有多种结构域，包括但不限于互补决定区(CDR)、可变区(Fv)、VH结构域、VL结构域、单链可变区(scFv)和Fab片段。
本领域普通技术人员将理解，scFv是包含免疫球蛋白的可变重链(VH)区和可变轻链(VL)区、通过短接头肽连接的融合多肽，该接头可以具有例如10个至约25个氨基酸。
技术人员还将理解，关于抗体的术语“Fab”通常涵盖抗体的由单个轻链通过二硫键与单个重链的可变区和第一恒定区结合(可变区和恒定区两者)组成的部分，而F(ab′)2包括包含VH结构域的重链和包含VL结构域的轻链的片段。
在一些实施方案中，抗体涵盖完整抗体分子，包括单克隆抗体和多克隆抗体。在一些实施方案中，抗体涵盖保留结合特异性的一个或更多个抗体片段，包括但不限于可变重链(VH)片段、可变轻链(VL)片段、Fab片段、F(ab')2片段、scFv片段、Fv片段、微抗体、双抗体、三抗体和四抗体。
工程化抗IL-2抗体
在一种实施方案中，本公开内容提供了由将氨基酸变异引入亲本抗IL-2抗体产生的工程化抗IL-2抗体。在一种实施方案中，氨基酸变异中的一个或更多个被引入CDR区中。在另一种实施方案中，一个或更多个氨基酸变异被引入框架(FR)区内。在又另一种实施方案中，氨基酸变异被引入到CDR区和框架(FR)区两者。本领域普通技术人员将容易地采用本领域中已知的多种标准技术将氨基酸变异引入到抗IL-2抗体中，并且然后测试所得到的修饰的抗体与IL-2结合的任何变化。虽然可以使用标准技术，但所得到的新产生的抗体的结合模式是不可预测的，并且必须被分析以确定功能性。
在某些实施方案中，本公开内容提供了包含VH结构域和VL结构域的多肽，所述VH结构域和VL结构域可以在合适的条件下二聚化。例如，VH结构域和VL结构域可以在合适的缓冲液中组合并通过适当的相互作用诸如疏水相互作用二聚化。在另一种实施方案中，VH结构域和VL结构域可以在包含酶和/或辅助因子的合适缓冲液中组合，所述酶和/或辅助因子可以促进VH结构域和VL结构域的二聚化。在另一种实施方案中，VH结构域和VL结构域可以在合适的媒介物中组合，所述媒介物允许它们在合适的试剂和/或催化剂的存在下彼此反应。
在某些实施方案中，VH结构域和VL结构域可以被包含在较长的多肽序列中，所述多肽序列可以包含例如但不限于恒定区、铰链区、接头区、Fc区、或二硫键结合区或其任何组合。恒定结构域是免疫球蛋白分子的恒定部分的免疫球蛋白折叠单元，也被称为恒定区的结构域(例如，CH1、CH2、CH3、CH4、Ck、Cl)。在一些实施方案中，较长的多肽可以包含根据本文公开的方法产生的VH结构域和VL结构域中的一个或两者的多个拷贝；例如，当本文产生的多肽用于形成双抗体或三抗体时。
在一些实施方案中，Fc区包含至少一种降低Fc-γ结合，即与Fcγ受体(FcγR)的结合的突变。在一些实施方案中，降低的结合是消除的结合，其与Fcγ受体的结合是不可检测到的。在一些实施方案中，降低的结合降低了对Fcγ受体的结合亲和力。在一些实施方案中，降低的结合降低了与Fcγ受体结合的结合速率(on rate)。在一些实施方案中，降低的结合降低了与Fcγ受体结合的解离速率(off rate)。在一些实施方案中，降低Fc-γ结合的突变包括L234A突变、L235A突变，也被称为LALA突变。在一些实施方案中，降低Fc-γ结合的突变包括除了L234A突变、L235A突变之外的P329G突变。在一些实施方案中，本文描述的抗体包含含有降低与Fcγ受体结合的突变的重链。
在一种实施方案中，本公开内容提供了工程化(或修饰的)抗IL-2抗体，其中所述抗体包含重链可变区，该重链可变区具有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:36中的一种的序列。在一种实施方案中，工程化抗体可以是IgG、IgA、IgM、IgE、IgD、Fv、scFv、Fab或F(ab′)2。IgG可以具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的亚类。在另一种实施方案中，工程化抗体可以是微抗体、双抗体、三抗体、纳米抗体或单结构域抗体的一部分。
在一种实施方案中，本公开内容提供了工程化(或修饰的)抗IL-2抗体，其中所述抗体包含轻链可变区，该轻链可变区具有SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:37中的一种的序列。在一种实施方案中，工程化抗体可以是IgG、IgA、IgM、IgE、IgD、Fv、scFv、Fab或F(ab′)2。IgG可以具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的亚类。在另一种实施方案中，工程化抗体可以是微抗体、双抗体、三抗体、纳米抗体或单结构域抗体的一部分。
在一种实施方案中，本公开内容提供了工程化(或修饰的)抗IL-2抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区具有以下中的一种的序列：SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14和SEQ IDNO:15；SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20和SEQID NO:21；SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27；或SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37。在一种实施方案中，工程化抗IL-2抗体包含SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11的序列。在一种实施方案中，工程化抗IL-2抗体包含SEQID NO:12和SEQ ID NO:13的序列。在一种实施方案中，工程化抗IL-2抗体包含SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的序列。在一种实施方案中，工程化抗IL-2抗体包含SEQ ID NO:16和SEQID NO:17的序列。在一种实施方案中，工程化抗IL-2抗体包含SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19的序列。在一种实施方案中，工程化抗IL-2抗体包含SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的序列。在一种实施方案中，工程化抗IL-2抗体包含SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23的序列。在一种实施方案中，工程化抗IL-2抗体包含SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25的序列。在一种实施方案中，工程化抗IL-2抗体包含SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27的序列。在一种实施方案中，工程化抗IL-2抗体包含SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37的序列。
在一些实施方案中，分离的抗IL-2抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含重链互补决定区(HCDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL包含轻链互补决定区(LCDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述CDR具有以下氨基酸序列：
(a)HCDR1包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，LCDR3包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；
(b)HCDR1包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列，LCDR3包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；
(c)HCDR1包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，LCDR3包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；
(d)HCDR1包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，LCDR3包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列；或
(e)HCDR1包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列，LCDR3包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VH和VL具有氨基酸序列，其中VH包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；VH包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，VL包含SEQID NO:13的氨基酸序列；VH包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；VH包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；VH包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；VH包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；VH包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；VH包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；VH包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；或VH包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，VL包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗体包含重链序列和轻链序列，所述重链序列在SEQ ID NO:68中列出并且所述轻链序列在SEQ ID NO:69中列出；所述重链序列在SEQ ID NO:70中列出并且所述轻链序列在SEQ ID NO:71中列出；或所述重链序列在SEQ ID NO:72中列出并且所述轻链序列在SEQ ID NO:73中列出。
在一种实施方案中，工程化抗体可以是IgG、IgA、IgM、IgE、IgD、Fv、scFv、Fab或F(ab′)2。IgG可以具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的亚类。在另一种实施方案中，工程化抗体可以是微抗体、双抗体、三抗体、纳米抗体或单结构域抗体的一部分。
在一种实施方案中，本公开内容还提供了编码抗IL-2抗体的重链可变区的分离的多核苷酸序列，其中重链可变区包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26或SEQID NO:36中的一种的氨基酸序列。在另一种实施方案中，本公开内容还提供了包含上文提及的多核苷酸序列的载体。鉴于本文公开的氨基酸序列，本领域普通技术人员将容易地构建编码该氨基酸序列的载体或质粒。在另一种实施方案中，本公开内容还提供了包含本文提供的载体的宿主细胞。取决于用途和实验条件，本领域技术人员将容易地采用合适的宿主细胞来携带和/或表达上文提及的多核苷酸序列。
在一种实施方案中，本公开内容还提供了编码抗IL-2抗体的轻链可变区的分离的多核苷酸序列，其中轻链可变区包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27或SEQID NO:37中的一种的氨基酸序列。在另一种实施方案中，本公开内容还提供了包含上文提及的多核苷酸序列的载体。鉴于本文公开的氨基酸序列，本领域普通技术人员将容易地构建编码该氨基酸序列的载体或质粒。在另一种实施方案中，本公开内容还提供了包含本文提供的载体的宿主细胞。取决于用途和实验条件，本领域技术人员将容易地采用合适的宿主细胞来携带和/或表达上文提及的多核苷酸序列。
鉴于本文公开的重链可变区和轻链可变区的序列，本领域普通技术人员将容易地采用本领域中已知的标准技术来构建抗IL-2scFv。在一种实施方案中，编码这样的抗IL-2scFv的多核苷酸序列可以具有SEQ ID NO:1-5中的一种或SEQ ID NO:31-35中的一种的序列。
在某些实施方案中，本文公开的分离的多核苷酸序列，编码对抗IL-2抗体的重链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:36中的任一种的氨基酸序列中列出的VH氨基酸序列。在一些实施方案中，载体包含编码SEQID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:36中的任一种的多核苷酸序列。在一些实施方案中，宿主细胞含有包含编码SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:36中的任一种的多核苷酸序列的载体。
在某些实施方案中，本文公开的分离的多核苷酸序列，编码抗IL-2抗体的轻链可变区，所述轻链可变区包括如在SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27或SEQ IDNO:37中的任一种的氨基酸序列中列出的VL氨基酸序列。在一些实施方案中，载体含有包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:37中的任一种的氨基酸序列的多核苷酸序列。在一些实施方案中，宿主细胞含有包含针对以下编码的多核苷酸序列的载体：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:37中的任一种的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多核苷酸序列编码抗IL-2scFv，其中多核苷酸序列在SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35中列出。在一些实施方案中，载体包含编码抗IL-2scFv的分离的多核苷酸序列，其中多核苷酸序列在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35中列出。在一些实施方案中，宿主细胞含有包含编码抗IL-2scFv的分离的多核苷酸序列的载体，其中多核苷酸序列在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34或SEQ ID NO:35中列出。
在另一种实施方案中，本公开内容还提供了分离的抗IL-2抗体，其中所述抗体包含具有互补性决定区(CDR)1、CDR2和CDR3的重链可变区。在一种实施方案中，CDR1、CDR2和CDR3包含分别为SEQ ID NO:38-40；分别为SEQ ID NO:44-46；分别为SEQ ID NO:50-52；分别为SEQ ID NO:56-58；或分别为SEQ ID NO:62-64的氨基酸序列。在一种实施方案中，抗体可以是IgG、IgA、IgM、IgE、IgD、Fv、scFv、Fab、F(ab′)2、微抗体，双抗体、三抗体、纳米抗体或单结构域抗体。IgG可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一种实施方案中，本公开内容还涵盖包含上文提及的抗体和药学上可接受的载体的组合物。
在另一种实施方案中，本公开内容还提供了分离的抗IL-2抗体，其中所述抗体包含具有互补性决定区(CDR)1、CDR2和CDR3的轻链可变区。在一种实施方案中，CDR1、CDR2和CDR3包含分别为SEQ ID NO:41-43；分别为SEQ ID NO:47-49；分别为SEQ ID NO:53-55；分别为SEQ ID NO:59-61；或分别为SEQ ID NO:65-67的氨基酸序列。在一种实施方案中，抗体可以是IgG、IgA、IgM、IgE、IgD、Fv、scFv、Fab、F(ab′)2、微抗体，双抗体、三抗体、纳米抗体或单结构域抗体。IgG可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一种实施方案中，本公开内容还涵盖包含上文提及的抗体和药学上可接受的载体的组合物。
在另一种实施方案中，本公开内容还提供了分离的抗IL-2抗体，其中所述抗体包含具有互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3的重链可变区，以及具有CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区。在一种实施方案中，重链CDR1、CDR2和CDR3包含分别为SEQ ID NO:38-40；分别为SEQID NO:44-46；分别为SEQ ID NO:50-52；分别为SEQ ID NO:56-58；或分别为SEQ ID NO:62-64的氨基酸序列。在一种实施方案中，轻链CDR1、CDR2和CDR3包含分别为SEQ ID NO:41-43；分别为SEQ ID NO:47-49；分别为SEQ ID NO:53-55；分别为SEQ ID NO:59-61；或分别为SEQID NO:65-67的氨基酸序列。在一种实施方案中，抗体可以是IgG、IgA、IgM、IgE、IgD、Fv、scFv、Fab、F(ab′)2、微抗体，双抗体、三抗体、纳米抗体或单结构域抗体。IgG可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一种实施方案中，本公开内容还涵盖包含上文提及的抗体和药学上可接受的载体的组合物。
药物组合物
在一些实施方案中，本文公开了用于治疗用途的组合物。在一些实施方案中，本文描述的组合物包含如本文公开的抗IL-2抗体和药学上可接受的载体。
如本文使用的，术语“组合物”和“药物组合物”在一些实施方案中可以可互换地使用，其具有全部相同的性质和含义。在一些实施方案中，本文公开了用于治疗如本文描述的状况或疾病的药物组合物。
在一些实施方案中，本文公开了用于在组合疗法中使用的药物组合物。
在另一种实施方案中，本文公开了用于治疗受试者中的疾病或状况的组合物。在一些实施方案中，疾病包括病毒感染、细菌感染或癌症。在一些实施方案中，状况包括IL-2诱导的状况。在一些实施方案中，IL-2诱导的状况包括肺水肿或血管渗漏。
本文公开的VH多肽和/或VL多肽可以单独或与载体即药学上可接受的载体组合被施用至受试者(例如，人类或动物)。药学上可接受的意指不是生物学上或其他方面不合意的材料，即该材料可以被施用至受试者，而不引起任何不合意的生物学效应或以有害的方式与含有其的药物组合物的任何其他组分相互作用。如将对于本领域普通技术人员熟知的，载体被选择为使本文公开的多肽的任何降解最小化，并且使受试者的任何不良副作用最小化。药物组合物可以通过药学领域中熟知的方法来制备。
包含本文公开的多肽的上文的药物组合物可以取决于是否需要局部(local)治疗或全身治疗而以任何合适的方式施用(例如，施用至哺乳动物、细胞或组织)。例如，组合物可以被表面地(topically)(例如，眼部地、阴道地、直肠地、鼻内地、经皮地等)、口服地、通过吸入或肠胃外地(包括通过静脉内滴注或皮下、腔内地、腹腔内、皮内或肌肉内注射)施用。表面(topical)鼻内施用指的是通过一个或两个鼻孔将组合物递送到鼻和鼻道中。组合物可以通过喷雾机制或液滴机制或通过雾化递送。递送还可以经由插管引导到呼吸系统的任何区域(例如，肺)。可选择地，施用可以是瘤内的，例如局部或静脉内注射。
如果组合物将被肠胃外地施用，则施用通常通过注射。可注射剂(theinjectable)可以以常规形式作为液体溶液或悬浮液、适合于在注射之前在液体中悬浮的固体形式或作为乳液制备。另外，肠胃外施用可以涉及缓慢释放系统或持续释放系统的制备，以便维持恒定剂量。
在一些实施方案中，组合物包含抗IL-2抗体，该抗IL-2抗体包含具有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:36中的一种的序列的重链可变区。在一些实施方案中，组合物包含抗IL-2抗体，该抗IL-2抗体包含具有SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:37中的一种的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，组合物包含抗IL-2抗体，该抗IL-2抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区具有以下中的一种的序列：SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:12和SEQID NO:13；SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27；或SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37。在一些实施方案中，组合物包含抗IL-2抗体，该抗IL-2抗体包含重链可变结构域，所述重链可变结构域含有包含分别为SEQ ID NO:38-40；分别为SEQ ID NO:44-46；分别为SEQ ID NO:50-52；分别为SEQ ID NO:56-58；或分别为SEQ ID NO:62-64的氨基酸序列的CDR1区、CDR2区和CDR3区。在一些实施方案中，组合物包含抗IL-2抗体，该抗IL-2抗体包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域含有包含分别为SEQ ID NO:41-43；分别为SEQ ID NO:47-49；分别为SEQ ID NO:53-55；分别为SEQ ID NO:59-61；或分别为SEQ ID NO:65-67的氨基酸序列的CDR1区、CDR2区和CDR3区。在一些实施方案中，组合物包含抗IL-2抗体，该抗IL-2抗体包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域含有包含分别为SEQ ID NO:38-40；分别为SEQ ID NO:44-46；分别为SEQ ID NO:50-52；分别为SEQ ID NO:56-58；或分别为SEQ ID NO:62-64的氨基酸序列的CDR1区、CDR2区和CDR3区，所述轻链可变结构域含有包含分别为SEQ ID NO:41-43；分别为SEQ ID NO:47-49；分别为SEQ ID NO:53-55；分别为SEQID NO:59-61；或分别为SEQ ID NO:65-67的氨基酸序列的CDR1区、CDR2区和CDR3区。
在一些实施方案中，组合物包含抗IL-2抗体，该抗IL-2抗体包含克隆BDG 17.014、BDG 17.023、BDG 17.038、BDG 17.043、BDG 17.053、BDG 17.054、BDG 17.066、BDG 17.067和BDG 17.069中的任一种。在一些实施方案中，组合物包含抗IL-2抗体，该抗IL-2抗体包含抗IL-2克隆BDG 17.014。在一些实施方案中，组合物包含抗IL-2抗体，该抗IL-2抗体包含抗IL-2克隆BDG 17.023。在一些实施方案中，组合物包含抗IL-2抗体，该抗IL-2抗体包含抗IL-2克隆BDG 17.038。在一些实施方案中，组合物包含抗IL-2抗体，该抗IL-2抗体包含抗IL-2克隆BDG 17.043。在一些实施方案中，组合物包含抗IL-2抗体，该抗IL-2抗体包含抗IL-2克隆BDG 17.053。在一些实施方案中，组合物包含抗IL-2抗体，该抗IL-2抗体包含抗IL-2克隆BDG 17.054。在一些实施方案中，组合物包含抗IL-2抗体，该抗IL-2抗体包含抗IL-2克隆BDG 17.066。在一些实施方案中，组合物包含抗IL-2抗体，该抗IL-2抗体包含抗IL-2克隆BDG 17.067。在一些实施方案中，组合物包含抗IL-2抗体，该抗IL-2抗体包含抗IL-2克隆BDG 17.069。
在一些实施方案中，组合物包含抗IL2抗体和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，组合物包含抗IL2抗体和IL-2以及药学上可接受的载体。在一些实施方案中，组合物包含与IL-2复合的抗IL-2抗体和药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，抗IL-2抗体和IL-2包含在同一组合物中。在一些实施方案中，抗IL-2抗体和IL-2包含在不同的组合物中。在一些实施方案中，施用抗IL-2抗体和IL-2或其组合物的组合是同时的。在一些实施方案中，施用抗IL-2抗体和IL-2或其组合物的组合包括在IL-2或其组合物之前施用抗IL-2抗体或其组合物。在一些实施方案中，施用抗IL-2抗体和IL-2或其组合物的组合包括在施用IL-2或其组合物之后施用抗IL-2抗体或其组合物。
技术人员将理解，“药物组合物”可以涵盖本文描述的一种或更多种活性成分与其他化学组分诸如生理学上合适的载体和赋形剂的制品。药物组合物的目的是促进将活性剂，例如但不限于抗体或化合物施用到生物体。
在一些实施方案中，本文公开了用于在治疗具有减弱的免疫系统的受试者中使用的疗法的药物组合物。在一些实施方案中，本文公开了用于在治疗患有病毒感染、细菌感染或癌症的受试者中使用的疗法的药物组合物。在一些实施方案中，本文公开了用作用于治疗具有减弱的免疫系统的受试者的组合疗法的一部分的药物组合物。在一些实施方案中，本文公开了用作用于治疗患有病毒感染、细菌感染或癌症的受试者的组合疗法的一部分的药物组合物。
技术人员将理解，可以可互换地使用的短语“生理学上可接受的载体”、“药学上可接受的载体”、“生理学上可接受的赋形剂”和“药学上可接受的赋形剂”，其可以涵盖不对生物体造成显著刺激且不消除所施用的活性成分的生物学活性和特性的载体、赋形剂或稀释剂。
技术人员将理解，“赋形剂”可以涵盖添加到药物组合物以进一步促进活性成分的施用的惰性物质。在一些实施方案中，赋形剂包括碳酸钙、磷酸钙、多种糖和多种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
用于药物的配制和施用的技术可见于"Remington’s PharmaceuticalSciences,"Mack Publishing Co.,Easton,PA,最新版本，其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，如本文公开的组合物包括治疗组合物。在一些实施方案中，如本文公开的组合物包括治疗效力。
组合疗法
在一些实施方案中，抗IL-2抗体或其组合物与免疫检查点抑制剂组合使用。在一些实施方案中，术语“免疫检查点抑制剂”可以涵盖能够抑制检查点蛋白的功能的任何化合物或分子。在一些实施方案中，术语“免疫检查点抑制剂”可以涵盖靶向免疫检查点蛋白的任何化合物或分子。技术人员将理解，“免疫检查点”是免疫系统的关键调节物，当受到刺激时，其可以抑制对免疫刺激的免疫应答。检查点抑制剂可以阻断抑制性检查点，并且从而恢复免疫系统功能。在一些实施方案中，一种或更多种检查点抑制剂包括免疫检查点抑制剂。
技术人员将理解，术语“免疫检查点抑制剂”(ICI)、“检查点抑制剂”等可以在本文中可互换地使用，其具有全部相同的性质和含义，其中免疫检查点抑制剂涵盖抑制免疫系统的活性或控制免疫系统的机制的化合物。免疫系统检查点或免疫检查点是免疫系统中的抑制性途径，该抑制性途径通常起作用以维持自身耐受性或调节生理免疫应答的持续时间和幅度，以使附带的组织损伤最小化。检查点抑制剂可以通过抑制途径中蛋白的活性来抑制免疫系统检查点。
免疫检查点抑制剂靶包括但不限于PD-1、PDL-1、CTLA-4、TIGIT、TIM-3、B7-H3、CD73、LAG3、CD27、CD70、4-1BB、GITR、OX40、SIRP-α(CD47)、CD39、ILDR2、VISTA、BTLA和VTCN-1在一些实施方案中，抗IL-2抗体疗法与免疫检查点抑制剂组合使用，其中免疫检查点抑制剂的靶包括PD-1、PDL-1、CTLA-4、TIGIT、TIM-3、B7-H3、CD73、LAG3、CD27、CD70、4-1BB、GITR、OX40、SIRP-α(CD47)、CD39、ILDR2、VISTA、BTLA或VTCN-1或其任何组合。
检查点抑制剂可以包括抗体或其抗原结合片段、其他结合蛋白、生物治疗剂或小分子，其结合并阻断或抑制PD-1、PDL-1、CTLA-4、TIGIT、TIM-3、B7-H3、CD73、LAG3、CD27、CD70、4-1BB、GITR、OX40、SIRP-α(CD47)、CD39、ILDR2、VISTA、BTLA或VTCN-1中的一种或更多种的活性。说明性检查点抑制剂包括但不限于以下表1中列出的那些。
表1：检查点抑制剂和免疫检查点抑制剂靶的非限制性实例.
Figure BDA0003892191780000341
Figure BDA0003892191780000351
在一些实施方案中，检查点抑制剂包括PD-1抑制剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂包括PDL-1抑制剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂包括CTLA-4抑制剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂包括TIGIT抑制剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂包括TIM-3抑制剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂包括B7-H3抑制剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂包括CD73抑制剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂包括LAG3抑制剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂包括CD27抑制剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂包括CD70抑制剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂包括4-1BB激动剂结合物。在一些实施方案中，检查点抑制剂包括GITR激动剂结合物。在一些实施方案中，检查点抑制剂包括OX40激动剂结合物。在一些实施方案中，检查点抑制剂包括SIRP-α(CD47)抑制剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂包括CD39抑制剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂包括ILDR2抑制剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂包括VISTA抑制剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂包括BTLA抑制剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂包括VTCN-1抑制剂。
在一些实施方案中，检查点抑制剂包括PD-1抑制剂、PDL-1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIGIT抑制剂、TIM-3抑制剂、B7-H3抑制剂、CD73抑制剂、LAG3抑制剂、CD27抑制剂、CD70抑制剂、4-1BB抑制剂、GITR抑制剂、OX40抑制剂、SIRP-α(CD47)抑制剂、CD39抑制剂、ILDR2抑制剂、VISTA抑制剂、BTLA抑制剂、VTCN-1抑制剂的组合。在一些实施方案中，检查点抑制剂包括至少两种检查点抑制剂，所述至少两种检查点抑制剂选自PD-1抑制剂、PDL-1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIGIT抑制剂、TIM-3抑制剂、B7-H3抑制剂、CD73抑制剂、LAG3抑制剂、CD27抑制剂、CD70抑制剂、4-1BB抑制剂、GITR抑制剂、OX40抑制剂、SIRP-α(CD47)抑制剂、CD39抑制剂、ILDR2抑制剂、VISTA抑制剂、BTLA抑制剂和VTCN-1抑制剂。
