DE69033214T2

DE69033214T2 - Neuronale nikotinacetylcholinrezeptorzusammensetzungen enthaltend die beta-4 subeinheit

Info

Publication number: DE69033214T2
Application number: DE69033214T
Authority: DE
Inventors: Evan Samuel Deneris; Robert Michael Duvoisin; Stephen Heinemann; James Patrick
Original assignee: Salk Institute for Biological Studies
Current assignee: Salk Institute for Biological Studies
Priority date: 1989-03-14
Filing date: 1990-03-14
Publication date: 1999-12-09
Anticipated expiration: 2010-03-15
Also published as: EP0463064B1; DK0463064T3; WO1990010648A1; JPH04504123A; US5789196A; CA2047683A1; EP0463064A1; EP0463064A4; DE69033214D1; ATE182360T1; JP3102877B2; CA2047683C

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft im allgemeinen neuronale Nicotinacetylcholinrezeptor-Gene und Proteine. Insbesondere betrifft die Erfindung eine neue Untereinheit in der Familie der neuronalen Nicotinacetylcholinrezeptoren. Die neue Untereinheit, die beta4 (β4) genannt wird, kann mit bekannten Untereinheiten, einschließlich den Untereinheiten vom alpha- Typ α2, α3 und α4 und der Untereinheit vom beta-Typ β2 (in der Gegenwart von mindestens einer alpha-Untereinheit) reagieren, um zuvor unbekannte funktionelle Rezeptoren zu bilden.

Hintergrund

Die Verschiedenheit von Neurotransmitterrezeptoren ist wesentlich größer als durch pharmakologische und physiologische Untersuchungen angenommen worden ist. Zwei Gen-Überfamilien codieren alle klonierten Neurotransmitterrezeptoren: eine ist die Protein-G gebundene Rezeptorüberfamilie und die andere ist die Überfamilie des Ionenkanals mit Ligandenschranke (Rezensionen siehe Hall, 1987; Barnard et al., 1987). alle Rezeptoren, die über ein Protein-G wirken, zum Beispiel die muskarinartigen Acetylcholinrezeptoren, die Dopaminrezeptoren und die β-adrenergen Rezeptoren, werden durch eine einzige Polypeptidkette gebildet, von der angenommen wird, daß sie die Plasmamembran mehrere Male umspannt. Für jede Rezeptorklasse codiert eine Genfamilie eng verwandte Varianten, die unterschiedliche pharmakologische und physiologische Eigenschaften und verschiedene Verteilungsmuster im Nervensystem haben.
Im Gegensatz zu der Protein-G Überfamilie setzen sich die Ionenkanäle mit Ligandenschranke aus mehr als einer Untereinheit zusammen. Die Expressionsuntersuchungen haben gezeigt, daß die Verschiedenheit der Rezeptoren mit Ligandenschranke auf die Gegenwart der gleichen Untereinheiten in verschiedenen Kombinationen zurückzuführen ist. außerdem codieren mehrere Gene jeden Untereinheitstyp. Zum Beispiel wurden drei Typen von GABAA Rezeptoruntereinheiten, α, β und γ, beschrieben und zumindest im Fall der α und β Untereinheiten codieren verschiedene Gene unterschiedliche Subtypen (Schofield et al., 1987, Levitan et al., 1988, Pritchett et al., 1989). In transienten Transfektionsassays können funktionelle Rezeptoren entweder durch die α oder β Untereinheit allein oder in gepaarten Kombinationen gebildet werden (Pritchett et al., 1988). Die Gegenwart der γ Untereinheit scheint jedoch für die Benzodiazepin- Empfindlichkeit erforderlich zu sein (Pritchett et al., 1989).
Ein Weg zur aufklärung der funktionellen Verschiedenheit der Nicotinacetylcholinrezeptoren (NACHRS) im Nervensystem ist die verschiedenen nAChR Untereinheiten auf dem Molekularniveau zu identifizieren. Die Pharmakologie und die Einzelkanaleigenschaften der klonierten Untereinheiten, die in verschiedenen Kombinationen in transfizierten Zellen oder in Eizellen des Xenopus exprimiert werden, können anschließend untersucht werden. Durch den Vergleich dieser Ergebnisse mit ähnlichen Untersuchungen, die in vivo durchgeführt werden, können die neuronalen Nicotinwege besser verstanden werden. Bei der Verfolgung dieses Ziels hat das Molekularneurobiologie-Labor des Salk Institute for Biological Studies cDNA-Klone von Ratten isoliert, die vier verschiedene neuronale nAChR Untereinheiten: α2, α3, α4 und β2 kennzeichnen (siehe US 5 371 188 und Wada et al., 1988; Boulter et al., 1986; Goldman et al., 1987; Deneris et al., 1988). Kürzlich wurden zwei weitere Klone, die mit den neuronalen nAChRs eng verwandt sind, aber für die bis jetzt keine Wirkung festgestellt wurde, identifiziert. Sie werden als α5 und β3 bezeichnet (US 5 371 188 und Boulter et al., 1990; Deneris et al., 1989). Die vorliegende Beschreibung offenbart eine weitere unterschiedliche neuronale nAChR Untereinheit, beta4. Bei der Identifizierung des Gens, das diese Untereinheit codiert, wurden Genombibliotheken von Ratten mit neuronalem nAChR cDNA-Sonden gescreent. Die Gene verschiedener zuvor beschriebener nAChR Untereinheiten wurden isoliert, und ihre Restriktionskarten wurden bestimmt. Ein rekombinanter Phage, der einen Teil des Gens für eine neue nAChR Untereinheit enthält, wurde außerdem isoliert. Die Primärstruktur dieser Untereinheit wurde von der Nucleotidsequenz eines cDNA-Klons abgeleitet. Die Expressionsuntersuchungen, bei denen die Eizellen des Xenopus verwendet wurden, haben gezeigt, daß diese Untereinheit sich mit den neuronalen α2, α3 und α4 Untereinheiten unter Bildung von funktionellem nAChRs verbinden kann.
Die neuronalen nAChR Untereinheiten sind eng verwandt und bilden eine Untergruppe der nAChR Genfamilie, die auch die Nicotinrezeptoren einschließt, die in dem Torpedo elektrischen Organ und an der neuromuskulären Verbindung des Wirbeltiers vorhanden sind. Der letztere wird durch Pentamerzusammenführung von vier homologen Untereinheiten gebildet: zwei α- Ligandbindenden Untereinheiten und jeweils eine der β, γ und δ Untereinheiten (Reynolds and Karlin, 1978). Es gibt Beweise, daß während der Entwicklung neue Nicotinrezeptoren, die eine &epsi; Untereinheit anstelle einer γ Untereinheit enthalten, an der neuromuskulären Endplatte eingeführt werden (Gu and Hall, 1988). In Übereinstimmung mit dieser neuen Population wird eine Erhöhung in dem Kanalleitvermögen beobachtet (Sakmann and Brenner, 1978; Mishina et al., 1986). Funktionelle neuronale nAChRs können hergestellt werden durch Coinjektion von RNA, die eine β2 Untereinheit und entweder eine α2, eine α3 oder eine α4 Untereinheit codieren, in die Eizellen des Xenopus (US 5 371 188 und Boulter et al., 1987; Wada et al., 1988). Whiting und Lindstrom (1986, 1987) haben vorgeschlagen, daß die in dem peripheren und zentralen Nervensystem festgestellten Nicotinrezeptoren nur aus zwei verschiedenen Untereinheiten, einer α und einer β Untereinheit in einer bis jetzt noch nicht bestimmten Stöchiometrie zusammengesetzt sind. Es besteht jedoch weiterhin die Möglichkeit, daß nAChRs aus mehr als zwei unterschiedlichen Untereinheiten zusammengesetzt sind.
Für den Fachmann ist verständlich, daß die Kenntnisse der molekularen Mechanismen, die an der Neurotransmission in dem zentralen Nervensystem beteiligt sind, auf die Komplexität dieses Systems beschränkt sind. Die Zellen sind klein, weisen umfassende Vorgänge auf und besitzen häufig tausende von Synapsen, die von Inputs von vielen unterschiedlichen Teilen des Gehirns abstammen. außerdem ist die tatsächliche Zahl der Neurotransmitterrezeptoren klein, wodurch ihre Reinigung sogar unter den besten Voraussetzungen erschwert wird. Folglich waren sowohl die zellulären als auch biochemischen Verfahren zur Untersuchung der Neurotransmission im zentralen Nervensystem nicht besonders ergiebig. Das ist schade, da höchstwahrscheinlich die Behandlung von Demenz, alzheimer-Krankheit und anderer Formen der Geisteskrankheit die Modifikation der synaptischen Transmission mit spezifischen Medikamenten umfaßt.
