DE69027995T2 - Reinigungsverfahren von transformierendem wachstumsfaktor (tgf) - Google Patents
Reinigungsverfahren von transformierendem wachstumsfaktor (tgf)Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Reinigung des transformierenden Wachstumsfaktors β aus einer Säugerzellkultur.
- Der transformierende Wachstumsfaktor β (TGF-β) ist ein multifunktionelles Peptid, von dem gezeigt wurde, daß es bei der Regulierung einer großen Vielzahl von sowohl normalen als auch neoplastischen Zelltypen aktiv ist. Es ist ein Homodimer mit einem Molekulargewicht von 25.000, das aus 12.500 Untereinheiten besteht, die miteinander durch neun Disulfidbrücken verbunden sind, und es wird als 391 Aminosäuremolekül synthetisiert, das aus einem 29 Aminosäure-Leaderpeptid und einem latenten 362 Aminosäurevorläufer besteht. Das reife, aktive TGF-β besteht aus den C-ständigen 112 Aminosäuren des latenten Peptids. Das genaue Mittel der physiologischen Aktivierung ist nicht bekannt, und das reife Peptid ist nicht glycosyliert. Es gibt jedoch drei potentielle N-gekoppelte Glycosylierungsstellen in dem Vorläuferteil des Proteins, von denen alle benutzt zu sein scheinen.
- Es wurden mindestens fünf TGF-β beschrieben, einschließlich TGF-β 1, 2, 3 und 4. Die Sequenzhomologie zwischen den verschiedenen Formen des reifen TGF-β-Peptids liegt im Bereich von 64 bis 82%. Die Sequenzhomologie zwischen den Vorläufersequenzen ist etwas geringer und liegt im Durchschnitt bei etwa 40%. Alle sind funktionell homolog, obgleich es einen Unterschied bei den TGF-β-Rezeptor-Bindungseigenschaften gibt.
- Es wurde gezeigt, daß TGF-β ein wirksamer Zellwachstumspromotor, insbesondere bei Epithelzellen ist, und die Verwendung von TGF-β als Wundheilungsmittel wurde gezeigt.
- Es ist deshalb wünschenswert, Verfahren zur Reinigung von fermentiertem TGF-β aus einer Säugerzellkultur zu schatten. Die Fermentierungsverfahren sollten große Mengen an TGF-β, vorzugsweise mindestens 1 mg/L pro Tag erzeugen können, und die Reinigungsverfahren sollten solche Menge zu einem sehr hohen Grad, vorzugsweise einer Reinheit von 99% oder mehr reinigen knnen.
- Reifes TGF-β wurde in Labormaßstab aus dem konditionierten Medium von Erzeugerzellinien gereinigt. Ein 6-Schritt-Reinigungsverfahren, einschließlich Lyophilisierung, Säure-Resuspension, Gelfiltrierung, Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssig-Chromatographie (HPLC), SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und Extraktion, ist in Massague (1984) J. Biol. Chem., 259, 9756- 9761 beschrieben. Ein 8-Schritt-Reinigungsverfahren, einschließlich Lyophilisierung, Säureextraktion, Dialyse, Lyophilisierung, Gelfiltrierung, Kationenaustausch-HPLC und Umkehrphasen-HPLC, ist in Van den Eignden/Van Raaij et al. (1989) Biochem. J. 257, 375-382 beschrieben. Reifes TGF-β wurde auch aus verschiedenen Geweben und ganzen Zellen im allgemeinen unter Verwendung eines 4-Schritt-Verfahrens gereinigt, einschließlich Extraktion mit Säure und Ethanol, Gelfiltrierung, Kationenaustausch und Umkehrphasen-HPLC, siehe beispielsweise Asscian et al. (1983) J. Biol. Chem., 258, 7155-7160, Frolik et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80, 3676-3680 und Roberts et al. (1983), Biochem. 22, 5692-5698.