在一些实施方案中，如本文描述的用于在组合疗法中使用的药物组合物包含有效量的如本文描述的检查点抑制剂和药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，本文公开的组合物包含检查点抑制剂和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，本文公开的组合物包含检查点抑制剂和药学上可接受的载体的组合。在一些实施方案中，组合物包含检查点抑制剂，该检查点抑制剂包括PD-1抑制剂、PDL-1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIGIT抑制剂、TIM-3抑制剂、B7-H3抑制剂、CD73抑制剂、LAG3抑制剂、CD27抑制剂、CD70抑制剂、4-1BB抑制剂、GITR抑制剂、OX40抑制剂、SIRP-α(CD47)抑制剂、CD39抑制剂、ILDR2抑制剂、VISTA抑制剂、BTLA抑制剂、VTCN-1抑制剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂包括至少两种检查点抑制剂和药学上可接受的载体，所述至少两种检查点抑制剂选自PD-1抑制剂、PDL-1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIGIT抑制剂、TIM-3抑制剂、B7-H3抑制剂、CD73抑制剂、LAG3抑制剂、CD27抑制剂、CD70抑制剂、4-1BB抑制剂、GITR抑制剂、OX40抑制剂、SIRP-α(CD47)抑制剂、CD39抑制剂、ILDR2抑制剂、VISTA抑制剂、BTLA抑制剂或VTCN-1抑制剂。在一些实施方案中，组合物包含至少两种检查点抑制剂，所述至少两种检查点抑制剂选自PD-1抑制剂、PDL-1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIGIT抑制剂、TIM-3抑制剂、B7-H3抑制剂、CD73抑制剂、LAG3抑制剂、CD27抑制剂、CD70抑制剂、4-1BB抑制剂、GITR抑制剂、OX40抑制剂、SIRP-α(CD47)抑制剂、CD39抑制剂、ILDR2抑制剂、VISTA抑制剂、BTLA抑制剂、VTCN-1抑制剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂包括至少两种检查点抑制剂和药学上可接受的载体，所述至少两种检查点抑制剂选自PD-1抑制剂、PDL-1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIGIT抑制剂、TIM-3抑制剂、B7-H3抑制剂、CD73抑制剂、LAG3抑制剂、CD27抑制剂、CD70抑制剂、4-1BB抑制剂、GITR抑制剂、OX40抑制剂、SIRP-α(CD47)抑制剂、CD39抑制剂、ILDR2抑制剂、VISTA抑制剂、BTLA抑制剂和VTCN-1抑制剂。
在某些实施方案中，当多于一种检查点抑制剂在本文描述的治疗方法中使用时，每种检查点抑制剂包含在单独的组合物内。在某些实施方案中，当多于一种检查点抑制剂在本文描述的治疗方法中使用时，检查点抑制剂可以包含在同一组合物内。
在一些实施方案中，组合疗法包括使用如本文描述的抗IL-2抗体或其组合物，以及检查点抑制剂或其组合物。在一些实施方案中，组合疗法包括使用如本文描述的抗IL-2抗体或其组合物和IL-2，以及检查点抑制剂或其组合物。在一些实施方案中，组合疗法包括使用如本文描述的与IL-2复合的抗IL-2抗体或其组合物，以及检查点抑制剂或其组合物。
在一些实施方案中，组合疗法包括使用如本文描述的抗IL-2抗体或其组合物，以及至少两种检查点抑制剂或其组合物。在一些实施方案中，组合疗法包括使用如本文描述的抗IL-2抗体或其组合物和IL-2，以及至少两种检查点抑制剂或其组合物。在一些实施方案中，组合疗法包括使用如本文描述的与IL-2复合的抗IL-2抗体或其组合物，以及至少两种检查点抑制剂或其组合物。
在一些实施方案中，组合疗法包括第二组合物，该第二组合物包含如本文描述的一种或更多种检查点抑制剂。
在组合疗法的一些实施方案中，抗IL-2抗体和IL-2作为检查点抑制剂包含在同一组合物中。在一些实施方案中，抗IL-2抗体和IL-2包含在彼此不同且与检查点抑制剂不同的组合物中。
在组合疗法的一些实施方案中，抗IL-2抗体或其组合物以及检查点抑制剂或其组合物的施用顺序可以是任何顺序。在组合疗法的一些实施方案中，抗IL-2抗体或其组合物、IL-2或其组合物以及检查点抑制剂或其组合物的施用顺序可以是任何顺序。例如但不限于抗IL-2抗体可以在施用检查点抑制剂之前、同时或之后施用。类似地，抗IL-2抗体和IL-2的组合可以在施用检查点抑制剂之前、同时或之后施用。在一些实施方案中，抗IL-2抗体可以在施用至少两种检查点抑制剂之前、同时或之后施用。类似地，抗IL-2抗体和IL-2的组合可以在施用至少两种检查点抑制剂之前、同时或之后施用。
在一些实施方案中，施用组合疗法与检查点抑制剂包括同时施用抗IL-2抗体或其组合物以及检查点抑制剂。在一些实施方案中，施用组合疗法与检查点抑制剂包括同时施用抗IL-2抗体和IL-2或其组合物以及检查点抑制剂。在一些实施方案中，施用组合疗法与检查点抑制剂包括在检查点抑制剂之前预先施用抗IL-2抗体或其组合物。在一些实施方案中，施用组合疗法与检查点抑制剂包括在检查点抑制剂之前预先施用抗IL-2抗体和IL-2或其组合物。在一些实施方案中，施用组合疗法与检查点抑制剂包括在施用检查点抑制剂之后抗IL-2抗体或其组合物的在后施用。在一些实施方案中，施用组合疗法与检查点抑制剂包括在施用检查点抑制剂之后抗IL-2抗体和IL-2或其组合物的在后施用。
在一些实施方案中，组合疗法包括使用检查点抑制剂和抗IL-2抗体，该抗IL-2抗体包含具有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:36中的一种的序列的重链可变区。在一些实施方案中，组合疗法包括使用检查点抑制剂和抗IL-2抗体，该抗IL-2抗体包含具有SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:37中的一种的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，组合疗法包括使用检查点抑制剂和抗IL-2抗体，该抗IL-2抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区具有以下中的一种的序列：SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13；SEQ IDNO:14和SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19；SEQID NO:20和SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27；或SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37。在一些实施方案中，组合疗法包括使用检查点抑制剂和抗IL-2抗体，该抗IL-2抗体包含重链可变结构域，所述重链可变结构域含有包含分别为SEQ ID NO:38-40；分别为SEQ ID NO:44-46；分别为SEQ IDNO:50-52；分别为SEQ ID NO:56-58；或分别为SEQ ID NO:62-64的氨基酸序列的CDR1区、CDR2区和CDR3区。在一些实施方案中，组合疗法包括使用检查点抑制剂和抗IL-2抗体，该抗IL-2抗体包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域含有包含分别为SEQ ID NO:41-43；分别为SEQ ID NO:47-49；分别为SEQ ID NO:53-55；分别为SEQ ID NO:59-61；或分别为SEQID NO:65-67的氨基酸序列的CDR1区、CDR2区和CDR3区。在一些实施方案中，组合疗法包括使用检查点抑制剂和抗IL-2抗体，该抗IL-2抗体包含重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构含有域包含分别为SEQ ID NO:38-40；分别为SEQ ID NO:44-46；分别为SEQ ID NO:50-52；分别为SEQ ID NO:56-58；或分别为SEQ ID NO:62-64的氨基酸序列的CDR1区、CDR2区和CDR3区，所述轻链可变结构域含有包含分别为SEQ ID NO:41-43；分别为SEQ ID NO:47-49；分别为SEQ ID NO:53-55；分别为SEQ ID NO:59-61；或分别为SEQ IDNO:65-67的氨基酸序列的CDR1区、CDR2区和CDR3区。
在一些实施方案中，组合疗法包括使用检查点抑制剂和抗IL-2抗体，该抗IL-2抗体包含克隆BDG 17.014、BDG 17.023、BDG 17.038、BDG 17.043、BDG 17.053、BDG 17.054、BDG 17.066、BDG 17.067和BDG 17.069中的任一种。在一些实施方案中，组合疗法包括使用检查点抑制剂和抗IL-2抗体，该抗IL-2抗体包含抗IL-2克隆BDG 17.014。在一些实施方案中，组合疗法包括使用检查点抑制剂和抗IL-2抗体，该抗IL-2抗体包含抗IL-2克隆BDG17.023。在一些实施方案中，组合疗法包括使用检查点抑制剂和抗IL-2抗体，该抗IL-2抗体包含抗IL-2克隆BDG 17.038。在一些实施方案中，组合疗法包括使用检查点抑制剂和抗IL-2抗体，该抗IL-2抗体包含抗IL-2克隆BDG 17.043。在一些实施方案中，组合疗法包括使用检查点抑制剂和抗IL-2抗体，该抗IL-2抗体包含抗IL-2克隆BDG 17.053。在一些实施方案中，组合疗法包括使用检查点抑制剂和抗IL-2抗体，该抗IL-2抗体包含抗IL-2克隆BDG17.054。在一些实施方案中，组合疗法包括使用检查点抑制剂和抗IL-2抗体，该抗IL-2抗体包含抗IL-2克隆BDG 17.066。在一些实施方案中，组合疗法包括使用检查点抑制剂和抗IL-2抗体，该抗IL-2抗体包含抗IL-2克隆BDG 17.067。在一些实施方案中，组合疗法包括使用检查点抑制剂和抗IL-2抗体，该抗IL-2抗体包含抗IL-2克隆BDG 17.069。
制剂
本文公开的包含抗IL-2抗体、或抗IL-2抗体和IL-2的组合、或检查点抑制剂的药物组合物可以方便地作为无菌液体制品提供，所述无菌液体制品例如等渗水性溶液、悬浮液、乳液、分散体或粘性组合物，它们可以被缓冲至选定的pH。液体制品通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物稍微更便于施用，尤其是通过注射。另一方面，粘性组合物可以在适当的粘度范围内配制，以提供与特定组织更长的接触期。液体组合物或粘性组合物可以包含载体，该载体可以是溶剂或分散介质，该溶剂或分散介质包含例如水、盐水、磷酸缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。
无菌可注射溶液可以根据需要通过将本文描述且用于实践本文公开的方法的抗IL-2抗体、或抗IL-2抗体和IL-2的组合、或检查点抑制剂并入所需量的适当溶剂和多种量的其他成分中来制备。这样的制剂可以与合适的载体、稀释剂或赋形剂诸如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等混合。制剂也可以被冻干。制剂可以包含辅助物质诸如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如，甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝添加剂或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂、着色剂等，这取决于施用途径和期望的制品。可以参考标准教科书，诸如通过引用并入本文的"REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE",第17版,1985，来制备合适的制品，而无需过度实验。
可以添加多种增强制剂的稳定性和无菌性的添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲液。防止微生物的作用可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来确保。可注射的药物形式的延长的吸收可以通过使用延迟吸收的剂例如单硬脂酸铝和明胶来产生。
在某些实施方案中，术语“药物组合物”、“组合物”和“制剂”可以可互换地使用，其具有相同的含义和性质。
本文描述的组合物或制剂可以是等渗的，即它们可以具有与血液和泪液相同的渗透压。如本文公开的组合物的期望的等渗性可以使用氯化钠或其他药学上可接受的剂诸如右旋糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇或其他无机或有机溶质来实现。对于含有钠离子的缓冲液，氯化钠可以是优选的。
如果需要，可以使用药学上可接受的增稠剂将组合物的粘度保持在选定的水平。甲基纤维素可以是优选的，因为它容易且经济地可获得并且易于使用。
其他合适的增稠剂包括例如黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。增稠剂的优选的浓度将取决于所选定的剂。重点是使用将达到所选定的粘度的量。明显地，合适的载体和其他添加剂的选择将取决于确切的施用途径和特定剂型的性质，例如液体剂型(例如，组合物是被配制成溶液、悬浮液、凝胶还是另一种液体形式，诸如定时释放形式或液体填充形式)。
在一些实施方案中，组合物被配制成pH在约pH 5.0-6.0之间。在一些实施方案中，组合物被配制成pH在约pH 5.0-7.0之间。在一些实施方案中，组合物被配制成pH在约pH5.0-6.5之间。在一些实施方案中，组合物被配制成pH在约pH 5.0-5.5之间。在一些实施方案中，组合物被配制成pH在约pH 5.5-6.0之间。在一些实施方案中，组合物被配制成pH在约pH 5.5-6.5之间。在一些实施方案中，组合物被配制成pH在约pH 5.0。在一些实施方案中，组合物被配制成pH在约pH 5.5。在一些实施方案中，组合物被配制成pH在约pH 6.0。在一些实施方案中，组合物被配制成pH在约pH 6.5。
在一些实施方案中，组合物被配制成pH在约pH 5.0-6.0之间，并且包含缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液包括药学上可接受的缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液包括组氨酸缓冲液或柠檬酸盐缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液包括组氨酸缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液包括柠檬酸盐缓冲液。
在一些实施方案中，组合物被配制成pH在约pH 5.0-6.0之间，并且包含选自组氨酸缓冲液和柠檬酸盐缓冲液的缓冲液。在一些实施方案中，组合物被配制成pH在约pH 5.0-6.0之间，并且包含组氨酸缓冲液。在一些实施方案中，组合物被配制成pH在约pH 5.0-6.0之间，并且包含柠檬酸盐缓冲液。
在一些实施方案中，组合物还包含蔗糖、甲硫氨酸或PS80中的至少一种或其任何组合。在一些实施方案中，组合物还包含蔗糖。在一些实施方案中，组合物还包含甲硫氨酸。在一些实施方案中，组合物还包含PS80。
在一些实施方案中，组合物包含如本文公开的抗IL-2抗体，并且被配制成pH在约pH 5.0-6.0之间，并包含选自组氨酸缓冲液和柠檬酸盐缓冲液的缓冲液。在一些实施方案中，组合物还包含IL-2。
本领域技术人员将认识到，组合物或制剂的组分应被选择为化学惰性的并且将不影响如本文描述的早期凋亡细胞群体的存活力或效力，以用于在本文公开的方法中使用。从本公开内容和本文引用的文件来看，对于化学和制药原理领域的技术人员来说，这将不会存在问题，或者问题可以通过参考标准教科书或通过简单实验(不涉及过度实验)容易地避免。
使用方法
在一种实施方案中，本公开内容提供了产生抗IL-2抗体的重链可变区的方法，该方法包括在有利于表达编码重链可变区的载体的条件下培养宿主细胞，从而产生抗IL-2抗体的重链可变区的步骤。
在一种实施方案中，本公开内容提供了产生抗IL-2抗体的轻链可变区的方法，该方法包括在有利于表达编码轻链可变区的载体的条件下培养宿主细胞，从而产生抗IL-2抗体的轻链可变区的步骤。
本文公开的VH多肽和/或VL多肽可以在治疗方法中使用。在一种实施方案中，本公开内容的多肽可以被用作免疫治疗剂，例如用于如本文描述的免疫细胞的差异活化。本发明的多肽可以直接或通过向受试者施用编码多肽的核酸序列施用至受试者，这样的核酸序列可以由载体携带。
引发期望的效果所需的本发明的多肽或其组合物的确切的量将随受试者不同而变化，这取决于受试者的物种、年龄、性别、体重和一般状况、特定的多肽、施用途径、以及方案中是否包括其他药物。因此，不可能为每种组合物指定确切的量。然而，适当的量可以由本领域普通技术人员使用常规实验来确定。剂量可以变化，并且多肽可以以每天一剂或更多剂(例如，两剂或更多剂、三剂或更多剂、四剂或更多剂、或五剂或更多剂)施用，持续一天或更多天。针对抗体选择适当的剂量的指导可以在文献中容易地找到。
在本文描述的抗IL-2抗体的使用方法的一些实施方案中，受试者包括哺乳动物受试者。在一些实施方案中，受试者包括人类受试者。在一些实施方案中，受试者患有免疫缺陷问题。在一些实施方案中，免疫缺陷受试者的治疗将包括预防性治疗。
在一种实施方案中，本公开内容提供了一种促进受试者中免疫细胞的差异生长的方法，该方法包括制备包含本文公开的抗IL-2抗体的组合物，并且向受试者施用该组合物，从而促进受试者中免疫细胞的差异生长的步骤。在一种实施方案中，本公开内容提供了一种促进受试者中免疫细胞的差异生长的方法，该方法包括制备包含IL-2和本文公开的抗IL-2抗体的组合物，并且向受试者施用该组合物，从而促进受试者中免疫细胞的差异生长的步骤。在一种实施方案中，受试者可以是动物或人类。在一种实施方案中，免疫细胞可以是CD8+细胞或NK细胞。
在一些实施方案中，本文公开了一种治疗受试者中的疾病或状况的方法，该方法包括向受试者施用包含如本文公开的抗IL-2抗体的组合物的步骤，其中所述抗体促进免疫细胞亚群的差异生长并且减少由IL-2引起的不合意的影响，从而治疗所述受试者中的所述疾病或状况。在一些实施方案中，此处公开的治疗疾病的方法包括使用包含抗IL-2抗体和IL-2、或与IL-2复合的抗IL-2抗体的组合物。在一些实施方案中，治疗疾病的方法包括治疗病毒感染、细菌感染或癌症。在一些实施方案中，治疗状况的方法包括治疗弱免疫系统，并且治疗预防性地增强免疫系统。
在治疗疾病或状况的方法的一些实施方案中，状况包括增加所述受试者中癌症的可能性的遗传易感性。在一些实施方案中，遗传易感性包括基因产物的表达或活性的改变。在一些实施方案中，增加癌症的可能性的遗传易感性包括肿瘤抑制基因或错配修复(MMR)基因的突变或其组合。
许多遗传性癌症是本领域已知的，非限制性实例包括但不限于遗传性乳腺癌和卵巢癌(HBOC)综合征、林奇综合征(Lynch syndrome)(遗传性非息肉病性结肠直肠癌)和利-弗劳梅尼综合征(Li-Fraumeni syndrome)。
在一些实施方案中，遗传易感性增加HBOC的可能性。HBOC与BRAC1基因和BRAC2基因的突变相关。HBOC与许多不同的癌症相关，所述癌症不仅仅是乳腺癌，包括但不限于输卵管癌、原发性腹膜癌、男性乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌。在一些实施方案中，遗传易感性增加乳腺癌、卵巢癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、男性乳腺癌、胰腺癌或前列腺癌中的任一种或其组合的可能性。
在一些实施方案中，遗传易感性增加遗传性非息肉病性结肠直肠癌(HNPCC)的可能性。HNPCC与基因的突变相关，所述基因包括但不限于MLH1、MSH2、MSH6、PMS1和PMS2。HNPCC与发展成子宫内膜癌以及卵巢癌、胃癌、小肠癌、胰腺癌、肾癌、脑癌、输尿管癌和胆管癌的高风险相关。在一些实施方案中，遗传易感性增加遗传性非息肉病性结肠直肠癌、卵巢癌、胃癌、小肠癌、胰腺癌、肾癌、脑癌、输尿管癌和胆管癌中的任一种的可能性。
在一些实施方案中，遗传易感性增加利-弗劳梅尼综合征的可能性。利-弗劳梅尼综合征与基因的突变相关，所述基因包括但不限于TP53和CHEK2或其组合。利-弗劳梅尼综合征与癌症相关，所述癌症包括肉瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤、白血病、脑(中枢神经系统)癌、肾上腺皮质癌和乳腺癌或其组合。在一些实施方案中，遗传易感性增加肉瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤、白血病、脑(中枢神经系统)癌、肾上腺皮质癌和乳腺癌中的任一种或其组合的可能性。
在一些实施方案中，在受试者中被治疗的状况包括治疗具有遗传易感性的受试者，该遗传易感性包括基因产物的表达或活性的改变，所述基因包括BRCA1、BRAC2、MLH1、MSH2、MSH6、PMS1、PMS2、TP53或CHEK2或其组合。
如本文描述的，IL-2和所公开的抗IL-2抗体的复合物在诱导记忆表型效应T细胞(MP)CD8+细胞和NK细胞的增殖方面表现出明显的效果，而对CD4+Treg存在小得多的影响。因此，本文公开的工程化抗IL-2抗体将可用于调节免疫细胞群体并诱导某些免疫效应细胞的差异扩增。在一种实施方案中，免疫效应细胞的这样的差异扩增将导致免疫系统的稳健活化，并且可用于肿瘤的治疗。在一些实施方案中，治疗包括治疗实体瘤。在一些实施方案中，治疗包括治疗非实体瘤。在一些实施方案中，治疗包括治疗实体瘤和/或非实体瘤，诸如但不限于黑色素瘤、肾细胞癌、小细胞肺癌或其他癌症状况。在另一种实施方案中，本文公开的方法将可用于治疗病毒感染或细菌感染。在另一种实施方案中，本文公开的方法将可用于治疗或预防由IL-2与内皮CD25表达细胞结合引起的状况，例如肺水肿或IL-2诱导的血管渗漏。
在治疗疾病或状况的方法的一些实施方案中，表现出差异生长的免疫细胞包括幼稚T细胞、记忆T细胞、CD8+T细胞、NK细胞或自然杀伤T细胞中的一种或更多种。在治疗疾病或状况的方法的一些实施方案中，由IL-2引起的不合意的影响包括调节性T细胞的活化、CD25+T效应细胞的凋亡、IL-2诱导的肺水肿、IL-2诱导的肺炎或IL-2诱导的血管渗漏中的一种或更多种。在治疗疾病或状况的方法的一些实施方案中，本文公开的抗IL-2抗体抑制IL-2与CD25的结合。
在一些实施方案中，癌症的治疗包括维持治疗。在一些实施方案中，施用维持治疗以维持不存在癌症或肿瘤。在一些实施方案中，施用维持治疗以维持不存在癌症或肿瘤的转移。在一些实施方案中，施用维持治疗以抑制癌症或肿瘤的转移。在一些实施方案中，施用维持治疗以维持不存在癌症或肿瘤的生长。在一些实施方案中，施用维持治疗以抑制癌症或肿瘤的生长。
在一些实施方案中，癌症的治疗包括预防性治疗，例如但不限于携带具有发展成癌症的高风险的一种或更多种遗传标志物的受试者。在一些实施方案中，遗传标志物包括BRCA1基因的突变。
在促进受试者中免疫细胞的差异生长的方法的一些实施方案中，该方法包括制备和施用包含本文公开的抗IL-2抗体的组合物的步骤。
在促进受试者中免疫细胞的差异生长的方法的一些实施方案中，该方法包括制备和施用包含IL-2和本文公开的抗IL-2抗体的组合物的步骤，施用抗IL-2抗体和IL-2或其组合物的组合是同时的。在促进受试者中免疫细胞的差异生长的方法的一些实施方案中，该方法包括制备和施用包含IL-2和抗IL-2抗体的组合物的步骤，施用抗IL-2抗体和IL-2或其组合物包括在IL-2或其组合物之前施用抗IL-2抗体或其组合物。在促进受试者中免疫细胞的差异生长的方法的一些实施方案中，该方法包括制备和施用包含IL-2和抗IL-2抗体的组合物的步骤，施用抗IL-2抗体和IL-2或其组合物包括在施用IL-2或其组合物之后施用抗IL-2抗体或其组合物。
在一些实施方案中，本公开内容提供了一种通过诱导免疫细胞的差异生长来治疗患有疾病或状况的受试者的方法。在一种实施方案中，疾病可以是病毒感染、细菌感染或癌症。在一种实施方案中，状况可以是IL-2诱导的肺水肿或IL-2诱导的血管渗漏。该方法包括以下步骤：
(a)制备包含如本文公开的抗IL-2抗体的组合物；以及
(b)向受试者施用来自(a)的组合物，从而通过受试者中免疫细胞的差异生长来治疗受试者。在某些实施方案中，本文公开的任何工程化抗IL-2抗体可以在如所描述的治疗方法中使用。
在一些实施方案中，本公开内容提供了一种通过诱导免疫细胞的差异生长来治疗患有疾病或状况的受试者的方法。在一种实施方案中，疾病可以是病毒感染、细菌感染或癌症。在一种实施方案中，状况可以是IL-2诱导的肺水肿或IL-2诱导的血管渗漏。该方法包括以下步骤：
(a)制备包含IL-2和如本文公开的抗IL-2抗体的组合物；以及
(b)向受试者施用来自(a)的组合物，从而通过受试者中免疫细胞的差异生长来治疗受试者。除了促进免疫效应细胞亚群的扩增之外，抗体/IL-2复合物还将减少由IL-2引起的不合意的影响(例如，IL-2诱导的肺水肿或IL-2诱导的血管渗漏)。在一种实施方案中，受试者可以是动物或人类。在某些实施方案中，本文公开的任何工程化抗IL-2抗体可以在如所描述的治疗方法中使用。
在一种实施方案中，本公开内容提供了一种治疗受试者(例如，动物或人类)中的疾病或状况的方法，该方法包括向受试者施用包含抗IL-2抗体的组合物的步骤，其中所述抗体促进免疫细胞亚群的扩增并减少由IL-2引起的不合意的影响，从而治疗受试者中的疾病或状况。在治疗受试者中的疾病或状况的方法的一些实施方案中，该方法包括制备和施用包含本文公开的抗IL-2抗体的组合物，以及施用包含抗IL-2抗体的组合物的步骤。在一种实施方案中，组合物包含IL-2和如本文公开的抗IL-2抗体，或者组合物包含与IL-2复合的抗IL-2抗体。
在治疗受试者中的疾病或状况的方法的一些实施方案中，该方法包括制备和施用包含IL-2和本文公开的抗IL-2抗体的组合物的步骤，施用抗IL-2抗体和IL-2或其组合物的组合是同时的。在治疗受试者中的疾病或状况的方法的一些实施方案中，该方法包括制备和施用包含IL-2和抗IL-2抗体的组合物的步骤，施用抗IL-2抗体和IL-2或其组合物包括在IL-2或其组合物之前施用抗IL-2抗体或其组合物。在治疗受试者中的疾病或状况的方法的一些实施方案中，该方法包括制备和施用包含IL-2和抗IL-2抗体的组合物的步骤，施用抗IL-2抗体和IL-2或其组合物包括在施用IL-2或其组合物之后施用抗IL-2抗体或其组合物。
在一种实施方案中，治疗方法对于治疗状况诸如IL-2诱导的肺水肿或IL-2诱导的血管渗漏将是有效的。在另一种实施方案中，治疗方法对于治疗由病毒感染或细菌感染引起的肺水肿(轻度或慢性)将是有效的。
在一种实施方案中，疾病可以是病毒感染、细菌感染、癌症、自身免疫性疾病或免疫紊乱。在一种实施方案中，疾病可以是上呼吸道病毒感染、早期肺感染或晚期肺感染。已知许多疾病和癌症由病毒引起。致病病毒的实例包括但不限于诺如病毒，轮状病毒，甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒或戊型肝炎病毒，狂犬病毒，西尼罗河病毒，肠道病毒，埃可病毒，柯萨奇病毒，单纯疱疹病毒(HSV)，HSV-2，水痘-带状疱疹病毒，蚊媒病毒，虫媒病毒，圣路易斯脑炎病毒，加利福尼亚脑炎病毒，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒，人类免疫缺陷病毒(HIV)，脊髓灰质炎病毒，寨卡病毒，风疹病毒，巨细胞病毒，人类乳头瘤病毒(HPV)，肠道病毒D68，严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒，中东呼吸综合征冠状病毒，SARS冠状病毒2，爱泼斯坦-巴尔病毒，流感病毒，呼吸道合胞病毒，多瘤病毒(诸如JC病毒、BK病毒)，埃博拉病毒，登革热病毒，或其任何组合。在一种实施方案中，病毒感染由SARS CoV-2引起。在另一种实施方案中，癌症可以是但不限于黑色素瘤或肾细胞癌。
在一种实施方案中，通过用抗IL-2抗体治疗而扩增的免疫细胞包括幼稚T细胞、记忆T细胞、CD8+T细胞、NK细胞和自然杀伤T细胞中的一种或更多种。在一种实施方案中，用抗IL-2抗体治疗将减少由IL-2引起的一种或更多种不合意的影响，诸如调节性T细胞的活化、CD25+T效应细胞的凋亡、肺水肿、肺炎和IL-2诱导的血管渗漏。
在一种实施方案中，在上文方法中施用的抗IL-2抗体是可以抑制IL-2与CD25结合的工程化或修饰的抗IL-2抗体。在一些实施方案中，工程化或修饰的抗IL-2抗体包含具有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:36中的一种的序列的重链可变区。在一些实施方案中，工程化或修饰的抗IL-2抗体包含具有SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:37中的一种的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，工程化或修饰的抗IL-2抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区具有以下中的一种的序列：SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:18和SEQ IDNO:19；SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24和SEQID NO:25；SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27；或SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37。
在另一种实施方案中，工程化或修饰的抗IL-2抗体包含具有互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3的重链可变区。在一种实施方案中，重链CDR1、CDR2和CDR3包含分别为SEQ IDNO:38-40；分别为SEQ ID NO:44-46；分别为SEQ ID NO:50-52；分别为SEQ ID NO:56-58；或分别为SEQ ID NO:62-64的氨基酸序列。
在另一种实施方案中，工程化或修饰的抗IL-2抗体包含具有互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3的轻链可变区。在一种实施方案中，轻链CDR1、CDR2和CDR3包含分别为SEQ IDNO:41-43；分别为SEQ ID NO:47-49；分别为SEQ ID NO:53-55；分别为SEQ ID NO:59-61；或分别为SEQ ID NO:65-67的氨基酸序列。
在一些实施方案中，工程化抗IL-2抗体可以是IgG、IgA、IgM、IgE、IgD、Fv、scFv、Fab或F(ab′)2。IgG可以具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的亚类。在一些实施方案中，工程化抗体可以是微抗体、双抗体、三抗体、纳米抗体或单结构域抗体的一部分。
在一些实施方案中，编码工程化抗IL-2抗体的多核苷酸序列在治疗患有如本文描述的疾病或状况的受试者的方法中使用，其中多核苷酸编码包含重链可变区的抗体，所述重链可变区具有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:36中的一种的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码工程化抗IL-2抗体的多核苷酸序列在治疗患有如本文描述的疾病或状况的受试者的方法中使用，其中多核苷酸编码包含轻链可变区的抗体，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:37中的一种的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码工程化抗IL-2抗体的多核苷酸序列在治疗患有如本文描述的疾病或状况的受试者的方法中使用，其中多核苷酸编码包含重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区和轻链可变区具有以下中的一种的氨基酸序列：SEQID NO:10和SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20和SEQ IDNO:21；SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26和SEQID NO:27；或SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37。