Die Erkenntnis, daß die Nicotinacetylcholinrezeptoren viel unterschiedlicher sind als zunächst erwartet wurde, bietet eine Gelegenheit für eine pharmazeutische Intervention und eine Chance, neue Medikamente zu entwerfen, die eine Wirkung auf spezifische Rezeptoruntereinheiten haben. Solche Subtypen machen es möglich, die Wirkung eines Medikaments in Bezug auf einen bestimmten Subtypen zu beobachten.
Informationen, die aus diesen Beobachtungen abgeleitet werden können, ermöglichen die Entwicklung neuer Medikamente, die spezifischer sind und daher weniger unerwünschte Nebenwirkungen aufweisen.
Außerdem ermöglicht das zur Verfügung stellen dieser neuronalen Rezeptoren die Durchführung eines ersten in vitro Screenens des Medikaments. Obwohl es stimmt, daß das Medikament letztlich im ganzen Tier wirken muß, ist es möglich, daß nützliche Medikamente übersehen werden, da das herkömmliche Screenen auf durchschnittliche Wirkungen von Mischungen beschränkt ist. Folglich ist es gut möglich, daß die Fähigkeit, Medikamente in vitro in Bezug auf spezifische(n) Rezeptor-Subtyp(en) zu screenen, informativer ist, als lediglich das Medikament in den ganzen Tieren zu screenen. Sowohl die DNA der Rezeptoruntereinheit als auch das codierte Protein/die Proteine dieser Erfindung können für den Entwurf von Medikamenten und zum Screenen verwendet werden. Zum Beispiel kann der cDNA-Klon, der nur die β4 Untereinheit codiert oder zusammen mit verschiedenen Klonen der α Untereinheit oder anderen Klonen von Untereinheiten, die schon bekannt sind oder erst später entdeckt werden, in vitro zur Herstellung von mRNA transkribiert werden. Diese mRNA, entweder von einem einzelnen Untereinheitsklon oder von einer Kombination von Klonen, kann in Eizellen injiziert werden, wo die mRNA die Synthese des Rezeptorproteins steuert.
Alternativ können die Klone stromabwärts der geeigneten Genregulationselemente plaziert und in das Genom von eukaryontischen Zellen eingeführt werden. Dies führt in transfizierten Zellinien zur Expression eines spezifischen Rezeptorsubtyps oder von spezifischen Kombinationen von Subtypen. Die davon abstammenden Zellinien können anschließend in einer Menge für die reproduzierbare quantitative Analyse der Wirkungen der Medikamente auf die Rezeptorfunktion hergestellt werden.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Die Abbildung umfaßt 6 Figuren:
Fig. 1: ist eine schematische Abbildung, die die Restriktionskarten und die Sequenzierungsstrategien zeigt. A ist die Restriktionskarte von einem Teil des Genominserts λDD15. Der fette Strich zeigt den fünften Exon-codierenden Bereich. B ist eine Vergrößerung dieses Exons, wobei die Pfeile auf das Ausmaß und die Richtung der Nucleotidsequenzierungsreaktionen hinweisen. C zeigt pGDD15, ein Plasmid, das zur Herstellung von β4- spezifischen Sonden verwendet wird, pGDD15 enthält eine NcoI-SalI Fragment von λDD15, das ein nicht konserviertes Segment der zytoplasmatischen Domäne codiert. D zeigt eine Restriktionskarte eines Teils des cDNA Inserts von λZPC13 und seine in vivo ausgeschnitte Plasmidversion pZPC13 und die Sequenzierungsstrategie. Siehe den Experimententeil dieser Beschreibung. Der fette Strich identifiziert den codierenden Bereich und die feine Linie stellt die 5' und 3' nicht translatierten Bereiche dar. SP6, T3 und T7 beziehen sich jeweils auf die SP6, T3 und T7 Transkriptionspromotoren.
Fig. 2: ist eine Photographie, die eine Analyse der Verteilung der β4 Transkripte durch in situ Hybridisierungshistochemie zeigt. Koronale Abschnitte des Gehirns einer erwachsenen Ratte (30 um dick) wurden mit ³&sup5;S radioaktiv markiertem Sinn- und Antisinn Strangsonden, die jeweils von KpnI- und BamHI-linearisiertem pGDDlS abstammen, · hybridisiert (siehe Fig. 1C). A zeigt, daß nur Abschnitte vom Thalamus, wie der hier gezeigte, Signale über dem Hintergrund durch Röntgenfilmautoradiographie ergaben. In parallelen Experimenten wurde eine Sinn-Sonde mit danebenliegenden Abschnitten hybridisiert und ergab Hintergrundhybridisierungswerte (Daten sind nicht gezeigt). B ist eine DunkelfeldNikrophotographie einer medialen Habenula von einem Abschnitt, der mit dem in A gezeigten nach dem Emulsionseintauchen identisch ist.
Fig. 3: ist eine schematische Abbildung, die die Nucleotidsequenz und die abgeleitete Aminosequenz λZPC13 zeigt. Die Genomnucleotidsequenzen an den Splicestellen und an der Substitutionsstelle (720) sind über der cDNA-Sequenz in Kleinbuchstaben gezeigt. Die vertikalen Striche weisen auf die vorhergesagten Splicestellen hin. Die Kernstelle einer DNA-Sequenz, die sich dreimal wiederholt, befindet sich in dem grauen Kasten. Die mutmaßlichen Membran-umspannenden Bereiche (MSRs) sind gezeigt. Das Polyadenylierungssignal ist unterstrichen. Eine Schere weist auf die vorhergesagte Signalpeptidspaltstelle hin. Ein Sternchen weist auf mutmaßliche N-gebundene Glykosylierungsstellen hin.
Fig. 4: ist eine schematische Abbildung, die die Aminosäurenanordnung der neuronalen Untereinheiten vom β-Typ der Ratte zeigt. Mit der β4 Untereinheit sind die β2 (US 5 371 188 und Deneris et al., 1988) und β3 (US 5 371 188 und Deneris et al., 1989) Sequenzen aufgeführt. Die identischen Reste in allen drei Untereinheiten sind auf schwarzem Hintergrund gezeigt. Konservative Unterschiede sind auf grauem Hintergrund gezeigt. Die mutmaßlichen Signalpeptide und Membran-umpannenden Bereiche sind unter den Sequenzen angegeben. Der Bereich, der als extrazelluläre Domäne bezeichnet wird, befindet sich zwischen dem Aminoterminus und MSR I, und die mutmaßliche cytoplasmatische Domäne befindet sich zwischen MSR III und MSR IV. Die Numerierung ist die von der Vorläufer β4 Untereinheit.
Fig. 5: zeigt die elektrophysiologischen aufzeichnungen der Eizellen des Xenopus, die mit in vitro synthetisierter RNA, die nAChR Untereinheiten in den angezeigten Kombinationen codiert, injiziert sind. Die jeweiligen Reaktionen, die durch Acetylcholin und Nicotinstimulierungen in den angegebenen Konzentrationen ausgelöst werden, sind gezeigt. Die potentiellen Messungen wurden mit einem digitalen Spannungsmesser verfolgt und auf einem Gould-Meßschreiber aufgezeichnet. Die Spannungskurven wurden gescannt und unter Verwendung eines Computers gedruckt.
Fig. 6: zeigt die Spannungsaufzeichnungen von Eizellen des Xenopus, die mit α3 und entweder mit α2 oder α4 injiziert sind, vor und nach dem ausgesetztsein bei ungefähr 0,1 uM 3,1 Bgt. Die jeweiligen durch Acetylcholin und Nicotinstimulierungen ausgelösten Reaktionen bei angegebenen Konzentrationen sind gezeigt. Die potentiellen Messungen wurden mit einem digitalen Spannungsmesser durchgeführt und auf einem Gould-Meßschreiber aufgezeichnet. Die Spannungsspuren wurden gescannt und unter Verwendung eines Computers gedruckt.