- Erfindungsgemäß wird das aktive TGF-β, das in dem konditionierten Medium vorhanden ist, das durch Fermentieren der Säugerzellinie hergestellt wird durch kationischen Ionenaustausch, gefolgt von einer hydrophoben Interaktionschromatographie unter Bedingungen, die zur Schaffung eines sehr gereinigten Produkts ausgewählt sind, gereinigt. Insbesondere wird das aktive TGF-β in dem konditionierten Medium auf eine Kationenaustauschmatrix unter Bedingungen aufgebracht, die zu einer im wesentlichen vollständigen Bindung des TGF-β an die Matrix führen. Das TGF-β wird dann selektiv eluiert und die das TGF-β enthaltende Fraktion wird gesammelt. Die gesammelte Fraktion wird dann auf die hydrophobe Interaktionsmatrix aufgebracht, und das TGF-β wird wiederum selektiv eluiert, was für eine große Reinheit, typischerweise von mehr als 95%, vorzugsweise v&n mehr als 99% sorgt. Das sich ergebende Produkt kann dann durch herkömmliche Techniken wie Ultrafiltrieren und Klassierungssäulenchromatographie konzentriert werden.
- Bei einem besonderen Aspekt der vorliegenden Erfindung können an TGF-β komplexierte Nukleinsäuren entfernt werden, um die Reinheit des Produkts weiter zu fördern. Nukleinsäuren sind sehr unerwünschte Verunreinigungen, insbesondere wenn das TGF-β zur Verwendung bei der Behandlung von Menschen bestimmt ist. Überraschenderweise kann das TGF-β aus den Komplexen aus Nukleinsäure und TGF-β freigesetzt werden, während das TGF-β an der Kationenaustauschmatrix gebunden ist. Ein anfängliches Binden des TGF-β an die Ionenaustauschmatrix wird unter Bedingungen geringer Ionenstärke und einem relativ neutralen pH-Wert bewirkt. Die Nukleinsäuren werden durch Anheben des pH-Werts oder einem leichten Erhöhen der Ionenstärke bei der mobilen Phase der Säule in einem ausreichenden Ausmaß freigesetzt, um die Nukleinsäurekomplexe zu zerstören, während das TGF-β in der Säule gebunden bleibt.
- Dieser Ansatz zur Entfernung der Nukleinsäuren aus den Komplexen aus Protein und Nukleinsäure ist im allgemeinen auf eine große Vielzahl von Proteinen anwendbar und nicht auf TGF beschränkt. Das Entfernen kann durchgeführt werden, indem der Komplex aus Protein und Nukleinsäure zuerst an eine Kationenaustauschmatrix gebunden wird, vorzugsweise ein starkes Kationenaustauschharz mit einer großen Kapazität und Ligandendichte. Die Komplexe werden unter Bedingungen geringer bis mäßiger Ionenstärke und eines mäßigen pH-Werts gebunden. Die Nukleinsäuren können aus den Komplexen freigesetzt werden, indem auf die Matrix eine mobile Phase mit einem ausreichend erhöhten pH-Wert oder einer leicht erhöhten Ionenstärke aufgebracht wird, um die Bindung zwischen den Nukleinsäuren und dem Protein zu zerstören. Indem im wesentlichen die gleiche Ionenstärke aufrechterhalten wird, wird die Bindung zwischen dem Protein und der Kationenmatrix aufrechterhalten. So können die Nukleinsäuren von dem Protein entfernt werden, während das Protein an dem Harz gebunden bleibt. Das Protein kann dann von der Kationenmatrix durch herkömmliche Eluierungsverfahren, typischerweise durch Erhöhen der Ionenstärke, eluiert werden.
- Unter einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden gereinigte TGF-β1-Zusammensetzungen mit einer spezifischen Aktivität von mehr als 10&sup7; U/mg (wie nachstehend definiert), vorzugsweise 1,5 x 10&sup7; U/mg, weiter bevorzugt 2 x 10&sup7; U/mg, geschaffen. Die gereinigten TGF-β1-Zusammensetzungen werden vorzugsweise durch das vorstehend beschriebene erfindungsgemäße Reinigungsverfahren hergestellt.
- Fig. 1 ist ein Blockdiagramm, das die Verarbeitungsschritte des erfindungsgemäßen Verfahrens zeigt.