在使用多核苷酸来治疗如上文描述的疾病或状况的方法的一些实施方案中，多核苷酸编码工程化抗IL-2抗体，该工程化抗IL-2抗体可以是IgG、IgA、IgM、IgE、IgD、Fv、scFv、Fab或F(ab′)2。IgG可以具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的亚类。在一些实施方案中，多核苷酸编码工程化抗体，该工程化抗体是微抗体、双抗体、三抗体、纳米抗体或单结构域抗体的一部分。
在一些实施方案中，编码工程化抗IL-2抗体的多核苷酸序列在治疗患有如本文描述的疾病或状况的受试者的方法中使用，其中多核苷酸序列包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35中的一种的序列。
在治疗如本文描述的疾病或状况的方法的一些实施方案中，由治疗活化的免疫效应细胞是CD8+细胞或NK细胞。在一种实施方案中，本文公开的抗IL-2抗体、或IL-2和本文公开的抗IL-2抗体的复合物在诱导MP CD8+细胞和NK细胞的增殖方面表现出明显的效果，而对CD4+Treg存在小得多的影响。在某些实施方案中，对CD4+Treg没有影响。
在某些实施方案中，本文公开的抗IL-2抗体的使用方法提供促刺激作用。技术人员将理解，使用本文描述和例示的抗IL-2抗体例如实施例1清楚地证明促刺激作用，而不是抗刺激作用或促调节作用。
在一些实施方案中，使用包含具有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:36中的一种的序列的重链可变区的工程化或修饰的抗IL-2抗体在有相应需要的受试者中提供促刺激免疫作用。在一些实施方案中，使用包含具有SEQ ID NO:11、SEQID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQID NO:25、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:37中的一种的序列的轻链可变区的工程化或修饰的抗IL-2抗体在有相应需要的受试者中提供促刺激免疫作用。在一些实施方案中，使用包含具有SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14和SEQID NO:15；SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27；或SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37中的一种的序列的重链可变区和轻链可变区的工程化或修饰的抗IL-2抗体在有相应需要的受试者中提供促刺激免疫作用。在一些实施方案中，所述使用包括抗IL-2抗体。在一些实施方案中，所述使用包括抗IL-2抗体和IL-2。在一些实施方案中，使用包括抗IL-2抗体与IL-2的复合物。
在一些实施方案中，使用包含具有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:36中的一种的序列的重链可变区的工程化或修饰的抗IL-2抗体在有相应需要的受试者中提供促刺激免疫作用，而不是抗刺激作用或促调节作用。在一些实施方案中，使用包含具有SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:37中的一种的序列的轻链可变区的工程化或修饰的抗IL-2抗体在有相应需要的受试者中提供促刺激免疫作用，而不是抗刺激作用或促调节作用。在一些实施方案中，使用包含具有SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21；SEQ IDNO:22和SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27；或SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37中的一种的序列的重链可变区和轻链可变区的工程化或修饰的抗IL-2抗体在有相应需要的受试者中提供促刺激免疫作用，而不是抗刺激作用或促调节作用。在一些实施方案中，所述使用包括抗IL-2抗体。在一些实施方案中，所述使用包括抗IL-2抗体和IL-2。在一些实施方案中，使用包括抗IL-2抗体与IL-2的复合物。
在一些实施方案中，使用含有包含如在氨基酸序列分别为SEQ ID NO:38-40；分别为SEQ ID NO:44-46；分别为SEQ ID NO:50-52；分别为SEQ ID NO:56-58；或分别为SEQ IDNO:62-64中列出的重链CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区的抗IL-2抗体在有相应需要的受试者中提供促刺激免疫作用。在一些实施方案中，使用含有包含如在氨基酸序列分别为SEQID NO:41-43；分别为SEQ ID NO:47-49；分别为SEQ ID NO:53-55；分别为SEQ ID NO:59-61；或分别为SEQ ID NO:65-67中列出的轻链CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区的抗IL-2抗体在有相应需要的受试者中提供促刺激免疫作用。在一些实施方案中，使用含有包含如在氨基酸序列分别为SEQ ID NO:38-40；分别为SEQ ID NO:44-46；分别为SEQ ID NO:50-52；分别为SEQ ID NO:56-58；或分别为SEQ ID NO:62-64中列出的重链CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区以及包含如在氨基酸序列分别为SEQ ID NO:41-43；分别为SEQ ID NO:47-49；分别为SEQ ID NO:53-55；分别为SEQ ID NO:59-61；或分别为SEQ ID NO:65-67中列出的轻链CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区的抗IL-2抗体在有相应需要的受试者中提供促刺激免疫作用。在一些实施方案中，所述使用包括抗IL-2抗体。在一些实施方案中，所述使用包括抗IL-2抗体和IL-2。在一些实施方案中，使用包括抗IL-2抗体与IL-2的复合物。
在一些实施方案中，使用含有包含如在氨基酸序列分别为SEQ ID NO:38-40；分别为SEQ ID NO:44-46；分别为SEQ ID NO:50-52；分别为SEQ ID NO:56-58；或分别为SEQ IDNO:62-64中列出的重链CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区的抗IL-2抗体在有相应需要的受试者中提供促刺激免疫作用，而不是抗刺激作用或促调节作用。在一些实施方案中，使用含有包含如在氨基酸序列分别为SEQ ID NO:41-43；分别为SEQ ID NO:47-49；分别为SEQ IDNO:53-55；分别为SEQ ID NO:59-61；或分别为SEQ ID NO:65-67中列出的轻链CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区的抗IL-2抗体在有相应需要的受试者中提供促刺激免疫作用，而不是抗刺激作用或促调节作用。在一些实施方案中，使用含有包含如在氨基酸序列分别为SEQ IDNO:38-40；分别为SEQ ID NO:44-46；分别为SEQ ID NO:50-52；分别为SEQ ID NO:56-58；或分别为SEQ ID NO:62-64中列出的重链CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区以及包含如在氨基酸序列分别为SEQ ID NO:41-43；分别为SEQ ID NO:47-49；分别为SEQ ID NO:53-55；分别为SEQ ID NO:59-61；或分别为SEQ ID NO:65-67中列出的轻链CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区的抗IL-2抗体在有相应需要的受试者中提供促刺激免疫作用，而不是抗刺激作用或促调节作用。在一些实施方案中，所述使用包括抗IL-2抗体。在一些实施方案中，所述使用包括抗IL-2抗体和IL-2。在一些实施方案中，使用包括抗IL-2抗体与IL-2的复合物。
因此，本文公开的工程化抗IL-2抗体将可用于在治疗疾病(诸如病毒感染、细菌感染或癌症)或者治疗状况(诸如IL-2诱导的肺水肿或IL-2诱导的血管渗漏)的方法中调节免疫细胞群体并诱导某些免疫效应细胞的差异扩增。
在一些实施方案中，本文公开了一种对受试者进行免疫接种的方法，其中所述免疫接种包括施用包含佐剂的疫苗，所述佐剂包括IL-2抗体佐剂。在一些实施方案中，IL-2抗体佐剂包括抗IL-2抗体和IL-2，或者包括与IL-2复合的抗IL-2抗体。在一些实施方案中，IL-2抗体佐剂包括抗IL-2抗体和IL-2。在一些实施方案中，IL-2抗体佐剂包括与IL-2复合的抗IL-2抗体。在一些实施方案中，IL-2抗体佐剂包括抗IL-2抗体。
在一些实施方案中，被免疫接种的受试者是哺乳动物受试者。在一些实施方案中，被免疫接种的受试者是人类。在一些实施方案中，被免疫接种的受试者具有减弱的免疫系统。
在免疫接种方法的一些实施方案中，抗IL-2抗体包含具有SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:36中的一种的序列的重链可变区。在免疫接种方法的一些实施方案中，抗IL-2抗体包含具有SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27或SEQID NO:37中的一种的序列的轻链可变区。在免疫接种方法的一些实施方案中，抗IL-2抗体包括包含重链可变区和轻链可变区的抗IL-2抗体，所述重链可变区和轻链可变区具有以下中的一种的序列：SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13；SEQ IDNO:14和SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19；SEQID NO:20和SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27；或SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37。
在免疫接种方法的一些实施方案中，抗IL-2抗体包括包含重链可变区的抗IL-2抗体，所述重链可变区包含互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3包含分别为SEQ ID NO:38-40；分别为SEQ ID NO:44-46；分别为SEQ ID NO:50-52；分别为SEQ IDNO:56-58；或分别为SEQ ID NO:62-64的氨基酸序列。在免疫接种方法的一些实施方案中，抗IL-2抗体包括包含轻链可变区的抗IL-2抗体，所述轻链可变区包含互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3包含分别为SEQ ID NO:41-43；分别为SEQ ID NO:47-49；分别为SEQ ID NO:53-55；分别为SEQ ID NO:59-61；或分别为SEQ ID NO:65-67的氨基酸序列。在免疫接种方法的一些实施方案中，抗IL-2抗体包括包含重链可变区和轻链可变区的抗IL-2抗体，所述重链可变区和轻链可变区中的每一个包含互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，其中所述重链CDR1、CDR2和CDR3包含分别为SEQ ID NO:38-40；分别为SEQ ID NO:44-46；分别为SEQ ID NO:50-52；分别为SEQ ID NO:56-58；或分别为SEQ ID NO:62-64的氨基酸序列，其中所述轻链CDR1、CDR2和CDR3包含分别为SEQ ID NO:41-43；分别为SEQ IDNO:47-49；分别为SEQ ID NO:53-55；分别为SEQ ID NO:59-61；或分别为SEQ ID NO:65-67的氨基酸序列。
在对受试者进行免疫接种的方法的一些实施方案中，免疫接种包括施用包含佐剂的疫苗，所述佐剂包括IL-2抗体佐剂，所述抗IL-2抗体包括如本文公开的抗IL-2抗体。在某些实施方案中，IL-2抗体佐剂包括抗IL-2抗体和IL-2，或者包括与IL-2复合的抗IL-2抗体。在对受试者进行免疫接种的方法的一些实施方案中，受试者具有减弱的免疫系统。
在一些实施方案中，用包含IL-2抗体佐剂的疫苗免疫接种的受试者包括具有包括增加所述受试者中癌症的可能性的遗传易感性的状况的受试者。在一些实施方案中，遗传易感性包括基因产物的表达或活性的改变。在一些实施方案中，增加癌症的可能性的遗传易感性包括肿瘤抑制基因或错配修复(MMR)基因的突变或其组合。许多遗传性癌症是本领域已知的，非限制性实例包括但不限于遗传性乳腺癌和卵巢癌(HBOC)综合征、林奇综合征(遗传性非息肉病性结肠直肠癌)和利-弗劳梅尼综合征。
在一些实施方案中，通过本文公开的用于治疗疾病或状况的方法治疗的受试者还用靶向一种或更多种免疫检查点的一种或更多种免疫检查点抑制剂治疗。在一些实施方案中，受试者在用所述抗IL-2抗体治疗的同时、在用所述抗IL-2抗体治疗之前或在用所述抗IL-2抗体治疗之后用所述免疫检查点抑制剂治疗。在本文公开的治疗方法的一些实施方案中，免疫检查点包括PD-1、PDL-1、CTLA-4、TIGIT、TIM-3、B7-H3、CD73、LAG3、CD27、CD70、4-1BB、GITR、OX40、SIRP-α(CD47)、CD39、ILDR2、VISTA、BTLA或VTCN-1或其组合。
如上文论述的，在一些实施方案中，如本文公开的治疗性治疗方法还包括包含检查点抑制剂的另外的活性剂。本领域技术人员将理解，包含在存在或不存在IL-2的情况下的抗IL-2抗体疗法并且另外包含检查点抑制剂的组合疗法可以利用包含如本文提供的抗IL-2抗体+/-IL-2以及检查点抑制剂的治疗组合物或制剂中的任一种。在一些实施方案中，至少两种检查点抑制剂在组合疗法中使用。
本申请的实施方案包括：
一种分离的抗IL-2抗体，其中所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:36中的一种的序列。
抗体包括包含IgG、IgA、IgM、IgE、IgD、Fv、scFv、Fab、F(ab′)2、微抗体，双抗体、三抗体、纳米抗体或单结构域抗体的抗体。
一种IgG，所述IgG包括
(a)IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；
(b)包含降低与Fcγ受体(FcγR)结合的突变的重链；或
(c)λ或κ轻链；或
(d)其(a)-(c)的任何组合。
一种组合物，所述组合物包含分离的抗IL-2抗体和药学上可接受的载体。
一种分离的抗IL-2抗体，其中所述抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:37中的一种的序列。
一种分离的抗IL-2抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区具有以下中的一种的序列：SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11；SEQ IDNO:12和SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17；SEQID NO:18和SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27；或SEQ ID NO:36和SEQ IDNO:37。
一种分离的抗IL-2抗体，其中所述抗体包含具有互补决定区1(CDR1)、CDR2和CDR3的重链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3包含分别为SEQ ID NO:38-40；分别为SEQ ID NO:44-46；分别为SEQ ID NO:50-52；分别为SEQ ID NO:56-58；或分别为SEQ ID NO:62-64的氨基酸序列。
一种分离的抗IL-2抗体，其中所述抗体包含具有互补决定区1(CDR1)、CDR2和CDR3的轻链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3包含分别为SEQ ID NO:41-43；分别为SEQ ID NO:47-49；分别为SEQ ID NO:53-55；分别为SEQ ID NO:59-61；或分别为SEQ ID NO:65-67的氨基酸序列。
一种分离的抗IL-2抗体，其中所述抗体包含：包含互补决定区1(CDR1)、CDR2和CDR3的重链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3包含分别为SEQ ID NO:38-40；分别为SEQ IDNO:44-46；分别为SEQ ID NO:50-52；分别为SEQ ID NO:56-58；或分别为SEQ ID NO:62-64的氨基酸序列；以及具有互补决定区1(CDR1)、CDR2和CDR3的轻链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3包含分别为SEQ ID NO:41-43；分别为SEQ ID NO:47-49；分别为SEQ ID NO:53-55；分别为SEQ ID NO:59-61；或分别为SEQ ID NO:65-67的氨基酸序列。
一种编码抗IL-2抗体的重链可变区的分离的多核苷酸序列，其中重链可变区包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:36中的一种的氨基酸序列。
一种载体，所述载体包含本文描述的多核苷酸序列。一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本文描述的载体。
一种编码抗IL-2抗体的轻链可变区的分离的多核苷酸序列，其中轻链可变区包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:37中的一种的氨基酸序列。
一种编码抗IL-2抗体的重链可变区并编码抗IL-2抗体的轻链可变区的分离的多核苷酸序列，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:36中的一种的氨基酸序列，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:37中的一种的氨基酸序列。
一种编码scFv的分离的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包括SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35中的一种的序列。
一种产生抗IL-2抗体的重链可变区的方法，所述方法包括将包含本文公开的载体的宿主细胞在有利于在所述宿主细胞中表达所述载体的条件下培养，从而产生抗IL-2抗体的重链可变区的步骤。
一种产生抗IL-2抗体的轻链可变区的方法，所述方法包括将宿主细胞在有利于在所述宿主细胞中表达所述载体的条件下培养，从而产生抗IL-2抗体的轻链可变区的步骤。
一种产生包含抗IL-2抗体的重链可变区和轻链可变区的抗IL-2抗体的方法，所述方法包括将宿主细胞在有利于在所述宿主细胞中表达所述载体的条件下培养，从而产生抗IL-2抗体的重链可变区和轻链可变区的步骤。
一种促进受试者中免疫细胞的差异生长的方法，该方法包括施用包含抗IL-2抗体的组合物，从而促进受试者中免疫细胞的差异生长的步骤。在一些实施方案中，组合物包含抗IL-2抗体和IL-2，或与IL-2复合的抗IL-2抗体。
一种通过诱导免疫细胞的差异生长来治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括施用包含抗IL-2抗体的组合物，从而治疗患有癌症的受试者的步骤。
一种治疗受试者中的疾病或状况的方法，该方法包括向受试者施用包含抗IL-2抗体的组合物的步骤，其中所述抗体促进免疫细胞亚群的扩增并且减少由IL-2引起的不合意的影响，从而治疗所述受试者中的所述疾病或状况。
在一些实施方案中，疾病包括病毒感染、细菌感染或癌症。在一些实施方案中，病毒感染由以下引起：SARS CoV-2；诺如病毒；轮状病毒；甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒或戊型肝炎病毒；狂犬病毒；西尼罗河病毒；肠道病毒；埃可病毒；柯萨奇病毒；单纯疱疹病毒(HSV)；HSV-2；水痘-带状疱疹病毒；蚊媒病毒；虫媒病毒；圣路易斯脑炎病毒；加利福尼亚脑炎病毒；淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒；人类免疫缺陷病毒(HIV)；脊髓灰质炎病毒；寨卡病毒；风疹病毒；巨细胞病毒；人类乳头瘤病毒(HPV)；肠道病毒D68；严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒；中东呼吸综合征冠状病毒；爱泼斯坦-巴尔病毒；流感病毒；呼吸道合胞病毒；多瘤病毒(包括JC病毒；BK病毒)；埃博拉病毒；登革热病毒；或其任何组合。在一些实施方案中，状况包括弱免疫系统，并且所述治疗预防性地增强免疫系统。
在一些实施方案中，状况包括IL-2诱导的肺水肿。
在本文公开的方法的一些实施方案中，免疫细胞包括幼稚T细胞、记忆T细胞、CD8+T细胞、NK细胞或自然杀伤T细胞中的一种或更多种。
在一些实施方案中，由IL-2引起的不合意的影响包括调节性T细胞的活化、CD25+T效应细胞的凋亡、IL-2诱导的肺水肿、肺炎或IL-2诱导的血管渗漏中的一种或更多种。
在一些实施方案中，本文公开的抗IL-2抗体抑制IL-2与CD25的结合。
一种对受试者进行免疫接种的方法，其中所述免疫接种包括施用包含佐剂的疫苗，所述佐剂包括IL-2抗体佐剂。
在一些实施方案中，IL-2抗体佐剂包括抗IL-2抗体和IL-2，或者包括与IL-2复合的抗IL-2抗体。
在一些实施方案中，受试者是动物或人类。在一些实施方案中，受试者具有减弱的免疫系统。
在本文公开的方法的一些实施方案中，免疫细胞是CD8+细胞或NK细胞。
在本文公开的方法的一些实施方案中，所述抗IL-2抗体包含具有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:36中的一种的序列的重链可变区。
在本文公开的方法的一些实施方案中，抗IL-2抗体包含具有SEQ ID NO:11、SEQID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQID NO:25、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:37中的一种的序列的轻链可变区。
在本文公开的方法的一些实施方案中，抗IL-2抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区具有以下中的一种的序列：SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:16和SEQ IDNO:17；SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:22和SEQID NO:23；SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27；或SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37。
在本文公开的方法的一些实施方案中，抗IL-2抗体包含含有互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3的重链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3包含分别为SEQ ID NO:38-40；分别为SEQID NO:44-46；分别为SEQ ID NO:50-52；分别为SEQ ID NO:56-58；或分别为SEQ ID NO:62-64的氨基酸序列。
在本文公开的方法的一些实施方案中，抗IL-2抗体包含含有互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3的轻链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3包含分别为SEQ ID NO:41-43；分别为SEQID NO:47-49；分别为SEQ ID NO:53-55；分别为SEQ ID NO:59-61；或分别为SEQ ID NO:65-67的氨基酸序列。
在本文公开的方法的一些实施方案中，抗IL-2抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区中的每一个包含互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，
其中所述重链CDR1、CDR2和CDR3包含分别为SEQ ID NO:38-40；分别为SEQ ID NO:44-46；分别为SEQ ID NO:50-52；分别为SEQ ID NO:56-58；或分别为SEQ ID NO:62-64的氨基酸序列，
其中所述轻链CDR1、CDR2和CDR3包含分别为SEQ ID NO:41-43；分别为SEQ ID NO:47-49；分别为SEQ ID NO:53-55；分别为SEQ ID NO:59-61；或分别为SEQ ID NO:65-67的氨基酸序列。
如本文使用的，除非上下文另外清楚地指出，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”、和“该(the)”包括复数指示物。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可以包括多于一种化合物，包括其混合物。
在整个本申请中，本发明的各种实施方案可以以范围格式来呈现。应当理解，以范围格式的描述仅是为了方便和简洁并且不应当被解释为对本发明的范围的不可改变的限制。因此，范围的描述应当被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在该范围内的单独的数值。例如，范围的描述诸如从1至6应当被认为是已经具体地公开了子范围诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及在该范围内的单独的数字例如1、2、3、4、5和6。不论范围的宽度如何，这都适用。
无论何时在本文中指出数值范围，它都意味着包括所指出的范围内的任何陈述的数字(分数或整数)。短语“范围在(ranging/ranges between)”第一个指示数和第二个指示数“之间”以及“范围为从(ranging/ranges from)”第一个指示数“到(to)”第二个指示数在本文中可互换地使用并且意指包括第一个指示数和第二个指示数及其之间的所有分数和整数。
技术人员将理解，术语“约”可以涵盖与所指示的数字或数字范围的0.0001％-5％之间的偏差。在一些情况下，术语“约”可以涵盖与所指示的数字或数字范围的1％-10％之间的偏差。在一些情况下，术语“约”涵盖与所指示的数字或数字范围的高达25％的偏差。
实施例
实施例1
本实施例描述了基于所产生的抗体的实施方案产生修饰的抗IL-2抗体。产生修饰的抗IL-2抗体的例示是基于本文公开的抗体亚群。实施例1中呈现的描述和结果是示例性的，并且不限制整个本申请中公开的修饰的抗IL-2抗体的产生。
文库设计
文库被设计成将变异引入到JES6.1的序列中。JES6.1的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中示出。简言之，三个位置随着编码所有氨基酸的密码子(密码子NNS)而变化。该文库的设计允许CDR L3和CDR H3两者中的一个突变，以及以下CDR之一中的一个突变：H1、H2或L2。CDR通过满足IMGT或ABR(Kunik等人,2012)定义来定义。在mIL2-JES6.1复合物(PDB 4YQX)的晶体结构中保守(基于针对PDB数据库的Blast检索)或不与小鼠IL-2(mIL-2)形成特异性相互作用的CDR残基被排除在变异之外。该文库的理论大小为1.38E+7个变体。
文库选择
使用酵母表面展示进行的筛选和选择
酵母展示的scFv文库在SDCAA选择性培养基中生长，并且根据既定方案在30℃用2％w/v半乳糖诱导表达过夜。将该文库与100nM的在PBS 0.1％ BSA中的具有6xhis标签的重组人类IL-2(hIL-2-His)(Reprokine,Israel)一起孵育持续1小时，然后用PBS 0.1％BSA洗涤三次，并且用荧光标记的抗体小鼠抗Myc-FITC(Santa Cruze,USA)和小鼠单克隆抗His APC(Miltenyi Biotec,Germany.目录号0020130-119-782)标记。在标记后，在BioRadS3e荧光活化细胞分选仪上针对与重组人类IL-2的高亲和力结合物对该文库进行分选。来自最终分选的分离的克隆通过使用Zymoprep试剂盒(Zymo Research,USA)从酵母克隆中提取质粒DNA来测序，并且对DNA进行测序。
Koff选择
为了选择具有改进的解离速率的结合物，将第2轮选择的克隆与10nM 6xhis标签(hIL-2)一起孵育持续15min，然后将酵母用1ml PBS 0.1％ BSA洗涤3次，并且与100nM未标记的IL-2一起孵育持续5分钟、4h、6h和24h。在指示的时间点，洗涤酵母并用Myc-FITC(Santa Cruze,USA)和单克隆抗His APC(Miltenyi Biotec,Germany.目录号0020130-119-782)标记，并且如上文描述的在Se3上进行分选。
IgG产生
JES6.1w.t.购买自Thermo Fisher(目录号：16-7022-81)。JES6.1.RMC被克隆为具有小鼠IgG2a恒定区的大鼠Fv，并且通过GeneScript抗体生产服务(Genscript NJ,USA)产生。将BDG17.014克隆到人类IgG1恒定区中，并且通过GeneScript抗体生产服务产生。JES6.1.RMC的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9中示出。所有其他抗体如下文所描述地产生。
重新格式化
选定的scFv克隆被重新格式化为人类IgG1形式。轻链(LC)可变区和重链(HC)可变区的序列被优化为哺乳动物密码子使用，并且作为genblocks(GB)从IDT(Integrated DNATechnologies.Coralville,Iowa USA)定购。使用标准克隆技术将GB克隆到pSF-CMV-HuIgG1_HC(HC质粒)和pSF-CMV-HuLambda_LC(LC质粒)(Oxford genetics,Oxford UK)中。当指示时，可变重链被克隆到pSF-CMV-HuIgG1_HC_LALA(HC质粒)中，其中编码重链的L234和L235的DNA被突变为丙氨酸密码子(L234A、L235A)。
IgG表达
将Expi-CHO细胞(Thermo Fisher Scientific,USA)用2:1的比例的LC质粒和HC质粒转染，并且根据制造商的说明进行表达。简言之：将50ml Expi-CHO细胞在37℃、120rpm、8％ CO2培养至6×106个细胞/ml的密度。然后，将50μg的1:2的比例的重链表达质粒和轻链表达质粒转染到CHO细胞中。在转染后，将促进增强剂(booster enhancer)和补料添加到培养物，并且将生长条件改变为32℃、120rpm、5％ CO2。在转染之后10天收获细胞。使用蛋白A珠(Tosoh Bioscience GmbH,Germany)从上清液中纯化IgG，随后在superdex 200 10/300increase柱上以PBS作为流动相(GE healthcare,USA)进行尺寸排阻色谱(SEC)纯化。
序列