Definitionen

In der Beschreibung und den Ansprüchen wird Bezug genommen auf ausdrücke und Begriffe des Standes der Technik, die hier wie folgt ausdrücklich definiert sind;
nAChR bedeutet hier den Nicotinacetylcholinrezeptor.
Eine Agonist-bindende Untereinheit ist hier eine Untereinheit eines Acetylcholinrezeptors, der eine Bindungsstelle für den Neurotransmitter Acetylcholin und dessen Analoga enthält.
Eine mutmaßliche neuronale nAChr Untereinheit, die durch cDNA-Klonierung isoliert wird, ist als "alpha" (α) Untereinheit bezeichnet, wenn die Cysteine 128, 142, 192 und 193 der Torpedo alpha Untereinheit konserviert sind. Einige alpha Untereinheiten sind als Agonist-bindende Untereinheiten bekannt, von anderen wird angenommen, daß sie Agonistbindende Untereinheiten sind, was auf der Tatsache basiert, daß sie die konservierten Cysteine an den Positionen 128, 142, 192 und 193 enthalten. Die bekannten α-Typ Agonistbindende Untereinheiten umfassen alphal, alpha4 (alpha4.1 und alpha4.2), α-Typ Agonist-bindende Untereinheiten, von denen erwartet wird, daß sie solche sind, umfassen α2, α3 und α5.
Eine mutmaßliche neuronale nAChR Untereinheit, die durch cDNA-Klonierung isoliert wird, wird als "beta" (β) Untereinheit bezeichnet, wenn nur die Cysteine 128 und 142 des Torpedos konserviert sind. Bekannte β Untereinheiten umfassen beta1, beta2 und beta3. Die erfindungsgemäße neue beta Untereinheit ist beta4.
Der ausdruck Antagonist, wenn er hier verwendet wird, bedeutet eine Substanz, die die Rezeptorwirkung beeinflußt. Es gibt zwei Typen von Antagonisten: kompetitive und nicht kompetitive. Ein kompetitiver Antagonist (oder kompetitiver Blocker) konkurriert mit dem Neurotransmitter um die gleiche Bindungsstelle. Im Fall von Acetylcholin ist ein Beispiel eines solchen Antagonisten 3.1 Bungarotoxin. Ein nicht kompetitiver Antagonist oder Blocker inaktiviert die Wirkung des Rezeptors durch Bindung an eine Stelle außer der Acetylcholinbindungsstelle.
Alpha1 bedeutet hier ein DNA-Segment, das eine Agonistbindende Untereinheit des gleichen Namens codiert. Diese Untereinheit wird im Skelettmuskel und dem Torpedo elektrischen Organ exprimiert.
Alpha2 bedeutet hier ein DNA-Segment, das im Huhn und der Ratte identifiziert worden ist, und das eine neuronale nAChR Untereinheit des gleichen Namens codiert. Die DNA, die die alpha2 Untereinheit codiert, ist bei der ATCC hinterlegt worden, die DNA (pHYP16 genannt) hat die ATCC Nr. 67646.
Alpha3 bedeutet hier ein DNA-Segment, das eine neuronale nAChR Untereinheit des gleichen Namens codiert. Diese Untereinheit wird in der PC12 Zellinie und verschiedenen Bereichen des Säugergehirns exprimiert. Die DNA, die die alpha3 Untereinheit codiert, ist bei der ATCC hinterlegt worden, die DNA (pPCA48 genannt) hat die ATCC Nr. 67642.
Alpha4 bedeutet hier ein DNA-Segment, das eine neuronale Agonist-bindende Untereinheit des gleichen Namens codiert. Die cDNA-Klone, die die Proteine codieren, und die hier als alpha4.1 und alpha4.2 bezeichnet sind, stanunen beide von dem alpha4-Gen. Die DNA, die alpha4.1 und alpha4.2 Transkripte codieren, sind bei der ATCC hinterlegt worden. Die alpha4.1 DNA (pHYA23-1(E)1) hat die ATCC Nr. 67644, die alpha4.2 DNA (pHIP3C(3)) hat die ATCC Nr. 67645.
Alpha5 bedeutet hier ein DNA-Segment, das eine neuronale nAChR Untereinheit des gleichen Namens codiert. Die DNA, die die alpha5 Untereinheit codiert, ist bei der ATCC hinterlegt worden, die DNA (PC1321 genannt) hat die ATCC Nr. 67652. Beta1 bedeutet hier ein DNA-Segment, das eine neuronale nAChR Untereinheit des gleichen Namens codiert. Diese Untereinheit wird in dem Torpedo elektrischen Organ und den Muskelrezeptoren des Säugers exprimiert.
Beta2 bedeutet hier ein DNA-Segment, das eine neuronale nAChR Untereinheit des gleichen Namens codiert. Siehe US 5 371 188 und Deneris et al., 1988. Die DNA, die beta2 codiert, ist bei der ATCC hinterlegt worden, die DNA (pPCX49 genannt) hat die ATCC Nr. 67643.
Beta3 bedeutet hier ein DNA-Segment, das eine neuronale nAChR Untereinheit des gleichen Namens codiert. Siehe US 5 371 188 und Deneris et al., 1989. Die DNA, die beta3 codiert, ist bei der ATCC hinterlegt worden, die DNA (EDS76 genannt) hat die ATCC Nr. 67653.
Beta4 bedeutet hier ein DNA-Segment, das eine neuronale nAChR Untereinheit des gleichen Namens codiert. Die DNA, die beta4 codiert, ist bei der ATCC hinterlegt worden, die DNA (pZP13 genannt) hat die ATCC Nr. 67893.
PC12 bezeichnet hier die adrenale chromaffine Tumorzelline PC12 der Ratte. Diese Zellinie exprimiert einen "ganglionären" Nicotinacetylcholinrezeptor vom Typ, der in sympathischen Neuronen festgestellt wurde.
Die Verwendung des ausdrucks "im wesentlichen Sequenzhomologie" in der Beschreibung und den Ansprüchen bedeutet, daß von DNA, RNA oder Aminosäuresequenzen, die wenige und keine folgenreichen Sequenzvariationen zu den hier offenbarten und beanspruchten tatsächlichen Sequenzen aufweisen, angenommen wird, daß sie mit den erfindungsgemäßen Sequenzen äquivalent sind und vom Umfang der beiliegenden Ansprüche umfaßt sind. In dieser Hinsicht bedeutet "wenige und keine folgenreichen Sequenzvariationen", daß "homologe" Sequenzen (d. h. Sequenzen, die im wesentlichen Sequenzhomologie mit den hier offenbarten und beanspruchten DNA, RNA oder Proteinen aufweisen) funktionell äquivalent zu den erfindungsgemäßen offenbarten und beanspruchten Sequenzen sind. Funktionell äquivalente Sequenzen wirken im wesentlichen auf die gleiche Weise, um im wesentlichen die gleichen Zusammensetzungen herzustellen, wie die hier offenbarten und beanspruchten Nucleinsäure- und Aminosäurezusammensetzungen.
Die Verwendung des ausdrucks "im wesentlichen rein" in der Beschreibung und den Ansprüchen als Modifizierer der DNA, RNA, Polypeptide oder Proteine bedeutet, daß die so bezeichneten, DNA, RNA, Polypeptide oder Proteine von ihren in vivo zellulären Umgebungen getrennt worden sind, als Ergebnis dieser Trennung sind die im wesentlichen reinen DNA, RNA, Polypeptide und Proteine auf eine Art und Weise nützlich, in der die nicht getrennten, unreinen DNA, RNA, Polypeptide oder Proteine nicht nützlich sind.
Die Aminosäuren, die die hier auftauchenden verschiedenen Aminosäuresequenzen beschreiben, können gemäß dem folgenden dreibuchstabigen oder einbuchstabigen Abkürzungen identifiziert werden.
Die Nucleotide, die die hier auftauchenden verschiedenen Nucleotidsequenzen beschreiben, haben die gewöhnlichen einbuchstabigen Bezeichnungen (A, G, T, C oder U), die routinemäßig im Stand der Technik verwendet werden.
In der Beschreibung und den Ansprüchen wird der Bezug auf griechische Buchstaben sowohl als alpha, beta, gamma, delta, epsilon usw. als auch als α, β, γ, δ, &epsi;, usw. verwendet.
In der Beschreibung sind die Temperaturen in Grad Celsius angegeben, wenn nicht anders angegeben.

Hinterlegungen

cDNA-Klone, die die neuronalen Nicotinacetylcholinrezeptor- Untereinheiten alpha2 (Klon pHYP16), alpha3 (Klon pPCA48), alpha4.1 (Klon pHYA23-1(E)1), alpha4.2 (Klon pHIP3C(E)3), alpha5 (Klon PC1321), beta2 (Klon pPCX49), beta 3 (Klon EDS76) und beta4 (Klon pZPC13) umfassen, von denen sich alle in E. coli HB101 befinden, wurden bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, U. S. A. (ATCC) unter den Bedingungen des Budapester Vertrag über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren hinterlegt. Proben der klonierten Untereinheiten sind erhältlich für Industrieunternehmen und andere Personen, die diese rechtmäßig erhalten können, unter den Bedingungen des besagten Vertrages und ansonsten gemäß den Patentgesetzen und Regulierungen der Vereinigten Staaten von Amerika und allen anderen Nationen oder internationalen Organisationen, in denen diese Anmeldung oder eine Anmeldung, die die Priorität dieser Anmeldung beansprucht, eingereicht wird, oder in denen ein Patent, das auf einer derartigen Patentanmeldung basiert, erteilt wird.
Die ATCC Hinterlegungsnummern der verschiedenen Hinterlegungen sind wie folgt:
alpha2 Klon pHYP16 ATCC Nr. 67646
alpha3 Klon pPCA48 ATCC Nr. 67642
alpha4.1 Klon pHYA23-1(E)1 ATCC Nr. 67644
alpha4.2 Klon pHIP3C(E)3 ATCC Nr. 67645
alpha5 Klon PC1321 ATCC Nr. 67652
beta2 Klon pPCX49 ATCC Nr. 67643
beta3 Klon EDS76 ATCC Nr. 67653
beta4 Klon pZPC13 ATCC Nr. 67893