- Unter Bezugnahme auf Fig. 1 wird TGF-β durch Fermentieren einer Säugerzellinie, die das TGF-β in ein konditioniertes Medium absondern kann, hergestellt. Das konditionierte Medium wird geerntet, und das TGF-β wird aktiviert und von anderen Proteinen und Verunreinigungen abgetrennt, indem das konditionierte Medium zuerst auf ein Kationenaustauschmedium aufgebracht wird, gefolgt von der selektiven Eluierung des TGF-β aus der Matrix. Wahlweise können Nukleinsäuren von den Komplexen aus TGF-β und Nukleinsäure entfernt werden, während das TGF-β an der Kationen-Ionenaustauschmatrix gebunden bleibt. Die durch selektives Eluieren aus der Kationen-Ionenaustauschmatrix erhaltene TGF-β-Fraktion wird dann auf eine hydrophobe Interaktionsmatrix aufgebracht, wo ein selektives Eluieren aus der Matrix einen zweiten Grad der Reinigung liefert. Das gereinigte TGF-β wird dann durch herkömmliche Techniken wie Ultrafiltrieren und Klassierungssäulenchromatographie gereinigt.
- Das Kulturmedium umfaßt ein Grundmedium, das für das Säugerzellwachstum geeignet ist, wie ein WEC-Medium. Für die Impfwachstumsphase wird das Grundmedium üblicherweise mit einer Serumquelle, typischerweise fötalemRinderserum (FBS) angereichert, das in einer Konzentration im Bereich von etwa 1 bis 10 Gew.-%, üblicherweise im Bereich von etwa 2 bis 5 Gew.-% vorhanden ist. Während der Perfusionswachstumsphase wird die FPS-Konzentration üblicherweise bei einer niedrigeren Konzentration gehalten, typischerweise im Bereich von etwa 0,1 bis 1%, üblicherweise bei etwa 0,5%. Während beider Wachstumsphasen sollte die Serumquelle behandelt werden, um proteolytische und andere Enzyme beispielsweise durch Kontaktieren des Serums mit Lysin-Sepharose zu behandeln wie in der gleichzeitig anhängigen, gemeinsam abgetretenen USSN 167.061, eingereicht am 11. März 1988, beschrieben ist, die hier durch Bezugnahme aufgenommen wird. Die Verwendung eines solchen "gereinigten" Serums hilft dabei, den Zerfall des in das konditionierte Medium abgesonderte TGF-β auf ein Minimum herabzusetzen und bewirkt weiterhin das Entfernen der Serumproteine, die sonst mit dem TGF-β gemeinsam gereinigt werden würden. Andere Wachstumsfaktoren können auch zugegeben werden wie Glutamin (wahlweise mit 400 mg/L). Aprotinin (üblicherweise mit 0,1 bis 10 klU/ml und vorzugsweise mit 1 bis 5 klU/ml) als Proteaseinhibitor, um das in das konditionierte Medium freigesetzte Produkt zu schützen.
- Zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignete Zellinien umfassen Säugerzellinien, die zum Haftwachstum auf Mikroträgerperlen fähig sind. Die Zellinien sind üblicherweise auch zum Wachstum in Suspensionskultur fähig, was die Fortpflanzung des anfänglichen Mikroträger-Inokulums erleichtern. Bestimmte Zellinien, die diese Erfordernisse erfüllen, umfassen Eierstockzellinien des chinesischen Hamsters (CHO).
- Eine besonders bevorzugte CHO-Zellinie ist β-3-2000, Klon 17, die in Dentry et al. (197) Mol. Cell Biol. 7, 3418-3427 beschrieben ist.
- Nach der Einstellung des pH-Werts auf den Bereich von 5 bis 7, vorzugsweise auf etwa 6, wird das aktivierte TGF-β in dem konditionierten Medium auf eine Kationenaustauschmatrix (üblicherweise in der Form einer Säule) unter Bedingungen aufgebracht, die ausgewählt sind, um für eine im wesentlichen vollständige Bindung des TGF-β zu sorgen. Während sich andere Proteine auch binden, sorgt die anfängliche Bindungsphase für einen ersten Grad der Trennung, da eine Anzahl der verunreinigenden Proteine in dem konditionierten Medium nicht fähig ist, sich an die Matrix zu binden, und so durch die Matrix fließt. Das TGF-β wird weiterhin durch selektives Eluieren aus der Matrix gereinigt, wobei das Eluieren entweder durch schrittweises Eluieren oder Lineargradienten-Eluieren durchgeführt werden kann. In beiden Fällen wird die TGF-β-Fraktion zum Zwecke einer weiteren Reinigung wie nachstehend beschrieben gesammelt.