编码克隆1(17.021)的scFv的DNA序列在SEQ ID NO:1中示出。编码克隆2(17.022)的scFv的DNA序列在SEQ ID NO:2中示出。编码克隆4(17.023)的scFv的DNA序列在SEQ IDNO:3中示出。编码克隆5(17.030)的scFv的DNA序列在SEQ ID NO:4中示出。编码克隆6(17.035)的scFv的DNA序列在SEQ ID NO:5中示出。
原始JES6_1起始序列和多种抗IL-2克隆的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列在下表中以及在图11和图12中示出。
表2：抗IL-2克隆亚群的VH氨基酸序列和VL氨基酸序列.
BDG克隆 重链可变区 轻链可变区
17.021 SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:11
17.022 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:13
17.023 SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:15
17.030 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:17
17.035 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:19
IgG与人类IL-2结合的测量
SPR分析在Biacore 200(GE healthcare,USA)上在CM5芯片(目录号：br10005-30,GE healthcare,USA)上进行。该芯片与针对人类IgG的初级捕获Ab(目录号：br-1008-39,GEhealthcare,USA)或针对小鼠IgG的初级捕获抗体(目录号：BR-1008-38,GE healthcare,USA)交联至靶为8000RU。在初级Ab的交联之后，将小鼠和人类测试抗体固定在初级Ab上至靶为大约另外的500RU。将JES6.1直接交联到CM5芯片。人类IL-2(目录号：60568,Reprokine,Israel)分析物在HEB-EP或PBS 0.05％tween-20(PBS-T)缓冲液中以一系列两倍或三倍稀释度以范围为从128nM至0.03nM的浓度动，每个循环一种浓度。小鼠IL-2(目录号：RKP04351,Reprokine,Israel)在HEB-EP或PBS-T缓冲液中以范围为从0.5nM至40nM的浓度流动。在每个循环结束时，使用3M MgCl2将分析物和测试抗体从芯片中剥离，并且如上文描述的，将新的测试Ab加载到芯片上。当指示时，代替剥离抗体，通过在一个循环中注射一系列分析物浓度由单循环动力学方法来确定动力学。结合动力学通过1:1结合模型使用Biacore T200评价软件来确定。
IgG与食蟹猴IL-2的结合
SPR分析在Biacore 200(GE healthcare,USA)上在CM5芯片(目录号：br10005-30,GE healthcare,USA)上进行。该芯片与针对人类IgG的初级捕获Ab(目录号：br-1008-39,GEhealthcare,USA)交联至靶为5000RU，并且食蟹猴IL-2(cIL-2)通过多循环方法在上文描述的相同条件中测试。
SEC分析
为了分析IgG，将100μg样品以0.8ml/min的流量加载到GE AKTA Explorer色谱系统(GE healthcare,USA)上的Superdex 200 10/300 increase柱(GE healthcare,USA)上。在280nm处监测抗体保留时间。
与CD25和CD122的特异性结合的测试
为了测试与CD25的特异性结合，如上文描述的，将BDG17.023固定到CM5芯片至靶RU为大约300RU。随后，注射50nM IL-2，直到BDG17.023或对照抗体被饱和。然后将Ab-IL-2复合物用PBS-T缓冲液洗涤持续10秒，并且注射1000nM的CD25并监测响应。
为了测试与CD122的特异性结合，如上文描述的，将BDG17.023固定到CM5芯片至靶RU为大约300RU-500RU。随后，注射50nM hIL-2，直到BDG17.023抗体被hIL-2饱和。接下来，将Ab-IL-2复合物用PBS-T缓冲液洗涤持续10秒，并且注射1000nM的CD122并监测响应。
为了测试人源化抗体IL-2复合物与CD122和CD25的特异性结合，如上文描述的，将抗体BDG17.038、BDG17.043、BDG17.053、BDG17.054、BDG17.067、BDG17.069(对于这些克隆的序列信息，参见实施例2的表6和表7)固定到附接至CM5芯片通道的捕获抗体至靶RU为大约300RU。随后，注射50nM IL-2，直到相应抗体被hIL-2饱和。然后将Ab-IL-2复合物用PBS-T缓冲液洗涤持续60秒，并且注射1000nM的CD25并监测响应。随后，将运行缓冲液注射持续60秒以达到稳定基线，并且然后将1000nM的CD122以30μl/min的流量注射持续30秒。为了测试CD122结合，以相反的顺序重复相同的实验，其中先注射CD122然后注射CD25。
IgG Tm的DSF分析
为了确定人源化抗hIL-2抗体的T-开始和Tm，将抗体在PBS中稀释至0.5mg/ml，并且使用NanoDSF Prometheus NT.48(Nanotemper,Germany)以1℃/min的升温速率进行分析。
体内实验
用IL-2/Ab复合物治疗小鼠
对六只7-8周龄的雄性C57BL/6小鼠的组每天腹膜内地(i.p.)注射BDG17.023/hIL-2或JES6.1/mIL-2免疫复合物，持续连续四天。PBS和游离的hIL-2或mIL-2用作对照。在第四天结束时，处死小鼠，收获脾脏并匀浆成单细胞悬浮液。将细胞过滤，离心(400g持续5分钟)，重悬于5ml PBS中至最终浓度为5×106个淋巴细胞/ml。该实验根据以色列国家机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee,IACUC)的指南进行。
对六只7-8周龄的雄性C57BL/6小鼠的组每天腹膜内地(I.P.)注射BDG17.038/hIL-2、BDG17.043/hIL-2、BDG17.054/hIL-2、BDG17.038/hIL-2或同种型对照/hIL-2免疫复合物，持续连续四天。为了形成复合物，在注射之前，将10μg的抗体与0.5μg的hIL-2在37℃一起预孵育持续30分钟。在第四天结束时，处死小鼠，收获脾脏并匀浆成单细胞悬浮液。将细胞过滤，离心(400g持续5分钟)，重悬于5ml PBS中至最终浓度为5×106个淋巴细胞/ml。该实验根据以色列国家机构动物护理和使用委员会(IACUC)的指南进行。
B16F10鼠黑色素瘤肿瘤异种移植模型
将雌性C57BL/6小鼠在右后侧区域中皮下地接种(2×105个)B16-F10肿瘤细胞。在接种后五天，当肿瘤体积达到～30mm3-50mm3时，将小鼠随机分为实验组(每组n＝10)，并且每天腹膜内地注射单剂量的所指示的抗体的10μg抗IL-2抗体/1μg hIL-2复合物或PBS对照，持续连续四天。在整个实验过程中监测小鼠的肿瘤体积生长、体重损失和非特异性临床体征。
通过FACS确定免疫细胞群体
为了鉴定免疫细胞群体，根据制造商的说明将脾淋巴细胞用下文描述的抗体标记。调节性T细胞(Treg)被指定为标记为CD45+/CD3+/CD4+/CD25+/FoxP3+的细胞。记忆表型效应T细胞(MP CD8+)：CD45+/CD3+/CD8+/CD44+/IL-2RB(CD122)+。自然杀伤细胞(NK)：CD45+/CD3-/CD49b+/NK1.1(CD161)。自然杀伤T细胞(NKT)：CD45+/CD3+/CD49b+/NK1.1(CD161)。从流式细胞仪上获得的原始数据计算阳性细胞频率和数目。
表3：标志物/标记的抗体
Figure BDA0003892191780000671
Figure BDA0003892191780000681
结果
JES6.1强烈结合小鼠IL-2但不结合人类IL-2
JES6.1已经被报告为以5.6nM的KD结合小鼠IL-2(mIL-2)。为了测试JES6.1是否可以结合人类IL-2(hIL-2)，通过SPR在BiacoreT200上测试JES6.1抗体。将JES6.1直接交联到CM5芯片，然后将人类IL-2分析物或小鼠IL-2分析物分别以范围为从0.5nM至128nM或0.5nM至16nM的浓度流动。如图4A中可以看到的，当用人类IL-2测试时，JES6.1的响应单元(RU)没有表现出明显变化。另一方面，当小鼠IL-2用作分析物时，稳健响应是明显的(图4B)，指示JES6.1强烈结合小鼠IL-2但不结合人类IL-2。用JES6.1RMC抗体嵌合体重复该实验，该JES6.1RMC抗体嵌合体被表达为具有如本文描述的小鼠恒定区的JES6.1大鼠FV。使用GE抗体捕获试剂盒将JES6.1RMC固定在CM5芯片上。使hIL-2以高达100nM的浓度流动导致RU没有变化，指示没有与人类IL-2的结合(图4C)。为了测试JES6.1RMC嵌合体是否像上文的JES6.1一样保留其mIL-2结合性质，测试了其与小鼠IL-2的结合。使mIL-2以0.5nM至320nM的浓度流动导致RU的大变化，指示稳健结合(图4D)。这些结果指示JES6.1和JES6.1RMC强烈结合小鼠IL-2但未表现出与人类IL-2的明显结合。JES6.1RMC与hIL-2和mIL-2两者的结合动力学的分析在下文中示出。
表4：JES6.1RMC的结合动力学.
Figure BDA0003892191780000691
将结合特异性从小鼠IL-2改变为人类IL-2
为了将结合特异性从小鼠IL-2改变为人类IL-2，将JES6.1作为scFv克隆到酵母展示载体中。JES6.1的scFv形式在酵母表面上良好表达，如由羧基末端myc标签标记所指示的(图5A-图5C)。将呈IgG形式的100nM JES6.1与表达小鼠IL-2的YSD克隆一起孵育导致强结合(图5A-图5C)。然而，与上文示出的SPR结果相关，JES6.1 YSD克隆与高达1μM标记的人类IL-2的孵育没有表现出荧光增加，指示JES6.1 scFv不结合hIL-2。
基于JES6.1 scFv，如上文描述地产生诱变文库。简言之，如上文描述地针对重组人类IL-2选择YSD文库。突变文库经过一轮针对1μM的人类IL-2的MACS选择和另一轮针对1μM的人类IL-2的FACS选择。选择前0.2％的克隆。随后，该文库经历另外两轮的选择，专门旨在改进如上文描述的所选定的克隆的koff性质。对于第3轮的选择，将酵母与10nM His-加标签的hIL-2在室温一起孵育持续15分钟，然后将酵母洗去hIL-2并且与100nM未标记的IL-2在室温一起孵育持续5分钟。第4轮以类似的方式进行，但是在标记和洗涤后，将酵母以20倍初始体积在PBS中孵育持续24小时。在第5轮中，将酵母标记并洗涤，并且然后与100nM未标记的IL-2在室温一起孵育持续六小时。在五轮选择之后，将克隆分离。对获得与hIL-2的结合的五个YSD克隆(图6A-图6B)进行测序。此外，通过用500nM可溶性TNFR2和500nM OX40以及500nM PD1的混合物标记来测试这些克隆的特异性。如在图6A-图6B中可以看到的，这些克隆对于hIL-2是特异性的并且不与任何其他蛋白结合。
BDG17.023的表达
在YSD表征之后，表现出与hIL-2显著结合的克隆#4被重新格式化为具有大鼠FV和人类Fc嵌合体的人类嵌合IgG1(BDG17.023)。如上文描述的，将大鼠可变结构域亚克隆到两个单独的表达载体pSF-CMV-HuIgG1_HC和pSF-CMV-HuLambda_LC中。如上文描述的，IgG在ExpiCHO细胞中表达。如从SDS PAGE分析明显的，纯化的IgG为>95％纯的。BDG17.023在superdex200 10/300上的尺寸排阻色谱示出两个主峰：具有～9.2ml(0.36CV)的保留的第一个峰是大聚集体的典型特征，并且具有大约～12.6ml(0.528CV)的保留的第二个峰是普通人类hIgG1的典型特征。这些SEC运行的峰积分分别示出11％和89％(图7)。
BDG17.023的结合动力学
为了确定BDG17.023与mIL-2和hIL-2的结合动力学和亲和力，如上文描述的，IgG通过SPR在BIAcore T200上使用GE捕获抗体试剂盒来分析。如图8A-图8B中示出的，BDG17.023以大约8×10^-11的亲和力结合hIL-2，其中结合速率为1.3*10^7并且解离速率为1*10^-3。BDG17.023还表现出以大约2.5×10^-6的低得多的亲和力与mIL-2结合。
表5：BDG17.023的动力学参数.
Figure BDA0003892191780000701
BDG17.023-hIL-2复合物的受体鉴别
JES61-mIL-2复合物被报告为与CD25特异性结合但不与CD122特异性结合。显示与SPR芯片结合的JES6.1-mIL-2复合物可以结合CD25但不能结合CD122。为了测试BDG17.023-hIL-2复合物是否可以鉴别与CD25和CD122的结合，如上文描述地进行类似的实验。如图9中示出的，与hIL-2复合的对照抗体结合人类CD25但不能结合CD122。相比之下，BDG17.023-hIL-2复合物被发现结合CD122但不结合CD25。该结果指示，尽管BDG17.023来源于JES6.1，但是JES6.1-mIL-2复合物和BDG17.023-hIL-2复合物表现出非常不同的IL-2受体偏好，可能是通过分别结合mIL-2和hIL-2的不同表位。另外，可以在mIL-2和hIL-2上诱导影响与IL-2受体的结合偏好的不同的别构效应。
BDG17.023的体内表征
体内施用与mIL-2复合的JES6.1导致调节性T细胞的稳健增殖和效应T细胞的小得多的增殖，从而改变MP CD8+/Treg比率趋向免疫抑制。由于BDG17.023-hIL-2复合物在SPR生化测定中表现出结合CD122的偏好并排除CD25结合，因此预测BDG17.023-hIL-2复合物将增强CD8+效应细胞和NK细胞在体内的增殖。人类IL-2可以与小鼠IL-2受体交叉反应，因此如上文描述的，将BDG17.023-hIL-2复合物施用至C57BL/6小鼠以测试其在体内的效应。简言之，17.023抗体-hIL-2复合物与hIL-2以1:1的摩尔比一起孵育，并且每天腹膜内地注射至C57BL/6小鼠，持续连续四天。作为对照，JES6.1-mIL-2复合物、单独的hIL-2或单独的mIL-2也以类似的方式施用。在第五天，收获小鼠脾脏，如上文描述地将细胞进行标记并且通过FACS进行分析。
如在图10A-图10D中可以看到的，BDG17.023在诱导MP CD8+细胞和NK细胞的增殖方面表现出显著作用，而对CD4+Treg存在小得多的影响。另一方面，JES6.1表现出与其报告的抗炎作用很不同的作用。这些结果展示，与结合数据一致并且与JES6.1不同，BDG17.023-IL-2复合物在体内对免疫系统具有强的刺激作用，而不是抗刺激作用或促调节作用。
实施例2
该实施例呈现了关于进一步选择人类IL-2结合物和产生人源化抗体的结果。
另外的选择策略用于在替代性选择压力下选择人类IL-2结合物。简言之：文库经过一轮针对1μM的人类IL-2的MACS选择和另外四轮针对100nM的人类IL-2的FACS选择。在第一轮FACS选择之后，选择所有结合物，随后选择前0.5％、前0.5％和前0.1％的结合物。在五轮选择之后，将克隆C#7(173R5C1-17.002)(SEQ ID NO:28)分离、验证其结合并测序。
抗体人源化
克隆C#7(173R5C1-17.002)被选择为人源化的模板。人类模板使用SchrodingerBioLuminate‘Antibody Humanization:CDR Grafting’CDR工具来选择(Kai Zhu,TylerDay等人,Antibody structure determination using a combination of homologymodeling,energy-based refinement,and loop prediction.Proteins:Structure,Function and Bioinformatics,82,8,8 2014)，并且JES6-1的PDB条目被用作查询(4YQX；Jamie B.Spangler,Jakub Tomala等人,Antibodies to Interleukin-2Elicit SelectiveT Cell Subset Potentiation through Distinct ConformationalMechanisms.Immunity,42,5,5 2015)。PDB条目5I18(Alexey Teplyakov,Galina Obmolova等人,Structural diversity in a human antibody germline library.mAbs,8,6,82016)被选择，因为它关于L链和H链的框架同一性和茎几何形状的组合具有最好得分。突变被引入到与CDR区(根据IMGT编号方案)或在4YQX中与抗原相互作用(在5A半径内)的位置。这些位置上的可变性被选择为包括人类模板(5I18)以及小鼠查询(4YQX)的氨基酸。此外，由于查询和模板的H1之间的显著结构变化，4YQX和5I18的H1之间完全转换的选项被引入。该文库具有大约1300个不同的变体。
文库通过FACS进行两轮选择。在第一轮中，将文库用5nM hIL-2标记，并且对前5％的结合克隆进行分选。在第二轮中，将文库用1nM hIL-2标记，并且对前5％的克隆进行分选。在选择之后对克隆进行测序，并且克隆C#8(173.2A.C6-17.014)(SEQ ID NO:31)被用作亲和力成熟的模板。
人源化抗体亲和力成熟
选择被预测为具有高体细胞高频突变率的CDR位置(IMGT/ABR定义)以进行变异。还靶向L3中被假定为与基于JES6-1的抗原相互作用的另外的位置以及所有H3以进行变异。变异是基于所有位置的序列保守性，除了对于H3其是DHY密码子之外。该文库的理论多样性为3.21×1012。
基于克隆C#8(173.2A.C6-17.014)，构建另一个文库，其中所有CDR位置使用编码所有氨基酸的NNS简并密码子来探索。筛选出2-3个突变的变体，每个CDR上最多一个。这样的文库的理论大小为2×106个双突变体和1×109个三突变体。
将上文产生的人源化亲和力成熟文库合并在一起以进行选择。简言之，在第一轮中，将合并的YSD文库用10nM hIL-2标记并在MACS上选择。在第二轮中，将酵母用0.1nMhIL-2标记并使用MACS选择。在第三轮选择中，将酵母用0.1nM hIL-2标记，并且所有结合物在FACS上选择。对于第四轮和第五轮选择，将酵母用10nM hIL-2标记并与100nM未标记的hIL-2竞争，分别持续24小时和48小时。随后，在FACS上对酵母进行分选以选择所有的结合物。最后一轮选择以与第四轮和第五轮类似的方式进行，但在标记和洗涤后，将酵母在室温在PBS中以1000倍的初始体积孵育持续一周。
在选择之后，将克隆分离，验证结合并测序。几个克隆的氨基酸序列在下文中示出。克隆亚群的重链可变区和轻链可变区以及CDR区的比对在图13A和图13B中呈现。
表6：抗IL-2克隆亚群的VH氨基酸序列和VL氨基酸序列.
克隆 重链可变区 轻链可变区
17.038 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:21
17.043 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:23
17.053 SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:25
17.054 SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:27
17.014 SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:37
17.066 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:21
17.067 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:23
17.069 SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:27
应当注意，克隆17.066、17.067和17.069包含LALA突变(L234A突变、L235A突变)。
某些选定的克隆的CDR序列在下文中示出。
表7：抗IL-2克隆的CDR氨基酸序列.
Figure BDA0003892191780000731
Figure BDA0003892191780000741
表8：抗IL-2克隆亚群的全长氨基酸序列.
BGD-克隆 重链(LALA) 轻链
BDG17.066 SEQ ID NO:68 SEQ ID NO:69
BDG17.067 SEQ ID NO:70 SEQ ID NO:71
BDG17.069 SEQ ID NO:72 SEQ ID NO:73
人源化抗体的结合动力学
为了确定BDG17.038、BDG17.043、BDG17.053、BDG17.054、BDG17.067、BDG17.066和BDG 17.069与hIL-2和食蟹猴IL-2(cIL-2)的结合动力学和亲和力，将克隆重新格式化为IgG、表达并纯化；随后如本文描述的，将抗体通过SPR在BIAcore T200上使用GE捕获抗体试剂盒来分析。如表9和图14A-图14G以及图15A-图15B中示出的，抗体在低两位数的pM范围紧密结合人类IL-2和食蟹猴IL-2。
人源化抗体的尺寸排阻色谱特征和热稳定性.
为测试人源化IgG BDG17.038、BDG17.043、BDG17.053、BDG17.054、BDG17.066、BDG17.067和BDG 17.069是否正确折叠和稳定，如上文描述的，使抗体经受尺寸排阻色谱和差示扫描荧光法(DSF)分析。总结在图16A-图16G和表8中的结果表明这些IgG作为>95％的非聚集物类产生，具有人类IgG1的典型SEC保留特征以及其中T开始为>＝54.4℃且Tm1>＝69℃的热变性特征。受体鉴别测定的图示在图17A中呈现，并且不同克隆的SPR结果在图17B-图17G中呈现。总之，SPR、SEC和DSF实验指示，紧密结合人类IL-2和食蟹猴IL-2的人源化抗体被正确折叠并且是高度稳定的。
表9：选择改进的人源化克隆的生物物理性质
Figure BDA0003892191780000751
Figure BDA0003892191780000761
实施例3
本实施例提供了关于特异性阻断人类IL-2与IL-2受体CD25结合并调节体内免疫系统的抗IL-2抗体的公开内容。
在特异性阻断IL-2和人类CD25之间相互作用的表位处结合人类IL-2的抗IL-2抗体具有若干种意义。这允许IL-2抗体复合物与效应T细胞和NK细胞结合，但阻止人类IL-2与表达高水平的CD25的非免疫细胞(例如，肺内皮和血管内皮)或与表达高亲和力三聚体复合物的免疫细胞(例如，Treg细胞和CD25+短寿命细胞毒性效应T细胞)结合。因此，这些抗IL-2抗体能够扩增效应T细胞和NK细胞，而不显著扩增调节性T细胞(参见，图1和图2)。另外，先前已经示出，肺内皮细胞表达CD25，并且在它们存在时高水平的IL-2将导致肺水肿。观察到IL-2通过IL-2与血管内皮细胞上表达的CD25相互作用诱导血管渗漏的类似作用。因此，通过靶向IL-2使其远离CD25，本文公开的抗IL-2抗体也被预期降低任何IL-2相关的肺和血管毒性(图3A-图3B)。
人源化IgG-hIL-2复合物的受体鉴别
BDG17.023-hIL-2复合物(抗IL-2抗体-人类IL-2复合物)表现出受体结合鉴别，BDG17.023-hIL-2复合物被发现结合CD122但不结合CD25，这导致特异性免疫系统调节结果。为了测试人源化抗体是否具有类似的作用，将其与hIL-2复合，并且通过SPR测试其与CD122和CD25的结合。分析以与如本文描述的BDG17.023类似的方式进行。如通过图17B-图17G中的SPR迹线可以看到的，当人源化抗体BDG17.038、BDG17.043、BDG17.053、BDG17.054、BDG17.066、BDG17.067或BDG17.069与hIL-2复合时，复合物结合CD122但不能结合CD25，指示这些抗体保留了人类大鼠嵌合体BDG17.023的结合鉴别性质。
人源化抗体的体内表征
已经假设，通过高亲和力抗体阻断IL-2上的CD25结合表位允许人类IL-2与效应T细胞和NK细胞结合，但阻止人类IL-2与表达CD25的非免疫细胞(例如，肺内皮和血管内皮)或表达三聚体复合物的细胞(例如，Treg细胞、CD25+效应T细胞)结合。为了在体内测试该假设，如本文描述地将抗IL-2抗体与人类IL-2预复合并且施用至健康C57BL/6雄性小鼠(图18A-图18B)。如在图18A和图18B中可以看到的，抗IL-2抗体BDG17.043和BDG17.054能够扩增效应T细胞、NKT细胞和NK细胞群体，而不显著扩增调节性T细胞(图18A-图18B)，可能是由于它们的表位特异性性质。另外，MP CD8+T细胞和NKT的增殖取决于IgG-hIL-2复合物的施用剂量，并且比与hIL2一起施用的同种型对照稳健得多，表明BDG17.043/IL-2和BDG17.054/IL-2积极促进CD122/CD132二聚体活化途径，而赦免CD25/CD122/CD132三聚体途径(图19A-图19B)。
与IL-2复合的BDG17.043和BDG17.054诱导MP CD8+效应T细胞和NK细胞的增殖，但不促进调节性T细胞的显著扩增，表明这些抗体-IL-2复合物对免疫系统具有强刺激作用，与通过促进Treg的增殖来诱导免疫系统抗刺激作用的其他抗体IL-2复合物如JES 6.1-IL-2(Spangler JB,Tomala J,Luca VC,Jude KM,Dong S,Ring AM,Votavova P,Pepper M,Kovar M,Garcia KC.Antibodies to Interleukin-2 Elicit Selective T Cell SubsetPotentiation through Distinct Conformational Mechanisms.Immunity.2015年5月19日；42(5):815-25.)和Pfizer的F5111.2-IL2(Trotta E,Bessette PH,Silveria SL,等人Ahuman anti-IL-2 antibody that potentiates regulatory T cells by a structure-based mechanism.Nat Med.2018；24(7):1005-1014.)相反。
在上文描述的小鼠研究中，每天监测动物的体重损失和非特异性临床体征。当在小鼠中评价药物化合物时，20％的体重损失被认为是需要伦理干预的可操作项目。如在图20A-图20B中示出的，在实验结束时，施用17.043/IL-2复合物或17.054/IL-2复合物的小鼠未表现出体重损失或表现出10％的体重损失。在所有剂量队列中观察到这种效应，所述队列包括用最高剂量25μg IgG/1.25μg IL-2复合物治疗的小鼠，指示所施用的复合物是良好耐受的。
人源化抗体在B16F10同基因癌症模型中的活性
病毒清除和癌症疗法两者共享扩增获得性T细胞免疫应答以获得效力的共同需求。在B16F10同基因黑色素瘤模型中测试抗IL-2抗体有效活化免疫应答的能力。如本文描述的，将C57BL/6小鼠接种B16F10黑色素瘤，并且用10μg抗IL-2抗体/1μg hIL-2复合物或PBS对照治疗。如图21A中示出的，所有用与IL-2复合的BDG17.043或BDR17.054治疗的小鼠在治疗后8天表现出显著的肿瘤生长抑制，其比用同种型对照和hIL-2治疗小鼠(研究第17天)大得多，可能是由于稳健且特异性的免疫刺激。另外，如在图21B中可以看到的，用两种抗IL-2抗体治疗的小鼠的平均瞬时体重损失为6.84％+/-3.9％和3.6％+/-5.2％，指示在同基因B16F10肿瘤模型的设置中，所施用的抗体/IL-2复合物是良好耐受的。
总之，这些研究表明，抗IL-2抗体(17.043&17.054)以高亲和力在预先确定的表位上结合人类IL-2，使得抗体完全阻止IL-2与其受体CD25的相互作用。因此，抗体/IL-2复合物被引导结合并活化IL-2R的二聚体形式(CD122/CD132)。
二聚体受体复合物在效应细胞上发现。对体内免疫刺激作用的分析展示，在抗IL-2克隆17.043和17.054的存在下，IL-2增加T效应细胞群体(IL-2Rβγ结合和信号传导)，而没有观察到对调节性T细胞(IL-2Rαβγ结合和信号传导)的影响。这展示IL-2与二聚体IL-2受体的相互作用导致无毒免疫刺激。总之，这些数据支持这样的假设，即干扰细胞因子结合CD25阳性细胞的能力的抗人类IL-2抗体可以用于治疗肿瘤患者，以增强这样的免疫应答，即导致针对癌症的免疫应答，或者在COVID-19感染的情况下可以增加病毒载量的清除。另外，这些抗体性质可以防止IL-2诱导的肺水肿，并且可能防止SARS-CoV-2感染的肺中的肺组织损伤。
实施例4
本实施例提供了对检查抗IL-2抗体的制剂所进行的研究的描述。
方法：制剂分析通过在四种不同的制剂中孵育30mg/ml的抗IL-2克隆BDG17.069来进行：
F1)20mM组氨酸，8％蔗糖，0.04％ PS80，pH5.5；
F2)20mM组氨酸，8％蔗糖，0.04％ PS80，pH6.0；
F3)20mM柠檬酸盐，8％蔗糖，0.04％ PS80，pH5.5；以及
F4)20mM组氨酸，8％蔗糖，10mM甲硫氨酸，0.04％ PS80，pH5.5。
使抗体经受(1)在40℃孵育持续一周和两周，(2)在25℃以300rpm搅拌持续三天，以及(3)3-5个冷冻/解冻(F/T)循环。在T＝0和处理后，分析抗体的外观、尺寸排阻色谱-超高效液相色谱(SEC-UPLC)、pH、蛋白浓度、PI(毛细管等电聚焦-cIEF)、亚可见颗粒(显微流动成像-MFI)和Tm(DSC)。
结果：作为图22A-图22G呈现的表示出了分析不同的抗体制剂的结果。
如在图22A-图22G中提供的表中可以看到的，在F2、F3、F4中配制的BDG17.069没有表现出浓度的明显变化，在40℃孵育一周和两周之后也没有检测到外观变化。通过MFI对亚视觉颗粒的分析展示，在F1、F2或F4中配制的BDG17.069中未表现出>＝25μM颗粒的形成，并且>＝10μM颗粒的形成仅微小变化(图22B)。SEC-UPLC分析揭示了对于所有四种制剂条件，小MW物类仅微小增加。另外，caliper-SDS分析展示在F2和F4中配制的BDG17.069的最小变化，并且通过cIEF的分析展示了在F4中配制的BDG17.069的相对小的变化。然而，在F3中配制的BDG17.069在40℃孵育2周之后呈现了酸性百分率的实质增加(图22C)。
虽然在F2中和在F3中配制的BDG17.069在搅拌后表现出轻微的颗粒形成(图22D)，并且在5个冷冻/解冻循环之后，在F4和F1中配制的BDG17.069未表现出其外观、pH、浓度的显著变化或任何>5μM的亚可见颗粒形成(图22F)。
总之，这些实验证明在制剂F1、F2、F3和F4中，BDG17.069在搅拌、冷冻-解冻压力之后具有良好的稳定性性能并在40℃孵育持续2周之后具有非常适中的聚集体百分比；考虑到所有压力条件，显然BDG 17.069当在20mM组氨酸、8％蔗糖、10mM甲硫氨酸、0.04％ PS80、pH5.5(F4)中配制时是最稳定的。
实施例5
本实施例提供了对展示表位特异性抗hIL-2抗体的安全性和效力的研究的描述，该表位特异性抗hIL-2抗体被设计为通过特异性活化效应T细胞和NK细胞，同时降低IL-2与调节性T细胞和肺内皮的结合来增强对感染原诸如SARS-CoV-2的免疫应答。
临床前研究
以下临床前研究可以以两个阶段进行：第1阶段是在健康志愿者中展示该化合物作为单次静脉内剂量的安全性；第2阶段是在病毒感染的动物模型中展示多剂量的安全性。
如本文公开的，抗IL-2抗体特异性结合人类IL-2且不结合小鼠IL-2。尽管小鼠IL-2受体可以结合人类IL-2，允许人们将hIL-2加载到复合物中并使用小鼠模型，但是正常小鼠是不可取的，因为它们随后将开始产生高水平的小鼠IL-2。因此，分泌的mIL-2将可用于结合肺中的受体以诱导水肿，从而混淆了安全性解释。因此，允许使用人类IL-2或抗体与内源性IL-2交叉反应确实发生的动物模型是优选的模型。对于小鼠模型，若干个选项是可用的。首先，为了研究抗体或Ab/IL2复合物是否直接对表达CD25的肺组织具有任何有害影响，IL-2敲除小鼠是可用的。该模型的主要限制是缺乏任何随后的免疫应答放大和任何另外的免疫引发的细胞因子。第二个选项是使用已经使用中和抗体耗尽小鼠IL-2的健康C57BL/6或BalbC小鼠。然而，将仍然需要对该模型进行优化。第三个选项是使用转移到NOD-EXL小鼠中的CD34+人类脐血细胞来产生表达人类免疫系统的小鼠。优点是表达了几乎完整的人类免疫系统(尽管有一些限制)，特别是所有T细胞和NK细胞群体。该模型也有利于用作急性病毒感染模型以及肿瘤学研究的模型系统。
