DE69034037T2

DE69034037T2 - Verfahren zur Herstellung von TGF-beta

Info

Publication number: DE69034037T2
Application number: DE69034037T
Authority: DE
Inventors: Eirik Nestaas; Pungaor, Jr.
Original assignee: Berlex Laboratories Inc
Current assignee: Berlex Laboratories Inc
Priority date: 1989-09-11
Filing date: 1990-09-10
Publication date: 2003-08-28
Anticipated expiration: 2010-09-11
Also published as: EP1132469A3; DE69034037D1; DE69027995T2; EP0722951A2; EP0491849B1; EP0722951B1; US5043431A; EP0722951A3; DE69027995D1; EP1132469A2; ATE231165T1; ES2093031T3; DK0491849T3; EP0491849A1; EP0491849A4; JPH05500898A; DK0722951T3; ES2188632T3; CA2066576A1; AU6504490A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von "Transforming Growth Factor β" [Transformierendem Wachstumsfaktor β] sowie von gereinigtem TGF-β.
Transforming Growth Factor β (TGF-β) ist ein Multifunktionspeptid, für das eine Aktivität bei der Regulation vieler verschiedener, sowohl normaler als auch neoplastischer Zellarten gezeigt werden konnte. Es handelt sich hierbei um ein Homodimer mit einem Molekulargewicht von 25 000, das aus zwei 12 500 großen Untereinheiten, die über neun Disulfidbrücken miteinander verbunden sind, besteht und als ein 391 Aminosäuren großes Molekül bestehend aus einem 29 Aminosäuren großen Leitpeptid und einem 362 Aminosäuren großen latenten Vorläufermolekül synthetisiert wird. Der reife aktive TGF-β besteht aus den C-terminalen 112 Aminosäuren des latenten Peptids. Die exakte Art und Weise der physiologischen Aktivierung ist unbekannt, und das reife Peptid wird nicht glykosiliert. Es liegen jedoch drei potentielle N-verknüpfte Glykosilierungsstellen im Vorläuferteil des Proteins vor, die allesamt genutzt zu werden scheinen.
Mindestens fünf unterschiedliche TGF-β's wurden bisher beschrieben, einschließlich TGF-β 1,2,3 und 4. Die Sequenzhomologie zwischen den unterschiedlichen Formen des reifen TGF-β-Peptids reicht von 64-82%. Die Sequenzhomologie zwischen den Vorläufersequenzen ist um einiges niedriger und liegt durchschnittlich bei 40%. Alle Sequenzen sind funktionell homolog, doch gibt es einige Unterschiede bei den TGF-β-Rezeptor-Bindungseigenschaften.
Es konnte gezeigt werden, daß TGF-β ein wirksamer Zellwachstumspromotor ist, insbesondere für Epithelzellen, und der Einsatz von TGF-β als Wundheilmittel wurde demonstriert.
Es wäre daher wünschenswert, Verfahren zur Herstellung relativ großer Mengen von TGF-β bereitzustellen. Es wäre besonders wünschenswert, Verfahren zur Fermentation von TGF-β aus Säugerzellkulturen bereitzustellen. Mit den Fermentationsverfahren sollte es möglich sein große Mengen an TGF-β, vorzugsweise wenigstens 1 mg/l/Tag, herzustellen.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Reifer TGF-β wurde im Labormaßstab aus den konditionierten Medien von Produktionszellinien gereinigt. Ein Reinigungsverfahren mit sechs Schritten, einschließlich Lyophilisierung, saurer Resuspension, Gelfiltration, Reverser-Phase-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC), SDS-Polyacrylamidgelelectrophorese sowie Extraktion, ist in Massague (1984) J. Biol. Chem. 259: 9756-9761 beschrieben. Ein Reinigungsverfahren mit acht Schritten, einschließlich Lyophilisierung, Säureextraktion, Dialyse, Lyophilisierung, Gelfiltration, Kationenaustausch-HPLC und Reverser-Phase-HPLC ist beschrieben in Van den Eignden-Van Raaij et al. (1989) Biochem. J. 257: 375- 382. Reifer TGF-β wurde ebenfalls aus mehreren Geweben und ganzen Zellen gereinigt, wobei im allgemeinen ein Verfahren mit vier Schritten, einschließlich Extraktion mit Säure und Ethanol, Gelfiltration, Kationenaustausch und Reverser-Phase-HPLC, eingesetzt wurde. Siehe z. B. Assoian et al. (1983) J. Biol. Chem. 258: 7155-7160; Frolik et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3676-3680; und Roberts et al. (1983) Biochem. 22: 5692-5698. In der gleichzeitig anhängigen Anmeldung mit der Seriennummer 07/184,519 wird ein Fermentationssystem beschrieben, das dem in der vorliegenden Erfindung eingesetzten ähnlich ist.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

TGF-β wird gemäß der vorliegenden Erfindung durch Fermentation einer zur Überproduktion von TGF-β transformierten Säugerzellinie hergestellt. Die Zellen werden auf einer Mikroträgermatrix in einer Perfusionskultur wachsen gelassen, wobei der TGF-β in das Kulturmedium sezerniert wird. Das entstandene konditionierte Medium wird geerntet und der latente TGF-β-Vorläufer aktiviert, typischerweise indem er Säure oder Wärme ausgesetzt wird. Der dadurch entstandene aktive TGF-β liegt im konditionierten Medium in einer relativ niedrigen Konzentration vor, gewöhnlich deutlich unterhalb von 1% des vorhandenen Proteins.
Der im konditionierten Medium vorliegende aktive TGF-β wird dann über kationischen Ionenaustausch mit nachfolgender hydrophober Wechselwirkungschromatographie unter Bedingungen, die so ausgewählt sind, daß ein hochgereinigtes Produkt erhalten wird, gereinigt. Genauer gesagt wird der im konditionierten Medium vorliegende aktive TGF-β auf eine Kationenaustauschmatrix unter Bedingungen, die zu einer im wesentlichen vollständigen Bindung des TGF-β an die Matrix führen, aufgetragen. Der TGF-β wird danach selektiv eluiert und die den TGF-β enthaltende Fraktion gesammelt. Die gesammelte Fraktion wird dann auf eine Matrix mit hydrophober Wechselwirkung aufgetragen, und der TGF-β wird wiederum selektiv eluiert, so daß eine hohe Reinheit, typischerweise von über 95%, vorzugsweise von über 99%, ezielt wird. Das entstandene Produkt kann dann mit herkömmlichen Techniken, wie z. B. Ultrafiltration und nach Größe auftrennende Säulenchromatographie, konzentriert werden.
Es werden die gereinigten TGF-β1-Zusammensetzungen mit einer spezifischen Aktivität oberhalb von 10&sup7; U/mg (wie unten definiert), vorzugsweise oberhalb von 1,5 · 10&sup7; U/mg und weiter bevorzugt oberhalb von 2 · 10&sup7; U/mg bereitgestellt.

BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

TGF-β wird durch Fermentieren einer zur Sezernierung des TGF-β in ein konditioniertes Medium fähigen Säugerzellinie hergestellt. Das konditionierte Medium wird geerntet, und der TGF-β wird aktiviert und von anderen Proteinen und Verunreinigungen getrennt, indem zunächst das konditionierte Medium auf ein Kationenaustauschmedium aufgetragen wird, woraufhin der TGF-β von der Matrix selektiv eluiert wird. Gegebenenfalls können Nukleinsäuren aus TGF-β-Nukleinsäurekomplexen entfernt werden, während der TGF-β an die kationische Ionenaustauschmatrix gebunden bleibt. Die durch selektive Elution von der kationischen Ionenaustauschmatrix erhaltene TGF-β-Fraktion wird dann auf eine Matrix mit hydrophober Wechselwirkung aufgetragen, wobei durch selektive Elution von der Matrix eine zweite Reinigungsstufe zur Verfügung gestellt wird. Als nächstes wird der gereinigte TGF-β mit herkömmlichen Techniken, wie z. B. Ultrafiltration und nach Größe auftrennender Säulenchromatographie, konzentriert.

1. Kulturmedium

Das Kulturmedium umfaßt ein für das Wachstum von Säugerzellen geeignetes Grundmedium, wie z. B. WEC-Medium. Für die Animpf-Wachstumsphase wird das Grundmedium gewöhnlich mit einer Serumquelle, typischerweise fötalem Rinderserum (Fetal Bovine Serum, FBS), das in einer Konzentration im Bereich von etwa 1 bis 10 Gew.-%, üblicherweise von etwa 2 bis 5 Gew.-%, vorliegt, supplementiert. Während der Perfusionswachstumsphase wird die FBS-Konzentration gewöhnlich auf einem niedrigeren Niveau gehalten und liegt typischerweise im Bereich von etwa 0,1 bis 1%, üblicherweise bei etwa 0,5%. Während beider Wachstumsphasen sollte die Serumquelle zur Entfernung von proteolytischen und anderen Enzymen behandelt werden, beispielsweise indem das Serum mit Lysin-Sepharose in Kontakt gebracht wird, wie in der ebenfalls anhängigen, am 11. März 1988 eingereichten USSN 167,061 der Anmelderin beschrieben, deren Offenbarung hiermit einbezogen wird. Die Verwendung eines solchen "geputzten" Serums hilft dabei, den Abbau des in das konditionierte Medium sezernierten TGF-β so gering wie möglich zu halten, und bewirkt weiterhin, daß Serumproteine, die ansonsten mit dem TGF-β zusammen aufgereinigt werden würden, entfernt werden. Andere Wachstumsfaktoren, wie z. B. Glutamin (bei einer optimalen Konzentration von 400 mg/l), können ebenfalls zugegeben werden. Aprotinin (üblicherweise 0,1 bis 10 kIU/ml und vorzugsweise 1 bis 5 kIU/ml) kann als Proteaseinhibitor zugegeben werden, um das in das konditionierte Medium freigesetzte Produkt weiter zu schützen.

2. Zellinien

Zu den für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeigneten Zellinien gehören Säugerzellinien, die adhärent auf Mikroträger-Beads wachsen können. Gewöhnlich sind die Zellinien auch dazu in der Lage in Suspensionskultur zu wachsen, um die Vermehrung der ursprünglichen Mikroträger-Animpfkultur zu erleichtern. Zu den bestimmten Zellinien, die diese Anforderungen erfüllen, gehören "Chinese Hamster Ovary" (CHO)-Zelllinien.
Eine besonders bevorzugte CHO-Zellinie ist β-3-2000, Klon 17, die in Dentry et al. (197) Mol. Cell Biol. 7: 3418-3427 beschrieben ist.

3. Starten der Fermentation

Vor dem Betrieb werden alle Komponenten des Reaktorsystems sterilisiert, typischerweise durch Autoklavieren. Die Leitungen zum und vom Reaktorgefäß werden zweckmäßigerweise mit engporigen (0,2 um) hydrophoben Filtern bedeckt, durch die zwar Dampf hindurchgelassen wird, ohne daß jedoch nachfolgend Mikroorganismen eingelassen werden. Bei der Autoklavierung des Reaktors sollten die verschiedenen Sensorsonden mit Flüssigkeit bedeckt sein, und am Reaktor sollte ein Vakuum angelegt sein, um den Einschluß von Luftblasen, die das Durchdringen mit Dampf stören können, zu verhindern.
Die in dem Gefäß befindliche Flüssigkeit wird soweit wie möglich über eine Probenleitung (nicht dargestellt) abgeleitet und frisches Kulturmedium aus dem Gefäß zugeführt. Eine gewünschte Menge an Serum-Premix wird ebenfalls zugegeben und eine Antischaum- Kontrolleinrichtung (nicht dargestellt) gestartet. Zum Testen der Sterilität wird der Reaktor ein bis zwei Tage bei 37ºC in 100% gelöstem Sauerstoff Rühren gelassen. Ist das Kulturmedium nach Beendigung des Tests immer noch steril, so ist es für die Animpfung bereit.
Das Reaktorgefäß kann mit einer von zwei Vorgehensweisen angeimpft werden, wobei bei der ersten an Mikroträger anhaftende Zellen und bei der zweiten Zellen in Suspension eingesetzt werden. In beiden Fällen wird die Animpfkultur aus einer Master Working Cell Bank von gefrorenen Aliquots gemäß Standard-Zellkulturtechniken vergrößert. Sobald eine genügend große Population vorhanden ist, kann das Reaktionsgefäß 12 angeimpft werden.
Unter Verwendung des Mikroträger-Animpfverfahrens wird eine Spinner-Kultur von Mikroträgerpartikeln bis zu einer Dichte von etwa 1 · 10&sup6; Zellen/ml wachsen gelassen. Die benötigte Menge an Animpfkultur variiert je nach Reaktorvolumen. Typischerweise liegt das Verhältnis von Animpfvolumen zu Reaktorvolumen im Bereich von etwa 1 : 10 bis 1 : 20. Man muß darauf achten, sicherzustellen, daß beim Transfer der Spinner-Kultur keine Mikroorganismenkontamination in das Reaktorgefäß 12 eingeführt wird. Typischerweise werden die Mikroträger übertragen, indem das Spinner-Kulturgefäß unter Druck gesetzt wird, während gleichzeitig gerührt wird, um die Mikroträger in Suspension zu halten. Die Animpfkultur wird dann durch ein Übertragungsrohr mit Überdruck in den Reaktor übertragen.
Bei Verwendung einer Suspensions-Animpfkultur wird das Reaktorgefäß mit einem calciumfreien Wachstumsmedium gefüllt. Eine Zellsuspension wird durch Trypsinisierung von Rollerflaschen erhalten, und der Transfer wird unter Verwendung eines sterilen Aspiratorkolbens mit Überdruck durchgeführt. Die Zellen werden in den Reaktor mit einer End-Reaktorkonzentration im Bereich von etwa 10&sup5; bis 10&sup6; Zellen/ml übertragen.

4. Vergrößerung der Kultur auf eine hohe Dichte

Nach dem Animpfen entweder mit dem Mikroträger oder der Suspension aus freien Zellen wird die Zellkultur auf die Produktionsdichte, die typischerweise im Bereich von etwa 10&sup6; bis 3 · 10&sup7; Zellen/ml liegt, vergrößert. Im Falle der Animpfung mit dem Mikroträger läßt man die Kultur auf der ursprünglichen Mikroträgerbeladung ohne die Zugabe frischen Mediums wachsen, bis die Zelldichte ein vorbestimmtes mittleres Niveau, typischerweise im Bereich von 1 bis 2 · 10&sup6; Zellen/ml, erreicht oder bis die restliche Glukose im Kulturmedium auf ein Niveau von weniger als 25% ihres Anfangsniveaus gefallen ist. Im Falle einer Animpfkultur einer Suspension von freien Zellen läßt man die freie Zelldichte ohne Zugabe von frischem Kulturmedium ansteigen, bis die Zelldichte etwa 10&sup6; Zellen/ml erreicht. Nach dem Erreichen dieser Dichte wird dem Kulturmedium genügend Calcium zugesetzt, um die Zellen adhärent zu machen, und dann werden die Mikroträger, typischerweise in einer Konzentration von etwa 1 Gramm Beads pro Liter Kulturmedium, zugegeben. Nach kurzer Zeit, typischerweise nach etwa 24 Std., haften die Zellen an die Beads an, wobei dann die weitere Vorgehensweise bei der Vergrößerung für die beiden Animpfkulturen von Mikroträgern bzw. der Suspension aus freien Zellen identisch sind.
Nachdem die gewünschte Zelldichte auf den Mikroträgern erreicht ist, wird mit der Perfusion mit frischem mit Serum-Premix supplementiertem Medium begonnen. Typischerweise beträgt die Serumkonzentration im frischen Medium im Bereich von etwa 2 Gew.-% bis 10 Gew.-%, noch typischer im Bereich von etwa 3 Gew.-% bis 8 Gew.-% und normalerweise bei etwa 5 Gew.-%. Die Perfusionsgeschwindigkeit liegt anfangs im Bereich von etwa 0,25 bis 0,75 Kulturvolumen/Tag, typischerweise bei etwa 0,5 Kulturvolumen/Tag. Mit dem Anstieg des Zellwachstums wird die Perfusionsgeschwindigkeit auf eine Endgeschwindigkeit im Bereich von etwa 1,5 bis 2,5 Kulturvolumen/Tag erhöht, typischerweise über einen Zeitraum von etwa 2 bis 10 Tagen. Während der Vergrößerung werden sterile, prä-equilibrierte Mikroträger in den Reaktor gegeben, um das Mikroträger/Zelldichte-Verhältnis im Bereich von etwa 0,5 bis 1,0 Gramm Beads auf 10&sup9; Zellen zu erhalten.
Zweckmäßigerweise werden die Beads unter Verwendung eines Aspirators durch die Probenleitung in den Reaktor gegeben.

5. Produktionsphase

Nachdem die Zelldichte das Produktionsniveau erreicht hat, wird die Serumzugabe zu dem frischen Kulturmedium reduziert, typischerweise auf eine Konzentration im Bereich von etwa 0,1 bis 0,5 Gewichtsprozent.
Die Kultur in der Produktionsphase benötigt nur wenig Aufmerksamkeit. Kulturmedien, Serum sowie Alkali müssen bei leerer werdenden Vorratstanks nachgeliefert werden. Proben der konditionierten Medien sollten wenigstens einmal am Tag analysiert werden, um sicherzustellen, daß die Produktion verunreinigungsfrei weiterläuft.

6. Diskontinuierliche Produktion

Alternativ zur oben beschriebenen Vorschrift für die kontinuierliche Produktion kann das konditionierte Medium auch in einer diskontinuierlichen oder semikontinuierlichen Vorgehensweise produziert werden, wobei der Rührer im Reaktorgefäß in regelmäßigen Zeitabständen angehalten wird, so daß sich die Mikroträger- Beads am Boden des Reaktors absetzen können. Der Kulturüberstand wird schnell abgepumpt, typischerweise durch die Probenleitung oder durch Verstellen der Position des Elutriationsrohres. Vorgewärmtes frisches Medium wird dann in einer zur Wiederaufnahme des Betriebsniveaus ausreichenden Menge in den Reaktor zurückgepumpt. Die Kultur kann dann mit oder ohne Perfusion fortgesetzt werden, bis die nächste Mediumcharge abgezogen wird.
Mit dem gerade beschriebenen Verfahren läßt sich im wesentlichen die gesamte Zellkultur im Reaktor in einem lebensfähigen Zustand halten, selbst wenn das Kulturmedium größtenteils abgezogen wird. Die Produktion des gewünschten Polypeptids wird dann durch Zugabe von frischem Medium wiederaufgenommen. Im allgemeinen ist das diskontinuierliche Produktionsverfahren gegenüber dem kontinuierlichen Produktionsverfahren nicht bevorzugt.

7. Aktivierungen

Nach dem Ernten können die konditionierten Medien bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von bis zu etwa 10 Tagen ohne ph-Einstellung gelagert werden. Während dieser Zeit kann der TGF-β-Vorläufer jederzeit aktiviert werden, typischerweise durch Säurebehandlung mit nachfolgender Wärmebehandlung. Die Säurebehandlung läßt sich durch Einstellen des pH-Werts der konditionierten Medien auf einen Bereich von etwa 2,5 bis 3,0 mit einer starken Mineralsäure, wie z. B. 5 M HCl, durchführen. Das angesäuerte konditionierte Medium wird bei dem reduzierten pH-Wert für einen Zeitraum von ungefähr 24 Stunden stehen gelassen und der pH-Wert danach wieder auf einen Wert im Bereich von etwa 5 bis 7, vorzugsweise auf etwa 6, eingestellt, bevor die Reinigungsverfahren begonnen werden. Die Wärmeaktivierung des angesäuerten Produkts kann entweder durch diskontinuierliches Erwärmen oder Erwärmen in einem kontinuierlichen Flußsystem erfolgen, wobei die Verweildauer bei der hohen Temperatur (40º bis 80ºC) von etwa 10 Minuten bis zu 8 Stunden reichen kann.
Nach der Aktivierung liegt der TGF-β im konditionierten Medium typischerweise in einer Konzentration von weniger als etwa 1%, üblicherweise von weniger als etwa 0,5% und häufig von 0,1% oder darunter vor.

8. Kationenaustauschchromatographie

Nach Einstellung des pH-Werts auf einen Bereich von 5 bis 7, vorzugsweise auf etwa 6, wird der in den konditionierten Medien vorliegende aktivierte TGF-β auf eine Kationenaustauschmatrix (gewöhnlich in Form einer Säule) unter Bedingungen, die so ausgewählt sind, daß für eine im wesentlichen vollständige Bindung des TGF-β gesorgt ist, aufgetragen. Während andere Proteine ebenfalls gebunden werden, liefert diese erste Bindungsstufe eine erste Trennstufe, da eine Reihe von verunreinigenden Proteinen in den konditionierten Medien nicht an die Matrix binden können und somit durch die Matrix hindurchfließen. Der TGF-β wird durch selektive Elution von der Matrix weitergereinigt, wobei die Elution entweder stufenweise oder mit einem linearen Gradienten erfolgen kann. In beiden Fällen wird die TGF-β-Fraktion zur weiteren, wie unten beschriebenen Reinigung gesammelt.
Zu den geeigneten Kationenaustauschmatrizes zählen viele verschiedene, mit kationischen Funktionalitäten derivatisierte Harze, die in der Lage sind, die anionischen Bereiche des TGF-β zu binden. Bevorzugt sind synthetische Harze, wie z. B. Styrol-Divinylbenzol- Beads, derivatisiert mit kationischen Funktionalitäten wie z. B. Carboxyl, Carboxymethyl, Sulfonyl, Phosphoryl, u. ä. Besonders geeignet sind relativ schwache Harze wie z. B. solche mit Carboxyl- oder Carboxymethylfunktionalitäten. Ein besonders bevorzugtes Harz ist das von der Firma J. T. Baker kommerziell erhältliche Baker Widepore CBX (Beadgröße 40 um).
Die Bindungs- und Elutionsbedingungen variieren je nach der Bindungsstärke des kationischen Harzes. Bei schwachen kationischen Harzen, wie z. B. Baker Widepore CBX, kann die Bindung bei niedriger Ionenstärke unter leicht sauren Bedingungen, typischerweise bei pH 5-7, vorzugsweise bei etwa 6, erfolgen. Nach dem Waschen der Matrix kann der TGF-β selektiv eluiert werden, indem man die Matrix einer mobilen Phase mit einer erhöhten Ionenstärke aussetzt, wobei entweder eine lineare oder eine stufenweise Elution verwendet wird. Im Falle des Baker Widepore CBX-Harzes eluiert TGF-β bei einem pH- Wert von etwa 6 mit einer Salzkonzentration zwischen etwa 400 mM und 800 mM NaCl. Die Säule kann danach leergewaschen und für einen folgenden Einsatz regeneriert werden.
Bei der bevorzugten Baker Widepore CBX-Matrix wird das Harz zu Anfang mit einem Puffer aus 50 bis 100 mM Natriumacetat, 0,5% Tween 80 bei pH 6 äquilibriert. Puffer wird bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,1 bis 0,5 Säulenvolumen pro Minute auf die Säule aufgetragen, bis sich der pH-Wert auf 6 stabilisiert hat. Das den aktivierten TGF-β enthaltende konditionierte Medium wird dann bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 0,5 bis 1,0 Säulenvolumen pro Minute auf die Säule aufgetragen, wobei typischerweise eine Zahnradpumpe verwendet wird. Zur Entfernung von Teilchen, die die Säulenmatrix verstopfen könnten, ist ein Filter vorgesehen. Die Säulenmatrix wird dann mit dem Äquilibrierungspuffer reäquilibriert, bis sich der pH Wert auf 6 stabilisiert hat, wofür typischerweise etwa 5 bis 8 Säulenvolumen erforderlich sind. Als nächstes wird ein Waschpuffer mit 100 mM Natriumacetat, 300 mM NaCl und 0,05% Tween 80 bei pH 6 und etwa 0,1 bis 0,2 Säulenvolumen pro Minute auf die Säule aufgetragen, bis sich der pH-Wert auf 6 stabilisiert hat. Als nächstes kann ein zweiter Puffer mit 100 mM Natriumacetat, 400 mM NaCl, 0,05% Tween 80 bei pH 6 in einer ähnlichen Weise auf die Säule aufgetragen werden. TGF-β wird dann von der Säule unter Verwendung eines Elutionspuffers mit 100 mM Natriumacetat, 800 mM NaCl, 0,05% Tween 80 ebenfalls bei pH 6 eluiert. Man läßt den Elutionspuffer solange laufen, bis der Puffer offensichtlich proteinfrei ist. Ein Strip-Puffer mit 200 mM Natriumacetat und 40% Ethanol, pH 6, wird dann auf die Säule aufgetragen, um die Matrix zu regenieren. Der Lagerungspuffer ist mit dem Resuspensionspuffer identisch.

9. Nukleinsäureabtrennung

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein neuartiges Verfahren zur Trennung von Nukleinsäuren von Protein- Nukleinsäure-Komplexen bereitgestellt. Während dieses Verfahren eine besondere Anwendung bei der Reinigung von TGF-β findet, darf angenommen werden, daß es auf verschiedene andere, rekombinant hergestellte Proteine, wie z. B. dem Gewebe-Plasminogenaktivator, breit anwendbar ist.
Im allgemeinen beruht das Verfahren auf der Bindung des gewünschten Protein-Nukleinsäure-Komplexes an eine Kationenaustauschmatrix der oben beschriebenen Art, vorzugsweise ein starkes Kationenaustauscherharz, mehr bevorzugt mit einer hohen Ligandendichte. Je nach dem betroffenen jeweiligen Protein wird die Bindung bei einem relativ niedrigen pH-Wert erreicht. Üblicherweise liegt der pH-Wert unterhalb von 7, noch üblicher unterhalb von etwa 6. Die Bindung wird unter den Bedingungen einer niedrigen oder mäßigen Ionenstärke durchgeführt. Die Kationenmatrix (negativ geladen) ist in der Lage, sowohl freies Protein (d. h. nicht mit DNA assoziiert) als auch DNA-Protein-Komplexe zu binden, wobei die Bindung über das Protein, das bei dem ausgewählten pH-Wert positiv geladen ist, stattfindet. Die DNA, bei einem pH-Wert von etwa 2,5, ist nicht in der Lage, unter den Bindungsbedingungen an die Kationenmatrix zu binden.
Nach der Bindung wird die Matrix einer mobilen Phase mit einem erhöhten pH-Wert und weitgehend derselben oder einer leicht erhöhten Ionenstärke ausgesetzt. Die Erhöhung des pH-Werts bzw. der Ionenstärke neigt dazu, die ionische Anziehung zwischen dem Protein und der Nukleinsäure zu reduzieren, während er nur eine minimale Wirkung auf die Bindung des Proteins an das kationische Harz hat. Der höhere pH-Wert erniedrigt die positive Ladungsmenge und erhöht die negative Ladungsmenge auf dem Protein, wodurch die positiv geladenen Stellen, die zur Wechselwirkung mit den Nukleinsäuren zur Verfügung stehen, reduziert werden. Damit das Verfahren funktioniert, muß das Ionenaustauscherharz eine ausreichende scheinbare Ligandendichte aufweisen, so daß es mit der DNA um die positiv geladenen Stellen auf dem Protein kompetieren kann. Die Ionenstärke der mobilen Phase muß hinreichend niedrig sein, um potentielle nicht ionische, sekundäre Wechselwirkungen zwischen dem gebundenen Protein und der DNA, z. B. hydrophobe Wechselwirkungen, zu minimieren.
Bei der Reinigung von TGF-β kann der Nukleinsäureabtrennungsschritt gleichzeitig mit der Bindung des TGF-β an die im Abschnitt 12 oben beschriebene Kationenaustauschmatrix durchgeführt werden. Der TGF-β wird auf die Säule bei etwa pH 6 aufgetragen, wobei die negativ geladenen Stellen auf der Matrix in der Lage sind, vorzugsweise das Protein relativ gegenüber der DNA zu binden. Freie DNA kann unter diesen Bedingungen überhaupt nicht an die Säule binden. Durch eine leichte Erhöhung der Ionenstärke, beispielsweise auf etwa 300 mM, wird nach vollständiger Bindung die in den Komplexen verbliebene DNA weitgehend entfernt.

10. Hydrophobe Wechselwirkungschromatographie

Die von der Kationenaustauschmatrix gesammelte TGF- β-Fraktion (mit oder ohne Entfernung von Nukleinsäuren) wird als nächstes auf eine Matrix mit hydrophober Wechselwirkung (gewöhnlich in Form einer Säule) unter Bedingungen, die die Bindung des TGF-β an die Matrix erlauben, typischerweise eine niedrige Tonenstärke und ein niedriger pH-Wert, aufgetragen. Der TGF-β wird dann selektiv eluiert, indem die Ionenstärke einer auf die Säule aufgetragenen mobilen Phase erhöht wird, wobei typischerweise ein linearer Gradient verwendet wird. Die TGF-β-Fraktion wird dann zur weiter unten beschriebenen Konzentration gesammelt.
Zu den geeigneten Matrizes mit hydrophober Wechselwirkung gehören viele verschiedene ungeladene Harze mit kovalent gebundenen hydrophoben Gruppen wie z. B. Propyl, Butyl, Octyl, Phenyl, u. ä. Bei den Harzen kann es sich um quervernetzte organische Polymere wie z. B. Styrol-divinylbenzol oder um einen beliebigen einer großen Vielfalt anderer geeigneter Träger auf Teilchenbasis handeln. Ein besonders bevorzugtes Harz ist das mit Butyl derivatisierte Baker Widepore C4 (40-um-Beads), das von der Firma J. T. Baker erhältlich ist.
Die Bindung an die hydrophobe Wechselwirkungssäule erfolgt unter den Bedingungen einer niedrigen Ionenstärke, üblicherweise bei einem sauren pH-Wert von 2 bis 3, noch üblicher bei etwa 2,5. Es wird im wesentlichen das gesamte Protein in der TGF-β-Fraktion von dem Ionenaustauscherharz an die Säule gebunden, und die Proteine lassen sich aufgrund der unterschiedlichen Stärke der hydrophoben Wechselwirkung mit den hydrophoben Gruppen auf der Matrix, d. h. mit ansteigender Hydrophobizität des Proteins, selektiv eluieren. Die Elution läßt sich mit einem Stufengradienten oder einem linearen Gradienten, gewöhnlich mit einem Salz- oder Alkohol-Elutionsmittel, vorzugsweise Alkohol, durchführen.
Bei der bevorzugten Baker Widepore C4-Matrix kann die Äquilibrierung mit einem Puffer mit 50 mM Glycin, 30% Ethanol bei einem pH-Wert von 2,5 durchgeführt werden. Die Matrix wird mit der TGF-β-Fraktion von der Ionenaustauschsäule geladen und dann mit dem oben beschriebenen Äquilibrierungspuffer reäquilibriert. Die Proteine werden dann mit einer Elutionspuffermischung mit einer von etwa 30% auf etwa 45% ansteigenden Ethanolkonzentration selektiv eluiert. Der TGF-β adsorbiert nach Durchlauf von ungefähr der Hälfte des Gradienten. Die Matrix läßt sich nicht wiederverwenden.

11. Mehrstufenkonzentration

Das von der hydrophoben Wechselwirkungssäule eluierte TGF-β-Produkt besitzt eine sehr hohe Produktreinheit, typischerweise von wenigstens etwa 95% und vorzugsweise von 99% oder höher. Das reine TGF-β-Produkt kann dann mit herkömmlichen Proteinkonzentrationsverfahren, wie z. B. Ultrafiltration und Durchlaufen einer nach Größe auftrennenden Säule, konzentriert werden. In der beispielhaften Ausführungsform wird der TGF-β von der Matrix mit hydrophober Wechselwirkung zunächst in einem Utrafiltrationssystem und danach durch Durchlaufen einer nach Größe auftrennenden Säule. Das Produkt von der nach Größe auftrennenden Säule wird dann durch eine zweite Ultrafiltrationsstufe und schließlich durch eine Sterilfiltrationsstufe geführt, um die Sterilität des Produkts sicherzustellen. Das Produkt kann dann in seiner konzentrierten Form bei einer niedrigen Temperatur, typischerweise von etwa 2 bis 7ºC, über einen Zeitraum von mehreren Monaten gelagert werden.

12. Gereinigte TGF-β1-Zusammensetzungen

Ein TGF-β1-Aktivitätstest beruht auf der Inhibierung der ³H-Aufnahme in Mink-Lungenepithelzellen (erhältlich von der Americal Tissue Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, Accession No. CCL 64. Die Zellen werden in Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) (Gibco), supplementiert mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) (Biofluids), Streptomycin (200 ug/ml) und Penicillin (200 U/ml), gehalten. Die Zellen werden in 75-cm²-Gewebekulturflaschen konfluent wachsen gelassen und dann trypsinisiert (trypsin/EDTA, Gibco). Die trypsinisierten Zellen werden mit etwa 5 · 10&sup4; Zellen/Well in einer Kulturplatte (Costar) ausplattiert. Nachdem die Zellen wiederum konfluent gewachsen sind, wird das Wachstumsmedium durch 0,5 ml EMEM mit 1% FBS und Antibiotika ersetzt. Nach einer Inkubation von 24 Std. bei 37ºC werden die TGFβ1-haltigen Testproben in das Wachstumsmedium gegeben und für weitere 18 Std. inkubiert. Nach Zugabe von ³H-Thymidin (ca. 2 uCl) zu den Test-Wells wird die Inkubation für weitere 4 Std. fortgesetzt. Die Medien werden dann entfernt und die Wells einmal mit 0,15 M NaCl gewaschen und anschließend mit kalter 10% TCA präzipitiert. Die entstandenen Pellets werden dann dreimal mit kaltem destilliertem Wasser gewaschen, mit 500 ul 1% SDS lysiert und dann ausgezählt.
Die spezifische Aktivität wird bestimmt, indem die CPM gegen die TGF-β1-Konzentration (ng/ml) aufgetragen werden. Die Hemmwirkungsaktivität jeder Probe wird als 50% effektive Dosis (ED&sub5;&sub0;) ausgedrückt. Eine Aktivitätseinheit ist definiert als die Menge an TGF-β1, die das Wachstum der Mink-Lungenepithelzellen um 50% inhibieren kann.
Bevorzugte, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gereinigte TGF-β1-Zusammensetzungen besitzen eine spezifischen Aktivität (gemessen wie gerade beschrieben) von wenigstens 10&sup7; U/mg, vorzugsweise wenigstens 1,5 · 10&sup7; U/mg und weiter bevorzugt wenigstens 2 · 10&sup7; U/mg.
Obwohl die vorstehende Erfindung zum Zwecke der Klarheit des Verständnisses ausführlich beschrieben wurde, versteht es sich, daß gewisse Modifikationen im Rahmen der als Anlage beigefügten Ansprüche ausgeführt werden können.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von "Transforming Growth Factor β" (TGF-β), umfassend die folgenden Schritte:

a) Perfusion von Kulturmedien durch eine Mikroträger-Bead-Matrix, die das Wachstum von zur Sekretion von TGF-β fähigen Zellen unterstützt, zur Herstellung von konditionierten Medien;

b) Trennen der konditionierten Medien von der Mikroträger-Bead-Matrix;

c) Aktivieren des TGF-β-Vorläufers mit dem biologischen Medium zur Produktion von aktivem TGF-β;

d) Auftragen des Mediums aus Schritt (c) auf eine Kationenaustauschmatrix, wodurch der aktive TGF-β sowie Nukleinsäurekomplexe mit dem TGF-β an die Matrix gebunden werden;

e) Entfernen der Nukleinsäuren aus den Nukleinsäurekomplexen mit TGF-β, während der TGF-β an die Kationenaustauschmatrix gebunden bleibt,

f) selektives Eluieren des aktiven TGF-β von der Kationenaustauschmatrix zur Herstellung eines Elutionsmediums;

g) Auftragen des Elutionsmediums aus Schritt (e) auf eine Matrix mit hydrophober Wechselwirkung, wodurch aktiver TGF-β an die Matrix mit hydrophober Wechselwirkung gebunden wird; und

h) selektives Eluieren des aktiven TGF-β von der Matrix mit hydrophober Wechselwirkung.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Säugerzellen zur Überproduktion von TGF-β rekombinant modifiziert sind.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Säugerzellen von einer "Chinese Hamster Ovary"-Zellinie abgeleitet sind.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Mikroträger- Bead-Matrix Beads mit Abmessungen im Bereich von etwa 50 bis 300 um umfaßt.