- Geeignete Kationenaustauschmatrizen umfassen eine große Vielzahl von Harzen, die mit kationischen Funktionalitäten denvatisiert sind, die imstande sind, die anionischen Bereiche des TGF-β zu binden. Synthetische Harze wie Styrol-Divinylbenzol-Perlen, mit kationischen Funktionalitäten wie Carboxyl, Carboxymethyl, Sulfonyl, Phosphoryl und dergleichen derivatisiert, sind bevorzugt. Besonders brauchbar sind relativ schwache Harze wie jene mit Carboxyl- oder Carboxymethylfunktionalitäten. Ein besonders bevorzugtes Harz ist Baker Widepore CBX (40 µm Perlengröße), im Handel von J.T. Baker erhältlich.
- Die Bindungs- und Eluierungsbedingungen variieren in Abhängigkeit von der Bindungsstärke des kationischen Harzes. Bei schwachen kationischen Harzen wie Baker Widepore CBX kann die Bindung mit niedriger Ionenstärke unter leicht sauren Bedingungen, typischerweise einem pH-Wert von 5 bis 7, bevorzugt von etwa 6, durchgeführt werden. Nach Waschen der Matrix kann das TGF-β selektiv durch Aussetzen der Matrix an eine mobile Phase mit einer erhöhten Ionenstärke unter Verwendung eines linearen oder schrittweisen Eluierens eluiert werden. Bei dem Baker Widepore CBX Harz eluiert das TGF-β bei einem pH-Wert von etwa 6 mit einer Salzkonzentration zwischen etwa 400 mM und 800 mM NaCl. Die Säule kann dann abgestreift und zur späteren Verwendung regeneriert werden.
- Bei der bevorzugten Baker Widepore CBX-Matrix wird das Harz anfänglich mit einem Puffer von 50 bis 100 mM Natriumacetat, 0,5% Tween 80, auf einen pH-Wert von 6 äquilibriert Der Puffer wird auf die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,1 bis 0,5 Säulenvolumina pro Minute aufgebracht, bis sich der pH-Wert bei 6 stabilisiert. Das aktiviertes TGF-β enthaltende, konditionierte Medium wird dann typischerweise unter Verwendung einer Zahnradpumpe mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 0,5 bis 1,0 Säulenvolumina pro Minute aufgebracht. Ein Filter ist vorgesehen, um teilchenförmiges Material zu entfernen, das die Säulenmatrix verstopfen könnte. Die Säulenmatrix wird dann mit dem Äquilibrierungspuffer erneut äquilibriert, bis der pH-Wert bei 6 stabilisiert ist, was typischerweise etwa 5 bis 8 Säulenvolumina erfordert. Ein Waschpuffer, der 100 mM Natriumacetat, 300 mM NaCl und 0,05% Tween 80 mit einem pH-Wert von 6 enthält, wird dann mit etwa 0,1 bis 0,2 Säulenvolumina pro Minute auf die Säule aufgebracht, bis sich der pH-Wert bei 6 stabilisiert. Ein zweiter Puffer mit 100 mM Natriumacetat, 400 mM NaCl, 0,05% Tween 80 mit einem pH-Wert von 6 kann dann auf ähnliche Weise auf die Säule aufgebracht werden. Das TGF-β wird dann von der Säule unter Verwendung eines Eluierungspuffers mit 100 mM Natriumacetat, 800 mM NaCl, 0,05% Tween 80 auch bei einem pH-Wert von 6 eluiert. Der Eluierungspuffer wird fließen gelassen, bis der Puffer anscheinend frei von Protein ist. Ein Abstreifpuffer, der 200 mM Natriumacetat und 40% Ethanol, pH- Wert 6, enthält, wird dann auf die Säule aufgebracht, um die Matrix zu regenerieren. Der Aufbewahrungspuffer ist der gleiche wie der Resuspensionspuffer.
- Erfindungsgemäß wird ein neues Verfahren zur Abtrennung der Nukleinsäuren aus Komplexen aus Protein und Nukleinsäure geschaffen. Während dieses Verfahrens, das besonders bei der Reinigung von TGF-β verwendet wird, wird erwartet, daß es weiter auf eine Vielzahl anderer rekombinant hergestellter Proteine wie dem Gewebeplasminogenaktivator verwendet werden kann.
- Im allgemeinen stützt sich das Verfahren auf das Binden des betreffenden Komplexes aus Protein und Nukleinsäure an einer Kationenaustauschmatrix des vorstehend beschriebenen Typs, vorzugsweise einem starken Kationenaustauschharz, weiter bevorzugt mit einer hohen Ligandendichte. Die Bindung wird bei einem relativ geringen pH-Wert in Abhängigkeit von dem betroffenen, besonderen Protein erzielt. Üblicherweise liegt der pH-Wert unterhalb 7, noch üblicherweise liegt er unterhalb etwa 6. Die Bindung wird unter Bedingungen niedriger oder mäßiger Ionenstärke durchgeführt. Die (negativ geladene) Kationenmatrix kann sowohl freie Proteine (d.h. mit der DNA nicht verbunden) als auch DNA-Protein-Komplexe binden, wobei das Binden durch das Protein stattfindet, das bei dem gewählten pH-Wert positiv geladen ist. Die DNA mit einem pH-Wert von etwa 2,5 kann die Kationenmatrix unter den Bindungsbedingungen nicht binden.
- Nach der Bindung wird die Matrix einer mobilen Phase mit einem erhöhten pH-Wert und im wesentlichen der gleichen oder einer leicht erhöhten Ionenstärke ausgesetzt. Die Erhöhung des pH-Werts oder der Ionenstärke neigt dazu, die Ionenzugkraft zwischen dem Protein und der Nukleinsäure zu verringern, während sie eine minimale Wirkung auf die Proteinbindung an dem Kationenharz hat. Der höhere pH-Wert verringert die Menge an positiver und erhöht die Menge an negativer Ladung an dem Protein, wodurch die positiv geladenen Stellen verringert werden, die verfügbar sind, um mit den Nukleinsäuren in Interaktion zu treten. Damit das Verfahren funktioniert, muß das Ionenaustauschharz eine ausreichende Scheinligandendichte aufweisen, um mit der DNA mit Bezug auf die positiv geladenen Stellen an dem Protein zu konkurrieren. Die Ionenstärke der mobilen Phase muß ausreichend gering sein, um potentielle nichtionische sekundäre Wechselwirkungen zwischen dem Protein, das gebunden wird, und der DNA, beispielsweise hydrophobe Interaktionen, auf einminimum herabzusetzen.
- Bei der Reinigung des TGF-β, kann der Nukleinsäureabtrennungsschritt gleichzeitig mit der Bindung des TGF-β an die Kationenaustauschmatrix erfolgen, die vorstehend in Abschnitt 12 beschrieben ist. Das TGF-β wird mit einem pH-Wert von etwa 6 auf die Säule beschickt, wo die negativ geladenen Stellen an der Matrix fähig sind, das Protein hinsichtlich der DNA bevorzugt zu binden. Freie DNA kann sich überhaupt nicht an die Säule unter diesen Bedingungen binden. Durch geringe Erhöhung der Ionenstärke, beispielsweise auf etwa 300 mM, nach Beendigung der Bindung wird die in den Komplexen verbleibende DNA im wesentlichen entfernt.
- Die aus der Kationenaustauschmatrix gesammelte TGF-β-Fraktion (mit oder ohne Nukleinsäureentfernung) wird dann auf eine hydrophobe Interaktionsmatrix (üblicherweise in der Form einer Säule) unter Bedingungen aufgebracht, die das Binden des TGF- β an die Matrix gestatten, typischerweise niedrige Ionenstärke und niedriger pH-Wert. Das TGF-β wird dann durch Erhöhen der Ionenstärke einer auf die Säule aufgebrachten mobilen Phase typischerweise unter Verwendung eines linearen Gradienten selektiv eluiert. Die TGF-β-Fraktion wird zur Konzentration wie nachstehend beschrieben gesammelt.
- Geeignete hydrophobe Interaktionsmatrizen umfassen eine große Vielzahl von ungeladenen Harzen mit kovalent gebundenen hydrophoben Gruppen wie Propyl, Butyl, Octal, Phenyl und dergleichen. Die Harze können vernetzte organische Polymere wie Styrol-Divinylbenzol oder irgendeines einer großen Vielzahl anderer geeigneter teilchenförmiger Träger sein. Ein besonders bevorzugtes Harz ist Baker Widepore C4 (40 µm Perlen), das mit Butyl derivatisiert ist und von J.T. Baker erhältlich ist.
- Das Binden an die hydrophobe Interaktionssäule erfolgt unter Bedingungen geringer Ionenstärke, üblicherweise bei einem sauren pH-Wert von 2 bis 3, noch üblicherweise von etwa 2,5. Im wesentlichen das gesamte Protein in der TGF-β-Fraktion aus dem Ionenaustauschharz wird an die Säule gebunden, und die Proteine können aufgrund von unterschiedlichen Stärken der hydrophoben Interaktion mit den hydrophoben Gruppen an der Matrix selektiv eluiert werden, d.h. zur Erhöung der Hydrophobie des Proteins. Das Eluieren kann mit einem schrittweisen oder linearen Gradienten, üblicherweise mit einem Salz- oder Alkoholeluierungsmittel, vorzugsweise Alkohol, durchgeführt werden.
- Mit der bevorzugten Baker Widepore C4 Matrix kann die Äquilibrierung mit einem Puffer mit 50 mM Glycin, 30% Ethanol bei einem pH-Wert von 2,5 durchgeführt werden. Die Matrix wird mit der TGF-β-Fraktion aus der Ionenaustauschsäule beschickt und dann mit dem vorstehend beschriebenen Äquilibrierungspuffer reäquilibriert. Proteine werden dann selektiv mit einer Eluierungspuffermischung mit einer Ethanolkonzentration, die sich von etwa 30% auf etwa 45% erhöht, eluiert. Das TGF-β adsorbiert bei etwa dem Mittelpunkt des Gradienten. Die Matrix ist nicht wieder verwendbar.
- Das aus der hydrophoben Interaktionssäule eluierte TGF-β-Produkt hat eine sehr große Produktreinheit, typischerweise mindestens etwa 95% und vorzugsweise 99% oder mehr. Das reine TGF-β-Produkt kann dann durch herkömmliche Proteinkonzentrierungsverfahren konzentriert werden wie Ultrafiltrierung und Durchlauf durch eine Klassierungssäule. Bei der beispielhaften Ausführungsform wird das TGF-β aus der hydrophoben Interaktionsmatrix zuerst durch ein Ultrafiltrierungsystem geleitet, gefolgt von einem Durchlauf durch eine Klassierungssäule. Das Produkt aus der Klassierungssäule wird durch eine zweite Stufe der Ultrafiltrierung und schließlich durch eine Stufe der sterilen Filtrierung geleitet, um die Sterilität des Produkts sicherzustellen. Das Produkt kann dann in seiner konzentrierten Form bei einer geringen Temperatur, typischerweise von etwa 2 bis 7ºC, während eines Zeitraums von mehreren Monaten gelagert werden.
- Ein Assay mit Bezug auf TGF-β1-Aktivität beruht auf der Hemmung der H³-Aufnahme in Epithelzellen der Nerzlunge (erhältlich von Americal Tissue Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, Zugangsnummer CCL 64. Die Zellen werden in Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) Gibco), angereichert mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) (Biofluids), Streptomycin (200 µg/ml) und Penicillin (200 U/ml) gehalten. Die Zellen werden in 75 cm² Gewebekulturkolben bis zur Konfluenz wachsengelassen und dann trypsiniert (Trypsin/EDTA, Gibco). Trypsinierte Zellen werden mit etwa 5 x 10&sup4; Zellen/Vertiefung in einer Kulturschale (Costar) aufgebracht. Nachdem sie wieder eine Konfluenz erreicht hatten, wurde das Wachstumsmedium durch 0,5 ml EMEM, das 1% FBS und Antibiotika enthielt, ersetzt. Nach Inkubieren während 24 Stunden bei 37ºC wurden Testproben, die TGF-β1 enthielten, dem Wachstumsmedium zugegeben und weitere 18 Stunden inkubiert. Nach Zugabe von H³- Thymidin (etwa 2µCi) zu den Testvertiefungen, wird die Inkubierung während weiterer 4 Stunden fortgesetzt. Das Medium wird dann entfernt und die Vertiefungen werden einmal mit 0,15 M NaCl, gefalgt von einer kalten 10%-igen TCA-Ausfällung gewaschen. Die sich ergebenden Pellets werden dann dreimal mit kaltem destillierten Wasser gewaschen, mit 500 µL 1% SDS lysiert und dann gezählt.
- Die spezifische Aktivität wird bestimmt durch Plotten von CPM gegen die Konzentration des TGF-β1 (ng/ml) bestimmt. Die Hemmwirkungsaktivität jeder Probe wird als 50%-ige Wirkdosis (ED&sub5;&sub0;) ausgedrückt. Eine Aktivitätseinheit wird als die Menge TGF-β1 definiert, die das Wachstum der Epithelzellen der Nerzlunge um 50% inhibieren kann.
- Bevorzugte TGF-β1-Zusammensetzungen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren gereinigt wurden, haben eine spezifische Aktivität (gemessen wie gerade beschrieben) von mindestens 10&sup7; U/mg, vorzugsweise mindestens 1,5 x 10&sup7; U/mg, und weiter bevorzugt mindestens 2 x 10&sup7; U/mg.
- Obgleich die vorstehende Erfindung detailliert zum Zwecke des klaren Verständnisses beschrieben wurde, ist offensichtlich, daß innerhalb des Umfangs der beiliegenden Ansprüche bestimmte Änderungen durchgeführt werden können.
Claims (9)
1. Ein Verfahren zur Reinigung des transformierenden Wachstumsfaktors β (TGF-β) aus
einem biologischen Medium, besagtes Verfahren umfaßt die folgenden Stufen:
(a) Aktivieren des Precursor TGF-β innerhalb des biologischen Mediums zur
Herstellung aktiven TGF-β;
(b) Aufbringen des Mediums aus Stufe (a) auf eine Kationenaustauscher-Matrix,
wobei das aktive TGF-β und Nukleinsäurekomplexe mit dem TGF-β an die Matrix
gebunden sind;
(c) Entfernen der Nukleinsäuren von den Nukleinsäurekomplexen mit TGF-β,
während das TGF-β an der Kationenaustauscher-Matrix gebunden bleibt;
(d) Selektives Eluieren des aktiven TGF-β von der Kationenaustauscher-Matrix zur
Herstellung eines Elutionsmediums;
(e) Aufbringen des Elutionsmediums aus Stufe (c) auf eine hydrophobe
Interaktionsmatrix, wobei aktives TGF-β an die hydrophobe Interaktionsmatrix
gebunden wird; und
(f) Selektives Eluieren des aktiven TGF-β von der hydrophoben Interaktionsmatrix.
2. Verfahren wie in Anspruch 1, worin die Nukleinsäuren in Stufe (c) durch Erhöhung des
umgebenden pH-Wertes um die Matrix herum entfernt werden, bei gleichbleibender oder
leicht erhöhter Ionenstärke der im wesentlichen unveränderten Umgebung.
3. Ein Verfahren wie in den Ansprüchen 1 oder 2, worin das TGF-β selektiv durch
Erhöhung der Ionenstärke der Umgebung um die Matrix herum eluiert wird.
4. Ein Verfahren wie in Anspruch 1, worin der Precursor TGF-β durch Säurebehandlung
oder durch Hitze aktiviert ist.
5. Ein Verfahren wie in Anspruch 1, worin das Medium aus Stufe (a) auf eine starke
Kationenaustauscher-Matrix in Stufe (b) bei einem pH-Bereich um 5 bis 7 und einer
geringen Ionenstärke aufgetragen wird.
6. Ein Verfahren wie in Anspruch 5, worin das TGF-β in Stufe (d) selektiv durch
Erhöhung der Ionenstärke der Umgebung um die Matrix herum eluiert wird, während der
pH-Wert in einem Bereich um 5 bis 7 beibehalten wird.
7. Ein Verfahren wie in Anspruch 1, worin das Elutionsmedium aus Stufe (d) auf eine
hydrophobe Interaktionsmatrix in Stufe (e) unter sauren pH-Bedingungen aufgebracht
wird.
8. Ein Verfahren wie in Anspruch 7, worin das aktive TGF-β selektiv von der
hydrophoben Interaktiosmatrix in Stufe (f) durch Aufbringung eines Elutionsgradienten
mit aufsteigerter Alkoholkonzentration eluiert wird.
9. Ein Verfahren wie in Anspruch 8, worin die Fraktion mit der maximalen Konzentration
an TGF-β gesammelt wird.
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