基于本文呈现的数据，由于17.067和17.069展示了对食蟹猴IL-2的稳健亲和力并且基于hIL-2和cIL-2之间的高度同源性可能对两者呈现Ab-IL2复合物受体鉴别，灵长类动物安全模型可以完成。健康食蟹猴可以在单次递增剂量测试中进行测试。已经证明食蟹猴可以被SARS-CoV-1感染，并且恒河猴已经被表明会被SARS-CoV-2感染。在这两种情况下，观察到轻度的肺水肿病例，类似于在轻度人类感染中观察到的病例。因此，这些猴子模型将允许检查抗IL-2抗体/IL-2复合物的安全性和效力两者。
剂量递增实验可以在健康动物(例如人源化小鼠、食蟹猴等)中如下进行：
支持首次人类(First in Man,FIM)健康
a.IL-2KO小鼠剂量递增；和/或
b.mIL2抗体耗尽的hIL2+抗体；和/或
c.CD34+SCT人源化小鼠(+/-IL2)；
d.健康食蟹猴或恒河猴单剂量递增；
e.健康食蟹猴或恒河猴多剂量(与FIM单次递增剂量同时进行)。
支持患者给药(第1b阶段或第2阶段)
a.加载病毒(分别为急性流感感染模型或冠状病毒)的小鼠(上文的b或c和/或hACE2转基因的)。
b.如果可获得的话，食蟹猴(SARS-CoV)或恒河猴(SARS-CoV-2)冠状病毒急性感染模型。
临床试验
第1部分)可以在健康志愿者中进行剂量递增试验，以确定最大耐受剂量。可以对所有人使用剂量之间的适当间隔对多达10个个体(8个测试，2个安慰剂)的8个队列进行，以用于安全性确定。
第2部分)使用第1部分中确定的剂量，最近具有轻微症状的有症状的SARS-CoV-2阳性患者可以被治疗并且监测安全性和效力。效力可以通过病毒清除时间的减少和呼吸道感染的体征和症状的减少来确定。探索性终点可以包括外周血免疫细胞群体和活化状态的变化。
化学、制造和对照
细胞系、药物物质(DS)和药物产品(DP)可以在GMP指导(例如，Wuxi Biologics)下由GMP合格的制造商进行。可以进行加速的材料生产以在6个月内为IND准备好材料。所有的生物负担、病毒清除、病毒载量和宿主细胞蛋白可以被检查并降低到如通过当前制造指南确定的规格，以确保产品安全性。DP可以被配制用于静脉内施用。稳定性测试可以同时进行，以确保长期的产品质量。
序列表
<110> 奥罗斯生物科学公司
因巴尔·阿米特
伊泰·莱文
盖伊·尼姆罗德
莎伦·费奇曼
列乌特·巴拉克福克斯
马雷克·斯特拉布尔
蒂莫西·怀恩特
迈克尔·哲宁
奥尔加·布卢夫施泰因耶莫雷耶夫
耶赫兹克尔·萨松
诺姆·格罗斯曼
纳塔莉亚·莱维汀
亚奈·奥弗兰
<120> 工程化抗IL-2抗体
<130> P-593094-PC
<150> 62/977,292
<151> 2020-02-16
<150> 63/139,315
<151> 2021-01-20
<160> 73
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> scFv克隆17.021
<400> 1
gagattcagc tgcagcagag cggtccagaa ctgcgtcgtc caggctcctc cgttaaactg 60
agctgcaaag cctctggtta taacatcacc gataacctga ttcattgggt tcgtcaccgt 120
ccagaacacg gtctggaatg gatcggctgg attgatccag aggacggtga aacccgttac 180
gcccaaaaat tccagtctaa agcaaccctg actgccgaca ctagctccaa cgccgcttac 240
atgcagctga gcagcctgac ccctgaggat accgccacct atttctgcgc acgttctctg 300
gattccacct atatttaccc attcgcatac tggggccaag gcacccttgt caccgtttcc 360
tccggcggtg gtggtagcgg aggcggagga tcaggtggag gcggcagtga cattgttatg 420
actcagtccc cattctccct ggccgtttct gagggtgaaa tggtaaccat taactgcaaa 480
tcatcccagt ccctgctgcg gtctggcaac cagaaaaact atctggcctg gtaccagcag 540
aaaccaggtc agtccccaaa actgctgatc tactacgcat ctactggcca gtctggtgtc 600
ccagaccgtt tcattggctc tggctctggt accgatttca ccctgaccat cagcgatgtt 660
caagctgaag acctggccga ttactattgt ctgcagcact accagagccc accaactttc 720
ggtgcaggca ccaaactgga actgaaa 747
<210> 2
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> scFv克隆17.022
<400> 2
gagattcagc tgcagcagag cggtccagaa ctgcgtcgtc caggctcctc cgttaaactg 60
agctgcaaag cctctggtta taacatcacc gattacctga ttcattgggt tcgtcaccgt 120
ccagaacacg gtctggaatg gatcggctgg attgatccag aggacggtga aacccgttac 180
gcccaaaaat tccagtctaa agcaaccctg actgccgaca ctagctccaa cgccgcttac 240
atgcagctga gcagcctgac ccctgaggat accgccacct atttctgcgc acgttctctg 300
gattccacct ggatttaccc attcgcatac tggggccaag gcacccttgt caccgtttcc 360
tccggcggtg gtggtagcgg aggcggagga tcaggtggag gcggcagtga cattgttatg 420
actcagtccc cattctccct ggccgtttct gagggtgaaa tggtaaccat taactgcaaa 480
tcatcccagt ccctgctgcg gtctggcaac cagaaaaact atctggcctg gtaccagcag 540
aaaccaggtc agtccccaaa actgctgatc tactacgcat ctactggcca gtctggtgtc 600
ccagaccgtt tcattggctc tggctctggt accgatttca ccctgaccat cagcgatgtt 660
caagctgaag acctggccga ttactattgt ctgcagcact acattacccc accaactttc 720
ggtgcaggca ccaaactgga actgaaa 747
<210> 3
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> scFv克隆17.023
<400> 3
gagattcagc tgcagcagag cggtccagaa ctgcgtcgtc caggctcctc cgttaaactg 60
agctgcaaag cctctggtta taacatcacc gattacctga ttcattgggt tcgtcaccgt 120
ccagaacacg gtctggaatg gatcggctgg attgatccag aggacggtga aacccgttac 180
gcccaaaaat tccagtctaa agcaaccctg actgccgaca ctagctccaa cgccgcttac 240
atgcagctga gcagcctgac ccctgaggat accgccacct atttctgcgc acgtcagctg 300
gattccacct atatttaccc attcgcatac tggggccaag gcacccttgt caccgtttcc 360
tccggcggtg gtggtagcgg aggcggagga tcaggtggag gcggcagtga cattgttatg 420
actcagtccc cattctccct ggccgtttct gagggtgaaa tggtaaccat taactgcaaa 480
tcatcccagt ccctgctgcg gtctggcaac cagaaaaact atctggcctg gtaccagcag 540
aaaccaggtc agtccccaaa actgctgatc tactacgcat ctactggcca gtctggtgtc 600
ccagaccgtt tcattggctc tggctctggt accgatttca ccctgaccat cagcgatgtt 660
caagctgaag acctggccga ttactattgt ctgcagcact acattacccc accaactttc 720
ggtgcaggca ccaaactgga actgaaa 747
<210> 4
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> scFv克隆17.030
<400> 4
gagattcagc tgcagcagag cggtccagaa ctgcgtcgtc caggctcctc cgttaaactg 60
agctgcaaag cctctggtta taacatcacc gattacctga ttcattgggt tcgtcaccgt 120
ccagaacacg gtctggaatg gatcggctgg attgatccag aggacggtga aacccgttac 180
gcccaaaaat tccagtctaa agcaaccctg actgccgaca ctagctccaa cgccgcttac 240
atgcagctga gcagcctgac ccctgaggat accgccacct atttctgcgc acgttctctg 300
gattccacct atgactaccc attcgcatac tggggccaag gcacccttgt caccgtttcc 360
tccggcggtg gtggtagcgg aggcggagga tcaggtggag gcggcagtga cattgttatg 420
actcagtccc cattctccct ggccgtttct gagggtgaaa tggtaaccat taactgcaaa 480
tcatcccagt ccctgctgcg gtctggcaac cagaaaaact atctggcctg gtaccagcag 540
aaaccaggtc agtccccaaa actgctgatc tactacgcat ctactggcca gtctggtgtc 600
ccagaccgtt tcattggctc tggctctggt accgatttca ccctgaccat cagcgatgtt 660
caagctgaag acctggccga ttactattgt ctgcagcact acatttcgcc accaactttc 720
ggtgcaggca ccaaactgga actgaaa 747
<210> 5
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> scFv克隆17.035
<400> 5
gagattcagc tgcagcagag cggtccagaa ctgcgtcgtc caggctcctc cgttaaactg 60
agctgcaaag cctctggtta taacatcacc gattacctga ttcattgggt tcgtcaccgt 120
ccagaacacg gtctggaatg gatcggctgg attgatccag aggacggtga aacccgttac 180
gcccaaaaat tccagtctaa agcaaccctg actgccgaca ctagctccaa cgccgcttac 240
atgcagctga gcagcctgac ccctgaggat accgccacct atttctgcgc acgttctctg 300
gattccacct ataactaccc attcgcatac tggggccaag gcacccttgt caccgtttcc 360
tccggcggtg gtggtagcgg aggcggagga tcaggtggag gcggcagtga cattgttatg 420
actcagtccc cattctccct ggccgtttct gagggtgaaa tggtaaccat taactgcaaa 480
tcatcccagt ccctgctgcg gtctggcaac cagaaaaact atctggcctg gtaccagcag 540
aaaccaggtc agtccccaaa actgctgatc tactacgcat ctactggcca gtctggtgtc 600
ccagaccgtt tcattggctc tggctctggt accgatttca ccctgaccat cagcgatgtt 660
caagctgaag acctggccga ttactattgt ctgcagcact ggattagccc accaactttc 720
ggtgcaggca ccaaactgga actgaaa 747
<210> 6
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> JES6.1的重链可变区
<400> 6
Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Arg Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Ile Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Ile His Trp Val Arg His Arg Pro Glu His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Ser Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Ala Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Asp Ser Thr Tyr Ile Tyr Pro Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 7
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> JES6.1的轻链可变区
<400> 7
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Phe Ser Leu Ala Val Ser Glu Gly
1 5 10 15
Glu Met Val Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Gly Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Asp Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln
85 90 95
His Tyr Ile Ser Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 8
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> JES6.1RMC的重链可变区
<400> 8
Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Arg Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Ile Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Ile His Trp Val Arg His Arg Pro Glu His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Ser Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Ala Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Asp Ser Thr Tyr Ile Tyr Pro Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 9
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> JES6.1RMC的轻链可变区
<400> 9
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Phe Ser Leu Ala Val Ser Glu Gly
1 5 10 15
Glu Met Val Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Gly Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Asp Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln
85 90 95
His Tyr Ile Ser Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 10
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆17.021的重链可变区
<400> 10
Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Arg Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Ile Thr Asp Asn
20 25 30
Leu Ile His Trp Val Arg His Arg Pro Glu His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Ser Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Ala Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Asp Ser Thr Tyr Ile Tyr Pro Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆17.021的轻链可变区
<400> 11
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Phe Ser Leu Ala Val Ser Glu Gly
1 5 10 15
Glu Met Val Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Arg Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Gly Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Asp Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln
85 90 95
His Tyr Gln Ser Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 12
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆17.022的重链可变区
<400> 12
Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Arg Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Ile Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Ile His Trp Val Arg His Arg Pro Glu His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Ser Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Ala Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Asp Ser Thr Trp Ile Tyr Pro Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 13
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆17.022的轻链可变区
<400> 13
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Phe Ser Leu Ala Val Ser Glu Gly
1 5 10 15
Glu Met Val Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Arg Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Gly Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Asp Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln
85 90 95
His Tyr Ile Thr Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 14
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆17.023的重链可变区
<400> 14
Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Arg Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Ile Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Ile His Trp Val Arg His Arg Pro Glu His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Ser Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Ala Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Leu Asp Ser Thr Tyr Ile Tyr Pro Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 15
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆17.023的轻链可变区
<400> 15
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Phe Ser Leu Ala Val Ser Glu Gly
1 5 10 15
Glu Met Val Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Arg Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Gly Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Asp Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln
85 90 95
His Tyr Ile Thr Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 16
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆17.030的重链可变区
<400> 16
Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Arg Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Ile Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Ile His Trp Val Arg His Arg Pro Glu His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Ser Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Ala Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Asp Ser Thr Tyr Asp Tyr Pro Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 17
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆17.030的轻链可变区
<400> 17
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Phe Ser Leu Ala Val Ser Glu Gly
1 5 10 15
Glu Met Val Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Arg Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Gly Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Asp Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln
85 90 95
His Tyr Ile Ser Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 18
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆17.035的重链可变区
<400> 18
Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Arg Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Ile Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Ile His Trp Val Arg His Arg Pro Glu His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Ser Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Ala Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Asp Ser Thr Tyr Asn Tyr Pro Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 19
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆17.035的轻链可变区
<400> 19
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Phe Ser Leu Ala Val Ser Glu Gly
1 5 10 15
Glu Met Val Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Arg Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Gly Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Asp Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln
85 90 95
His Trp Ile Ser Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 20
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆17.038的重链可变区
<400> 20
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Asp Ser
20 25 30
Leu Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Ile Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Asp Ser Tyr Pro Ile Asp Pro Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 21
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆17.038的轻链可变区
<400> 21
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Arg Asn
20 25 30
Gly Asn Gln Gln Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Gly Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
His Tyr Val Thr Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 22
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆17.043的重链可变区
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asp Gly Val Thr Ala Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Asp Tyr Asp Pro Ile Tyr Pro Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 23
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆17.043的轻链可变区
<400> 23
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Arg Asn
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Gly Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
His Tyr Val Thr Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 24
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆17.053的重链可变区
<400> 24
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Asp Tyr Asp Pro Ile Tyr Pro Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 25