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung offenbart eine neues Untereinheitsmitglied in der Familie der neuronalen Nicotinacetylcholinrezeptoren von Säugern. Die neue Untereinheit, β4 genannt, kann sich mit bekannten Untereinheiten, einschließlich Untereinheiten vom α-Typ, α2, α3 und α4, und der Untereinheit vom β-Typ, β2, in der Gegenwart von mindestens einem α zur Bildung von zuvor unbekannten funktionellen Rezeptoren verbinden.
Insbesondere ist eine erfindungsgemäße Ausführungsform ein im wesentlicher reiner funktioneller neuronaler Nicotinacetylcholinrezeptor, der mindestens eine beta4 Untereinheit umfaßt.
Eine andere erfindungsgemäße Ausführungsform ist ein im wesentlicher reiner funktioneller neuronaler Nicotinacetylcholinrezeptor, der mindestens eine beta4 Untereinheit und mindestens eine nicht beta4 Untereinheit umfaßt, worin zumindest eine der nicht beta4 Untereinheiten eine alpha Untereinheit ist.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist eine im wesentliche reine neuronale Nicotinacetylcholinrezeptor- Untereinheit, beta4.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist ein DNA- Segment, das im wesentlichen reine doppelsträngige DNA- Sequenzen umfaßt, wobei der Sinnstrang die Aminosäuresequenz der neuronalen Nicotinacetylcholinrezeptor-Untereinheit vom Säuger, beta4, codiert.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform umfaßt im wesentlichen reine einzelsträngige DNA und mRNA, die daraus transkribiert wird, wobei die Sequenzen die Aminosäuresequenz der neuronalen Nicotinacetylcholinrezeptor-Untereinheit vom Säuger, beta4, codiert.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform umfaßt im wesentlichen reine DNA-Sequenzen, die die erfindungsgemäße neuronale Nicotinacetylcholinrezeptor beta4 Untereinheit codiert. Ein cDNA-Klon, der solche Sequenzen umfaßt, wurde bei der American Type Culture Collection für Patentzwecke hinterlegt. Die erfindungsgemäße cDNA wird als beta4 bezeichnet (Klon pZPC13, ATCC Nr. 67893). Die DNA-Sequenzen des Klons können als Sonden verwendet werden, um andere neuronale Nicotinacetylcholinrezeptoren aus cDNA Bibliotheken zu identifizieren und isolieren.
Wiederum eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform umfaßt eine Zelle, bevorzugt eine Säugerzelle, die mit den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen transfiziert ist.
Darüberhinaus umfaßt die Erfindung neue neuronale Nicotinacetylcholinrezeptoren, die durch Expression der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen oder Translation der entsprechenden mRNA hergestellt werden. Solche neuen Rezeptoren umfassen Rezeptoren, die nur die beta4 Untereinheit enthalten, und funktionelle Kombinationen, die zumindest eine beta4 Untereinheit und zumindest eine andere nicht beta4 Untereinheit enthalten. Die erfindungsgemäß funktionellen Kombinationen umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Rezeptoren, die enthalten: zumindest eine beta4 Untereinheit und zumindest eine alpha2 Untereinheit, zumindest eine beta4 Untereinheit und zumindest eine alpha3 Untereinheit, zumindest eine beta4 Untereinheit und zumindest eine alpha4 Untereinheit, und zumindest eine beta4 Untereinheit, zumindest eine beta2 und zumindest eine alpha Untereinheit
Darüberhinaus umfaßt die Erfindung DNA, RNA und Proteine, die funktionell äquivalent zu den erfindungsgemäßen DNA, RNA und Proteinen sind. Solche funktionell äquivalenten DNA, RNA und Proteine wirken im wesentlichen auf die gleiche Weise wie die erfindungsgemäßen DNA, RNA und Proteine.
Wiederum eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform umfaßt die Verwendung von im wesentlichen reinen funktionellen neuronalen Nicotinacetylcholinrezeptoren, die zumindest eine β4 Untereinheit umfassen, um nach neuronalen Nicotinacetylcholinrezeptor-Agonisten und Antagonisten zu screenen.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Entdeckung und Isolierung von DNA- Segmenten, die eine neuronale Nicotinrezeptor-Untereinheit, beta4 (β4), codieren. Die neue Untereinheit wird in dem zentralen und peripheren Nervensystem und in PC12 Zellen exprimiert und kann an der Bildung von funktionellen nAChRs mit zuvor beschriebenen alpha (α) und beta (β) Untereinheiten teilnehmen.
Zur Gewinnung der neuen neuronalen Rezeptoruntereinheit wurden Säuger (Ratten) Genombibliotheken mit neuronalen nAChR-Sonden gescreent. Ein rekombinanter Phage, der DNA- Sequenzen enthält, die eine neue nAChR Untereinheit codieren, wurde isoliert. Die Primärstruktur dieser Untereinheit wurde von der Nucleotidsequenz eines cDNA-Klons abgeleitet.
Expressionsuntersuchungen unter Verwendung von Eizellen des Xenopus zeigten, daß sich diese Untereinheit mit den neuronalen α2, α3, a4 Untereinheiten und der β2 Untereinheit in Verbindung mit zumindest einer α Untereinheit zur Bildung von funktionellen nAChRs verbinden kann.
In den folgenden Beispielen wird gezeigt, daß die β4 Untereinheit in den zentralen und peripheren Nervensystemen von Säugern exprimiert wird. Die Ergebnisse zeigen außerdem, daß die β4 Untereinheit am engsten mit der β2 Untereinheit (insgesamt 64% Übereinstimmung in der Aminosäuresequenz) verwandt, und daß sie den anderen neuronalen Nicotinrezeptor-Untereinheiten gleicht, die in dem Molekularneurobiologie-Labor im Salk Institute for Biological Studies kloniert wurden (48% Übereinstimmung mit α2, 46% mit α3, 52% mit α4 und 44% mit β3). Die Expressionsuntersuchungen ergaben, daß zumindest vier unterschiedliche Typen von funktionellen neuronalen Nicotinacetylcholinrezeptoren durch Coinjektion von β4-mRNA und jeder neuronalen α2-, α3-, α4- und β2-mRNA in Eizellen hergestellt werden. Siehe Beispiel 4.
Dem Fachmann ist bekannt, daß ganglionäre nAChRs durch Bungarotoxin 3.1 (3.1 Bgt) blockiert werden. In Eizellen werden nAChRs, die die Ratten α3 oder α4 Untereinheit in Verbindung mit der β2 Untereinheit umfassen, durch dieses Toxin blockiert (siehe US 5 371 188 und Boulter et al., 1987), die α4β2 Kombination ist wesentlich weniger empfindlich, als die α3β2 Kombination (Luetje et al., 1990). Die Rezeptoren, die die α2 und β2 Untereinheiten umfassen, werden durch 3.1 Bgt nicht blockiert (siehe US 5 371 188 und Wada et al., 1988). Die Ergebnisse in Beispiel 4 zeigen überraschenderweise, daß die α3β4 Kombination nicht durch das Toxin blockiert wird. Dieses Ergebnis läßt auf eine Beteiligung der β4 Untereinheit durch die Wirkung von 3.1 Bgt auf neuronale Nicotinrezeptoren schließen.
Ein stellvertretender cDNA-Klon, der die erfindungsgemäße neuronale Nicotinacetylcholinrezeptor-Untereinheit codiert, wurde bei der ATCC zu Patentzwecken hinterlegt. Diese β4-DNA ist unter der ATCC Nr. 67893 geführt. Die DNA und Aminosäuresequenzen von β4 sind in Fig. 3 gezeigt.
Es wird - ohne weitere Ausführungen - angenommen, daß der Fachmann durch die vorangehende Beschreibung, die folgenden Beispiele und den Abschnitt über die experimentellen Verfahren die Erfindung in ihrem ganzen ausmaß ausnutzen kann. Das in den Beispielen und in dem Abschnitt über die experimentellen Verfahren offenbarte Material ist - wenn nicht anders angegeben - beispielhaft und sollte nicht einschränkend in Bezug auf die beiliegenden Ansprüche gesehen werden.

Beispiele und experimentelle Verfahren

Beispiel 1 Identifizierung eines neuen nAChR Gens

Zum Isolieren von bisher nicht identifizierten nAChR Untereinheiten wurden Genombibliotheken von Ratten mit neuronalen Nikotinrezeptor cDNA-Sonden gescreent. Eine Genombibliothek (Sierra et al., 1986), die in dem Austauschvektor EMBL3 hergestellt wurde, wurde mit einer β2 cDNA-Sonde gescreent, und vier unabhängige rekombinante Phagen wurden isoliert. Drei Klone erwiesen sich als überlappend und enthielten das β2-Gen. Die Restriktionskarte des vierten Klons, λDD15 (Fig. 1A), war mit dem β2-Gen nicht kompatibel. Zur einwandfreien Bestimmung, daß dieser Klon das Gen für eine nicht identifizierte nAChR Untereinheit enthält, wurde die Nucleotidsequenz eines kleinen Fragments (Alu1-Alu1 [710-1149], siehe Fig. 3), das mit der β2-Sonde hybridisierte, bestimmt. Die abgeleitete Aminosäuresequenz ist mit der von β2 und anderen klonierten nAChR Untereinheiten verwandt, aber verschieden davon.
Die α Untereinheit von nAChR enthält zwei nebeneinander liegende Cysteinreste (192 und 193 in der α-Untereinheit des Torpedo elektrischen Organs, Noda et al., 1982), von denen angenommen wird, daß sie sich in der Nähe der Ligandbindenden Domäne des Rezeptors befinden (Kao et al., 1984). In sequenzierten neuronalen nAChRs Genen wird dieser Bereich von dem 5. Exon codiert (Nef et al., 1988). In dem Abschnitt über die Definitionen wurde angegeben, daß wenn funktionelle Untersuchungen nicht verfügbar sind, die Gegenwart oder Abwesenheit dieser Cysteinreste verwendet wird, um eine Untereinheit jeweils dem α- oder β-Typ zuzuordnen. außerdem codiert das 5. Exon das meiste der angenommenen cytoplasmatischen Domäne jeder Untereinheit. Vergleiche der Primärstrukturen zwischen den verschiedenen nAChR Untereinheiten zeigten eine geringfügige Konservierung dieser Proteindomäne, und die diesen Bereich codierenden DNA- Fragmente können daher als Untereinheit-spezifische Sonden verwendet werden. Die Nucleotidsequenz des 5. Exons des durch λDD15 codierten Gens wurde bestimmt (Fig. 1B, siehe auch Fig. 3). Da die abgeleitete Aminosäuresequenz die nebeneinander liegenden Cysteinreste nicht enthält, wurde die Untereinheit β4 genannt; β1 ist eine Muskeluntereinheit und β2 und β3 sind zwei zuvor entdeckte neuronale Untereinheiten vom β-Typ (siehe US 5 371 188 und Deneris et al., 1988, 1989).

Beispiel 2 Das β4-Gen wird im Nervensystem der Ratte exprimiert

In situ Hybridisierungshistochemie von Gehirnabschnitten von erwachsenen Ratten wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob das β4-Gen in dem zentralen Nervensystem exprimiert wird. Zur Synthese der β4-spezifischen RNA-Sonden wurde das Plasmid pGDD15 durch Einführen eines Genom DNA-Fragments, das einen nicht konservierten Teil der cytoplasmatischen Domäne codiert, in einen Plasmidvektor hergestellt (Fig. 1C). Das Insert befindet sich zwischen den Transkriptionsanfangsstellen der SPE und T7 RNA Polymerasen, wodurch die in vitro Transkription von Sinn- oder Antisinn- RNA-Sonden ermöglicht wird. Fig. 2A zeigt ein Autoradiogramm eines coronalen Abschnitts auf dem Level des Thalamus des Rattengehirns unter Verwendung eines ³&sup5;S- radiomarkierten Antisinnsonde. Die mediale Habenula ist der einzige Bereich, in dem Hybridisierung über dem Hintergrund durch Röntgenfilmautoradiographie festgestellt wurde.
Außerdem befinden sich viele β4 Transkripte, wie in Fig. 2B gezeigt, in 2/3 der medialen Habenula zur zentralen Seite. Einige Zellen in der dorsalen medialen Habenula enthalten auch niedrige β4 mRNA Gehalte. Dieses Ergebnis steht im Gegensatz zu der allgemeinen Verteilung der α3, α4 und β2 Transkripte in Rattengehirn (US 5 371 188 und Goldman et al., 1986, 1987; Deneris et al., 1988; Wada et al. 1989).
Da gezeigt wurde, daß die Phäochromocytom-Zellinie PC12 Nicotinrezeptoren exprimiert und verschiedene cDNA-Klone, die nAChR Untereinheiten codieren, von PC12 cDNA-Bibliotheken isoliert wurden, wurden Tests durchgeführt, um zu bestimmen, ob diese Zellinie eine ausgiebige Quelle von β4 Transkripten liefern könnte. Experimente über RNAase Schutz zeigten β4- Genexpression in diesen Zellen (Daten sind nicht gezeigt).
β4-mRNA wurde außerdem in der Poly(A)+ RNA der Rattennebenniere festgestellt, was auf eine Expression des β4-Gens in dem peripheralen Nervensystem hinweist (Boulter et a1., unveröffentlichte Daten).

Beispiel 3 β4-Primärstruktur

Die Bestätigung, daß das β4-Gen tatsächlich eine neue nAChR Untereinheit codiert, erforderte die funktionelle Expression. Zu diesem Zweck und zur Bestimmung der Primärstruktur der β4 Untereinheit wurden cDNA-Klone isoliert. Die doppelsträngige cDNA wurde hergestellt und zwischen den EcoRI und XhoI Stellen des λ Phagenvektors XZAPII gegen die Richtung eingeführt. Das Screenen der 1 · 10&sup6; Phagen mit einer β4 Ribosonde ergab 8 Klone, die gereinigt wurden. Das cDNA Insert dieser Klone wurde aus dem X Phagenvektor in ein Plasmid durch das in vivo Schnittverfahren übertragen (Short et al., 1988), und die Nucleotidsequenz der 6 Inserts am 5' Ende wurde bestimmt. Das pZPC13 Insert (das Plasmidanalog von XZPC13) wurde sequenziert und enthielt die gesamte codierende λ4-Sequenz und einen vollständigen nicht translatierten Bereich (Fig. 1D, Fig. 3). Die cDNA-Sequenz in dem Bereich, der das 5. Exon codiert, stimmt mit derjenigen überein, die von dem Genomklon bestimmt wurde, mit der ausnahme einer Substitution eines T für ein C an der Position 720 (Fig. 3). Dieser Unterschied ändert die davon abgeleitete Aminosäuresequenz nicht. Er könnte auf einen Polymorphismus zwischen dem Rattenstamm, der als Quelle für die PC12 Zellinie dient, und dem Rattenstamm, aus dem eine Genombibliothek hergestellt wurde, zurückzuführen sein. Alternativ könnte er ein unerwünschtes cDNA- Klonierungspseudoergebnis sein, wie ein Fehler der reversen Transkriptase. Eine Sequenz, deren Kern 44 bp lang ist, wird dreimal am Anfang des 3' nicht translatierten Bereichs wiederholt (Fig. 3, graue Kästen). Diese Sequenz stammt wahrscheinlich nicht von einem unerwünschten Klonierungspseudoergebnis, da ein anderer Klon pZPC11 die gleichen Wiederholungen enthält. Das Suchen in der EMBO Datenbank (Ausgabe 17) ergab kein weiteres auftreten dieser Sequenz, und die Wirkung dieser Wiederholung, sofern eine vorhanden ist, muß noch untersucht werden.
Der offene Leserahmen von pZPC13 von dem ersten ATG, das in einer günstigen Umgebung für den Translationsanfang liegt, (Kozak, 1986) bis zu dem TGA Terminator-Codon an der Position 1546 codiert ein Protein von 495 Resten. Die Analyse der abgeleiteten Aminosäuresequenz ergab Merkmale, die für eine Untereinheit eines Ionenkanals mit Ligandenschranke einschließlich von vier mutmaßlichen Transmembrandomänen, charakteristisch sind, wobei die Merkmale unter Verwendung des Algorithmus von Eisenberg et al. (1984) festgestellt wurden. Die β4 Untereinheit ist am engsten mit der β2 Untereinheit verwandt (64% Übereinstimmung mit der γesamten Aminosäuresequenz) und ähnelt den anderen neuronalen Nicotinrezeptor-Untereinheiten der Ratte sehr, die in dem Molekularneurobiologie-Labor im Salk Institute for Biological Studies kloniert wurden (48% Übereinstimmung mit α2, 46%. mit α3, 52% mit α4 und 44% 44% mit β3). Die αminoterminalen Reste sind für ein Signalpeptid kennzeichnend, aber das Verfahren von von Heijne (1986) bestimmt keine unzweideutige Spaltstelle, wobei der höchste Score eine Spaltstelle zwischen den Positionen 20 und 21 nahelegt. Da es nicht möglich war, abschließend den aminoterminalen Rest des reifen Proteins zu bestimmen, betrifft die Numerierung in dieser Beschreibung durchweg das Vorläuferprotein. Die Fig. 4, die ein Aneinanderreihung der Aminosäuren von neuronalen β Untereinheiten darstellt, zeigt, daß die vorhergesagten Membran-umspannenden Bereiche I bis III stark konserviert sind. Die extrazelluläre Domäne, der vierte Membranumspannende Bereich und ungefähr 30 Reste an jedem Ende der cytoplasmatischen Domäne stellen auch konservierte Reste dar. Alle drei β Untereinheiten enthalten die kennzeichnenden zwei Cysteinreste, die den Resten 128 und 142 der α Untereinheit des Torpedo elektrischen Organs entsprechen (Noda et al., 1982: Positionen 152 und 166 der β4 Untereinheit in den Fig. 3 und 4), aber nicht die beiden nebeneinander liegenden Cysteine, die für die Untereinheiten vom α-Typ kennzeichnend sind. Die extrazelluläre Domäne der neuronalen nAChR Untereinheiten hat zwei potentielle N-gebundene Glykosylierungsstellen. Für die β4 Untereinheit sind vier solcher Stellen bezeichnend, eine befindet sich an dem konservierten Rest der Position 165, eine andere an der Position 35 und die beiden zusätzlichen Glykosylierungsstellen befinden sich an den Resten 92 und 137. Eine der drei neuronalen Untereinheiten vom β-Typ, β4 hat die längste cytoplasmatische Domäne.

Beispiel 4 Die β4 Untereinheit verbindet sich mit den α2, α3 und α4 Untereinheiten zur Bildung von funktionellen nAChRs

Die abgeleitete Primärstruktur des XZPC13-codierenden
Proteins läßt darauf schließen, daß es eine Untereinheit der neuronalen Nicotinrezeptoren vom β-Typ ist. Zur Untersuchung dieser Hypothese wurden Expressionsuntersuchungen in Eizellen des Xenopus durchgeführt. Paarweise Injektionen der Eizellen mit in vitro synthetisierter RNA, die die β4 Untereinheit und entweder die α2, α3 oder α4 Untereinheit codiert, wurden durchgeführt. Nach dem Baden in Acetylcholin oder Nicotin wurden die mit jeder Kombination injizierten Eizellen depolarisiert, Beispiele solcher Spannungsreaktionen sind in der Fig. 5 gezeigt. Diese Ergebnisse sind ähnlich wie die zuvor für die α2β2, α3β2 und α4β2 Kombinationen berichteten (siehe US 5 371 188, Boulter et al., 1987; Wada et al., 1988) und zeigen, daß ß4 eine neue funktionelle Nicotinrezeptor- Untereinheit ist. Die Injektion der β4-RNA allein (n = 8) und der β4 in Kombination mit β2 (n = 6) zeigte keine Reaktionen nach der Stimulierung mit bis zu 1 mM Acetylcholin (Daten sind nicht gezeigt). Zusammengefaßt deuten diese Ergebnisse darauf hin, daß die β4 Untereinheit ein funktionelles Äquivalent zu der β2 Untereinheit ist.
Außerdem unterstützt dies die Zuordnung einer α oder β Bezeichnung auf neuronale nAChR Untereinheiten, basierend auf dem Vorkommen der gepaarten Cysteinreste in der extrazellulären Domäne.
Da die β2 Untereinheit die Muskel β1 Untereinheit funktionell ersetzt (Deneris et al., 1988), wurden Untersuchungen durchgeführt, um zu bestimmen, ob die β4 Untereinheit auch mit den Muskel α1, γ und δ Untereinheiten zur Bildung eines funktionellen Rezeptors verbunden werden kann. Parallelexperimente, in denen Eizellen entweder mit α1γδ- oder α1β4γδ-RNA Kombinationen injiziert wurden, wurden durchgeführt. Die mit der α1γδ Kombination infizierten Eizellen zeigten keine Reaktion bei der Verabreichung von 1 uM Acetylcholin (n = 9, durchschnittliches Restpotential = -69 mV), obgleich hohe Acetylcholinkonzentrationen kleine Reaktionen bewirken (11 ± 8 m Depolarisierungen bei 1 mM, n = 5), wie zuvor von Kurosaki et al. (1987) gezeigt wurde. auf der αnderen Seite zeigten mit der α1β4γδ Kombination injizierte Eizellen eine durchschnittliche Depolarisierung von 43 ± 25 mV, wenn sie 1 uM Acetylcholin ausgesetzt sind (n = 5, Fig. 5). Folglich stellt die Einführung der RNA der β4 Untereinheit die starke funktionelle Expression in der Muskel α1γδ Kombination wieder her. Nur die Injektion der RNA von α1 und β4 ergab keine funktionellen Rezeptoren (n = 9), wodurch die Beobachtung bestätigt wurde, daß y oder δ in Kombination mit der Muskel α1 Untereinheit für die Bildung von funktionellen nAChRs erforderlich sind (Kurosaki et al., 1987).
Ganglionäre nAChRs wurden mit Bungarotoxin 3.1 blockiert (3.1 Bgt) bezieht sich auch auf das neuronale Bungarotoxin von Lindstrom et al. (1987), auf das Toxin F von Lording et al., (1984) und auf das K-Bungarotoxin von Chiappinelli, (1983)). In Eizellen werden nAChRs, die die α3 oder α4 Untereinheit der Ratte in Kombination mit der β2 Untereinheit umfassen, durch dieses Toxin blockiert (Boulter et al., 1987), obwohl die α4β2 Kombination wesentlich weniger empfindlich als die α3β2 Kombination ist (Luetje et al., 1990). Die Rezeptoren, die die α2 und β2 Untereinheiten enthalten, werden durch 3.1 Bgt nicht blockiert (Wada et al., 1988). Zur Untersuchung der Wirkung der Substitution der Untereinheiten vom β-Typ wurden Vergleiche mit der 3.1 Bgt Blockierung der Acetylcholinreaktionen in Eizellen, die mit den a3β2 und α3β4 Kombinationen infiziert sind, durchgeführt. 3.1 Bgt blockierte wie erwartet die Aktivität des α3β2 Rezeptors als Reaktion auf Verabreichungen von 1 uM Acetylcholin (Fig. 6). In Parallelexperimenten wurde die α3β4 Kombination durch das Toxin nicht blockiert. Diese Ergebnis läßt auf eine Teilnahme der β Untereinheit bei der Wirkung von 3.1 Bgt auf neuronale Nicotinrezeptoren schließen.

Beispiel 5 Verwendung von nAChRs zum Screenen nach nAChR Agonisten und Antagonisten

Funktionelle neuronole Nicotinacetylcholinrezeptoren können verwendet werden, um nach nAChR Agonisten und Antagonisten zu screenen. In einem bevorzugten Verfahren werden funktionelle neuronale Nicotinacetylcholinrezeptoren, die funktionelle alpha2, alpha3, alpha4, beta2 und beta4 Untereinheiten umfassen, durch Transfektion geeigneter Zellen (z. B. kultivierter Fibroblasten oder neuronaler Zellen) mit DNA, die verschiedene alpha und beta Untereinheiten codieren, hergestellt. Bekannte elektrophysiologische Verfahren werden anschließend verwendet, um die Wirkung von bekannten und potentiellen Agonisten und Antagonisten auf die transfizierten Zellen zu bestimmen. Solche Verfahren schließen Depolarisierungen und Stromaufzeichnungen mit einer Spannungsklammer ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Ein zweites bevorzugtes Verfahren zum Screenen auf bekannte und potentielle nAChR Agonisten und Antagonisten verwendet herkömmliche Bindungsassays, bei denen die transfizierten Zellen mit markierten Agonisten oder Antagonisten in Kontakt gebracht werden. Geeignete Markierungen umfassen radioaktive Markierungen, fluoreszierende Markierungen und dergleichen. Dieser Assaytyp ermöglicht die Messung der Bindung sowie den Austausch von gebundenen Agonisten oder Antagonisten.

Experimentelle Verfahren

Screenen der Genombibliotheken

Die Bibliothek, aus der der Klon λDD15 isoliert wurde, wurde in dem λ-Phagenvektor EMBL3 hergestellt (Sierra et al., 1986). Ungefähr 106 Phagen wurden mit einer PCX49-Sonde (Deneris et al., 1988), die durch wahlloses Primen mit ³²P- markiert war (Multi-prime, Amersham, Arlington Heights, IL), gescreent. Die Filter wurden über Nacht bei 65ºC in 5 · SSPE, 1% SDS, 1 · Denhardtslösung hybridisiert. Gewaschen wurde 30 Minuten bei 65ºC zweimal in 2 · SSC, 1% SDS und einmal in 0,2 · SSC, 1% SDS. SSPE, Denhardtslösung und SSC entsprachen den von Maniatis et al. (1982) definierten.

In Situ Hybridisierung

Zur Herstellung spezifischer β4-Sonden wurde nach dem Klenow- Ausfüllen der hervorstehenden Enden das Plasmid pGDD15 hergestellt durch Einführen des ungefähr 450 bp Fragments, das von einer NcoI-Stelle (Fig. 3, Position 1040) bis zu der SalI-Stelle in dem EMBL3-Linker reicht, in die SmaI- Stelle des pGEM-32 Expressionsvektors (Promega, Madison, WI) (siehe Fig. 1). Unter Verwendung der SP6 oder T7 RNA- Polymerase wurden die 355 markierten Sinn- oder Antisinn-RNA- Sonden in vitro von dem KpnI- oder BamHI-linearisierten pGDD15 synthetisiert. Die Bedingungen der in situ Hybridisierungshistochemie entsprechen den zuvor beschriebenen (US 5 371 188 und Deneris et al., 1988).

Herstellung und Screenen der cDNA-Bibliothek

Die gesamte RNA wurde aus den PC12 Zellen gemäß Cathala et al., (1983) extrahiert. Die Poly(A)~ RNA wurde chargenweise unter Verwendung von Oligo(dT)Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) wie beschrieben hergestellt (Nagamine et al., 1983). Fünf Microgramm wurden zur Herstellung einer rechtsgängigen cDNA-Bibliothek in λZAPII unter Verwendung des UniZAP Kits (Stratagene, San Diego, CA) hergestellt. Ungefähr 5 · 10&sup6; rekombinante Phagen pro Microgramm RNA wurdne erhalten. Ungefähr 106 Phagen wurden mit der ³²p markierten RNA-Sonde, die von pGDDIS stammt, gescreent. Die Filter wurden über Nacht bei 42ºC in 50% Formamid, 5 · SSPE, 0,5% SDS hybridisiert und mehrmals bei Erhöhung der Stärken gewaschen. Das letzte Waschen wurde bei 75ºC in 0,1 · SSC, 0,1% SDS durchgeführt. Die cDNA Inserts wurden in die Plasmidvektoren durch das in vivo Schnittverfahren überträgen (Short et al., 1988). Es sei kurz erwähnt, das die rekombinanten λ Phagenvorräte mit dem Helferphagen R408 f1 verwendet wurden, um exponentielle Kulturen des XL1-blauen Stamms von E. coli zu infizieren. Die Kulturen wurden 6 Stunden bei 37ºC wachsen gelassen und bei 7000 · g 10 Minuten zentrifugiert. Die Proben der Kulturüberstände wurden verwendet, um XL1-blaue Bakterien zu infizieren, die auf L- Agarplatten, die 100 ug/ml Ampicillin enthalten, plattiert wurden. Resistente Kolonien enthalten das cDNA Insert in dem Pläsmidvektor pBluescript SK(-) (Stratagene, San Diego, CA).

Bestimmung und Analyse der Nucleotidsequenz

Geeignete Restriktionsfragmente wurden in den einzelsträngigen Phagenvektoren M13mp18 und M13mp19 subkloniert (Yanish-Perron et al., 1985). Die Nucleotidsequenz der Inserts wurde bestimmt unter Verwendung des Sequenasekits (United States Biochemicals, Cleveland, OH) und entweder dem zur Verfügung gestellten Universalprimer oder den mit einem Cyclone DNA Synthesizer synthetisierten Oligonucleotiden (Biosearch, San Rafael, CA). Die Sequenzanalyse wurde durch die Verwendung der PC/GENE (Genofit SA, Genf, Schweiz) und UW-GCG (Devereux et al., 1984) Software Betriebssysteme ermöglicht. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen wurden miteinander angeordnet. Die Prozentwerte der Sequenzidentität zwischen den Untereinheiten wurde durch Dividieren der Zahl der identischen Reste durch die Zahl der zu vergleichenden Reste berechnet (wodurch Lücken von der Berechnung ausgeschlossen wurden). Ähnliche Aminosäuren wurden wie folgt definiert: A, S, T; D E; N, Q; R, K; I, L, M, V; F, Y, W.

Expression in Eizellen des Xenopus und Elektrophysiologie

Die RNA wurde in vitro unter Verwendung der linearisierten Matrizen-DNA, die α2 (US 5 371 188 und Wada et al., 1988), α3, α4 und β2, wie zuvor beschrieben (US 5 371 188 und Boulter et al., 1987), codiert, synthetisiert.
Diguanosintriphosphat-gekappte β4 codierende RNA wurde auf ähnliche Weise aus der XhoI-linearisierten Matrizen-DNA von pZPC13 unter Verwendung von T3 RNA-Polymerase hergestellt (Stratagene, San Diego, CA).
Die Eizellen wurden anästhesiertem, weiblichem reifen Xenopus (Xenopus I, Madison, WI) entnommen und die Follikelzellen wurden durch Behandlung mit Collagenase vom Typ IA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 2 Stunden bei Raumtemperatur und bei kontinuierlichem langsamem Rühren entfernt. Jede Eizelle wurde mit ungefähr 5 ng RNA in einem Volumen von 50 nl Wasser injiziert und in Barth-Kochsalzlösung (Coleman, 1984) zwei Tage bei 20ºC inkubiert. alternativ wurde die Transfektion mit den entsprechenden DNA-Sequenzen erreicht.
Elektrophysiologische Aufzeichnungen wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (US 5 371 188 und Boulter et al., 1987). 3.1 Bgt wurde gemäß Ravdin und Berg (1979) hergestellt. Mehrere Aufzeichnungen wurden durchgeführt unter Verwendung einer unabhängig gereinigten Herstellung der 3.1 Bgt Probe mit den gleichen Ergebnissen.

Referenzen

Die folgenden Referenzen sind in der vorliegenden Anmeldung zitiert worden. alle zitierten Referenzen sind ausdrücklich durch Referenz hierin umfaßt.
1. Barnard, E. A., et al. (1987). Trends Neurosci. 10, 502-509.
2. Bormann, J., et al. (1983). Neurosci. Lett. 40, 193-197.
3. Boulter, J., et al. (1986). Nature 319 368-374.
4. Boulter, J., et al. (1987). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7763-7767.
5. Boulter, J., et al. (1990). J. Biol. Chem. 265, 4472-4482.
6. Cathala, G., (1983). DNA 2, 329-335.
7. Changeux, J. (1981). Harvey Lect. 75, 85-254.
8. Chiappinelli, V. A. (1983). Brain Res. 277, 9-21.
9. Coleman, A. (1984). In Transcription and Translation: A Practical Approach. B. D. Hames und S. J. Higgins, Hrsg. (Oxford: IRL Press Ltd.), pp. 271-302.
10. Deneris, E. S., et al. (1988). Neuron 1, 45-54.
11. Deneris, E. S., et al. (1989). J. Biol. Chem. 264, 6268-6272.
12. Devereux, J., et al. (1984). Nucl. Acids Res. 12, 387-395.
13. Eisenberg, D., et al. (1984). J. Mol. Biol. 179, 125-142.
14. Goldman, D., et al. (1986). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4076-4080.
15. Goldman, D., et al. (1987). Cell 48, 965-973.
16. Gu, Y., et al. (1988). Neuron 1, 117-125.
17. Hall, Z. W. (1987). Trends Neurosci. 10, 99-101.
18. Halvorsen, et al. (1987). J. Neurosci. 7, 2547- 2555.
19. Isenberg, K. E., et al., (1989). J. Neurochem. 52, 988-991.
20. Kao, P. N., et al. (1984). J. Biol. Chem. 259, 1162-1165.
21. Kozak, M. (1986). Cell 44, 283-292.
22. Kurosaki, T., et al. (1987). FEBS. Lett. 214, 253-248.
23. Langosch, et al. (1988). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7394-7398.
24. Levitan, E. S.,et al. (1988). Nature 335, 76-79. 25. Lindstrom, J., et al. (1987). Mol. Neurobiol. 1, 281-337.
26. Loring, R. H., et al. (1984). Neuroscience 11, 989-999.
27. Luetje, C., et al. (1990). J. Neurochem., In Press.
28. Maniatis; T., et. al. (1982), Molecular Celaning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory).
29. Mishina, M., et al. (1986). Nature 321, 406-411.
30. Nagamine, Y., et al. (1983). Cell 32, 1181-1190.
31. Nef, P., et al. (1988). EMBO J. 7, 595-601.
32. Noda, M., et al. (1982). Nature 299, 793-797.
33. Obata, K. (1974). Brain Res. 73, 71-88.
34. Patrick, J., et al. (1977). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 4689-4692.
35. Pritchett, D. B., et al. (1988). Science 242, 1396-1308.
36. Pritchett, D. B., et al. (1989). Nature 338, 582- 585.
37. Ravdin, P., et al. (1979). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 2072-2076.
38. Reynolds, J. A., et al. (1978). Biochemistry 17, 2035-2038.
39. Sakmann B., et al. (1978). Nature 276, 401-402..
40. Schoepfer, R., et al. (1988). Neuron 1, 241-248.
41. Schofield, P. R., et al. (1987). Nature 328, 221- 227.
42. Short, J. M., et al. (1988). Nucl. Acids Res. 16, 7583-7600.
43. Sierra, F., et al. (1986). Mol. Cell. Biol. 6, 4067-4076.
44. Staden, R. (1984). Nucl. Acids Res. 12, 505-519.
45. von Heijne, G. (1986). Nucl. Acids Res. 14, 4683-4691.
46. Wada, K., et al. (1988). Science 240, 330-334.
47. Wada, E., et al. (1989). J. Comp. Neurol. 284, 314-335.
48. Whiting, P. J., et al. (1986). Biochemistry 25, 2082-2093.
49. Whiting, P. J., et al. (1987). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 595-599.
50. Whiting, P. J., et al. (1987). FEBS Lett. 2, 459- 463,
51. Yanish-Perron et al. (1985). Gene 33, 103-119.

Zusammenfassung der Beschreibung

Aus der vorgenannten Beschreibung kann der Fachmann entnehmen, daß die Erfindung die Entdeckung und Isolierung von DNA-Sequenzen betrifft, die ein neues Untereinheitsmitglied in der Familie der neuronalen Nicotinacetylcholinrezeptoren von Säugern codiert, die in dem zentralen Nervensystem exprimiert werden. Die neue neuronale Nicotinacetylcholin-Untereinheit vom Säuger ist die beta4 Untereinheit, die allein oder in funktioneller Kombination mit anderen Untereinheiten, einschließlich alpha2, alpha3, alpha4 und beta2, nützlich ist, wobei dies keine Beschränkung darstellt.
Sowohl das Gen der Rezeptoruntereinheit als auch die Proteine der Erfindung können für den Entwurf von Medikamenten und zum Screenen verwendet werden. Der cDNA-Klon, der die β4 Rezeptoruntereinheit codiert, kann zum Beispiel in vitro zur Herstellung von mRNA transkribiert werden. Diese mRNA, entweder von einem Klon der Untereinheit oder einer Kombination von Klonen, kann anschließend in Eizellen injiziert werden, wo sie die Synthese des Rezeptormoleküls/der Moleküle leitet. alternativ können die Klone stromabwärts der geeigneten Genregulationselemente plaziert werden und in das Genom von eukaryontischen Zellen eingeführt werden. Dies führt zu transfizierten Zellinien, die einen spezifischen Rezeptorsübtyp oder Kombinationen von Subtypen exprimieren. Die abgeleiteten Zellinien können anschließend in einer Menge für die reproduzierbare quantitative Analyse der Wirkungen von Medikamenten auf die Rezeptorwirkung hergestellt werden.
Ohne den Umfang der Erfindung zu verlassen, kann der Fachmann verschiedene Änderungen und Modifikationen in der Erfindung durchführen, um sie auf verschiedene Verwendungen und Bedingungen anzupassen. Diese Änderungen und Modifikationen liegen im Äquivalenzbereich der folgenden Ansprüche.

Claims

1. DNA mit der in Fig. 3 gezeigten Aminosäuresequenz, die eine β4 neuronale Nikotinacetylcholinrezeptor- Untereinheit codiert.

2. DNA, die ein Protein codiert, das biologische Aktivität einer β4 neuronalen Nikotinacetylcholinrezeptor-Einheit hät, wobei die DNA mit der in Fig. 3 gezeigten Nucleotidsequenz hybridisieren kann.

3. DNA, die einen replizierbaren Vektor umfaßt, der eine DNA nach Anspruch 1 oder 2 enthält.

4. DNA nach Anspruch 1 oder 2, wobei die DNA ein Protein codiert, das mit α3 einen Nikotinacetylcholinrezeptor bildet, wobei der Rezeptor durch α-Bungarotoxin 3.1 nicht blockiert wird.

5. Messenger RNA (mRNA), die von einem der DNA-Moleküle der Ansprüche 1 bis 4 transkribiert wird, wobei die DNA eine β4 neuronale Nikotinacetylcholinrezeptor-Untereinheit codiert.

6. Protein mit biologischer Aktivität einer β4 neuronalen Nikotinacetylcholinrezeptor-Untereinheit, das durch die DNA der Ansprüche 1 oder 2 codiert wird.

7. Protein, das die Aminosäuresequenz der β4 Untereinheit des Proteins umfaßt, die durch das Plasmid pZPC13, ATCC Zugangs-Nr. 67893, codiert wird.

8. Verfahren zum Screenen von Verbindungen, um solche auszuwählen, die neuronale Nikotinacetylcholin-Agonisten sind, wobei das Verfahren umfaßt:

- Vergleichen der Testantwort der Zellen in der Gegenwart einer oder mehrerer dieser Verbindungen mit der Kontrollantwort der Zellen in der Gegenwart der Verbindungen, wobei

- die Zellen funktionelle Nikotinacetylcholin- Zelloberflächen-Rezeptoren exprimieren, die mindestens eine Untereinheit umfassen, die die in Fig. 3 gezeigte Aminosäuresequenz umfaßt, wobei die Untereinheit durch eine DNA oder mRNA codiert wird, die mit diesen Zellen heterolog ist; und

- die Antworten durch die Rezeptoren vermittelt werden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin die Rezeptoren eine Nikotinacetylcholin-α-Untereinheit umfassen.

10. Verfahren nach Anspruch 8, worin die Rezeptoren außerdem mindestens eine neuronale Nikotinacetylcholinrezeptor - Untereinheit, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus α2, α3, α4 und β2, umfassen.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, worin die Antworten elektrophysikalische Antworten sind.

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin die Antworten durch die Spannungsklemmtechnik gemessen werden.

13. Verfahren zum Screenen von Verbindungen, um solche auszuwählen, die neuronale Nikotinacetylcholin- Antagonisten sind, wobei das Verfahren umfaßt:

a) Kontaktieren der Zellen mit einer bestimmten Konzentration eines neuronalen Nikotinacetylcholin- Agonisten in der Gegenwart von zunehmenden Konzentrationen einer oder mehrerer dieser Verbindungen; und

b) Nachweisen der Unterschiede in der Testantwort der Zellen gegenüber dem Agonisten in der Gegenwart der Verbindungen, im Vergleich zu der Kontrollantwort der Zellen gegenüber dem Agonisten in der Abwesenheit der Verbindungen, wobei

- die Zellen funktionelle Nikotinacetylcholin- Zelloberflächen-Rezeptoren exprimieren, die mindestens eine Untereinheit umfassen, die die in Fig. 3 gezeigte Aminosäure umfaßt, wobei die Untereinheit durch eine DNA oder mRNA codiert wird, die mit den Zellen heterolog ist; und

- die Antworten durch die Rezeptoren vermittelt werden.

14. Verfahren nach Anspruch 13, worin die Rezeptoren eine Nikotinacetylcholin-α-Untereinheit umfassen.

15. Verfahren nach Anspruch 13, worin die Rezeptoren außerdem eine oder mehrere neuronale Nikotinacetylcholin-Rezeptor-Untereinheiten, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus α2, α3, α4 und β2, umfassen.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, worin die Antworten elektrophysikalische Antworten sind.

17. Verfahren nach Anspruch 16, worin die Antworten durch die Spannungsklemmtechnik gemessen werden.

18. Verfahren zum Nachweis von Verbindungen, die an die Nikotinacetylcholin-Rezeptoren binden, umfassend:

- Vergleichen des Grades der Bindung eines Nikotinacetylcholin-Rezeptor-Agonisten an Zellen in der Gegenwart einer oder mehrerer dieser Verbindungen und in der Abwesenheit der Verbindungen, wobei die Zellen Nikotinacetylcholin- Zelloberflächen-Rezeptoren exprimieren, die mindestens eine Untereinheit umfassen, die die in Fig. 3 gezeigte Aminosäuresequenz umfaßt, wobei die Untereinheit durch eine DNA oder mRNA codiert wird, die mit diesen Zellen heterolog ist.

19. Verfahren nach Anspruch 18, worin die Zellen außerdem eine Nikotinacetylcholin-α-Untereinheit umfassen.

20. Verfahren nach Anspruch 18, worin die Rezeptoren außerdem neuronale Nikotinacetylcholin-Rezeptor- Untereinheiten, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus α2, α3, α4 und β2, umfassen.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, worin der Agonist Nikotin ist.

22. Verwendung eukaryontischer Zellen zum Screenen nach Verbindungen, die neuronale Nikotinacetylcholin- Rezeptor-Agonisten und Antagonisten sind, wobei die Zellen funktionelle Nikotinacetylcholin-Zelloberflächen- Rezeptoren exprimieren, die mindestens eine β4- Untereinheit umfassen, die durch eine DNA oder mRNA nach einem der Ansprüche 1 bis 5 codiert wird, die mit dieser Zelle heterolog ist.

23. Eukaryontische Zelle, umfassend:

a) eine erste Nucleinsäure, die eine heterologe DNA oder heterologe mRNA ist, wobei die erste Nucleinsäure eine oder mehrere neuronale Nikotinacetylcholin-Rezeptor-Untereinheiten codiert, die die in Fig. 3 gezeigte Aminosäuresequenz umfaßt, und

b) wahlweise eine zweite Nucleinsäure, die eine heterologe DNA oder heterologe mRNA ist, wobei die zweite Nucleinsäure eine oder mehrere neuronale Nikotinacetylcholin-Rezeptor-Untereinheiten codiert, wobei die Nucleinsäuren heterolog mit der eukaryontischen Zelle sind.

24. Zelle nach Anspruch 23, wobei die erste Nucleinsäure die in Fig. 3 gezeigte Nucleotidsequenz hat.

25. Zelle nach Anspruch 23, die außerdem neuronale Nikotinacetylcholin-Rezeptor-Untereinheiten, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus α2, α3, α4 und β2, umfaßt.

26. Zelle nach einem der Ansprüche 23 bis 25, wobei die Zelle auf ihrer Oberfläche neuronale Nikotinacetylcholin-Oberflächenrezeptoren aufweist, wobei die Rezeptoren eine oder mehrere Untereinheiten, die durch die erste Nucleinsäure oder die zweite Nucleinsäure codiert sind, umfassen.

27. Zelle nach Anspruch 26, worin die Rezeptoren eine β4- Untereinheit, die durch die erste Nucleinsäure codiert wird, umfaßt.