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆17.053的轻链可变区
<400> 25
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Arg Asn
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Gly Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
His Tyr Ile Thr Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 26
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆17.054的重链可变区
<400> 26
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Asp Asp
20 25 30
Leu Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Asp Ser Thr Trp Ile Tyr Pro Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 27
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆17.054的轻链可变区
<400> 27
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Arg Arg
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn His Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Gly Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln
85 90 95
Ser Tyr Ile Thr Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 28
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> scFv克隆17.002
<400> 28
gagattcagc tgcagcagag cggtccagaa ctgcgtcgtc caggctcctc cgttaaactg 60
agctgcaaag cctctggtta taacatcacc gattacctga ttcattgggt tcgtcaccgt 120
ccagaacacg gtctggaatg gatcggctgg attgatccag aggacggtga aacccgttac 180
gcccaaaaat tccagtctaa agcaaccctg actgccgaca ctagctccaa cgccgcttac 240
atgcagctga gcagcctgac ccctgaggat accgccacct atttctgcgc acgttctctg 300
gattccaccc cgatttaccc attcgcatac tggggccaag gcacccttgt caccgtttcc 360
tccggcggtg gtggtagcgg aggcggagga tcaggtggag gcggcagtga cattgttatg 420
actcagtccc cattctccct ggccgtttct gagggtgaaa tggtaaccat taactgcaaa 480
tcatcccagt ccctgctgcg gtctggcaac cagaaaaact atctggcctg gtaccagcag 540
aaaccaggtc agtccccaaa actgctgatc tactacgcat ctactggcca gtctggtgtc 600
ccagaccgtt tcattggctc tggctctggt accgatttca ccctgaccat cagcgatgtt 660
caagctgaag acctggccga ttactattgt ctgcagcact acattacgcc accaactttc 720
ggtgcaggca ccaaactgga actgaaa 747
<210> 29
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆17.002的重链可变区
<400> 29
Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Arg Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Asn Ile Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Ile His Trp Val Arg His Arg Pro Glu His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Ser Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Ala Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Asp Ser Thr Pro Ile Tyr Pro Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 30
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆17.002的轻链可变区
<400> 30
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Phe Ser Leu Ala Val Ser Glu Gly
1 5 10 15
Glu Met Val Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Arg Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Gly Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Asp Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln
85 90 95
His Tyr Ile Thr Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 31
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> scFv克隆17.014
<400> 31
caggtccaac tggtgcagtc cggtgccgaa gttaaaaaac ctgggtcttc cgttaaagtt 60
tcttgcaaag cctctggcta cagcatcacc gattatctga ttcactgggt ccgtcaggct 120
ccaggtcaag gtctggaatg gatgggttgg atcgatccag aagacggtga aaccaactat 180
gcccagaaat tccagggtcg tgtaaccctg accgccgaca cctccacctc taccgcctac 240
atggagttaa gtagcctgcg ttcagaggat accgcagtgt actactgcgc tcgttcactg 300
gactccaccc caatctaccc attcgcatac tggggtcagg gcaccctggt aaccgttagt 360
agcggcggtg gtggtagcgg aggcggagga tcaggtggag gcggcagtga catcgtgatg 420
acccagtctc ctgactcctt ggccgtctct ctgggcgaac gtgcaactat caactgcaaa 480
tccagccaga gcttactgcg ttctggtaat cagaaaaact accttgcatg gtatcagcag 540
aaaccaggtc agccaccaaa attactgatc tattatgcat ctaccggtca aagcggtgtc 600
ccagatcgtt tcagcggttc cggctccggt actgacttca ccctgaccat ctcttccctt 660
caggccgaag atgtggccgt gtattactgc ctgcagcact acatcacccc acctactttc 720
ggtgctggta ctaaagttga aatcaaa 747
<210> 32
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> scFv克隆17.038
<400> 32
caggtccaac tggtgcagtc cggtgccgaa gttaaaaaac ctgggtcttc cgttaaagtt 60
tcttgcaaag cctctggcta cagcatcacc gattctctga ttcactgggt ccgtcaggct 120
ccaggtcaag gtctggaatg gatgggttgg atcgatccag aagacggtga aattaactat 180
gcccagaaat tccagggtcg tgtaaccctg accgccgaca cctccacctc taccgcctac 240
atggagttaa gtagcctgcg ttcagaggat accgcagtgt actactgcgc tcgttcactg 300
gactcctacc caatcgatcc attcgcatac tggggtcagg gcaccctggt aaccgttagt 360
agcggcggtg gtggtagcgg aggcggagga tcaggtggag gcggcagtga catcgtgatg 420
acccagtctc ctgactcctt ggccgtctct ctgggcgaac gtgcaactat caactgcaaa 480
tccagccaga gcttactgcg taatggtaat cagcaaaact accttgcatg gtatcagcag 540
aaaccaggtc agccaccaaa attactgatc tattatgcat ctaccggtca aagcggtgtc 600
ccagatcgtt tcagcggttc cggctccggt actgacttca ccctgaccat ctcttccctt 660
caggccgaag atgtggccgt gtattactgc cagcagcact acgtcacccc acctactttc 720
ggtgctggta ctaaagttga aatcaaa 747
<210> 33
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> scFv克隆17.043
<400> 33
caggtccaac tggtgcagtc cggtgccgaa gttaaaaaac ctgggtcttc cgttaaagtt 60
tcttgcaaag cctctggcta cagcatcacc gattatctga ttcactgggt ccgtcaggct 120
ccaggtcaag gtctggaatg gatgggttgg atcgatccag aagacggtgt gaccgcctat 180
gcccagaaat tccagggtcg tgtaaccctg accgccgaca cctccacctc taccgcctac 240
atggagttaa gtagcctgcg ttcagaggat accgcagtgt actactgcgc tcgttcactg 300
gactacgacc caatctaccc attcgcatac tggggtcagg gcaccctggt aaccgttagt 360
agcggcggtg gtggtagcgg aggcggagga tcaggtggag gcggcagtga catcgtgatg 420
acccagtctc ctgactcctt ggccgtctct ctgggcgaac gtgcaactat caactgcaaa 480
tccagccaga gcttactgcg taacggtaat cagaaaaact atcttgcatg gtatcagcag 540
aaaccaggtc agccaccaaa attactgatc tattatgcat ctaccggtca aagcggtgtc 600
ccagatcgtt tcagcggttc cggctccggt actgacttca ccctgaccat ctcttccctt 660
caggccgaag atgtggccgt gtattactgc cagcagcact acgtcacccc acctactttc 720
ggtgctggta ctaaagttga aatcaaa 747
<210> 34
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> scFv克隆17.053
<220>
<221> misc_feature
<222> (726)..(726)
<223> n是a、c、g或t
<400> 34
caggtccaac tggtgcagtc cggtgccgaa gttaaaaaac ctgggtcttc cgttaaagtt 60
tcttgcaaag cctctggcta cagcatcacc gattatctga ttcactgggt ccgtcaggct 120
ccaggtcaag gtctggaatg gatgggttgg atcgatccag aagacggtga aactaactat 180
gcccagaaat tccagggtcg tgtaaccctg accgccgaca cctccacctc taccgcctac 240
atggagttaa gtagcctgcg ttcagaggat accgcagtgt actactgcgc tcgttcactg 300
gactacgacc caatctaccc attcgcatac tggggtcagg gcaccctggt aaccgttagt 360
agcggcggtg gtggtagcgg aggcggagga tcaggtggag gcggcagtga catcgtgatg 420
acccagtctc ctgactcctt ggccgtctct ctgggcgaac gtgcaactat caactgcaaa 480
tccagccaga gcttactgcg taacggtaat cagaaaaact accttgcatg gtatcagcag 540
aaaccaggtc agccaccaaa attactgatc tattatgcat ctaccggtca aagcggtgtc 600
ccagatcgtt tcagcggttc cggctccggt actgacttca ccctgaccat ctcttccctt 660
caggccgaag atgtggccgt gtattactgc cagcagcact acattacccc acctactttc 720
ggtgcnggta ctaaagttga aatcaaa 747
<210> 35
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> scFv克隆17.054
<400> 35
caggtccaac tggtgcagtc cggtgccgaa gttaaaaaac ctgggtcttc cgttaaagtt 60
tcttgcaaag cctctggcta cagcatcacc gatgacctga ttcactgggt ccgtcaggct 120
ccaggtcaag gtctggaatg gatgggttgg atcgatccag aagacggtga aaccaactat 180
gcccagaaat tccagggtcg tgtaaccctg accgccgaca cctccacctc taccgcctac 240
atggagttaa gtagcctgcg ttcagaggat accgcagtgt actactgcgc tcgttcactg 300
gactccacct ggatctaccc attcgcatac tggggtcagg gcaccctggt aaccgttagt 360
agcggcggtg gtggtagcgg aggcggagga tcaggtggag gcggcagtga catcgtgatg 420
acccagtctc ctgactcctt ggccgtctct ctgggcgaac gtgcaactat caactgcaaa 480
tccagccaga gcttactgcg tcgcggtaat cagaaaaacc accttgcatg gtatcagcag 540
aaaccaggtc agccaccaaa attactgatc tatgacgcat ctaccggtca aagcggtgtc 600
ccagatcgtt tcagcggttc cggctccggt actgacttca ccctgaccat ctcttccctt 660
caggccgaag atgtggccgt gtattactgc ctgcagagct acatcacccc acctactttc 720
ggtgctggta ctaaagttga aatcaaa 747
<210> 36
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆17.014的重链可变区
<400> 36
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Asp Ser Thr Pro Ile Tyr Pro Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 37
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆17.014的轻链可变区
<400> 37
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Arg Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Gly Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln
85 90 95
His Tyr Ile Thr Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 17.014 H- CDR1
<400> 38
Gly Tyr Ser Ile Thr Asp Tyr Leu
1 5
<210> 39
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 17.014 H- CDR2
<400> 39
Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr
1 5
<210> 40
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 17.014 H- CDR3
<400> 40
Ala Arg Ser Leu Asp Ser Thr Pro Ile Tyr Pro Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 41
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 17.014 L- CDR1
<400> 41
Gln Ser Leu Leu Arg Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 42
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 17.014 L- CDR2
<400> 42
Tyr Ala Ser
1
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 17.014 L- CDR3
<400> 43
Leu Gln His Tyr Ile Thr Pro Pro Thr
1 5
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 17.038 H- CDR1
<400> 44
Gly Tyr Ser Ile Thr Asp Ser Leu
1 5
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 17.038 H- CDR2
<400> 45
Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Ile
1 5
<210> 46
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 17.038 H- CDR3
<400> 46
Ala Arg Ser Leu Asp Ser Tyr Pro Ile Asp Pro Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 47
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 17.038 L- CDR1
<400> 47
Gln Ser Leu Leu Arg Asn Gly Asn Gln Gln Asn Tyr
1 5 10
<210> 48
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 17.038 L- CDR2
<400> 48
Tyr Ala Ser
1
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 17.038 L- CDR3
<400> 49
Gln Gln His Tyr Val Thr Pro Pro Thr
1 5
<210> 50
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 17.043 H- CDR1
<400> 50
Gly Tyr Ser Ile Thr Asp Tyr Leu
1 5
<210> 51
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 17.043 H- CDR2
<400> 51
Ile Asp Pro Glu Asp Gly Val Thr
1 5
<210> 52
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 17.043 H- CDR3
<400> 52
Ala Arg Ser Leu Asp Tyr Asp Pro Ile Tyr Pro Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 53
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 17.043 L- CDR1
<400> 53
Gln Ser Leu Leu Arg Asn Gly Asn Gln Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 54
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 17.043 L- CDR2
<400> 54
Tyr Ala Ser
1
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 17.043 L- CDR3
<400> 55
Gln Gln His Tyr Val Thr Pro Pro Thr
1 5
<210> 56
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 17.053 H- CDR1
<400> 56
Gly Tyr Ser Ile Thr Asp Tyr Leu
1 5
<210> 57
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 17.053 H- CDR2
<400> 57
Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr
1 5
<210> 58
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 17.053 H- CDR3
<400> 58
Ala Arg Ser Leu Asp Tyr Asp Pro Ile Tyr Pro Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 59
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 17.053 L- CDR1
<400> 59
Gln Ser Leu Leu Arg Asn Gly Asn Gln Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 60
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 17.053 L- CDR2
<400> 60
Tyr Ala Ser
1
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 17.053 L- CDR3
<400> 61
Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Pro Thr
1 5
<210> 62
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 17.054 H- CDR1
<400> 62
Gly Tyr Ser Ile Thr Asp Asp Leu
1 5
<210> 63
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 17.054 H- CDR2
<400> 63
Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr
1 5
<210> 64
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 17.054 H- CDR3
<400> 64
Ala Arg Ser Leu Asp Ser Thr Trp Ile Tyr Pro Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 65
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 17.054 L- CDR1
<400> 65
Gln Ser Leu Leu Arg Arg Gly Asn Gln Lys Asn His
1 5 10
<210> 66
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 17.054 L- CDR2
<400> 66
Asp Ala Ser
1
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 17.054 L- CDR3
<400> 67
Leu Gln Ser Tyr Ile Thr Pro Pro Thr
1 5
<210> 68
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BDG17.066重链LALA
<400> 68
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Asp Ser
20 25 30
Leu Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Ile Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Asp Ser Tyr Pro Ile Asp Pro Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 69
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BDG17.066轻链
<400> 69
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Arg Asn
20 25 30
Gly Asn Gln Gln Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Gly Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
His Tyr Val Thr Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 70
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BDG17.067重链LALA
<400> 70
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Asp Tyr
20 25 30
Leu Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asp Gly Val Thr Ala Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Asp Tyr Asp Pro Ile Tyr Pro Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 71
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BDG17.067轻链
<400> 71
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Arg Asn
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Gly Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
His Tyr Val Thr Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 72
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BDG17.069重链LALA
<400> 72
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Asp Asp
20 25 30
Leu Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Leu Asp Ser Thr Trp Ile Tyr Pro Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 73
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BDG17.069轻链
<400> 73
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Arg Arg
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn His Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Gly Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln
85 90 95
Ser Tyr Ile Thr Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220

Claims (38)

1.一种分离的抗IL-2抗体，包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含重链互补决定区(HCDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL包含轻链互补决定区(LCDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述CDR具有以下氨基酸序列：
(a)所述HCDR1包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，所述LCDR3包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列；
(b)所述HCDR1包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列，所述LCDR3包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列；
(c)所述HCDR1包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，所述LCDR3包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；
(d)所述HCDR1包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，所述LCDR3包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列；或
(e)所述HCDR1包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列，所述LCDR1包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列，所述LCDR2包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列，所述LCDR3包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述VH和VL具有以下氨基酸序列：
(a)所述VH包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；
(b)所述VH包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；
(c)所述VH包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列；
(d)所述VH包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列；
(e)所述VH包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列；
(f)所述VH包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；
(g)所述VH包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；
(h)所述VH包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；
(i)所述VH包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列；或
(j)所述VH包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包括IgG、IgA、IgM、IgE、IgD、Fv、scFv、Fab、F(ab′)2、微抗体、双抗体、三抗体、纳米抗体或单结构域抗体。
4.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含重链，所述重链包含降低与Fcγ受体结合的突变。
5.根据权利要求4所述的抗体，所述抗体包含重链序列和轻链序列，
(a)所述重链序列在SEQ ID NO:68中列出并且所述轻链序列在SEQ ID NO:69中列出；
(b)所述重链序列在SEQ ID NO:70中列出并且所述轻链序列在SEQ ID NO:71中列出；或
(c)所述重链序列在SEQ ID NO:72中列出并且所述轻链序列在SEQ ID NO:73中列出。
6.一种组合物，包含根据权利要求1所述的抗体和药学上可接受的载体。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述组合物被配制成pH在约pH 5.0-6.0之间，并且包含选自组氨酸缓冲液和柠檬酸盐缓冲液的缓冲液。
8.根据权利要求7所述的组合物，所述组合物还包含蔗糖、甲硫氨酸或PS80中的至少一种或其任何组合。
9.根据权利要求6所述的组合物，还包含IL-2。
10.一种编码抗IL-2抗体的重链可变区的分离的多核苷酸序列，其中所述VH氨基酸序列在SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:36的氨基酸序列中列出。
11.一种载体，包含根据权利要求10所述的多核苷酸序列。
12.一种宿主细胞，包含根据权利要求11所述的载体。
13.一种编码抗IL-2抗体的轻链可变区的分离的多核苷酸序列，其中所述VL氨基酸序列在SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:37的氨基酸序列中列出。
14.一种载体，包含根据权利要求13所述的多核苷酸序列。
15.一种宿主细胞，包含根据权利要求14所述的载体。
16.一种编码抗IL-2scFv的分离的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列在SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:35中列出。
17.一种载体，包含根据权利要求16所述的多核苷酸序列。
18.一种宿主细胞，包含根据权利要求17所述的载体。
19.一种治疗受试者中的疾病或状况的方法，包括向所述受试者施用包含根据权利要求1所述的抗IL-2抗体的组合物的步骤，其中所述抗体促进免疫细胞亚群的差异生长并且减少由IL-2引起的不合意的影响，从而治疗所述受试者中的所述疾病或状况。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述组合物包含所述抗IL-2抗体和IL-2，或与IL-2复合的所述抗IL-2抗体。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述疾病包括病毒感染、细菌感染或癌症。
22.根据权利要求19所述的方法，其中所述状况包括弱免疫系统，并且所述治疗预防性地增强所述免疫系统。
23.根据权利要求19所述的方法，其中所述状况包括增加所述受试者中癌症的可能性的遗传易感性。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述遗传易感性包括基因产物的表达或活性的改变，所述基因包括肿瘤抑制基因或错配修复(MMR)基因或其组合。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述遗传易感性包括基因产物的表达或活性的改变，所述基因包括BRCA1、BRAC2、MLH1、MSH2、MSH6、PMS1、PMS2、TP53或CHEK2或其组合。
26.根据权利要求19所述的方法，其中所述免疫细胞包括幼稚T细胞、记忆T细胞、CD8+T细胞、NK细胞或自然杀伤T细胞中的一种或更多种。
27.根据权利要求19所述的方法，其中所述由IL-2引起的不合意的影响包括调节性T细胞的活化、CD25+T效应细胞的凋亡、IL-2诱导的肺水肿、IL-2诱导的肺炎或IL-2诱导的血管渗漏中的一种或更多种。
28.根据权利要求19所述的方法，其中所述抗IL-2抗体抑制IL-2与CD25的结合。
29.根据权利要求19所述的方法，其中所述受试者还用靶向一种或更多种免疫检查点的一种或更多种免疫检查点抑制剂治疗。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述受试者在用所述抗IL-2抗体治疗的同时、在用所述抗IL-2抗体治疗之前或在用所述抗IL-2抗体治疗之后用所述免疫检查点抑制剂治疗。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述免疫检查点包括PD-1、PDL-1、CTLA-4、TIGIT、TIM-3、B7-H3、CD73、LAG3、CD27、CD70、4-1BB、GITR、OX40、SIRP-α(CD47)、CD39、ILDR2、VISTA、BTLA或VTCN-1或其组合。
32.根据权利要求21所述的方法，其中所述病毒感染由以下引起：SARS CoV-2；诺如病毒；轮状病毒；甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒或戊型肝炎病毒；狂犬病毒；西尼罗河病毒；肠道病毒；埃可病毒；柯萨奇病毒；单纯疱疹病毒(HSV)；HSV-2；水痘-带状疱疹病毒；蚊媒病毒；虫媒病毒；圣路易斯脑炎病毒；加利福尼亚脑炎病毒；淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒；人类免疫缺陷病毒(HIV)；脊髓灰质炎病毒；寨卡病毒；风疹病毒；巨细胞病毒；人类乳头瘤病毒(HPV)；肠道病毒D68；严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒；中东呼吸综合征冠状病毒；爱泼斯坦-巴尔病毒；流感病毒；呼吸道合胞病毒；多瘤病毒包括JC病毒；BK病毒)；埃博拉病毒；登革热病毒；或其任何组合。
33.一种对受试者进行免疫接种的方法，其中所述免疫接种包括施用包含佐剂的疫苗，所述佐剂包括IL-2抗体佐剂，所述抗IL-2抗体包括根据权利要求1所述的抗IL-2抗体。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述IL-2抗体佐剂包括所述抗IL-2抗体和IL-2，或者包括与IL-2复合的所述抗IL-2抗体。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述受试者具有减弱的免疫系统。
36.根据权利要求33所述的方法，其中所述受试者具有增加所述受试者中癌症的可能性的遗传易感性。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述遗传易感性包括基因产物的表达或活性的改变，所述基因包括肿瘤抑制基因或错配修复(MMR)基因或其组合。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述遗传易感性包括基因产物的表达或活性的改变，所述基因包括BRCA1、BRAC2、MLH1、MSH2、MSH6、PMS1、PMS2、TP53或CHEK2或其组合。
CN202180028914.7A 2020-02-16 2021-02-15 工程化抗il-2抗体 Active CN115397852B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310897633.6A CN117143233A (zh) 2020-02-16 2021-02-15 工程化抗il-2抗体

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202062977292P 2020-02-16 2020-02-16
US62/977,292 2020-02-16
US202163139315P 2021-01-20 2021-01-20
US63/139,315 2021-01-20
PCT/IB2021/051267 WO2021161287A2 (en) 2020-02-16 2021-02-15 Engineered anti-il-2 antibodies

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310897633.6A Division CN117143233A (zh) 2020-02-16 2021-02-15 工程化抗il-2抗体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115397852A true CN115397852A (zh) 2022-11-25
CN115397852B CN115397852B (zh) 2023-08-11

Family

ID=77295172

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310897633.6A Pending CN117143233A (zh) 2020-02-16 2021-02-15 工程化抗il-2抗体
CN202180028914.7A Active CN115397852B (zh) 2020-02-16 2021-02-15 工程化抗il-2抗体

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310897633.6A Pending CN117143233A (zh) 2020-02-16 2021-02-15 工程化抗il-2抗体

Country Status (12)

Country Link
US (3) US20230085471A1 (zh)
EP (1) EP4103607A4 (zh)
JP (2) JP7292526B2 (zh)
KR (2) KR20240014590A (zh)
CN (2) CN117143233A (zh)
AU (2) AU2021221287B2 (zh)
BR (1) BR112022016216A2 (zh)
CA (1) CA3166139A1 (zh)
IL (2) IL308185A (zh)
MX (1) MX2022010034A (zh)
WO (1) WO2021161287A2 (zh)
ZA (1) ZA202209060B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117642424A (zh) * 2021-08-25 2024-03-01 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种含融合蛋白的药物组合物
CN115850471A (zh) * 2022-10-13 2023-03-28 深圳市百士通科技开发有限公司 一种抗人il-2单克隆抗体及其应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02209898A (ja) * 1988-10-31 1990-08-21 Takeda Chem Ind Ltd 修飾インターロイキン―２
US20160068612A1 (en) * 2013-04-29 2016-03-10 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-cd38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2b
US20160272993A1 (en) * 2006-12-06 2016-09-22 Monsanto Technology Llc Genes and uses for plant improvement
US20190085076A1 (en) * 2015-06-12 2019-03-21 Alector Llc Anti-cd33 antibodies and methods of use thereof
CN110087681A (zh) * 2016-09-28 2019-08-02 佐马美国有限公司 结合白细胞介素-2的抗体和其用途
WO2019168791A2 (en) * 2018-02-28 2019-09-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Single-chain il-2/antibody fusions that selectively activate regulatory t cells

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014100014A1 (en) 2012-12-17 2014-06-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Super-2 complexes with antibody to augment il-2 therapy
CN106604932A (zh) 2014-07-10 2017-04-26 诺华公司 人白细胞介素‑2的免疫刺激单克隆抗体
PL3328894T3 (pl) 2015-08-06 2019-05-31 Agency Science Tech & Res Przeciwciała dla il2rbeta/wspólnego łańcucha gamma
MA43859A (fr) * 2016-01-11 2018-11-21 Novartis Ag Anticorps monoclonaux humainisés immunostimulants dirigés contre l'interleukine -2 humaine, et leurs protéines de fusion
CN110914297B (zh) * 2017-05-25 2023-06-06 基础科学研究院 抗人白细胞介素2抗体及其用途

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02209898A (ja) * 1988-10-31 1990-08-21 Takeda Chem Ind Ltd 修飾インターロイキン―２
US20160272993A1 (en) * 2006-12-06 2016-09-22 Monsanto Technology Llc Genes and uses for plant improvement
US20160068612A1 (en) * 2013-04-29 2016-03-10 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-cd38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2b
US20190085076A1 (en) * 2015-06-12 2019-03-21 Alector Llc Anti-cd33 antibodies and methods of use thereof
CN110087681A (zh) * 2016-09-28 2019-08-02 佐马美国有限公司 结合白细胞介素-2的抗体和其用途
WO2019168791A2 (en) * 2018-02-28 2019-09-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Single-chain il-2/antibody fusions that selectively activate regulatory t cells

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JAMIE B SPANGLER等: "Antibodies to Interleukin-2 Elicit Selective T Cell Subset Potentiation through Distinct Conformational Mechanisms", 《IMMUNITY.》 *
JAMIE B SPANGLER等: "Antibodies to Interleukin-2 Elicit Selective T Cell Subset Potentiation through Distinct Conformational Mechanisms", 《IMMUNITY.》, 19 May 2015 (2015-05-19), pages 815 - 825 *
常瑞雪;颜天华;王秋娟;郭青龙;: "白细胞介素-2及其相关药物的应用研究进展", 药学进展, no. 01, pages 1 - 5 *
王永祥,周雪燕,金玉怀,金士香,房文亮: "白细胞介素-2基因佐剂对柯萨奇病毒B3VP1基因疫苗的免疫增强作用", 河北医科大学学报, no. 01, pages 1 - 3 *

Also Published As

Publication number Publication date
US11851485B2 (en) 2023-12-26
AU2023266270A1 (en) 2023-12-07
EP4103607A2 (en) 2022-12-21
WO2021161287A3 (en) 2021-09-16
WO2021161287A2 (en) 2021-08-19
KR20240014590A (ko) 2024-02-01
EP4103607A4 (en) 2023-12-20
CA3166139A1 (en) 2021-08-19
KR20220143716A (ko) 2022-10-25
US20230203152A1 (en) 2023-06-29
JP2023113807A (ja) 2023-08-16
BR112022016216A2 (pt) 2023-02-28
NZ791361A (en) 2023-08-25
US20240092888A1 (en) 2024-03-21
IL295210A (en) 2022-10-01
IL295210B1 (en) 2023-12-01
MX2022010034A (es) 2022-12-13
JP7292526B2 (ja) 2023-06-16
JP2023506093A (ja) 2023-02-14
US20230085471A1 (en) 2023-03-16
CN115397852B (zh) 2023-08-11
ZA202209060B (en) 2023-12-20
CN117143233A (zh) 2023-12-01
IL295210B2 (en) 2024-04-01
AU2021221287B2 (en) 2023-10-05
IL308185A (en) 2024-01-01
KR102627471B1 (ko) 2024-01-18
AU2021221287A1 (en) 2022-08-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7488323B2 (ja) 抗ｌａｇ－３抗体および組成物
JP7100731B2 (ja) ヒトｉｌ－４受容体に対する高親和性ヒト抗体
JP6783886B2 (ja) 抗ｃｔｌａ４モノクローナル抗体またはその抗原結合断片、医薬組成物および使用
JP6432121B2 (ja) Ｐｄｌ−１抗体、その医薬組成物及びその使用
JP2023504016A (ja) Ｃｄ３およびｂｃｍａに対する抗体およびそれらから作製した二重特異性結合タンパク質
US11851485B2 (en) Engineered anti-IL-2 antibodies
CN115991778A (zh) 抗pd-l1抗体及其用途
AU2015367224B2 (en) IL-21 antibodies
JP2022553129A (ja) ポリオウイルス受容体（ｐｖｒ）に対する抗体およびその使用
US20230357398A1 (en) Novel human antibodies binding to human cd3 epsilon
TW202233674A (zh) 用於調節δγ鏈介導之免疫的組成物及方法
WO2023284741A1 (zh) Pd-1抗体及其用途
WO2024017281A1 (zh) 多特异性抗体及其用途
NZ791361B2 (en) Engineered anti-il-2 antibodies
JP6529602B2 (ja) 抗ｃｄ２０／抗ｂａｆｆ二重特異性抗体
JP2023547662A (ja) Ｃｌｄｎ６及びｃｄ３に選択的に結合するポリペプチド構築物
WO2024054418A1 (en) Sequence optimization of a pd1 blocking antibody

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant