DE69032883T2

DE69032883T2 - Enzymatische bindung von bioaktiven materialien an proteine

Info

Publication number: DE69032883T2
Application number: DE69032883T
Authority: DE
Inventors: Klaus Breddham; Thomas Coolidge; William Lewis; Sheldon Schuster; Jay Stout; Fred Wagner; Dwane Wylie
Original assignee: BioNebraska Inc; University of Nebraska
Current assignee: BioNebraska Inc; University of Nebraska
Priority date: 1989-06-30
Filing date: 1990-06-28
Publication date: 1999-08-19
Anticipated expiration: 2010-06-29
Also published as: JPH04506454A; AU6030090A; US5279954A; DE69032883D1; EP0479897B1; CA2063434A1; WO1991000296A1; IE902389A1; US5741686A; EP0479897A1; IE902389L; AU646638B2; ATE175426T1

Description

Technisches Gebiet

Diese Erfindung betrifft immobilisierte und markierte Proteine und die Bindung von Proteinen an bioative Agenzien. Im besonderen betrifft sie Verfahren zur Bindung von Markern, Immobilisierungsträgern und bioaktiven Agenzien an spezifische Bereiche von Proteinen.

Hinterrund der Erfindung

Es ist bekannt, daß die Funktion bioaktiver Proteine oft durch deren Kombination mit anderen Substanzen verstärkt werden kann. Bei der Verwendung zur Katalyse einer Reaktion oder um Auftrennung zu erlangen, können Proteine immobilisiert werden, um die Reaktionseffizienz zu steigern und die Verarbeitung zu vereinfachen. Bei der Verwendung als Nachweisreagenz können Proteine markiert werden, um die Messung zu erleichtern. Bei der Verwendung zur Komplexbildung mit oder Behandlung von biologischen Organismen können Proteine mit bioaktiven Agenzien kombiniert werden (im weiteren "Aufbesserung" genannt), um zum Wirksamkeit der Behandlung beizutragen.
Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen sind wünschenswert, weil sie Reaktionsstellen lokalisieren und die wirtschaftliche Rückgewinnung verbessern. Ferner sind immobilisierte Proteine im Vergleich zu freien Proteinen im allgemeinen weniger anfällig für Aktivitätsverluste durch chemischen Angriff sowie Veränderungen der Temperatur und des pH.
Verfahren zur Markierung oder Aufbesserung von Proteinen sind wünschenswert, weil sie die Quantifizierung, Lokalisation, Spezifität und Reaktivität des Proteins erleichtern. Die sich ergebenden Kombinationen sind weiterhin mächtige Werkzeuge zur klinischen Analyse und Behandlung.
Es gibt zahlreiche Techniken zur Immobilisierung von Proteinen auf festen Trägermaterialien. Proteine können physikalisch auf inerte Trägermaterialien adsorbiert werden oder durch Reaktion mit bifunktionalen Verbindungsarmen kovalent an das Trägermaterial gebunden werden. Auch Mikroverkapselung, Einschluß in Gel und Komplexierung (mit Ionenaustauscherharzen) können zur Bindung und Immobilisierung führen.
Weiterhin existieren zahlreiche Techniken zur Bindung von Markern und bioaktiven Agenzien an Proteine. Die meisten dieser Techniken erfordern eine Reaktion des Markers oder Agens mit einer funktionellen Gruppe des Proteins, wie z. B. einer Aminogruppe, die wiederholt im gesamten Protein auftritt. Auch wenn einige Wiederholungen einer solchen Gruppe durch die Konformation des Proteins gegen eine Anbindung abgeschirmt sind, liegen doch viele andere frei und stehen zur Bindung der Markergruppe oder des biokativen Agens zur Verfügung. Das Ergebnis ist eine Mischung aus Proteinen mit an verschiedenen nichtspezifischen Stellen gebundenen Markern oder bioaktiven Agenzien.
Bei jeder dieser Techniken zur Immobilisierung, Markierung oder Aufbesserung sollten einige Kriterien erfüllt sein. Das erste ist eine korrekte räumliche Orientierung für die optimale Reaktionsfähigkeit der Proteine. Ein Protein arbeitet am besten, wenn es auf eine Weise gebunden ist, die die aktiven Zentren vom Trägermaterial, Marker oder bioaktiven Agens fortweisen läßt und sie zur funktionalen Operation verfügbar hält. Das zweite ist das Erlangen von Proteinaktivitäten und -spezifitäten, die mindestens vergleichbar mit denen sind, die von der ungebundenen Form des Proteins gezeigt werden. Das dritte, das insbesondere für die Immobilisierung gilt, ist die Möglichkeit zur wiederholten Verwendung und einer hohen Packungsdichte. Das vierte ist die Vermeidung einer Bindung des Trägermaterials, Markers oder Agens an oder in der Umgebung des aktiven Zentrums des Proteins. Anderenfalls verursacht der sich ergebende Verlust funktionaler Kapazität häufig unzulängliche Reaktionsfähigkeit und die Notwendigkeit, mehr Protein einzusetzen.
Eine der wichtigsten Ausführungsformen von Proteinen, die heute untersucht werden, ist der Antikörper. Die Notwendigkeit, die Bindung von Immobilisierungsträgern, Markierungsgruppen oder bioaktiven Agenzien an oder nahe der Antigenbindungsstelle des Antikörpers zu minimieren, ist weithin anerkannt.
Ein Verfahren zur derartigen Minimierung erfordert die Bindung eines Antigens an den Antikörper, bevor die Reaktion mit der Markierungsgruppe, dem bioaktiven Agens oder dem Immobilisierungsträger stattfindet. Auf diese Weise schirmt das Antigen die Bindungsstelle des Antikörpers gegen eine Reaktion ab. Der Erfolg dieser Abschirmungsmethode ist jedoch begrenzt. Obwohl eine starke Affinität des Antikörpers zum Antigen besteht, erlaubt das Gleichgewicht zwischen dem Antikörper/Antigen-Komplex und dem freien Antikörper/Antigen die Reaktion des freien Antikörpers. Dies hat vorhersehbare negative Folgen. Weiterhin resultiert das Ausgesetztsein des Antigens gegenüber einer Markierungsgruppe, einem bioaktiven Agens oder einem Immobilisierungsträger häufig in einer Bindung dieses Materials an das Antigen.
Die bekannten Verfahren zur Immobilisierung, Markierung oder Aufbesserung jeglicher Art von Protein sind bei weitem nicht in der Lage, die funktionale Kapazität des Proteins zu erhalten. Die Proteinreaktionsfähigkeit wird im allgemeinen verringert. Geeignete räumliche Orientierung und Packungsdichte liegen häufig nicht vor. Und als Folge treten viele wirtschaftliche, toxische, reaktive und Unspezifitäts-Probleme auf Folglich werden bessere und spezifischere Verfahren zur Bindung von Markern, Trägermaterialien oder bioaktiven Agenzien an Proteine benötigt.
WO 80/02157 offenbart eine Reaktion eines Substrats, gewählt aus Aminosäureestern, Peptidestern und Depsipeptiden, gegebenenfalls N-substituierten Aminosäureamiden und Peptidamiden oder gegebenenfalls N-terminal geschützten Peptiden mit einer Aminokomponente in Gegenwart eines Carboxypeptidase-Enzyms in einer wäßrigen Lösung oder Dispersion mit einem pH zwischen 5 und 10,5. Im Besonderen offenbart DI die Einbringung eines Hydrazids am C-Terminus eines Peptids.
WO 85/05638 beschreibt allgemein die selektive Modifikation vieler funktionaler Gruppen in einem Protein ohne spezifischen Bezug auf C-terminale Modifikation.
Carlsberg Res. Commun. 49 (1984), 457-462, ist ein Übersichtsartikel, der sich mit der Verwendung von Exopeptidasen bei der Peptidsynthese, im besonderen der Verwendung der Carboxypeptidase Y bei der Transpeptidierung und Peptidsynthese, beschäftigt.
Carlsberg Res. Commun. 51 (1986), 83-128, diskutiert die Verwendung von Exopeptidasen bei der Peptidsynthese mit kleinen Peptidsubstraten einschließlich einer Diskussion der Verwendung von Exopeptidasen beim Austausch von C-terminalen Aminosäureresten in Peptiden einschließlich vom Schwein stammender und menschlicher Insuline.
Biochem. J. 249 (1988), 83-88, offenbart die enzymatische Kupplung aminosäureaktiver Ester mit dem C-Terminus eines Proteins unter Verwendung von Trypsin. Es wird festgestellt, daß die Verwendung von Carboxypeptidase Y zur Addition von Aminosäureresten an den C-Terminus von Polypeptiden fragwürdig und wenig geeignet erscheint, da Exopeptidasen anfälliger für sterische Beschränkungen sind als Endopeptidasen wie Trypsin.
JBC 261 (1986), 10695, beschreibt die Einbringung einer p-Azidophenylgruppe in ein Peptid durch konventionelle Techniken der chemischen Synthese.
EP-A-0 375 260 beschreibt die Herstellung von Peptiden mit C-terminalem Prolinamid durch Reaktion eines Proteinsubstrats mit Carboxypeptidase Y in wäßriger Lösung in Gegenwart von Ammoniak.
Carlsberg Res. Commun. 46 (1981), 121-128, beschreibt, daß Carboxypeptidase Y den Austausch von C-terminalen Aminosäureresten in Peptiden gegen verschiedene andere Gruppen katalysiert. Die Umsetzung von Peptiden zu Peptidestern durch Alkoholyse wird als beschränkt auf pH-Werte unter 4 beschrieben.
Ein Gegenstand der Erfindung ist daher, Verfahren zur Markierung, Immobilisierung oder bioaktiven Aufbesserung von Proteinen an Stellen zu entwickeln, die entfernt vom funktional aktiven Zentrum oder Zentren des Proteins liegen. Es ist weiterhin Gegenstand der Erfindung, Proteine zu immobilisieren, indem sie kovalent an einen inerten Immobilisationsträger gebunden werden. Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist die kovalente Bindung eines Markers an eine spezifische Stelle eines Proteins. Ferner ist die kovalente Bindung eines bioaktiven Agens an eine spezifische Stelle eines Proteins Gegenstand der Erfindung. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Immobilisierung von Proteinen, die zu geeigneter räumlicher Orientierung und Packungsdichte führt, so daß ungehinderter Zugang zu den funktional aktiven Zentren besteht.

Zusammenfassung der Erfindung

Diese und andere Ziele werden durch die vorliegende Erfindung, die auf Verfahren zur Immobilisierung, Markierung und Aufbesserung von Proteinen gerichtet ist, erreicht. Allgemein umfaßt das Verfahren die Bindung des Immobilisationsträgers, Markers oder bioaktiven Agens (im weiteren "Hilfssubstanz" genannt) an ein Protein an einer spezifischen Stelle, so daß die Störung der Funktion und Leistung des Proteins minimiert oder ausgeschlossen wird. Bevorzugt liegt diese spezifische Stelle weit von den aktiven Zentren des Proteins entfernt.
Im einzelnen umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren zwei primäre Reaktionen. Die erste (im weiteren die "primäre Kupplungsreaktion" genannt) verknüpft katalytisch eine L-Aminosäure, ein L-Aminosäurederivat, ein Amin oder einen Alkohol (im weiteren "Nucelophil" genannt) mit dem Carboxylende des Proteins unter Verwendung eines Carboxypeptidase-Enzyms in einem nicht-neutralen Medium. Die zweite (im weiteren "primäre Bindungsreaktion" genannt) bindet die Seitenkette des Nucleophils an eine spezifisch reaktive Gruppe an der Hilfssubstanz, welche einen Immobilisierungsträger, Marker oder ein bioaktives Agens umfaßt.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf alternativen Synthesewegen durchgeführt werden, abhängig davon, ob die primäre Kupplungsreaktion oder die primäre Bindungsreaktion zuerst ausgeführt wird. Diese zwei Wege sind in dem Schema dargestellt, das im folgenden Abschnitt mit dem Titel "Detaillierte Beschreibung der Erfindung" gezeigt ist.
Der erste Syntheseweg kann mit allen Größen und Löslichkeiten der Reaktionspartner angewandt werden. Ein Nucleophil mit einer kennzeichnenden Seitenkette wird zunächst durch die primäre Kupplungsreaktion mit dem Carboay- oder Carboxyesterterminus des Proteins verknüpft. Diese Verknüpfung fügt das Nucleophil entweder zum Carboxylende des Proteins hinzu (Kondensation) oder substituiert den Aminosäurerest, der das Carboxylende des Proteins bildet, durch das Nucleophil (Transpeptidierung mit Aminosäure oder Amin oder Umesterung mit Alkohol) oder substituiert die Alkoholgruppe eines terminalen Aminosäureesterrestes durch das Nucleophil. Das resultierende Protein-Nucleophil-Addukt wird dann unter Nutzung des kennzeichnenden Charakters der Seitenkette durch die primäre Bindungsreaktion an eine Hilfssubstanz gebunden. Das Addukt wird entweder direkt an die Hilfssubstanz oder indirekt über einen bifunktionalen Verbindungsarm gebunden. In beiden Fällen findet die Bindungsreaktion zwischen der Seitenkette des Nucleophils und der spezifisch reaktiven Gruppe an der Hilfssubstanz oder dem Verbindungarm statt.
Der zweite Syntheseweg kann angewandt werden, wenn die Molaritäten der Reaktionspartner ausreichend sind, um eine relativ schnelle enzymatische Verknüpfung zu erlauben. Ein Nucleophil wird zunächst durch die primäre Bindungsreaktion an die Hilfssubstanz gebunden, so daß eine Zwischenform aus Hilfssubstanz und Nucleophil entsteht. Die Bindung kann durch direkte Reaktion zwischen der Seitenkette des Nucleophils und der Hilfssubstanz oder indirekt über einen Verbindungsarm, der zuvor an die Hilfssubstanz gebunden wurde, erfolgen. Die Zwischenform wird dann durch die primäre Kopplungsreaktion mit dem Carboxylende des Proteins verbunden. Transpeptidierung, Kondensation und Umesterung mit Aminosäure, Aminosäurederivaten, Amin- oder Alkohol- Nucleophilen können sämtlich in dieser primären Kopplungsreaktion angewandt werden.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Proteine sind biologisch aktive Polypeptide. Ohne Einschränkung eingeschlossen sind Enzyme, Enzyminhibitoren, Peptidhormone, DNA-bindende Proteine, Leserahmen-Proteine, Transkriptasen, Antikörper, F8b-beschnittene Antikörper, Antikörperfragmente, Regulationsproteine, Peptide ab einer Größe von nur zwei Resten und verschiedene andere funktionale Proteine.
Die bevorzugten Proteine zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren sind monoklonale oder polyklonale Antikörper. Bevorzugte Klassen von Antikörpern schließen jene ein, deren Funktion das Auffinden von Antigenen in biologischen Systemen oder Verunreinigungen in biologischen oder unbelebten Systemen, der Transport von bioaktiven Agenzien zu spezifischen Orten, die Diagnose von Krankheiten oder organischen Fehlfunktionen, die Abtrennung von Antigenen von anderen Materialien in biologischen oder unbelebten Systemen und die Entfernung von Antigenen aus biologischen oder unbelebten Systemen ist. Besonders bevorzugte Ausführungsformen sind Säuger-Immunglobulinproteine der IgA-, IgD-, IgE-, IgM- oder IgG-Klasse der Immunoproteine.
Das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete L-Aminosäurenucleophil ist eine L-Alpha-Aminosäure oder Aminosäurederivat mit einer Seitenkette mit einem reaktiven Substiuenten. Alternativ kann es, soweit es ebenfalls die Hilfssubstanz darstellt, eine einfache, nicht-funktionale Seitenkette besitzen. Kommt der erste Syntheseweg zur Anwendung, wird die Seitenkette so gewählt, daß das L-Aminosäurenucleophil einen kennzeichnenden Charakter bezüglich der Aminosäuren des Proteins besitzt. Durch dieses Design wird das L-Aminosäurenucleophil eher als die Aminosäuren des Proteins selektiv und vorzugsweise mit einer spezifisch reaktiven Gruppe des Verbindungsarms oder der Hilfssubstanz zur Reaktion gebracht. Wird der zweite Syntheseweg angewandt, kann ein solcher kennzeichnender Charakter verwendet werden, er ist jedoch nicht notwendig, da die primäre Kupplungsreaktion die angestrebte Selektivität bereitstellt.
Das Aminnucleophil, das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, ahmt das L-Aminosäurenucleophil nach. Es ist ein C&sub2; bis C&sub2;&sub0; aliphatisches, aromatisches oder arylaliphatisches primäres Amin mit einem reaktiven Substituenten entlang seiner Hauptkette oder an seinem anderen Ende. Die obengenannten Bedingungen hinsichtlich des Charakters der Aminosäureseitenkette gelten auch, wenn ein Amin im ersten und zweiten Syntheseweg verwendet wird.
Das Alkoholnucleophil, das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, ist ein aliphatischer, aromatischer oder arylaliphatischer C&sub1; bis C&sub2;&sub0; primärer Alkohol mit einem reaktiven Substituenten entlang seiner Hauptkette oder an seinem anderen Ende.
Der Verbindungsarm, der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, ist eine flexible oder semi-flexible Kette, die an ihren Enden (1) eine spezifisch reaktive Gruppe, die in bezug auf die Seitenkette des Nucleophils reaktionsfähig ist, und (2) eine andere funktionelle Gruppe, die mit einer bindungsfähigen Gruppe der Hilfssubstanz reagiert, trägt.
In der vorliegenden Erfindung nützliche Immobilisationsträger sind anorganische oder organische Materialien, die funktionalisiert werden können mit einer spezifisch reaktiven Gruppe, die eine selektive Reaktion mit der Seitenkette des Nucleophils erlaubt oder mit einer bindungsfähigen Gruppe, die mit der anderen funktionalen Gruppe des Verbindungsarms reagiert. Das Trägermaterial ist ein poröses oder semi-poröses Material, daß biologisch inert und im verwendeten Medium unlöslich ist.
Bioaktive Agenzien schließen jene ein, die ein wünschenswertes biochemisches oder therapeutisches Ergebnis bewirken. Sie können funktionalisiert werden mit einer spezifisch reaktiven Gruppe, die eine Reaktion mit der Seitenkette des Nucleophils erlaubt oder mit einer bindungsfähigen Gruppe, die mit der anderen funktionalen Gruppe des Verbindungsarms reagiert. Eingeschlossen sind chemotherapeutische Wirkstoffe, oxidierende oder reduzierende Wirkstoffe, cytotoxische Wirkstoffe, Antikrebsmittel, radioaktive Wirkstoffe, Antibiotica, Antimycotica, Anti-Infectiva, Schwermetall-Agenzien, antivirale Wirkstoffe, lytische Wirkstoffe, Chelatgruppen und ähnliches.
In der vorliegenden Erfindung nützliche Marker schließen fluoreszierende Gruppen, phosphoreszierende Gruppen, kolorimetrische Gruppen, radioaktive Gruppen, luminieszente Gruppen, spektrometrische Gruppen, kernmagnetisch resonante Gruppen, elektronenspinresonante Gruppen und andere Gruppen mit physikochemischen Eigenschaften, die durch Meßverfahren nachgewiesen werden können ein. Diese Marker können funktionalisiert werden mit einer spezifisch reaktiven Gruppe, die eine Reaktion mit der Seitenkette des Nucleophils erlaubt oder mit einer bindungsfähigen Gruppe, die mit der anderen funktionalen Gruppe des Verbindungsarms reaktionsfähig ist. Das Nucleophil kann ebenfalls als Marker fungieren, wenn es radioaktive Atome trägt.
Die Enzyme, die die primären Kopplungsreaktionen durchführen sind Carboxypeptidasen. Sie wirken spezifisch am C-terminalen Ende von Peptidketten, und bilden oder transformieren Peptidbindungen unter basischen Bedingungen (Kondensation und Transpeptidierung) oder sauren Bedingungen (Umesterung) und sind relativ stabil unter den verwendeten Reaktionsbedingungen.
Bevorzugte Gruppen von Carboxypeptidasen für das erfindungsgemäße Verfahren sind Serin-Carboxypeptidasen. Bestimmte Vertreter dieser Enzyme, bekannt als Carboxypeptidase Y, sind spezifisch für Aminosäuren oder Amine mit neutralen oder basischen Seitenketten. Bestimmte andere Klassen von Carboxypeptidase-Enzymen sind spezifisch für Aminosäuren mit sauren Seitenketten. Eine Korrelation zwischen der Spezifität des Carboxypeptidase-Enzyms und dem neutralen, sauren oder basischen Charakter des zu verknüpfenden Nucleophils ist entsprechend des erfindungsgemäßen Verfahrens angemessen.
Die Bedingungen für die enzymatisch katalysierte Reaktion zwischen dem Protein und dem Nucleophil schließen die Kontrolle des pH, der Temperatur der Konzentration und der Inkubationszeit ein.
Zusammengefaßt ist die vorliegende Erfindung auf Verfahren zur Bildung eines Proteins, das an eine Hilfssubstanz gebunden ist gerichtet. Ein solches Verfahren umfaßt die Schritte (a) Verknüpfung eines Nucleophils mit dem Protein durch Katalyse mit einem Carboxypeptidase-Enzym in einem nicht-neutralen Medium zur Bildung eines Addukts, wobei das Nucleophil eine L-Aminosäure, ein L-Aminosäurederivat, ein Amin oder ein Alkohol mit einer Seitenkette ist, die einen kennzeichnenden reaktiven Substituenten trägt und (b) Bindung des Addukts an die Hilfssubstanz oder deren Kombination mit einem Verbindungsarm zur Bildung des gebundenen Proteins, wobei die Hilfssubstanz oder die Kombination eine spezifisch reaktive Gruppe trägt, die in bezug auf den kennzeichnenden reaktiven Substituenten des Addukts reaktionsfähig ist. Ein weiteres Verfahren zur Bindung eines Proteins an eine Hilfssubstanz umfaßt die Schritte (a) Bindung des Nucleophils an die Hilfssubstanz oder deren Kombination mit einem Verbindungsarm zur Bildung einer Zwischenform, wobei das Nucleophil eine L-Aminosäure, ein L-Aminosäurederivat, ein Amin oder ein Alkohol mit einer Seitenkette ist, die einen reaktiven Substituenten trägt, und die Hilfssubstanz oder Kombination eine reaktive Gruppe trägt, die in bezug auf den reaktiven Substituenten des Nucleophils reaktionsfähig ist und (b) Verknüpfung der Zwischenform mit dem Protein durch nicht-neutrale Katalyse mit einem Carboxypeptidase-Enzym zur Bildung des gebundenen Proteins.
Nach jedem dieser zwei Verfahren kann die Hilfssubstanz ein Immobilisierungsträger, ein Marker oder ein bioaktives Agens sein. Vorzugsweise verwenden die Verfahren die Kombination aus der Hilfssubstanz und dem kovalent gebundenem Verbindungsarm mit der spezifisch reaktiven Gruppe am freien Ende des Verbindungsarms. Unter basischen Katalysebedingungen ist es bevorzugt, daß das Nucleophil eine L-Aminosäure, ein L-Aminosäurederivat oder Amin ist. Unter sauren Katalysebedingungen ist es bevorzugt, daß das Nucleophil ein Alkohol ist. Weiter ist es bevorzugt, daß die Katalysebedingungen eine kurze Inkubationszeit einschließen. L-Aminosäurenucleophile können aliphatische Aminosäuren, Hydroxy-L-Aminosäuren, schwefelhaltige L-Aminosäuren, Diaminomonocarbosäuren, aromatische L-Aminosäuren, heterozyklische L-Aminosäuren und aktivierte Derivate derselben einschließen. Bevorzugt ist das L-Aminosäurenucleophil Serin, Taurin oder Alanin.
Das Protein in jedem dieser Verfahren kann ein Antikörper, ein Enzym, ein Enzyminhibitor, ein Proteinhomon, ein DNA-bindendes Protein, ein Regulationsprotein oder ein DNA-Leserahmen-Protein sein. Es ist bevorzugt, daß das Protein ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper und daß das Nucleophil im wesentlichen vollständig an das Carboxylende der schweren Kette des Antikörpers gebunden ist. Weiter ist bevorzugt, daß das Protein ein IgG-Immunoprotein ist.
Das Carboxypeptidase-Enzym kann vorzugsweise eine Serin- oder Cystein- Carboxypeptidase sein.
Die Erfindung richtet sich auch auf Verfahren zur Herstellung eines markierten Proteins. Die Verfahren umfassen die Bindung eines Proteins mit einem Nucleophil einer markierten L-Aminosäure, eines L-Aminosäurederivats, eines Amins oder eines Alkohols in einem nicht-neutralen Medium und in Gegenwart eines Carboxypeptidase-Enzyms. Der Marker kann fluoreszierend, kernmagnetisch, phosphoreszierend, kolorimetrisch, magnetisch, elektronenresonant oder spektrometrisch sein. Ein besonderes erfindungsgemäßes Verfahren umfaßt (a) die Verknüpfung eines Proteins und eines Nucleophils in einem nicht-neutralen Medium und in Gegenwart eines Carboxypeptidase-Enzyms zur Bildung eines Addukts, wobei das Nucleophil eine Seitenkette mit einem kennzeichnenden reaktiven Substituenten trägt, der bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus Sulfhydryl, Hydroxyl, aktiviertes Hydroxyl, Olefinyl, aktivierter Ester, Amino, Azidyl, Hydrazinyl, Phosphoramidoyl, Boryl, Ferrocenyl, Ferro-Komplexen und Mischungen daraus gewählt wird, (b) das Kombinieren eines Markers und eines Verbindungsarms zur Bildung einer Kombination, wobei der Marker mindestens eine reaktive Gruppe besitzt und der Verbindungsarm eine flexible oder semiflexible Kette ist, die einerseits eine spezifisch reaktive Gruppe trägt, die in bezug auf den kennzeichnenden reaktiven Substituenten reaktionsfähig ist, und andererseits eine weitere funktionelle Gruppe besitzt, die reaktionsfähig gegenüber der reaktiven Gruppe des Labels ist, und (c) die Verbindung des Addukts und dei Kombination zur Bildung des markierten Proteins. Ein weiteres Verfahren umfaßt (a) das Kombinieren eines Markers und eines Verbindungsarms zur Bildung einer Kombination, wobei der Marker mindestens eine bindungsfähige Gruppe besitzt und der Verbindungsarm eine flexible oder semi-flexible Kette ist, die einerseits eine spezifisch reaktive Gruppe trägt, die in bezug auf die bindungsfähige Gruppe des Markers nicht reaktionsfähig ist oder nicht reaktionsfähig gemacht wird und andererseits eine weitere funktionelle Gruppe trägt, die in bezug auf die bindungsfähige Gruppe des Markers reaktionsfähig ist, (b) die Verbindung der Kombination und eines Nucleophils zur Bildung einer Zwischenform, wobei das Nucleophil eine Seitenkette mit einem reaktiven Substituenten trägt, der in bezug auf die spezifisch reaktive Gruppe der Kombination reaktionsfähig ist, und (c) die Verbindung eines Proteins mit der Zwischenform in einem nicht-neutralen Medium und in Gegenwart eines Carboxypeptidase-Enzyms zur Bildung des markierten Proteins. Noch ein weiteres Verfahren zur Bildung eines markierten Proteins umfaßt (a) die Verbindung eines Markers und eines Nucleophils zur Bildung einer Zwischenform, wobei das Nucleophil eine Seitenkette mit einem reaktiven Substituenten trägt und der Marker eine reaktive Gruppe besitzt, die in bezug auf den reaktiven Substituenten des Nucleophils reaktionsfähig ist, und (b) Verbindung eines Proteins und der Zwischenform in einem nicht-neutralen Medium und in Gegenwart eines Carboxypeptidase-Enzyms.
Die resultierenden markierten Proteine können ein Protein einschließen, das ein markiertes Nucleophil einer L-Aminosäure, eines L-Aminosäurederivats, eines Amins oder eines Alkohols an sein Carboxylende gekoppelt oder substituiert hat. Vorzugsweise ist das Nucleophil im wesentlichen ausschließlich an das Carboxylende gekoppelt oder substituiert. Es ist bevorzugt, daß das Protein ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper ist und daß das Nucleophil L-Serin, L-Taurin oder L-Alanin ist. Es ist weiterhin bevorzugt, daß das markierte Nucleophil radioaktiv ist.
In den erfindungsgemäßen Verfahren zu Proteinmarkierung ist es bevorzugt, daß die Proteinkonzentration etwa 1 uM bis etwa 1 mM beträgt und die Enzymkonzentration bei etwa 1 pM bis 1 mM liegt. Unter sauren Kopplungsbedingungen ist es bevorzugt, daß das Nucleophil ein Alkohol ist. Unter basischen Kopplungsbedingungen ist es bevorzugt, daß das Nucleophil eine L-Aminosäure, ein L-Aminosäurederivat oder Amin ist, daß die Kopplungsreaktion für mindestens 5 Sekunden durchgeführt wird, und daß das Protein, das Nucleophil und das Enzym in einer wäßrigen Mischung kombiniert werden. Diese Mischung kann hergestellt werden durch (a) Kombination des Proteins und des Nucleophils zur Bildung einer Mischung, (b) Einstellung des pH der Mischung auf einen Bereich zwischen 2,0 bis 10,5 und (c) Hinzufügen des Enzyms zu der Mischung.
Die Erfindung bietet weiterhin Verfahren zu Herstellung eines immobilisierten Proteins. Ein solches Verfahren umfaßt die Schritte (a) Verknüpfung eines Proteins und eines Nucleophils in einem nicht-neutralen Medium und in Gegenwart eines Carboxypeptidase- Enzyms zur Bildung eines Addukts, und (b) Verbindung des Addukts und eines Immobilisierungsträgers zur Bildung des immobilisierten Proteins, wobei der Immobilisierungsträger mindestens eine spezifisch reaktive Gruppe trägt, die in bezug auf den kennzeichnenden reaktiven Substituenten des Addukts reaktionsfähig ist. Ein anderes Verfahren umfaßt (a) die Verknüpfung eines Proteins und eines Nucleophils in einem nichtneutralen Medium und in Gegenwart eines Carboaypeptidase-Enzyms zur Bildung eines Addukts, (b) das Kombinieren eines Immobilisierungsträgers und eines Verbindungsarms zur Bildung einer kovalent verbundenen Kombination, wobei der Immobilisierungsträger mindestens eine bindungsfähige Gruppe besitzt und der Verbindungsarm eine flexible oder semi-flexible Kette ist, die einerseits eine spezifisch reaktive Gruppe trägt, die in bezug auf den kennzeichenden reaktiven Substituenten des Addukts reaktionsfähig ist, und andererseits eine weitere funktionelle Gruppe besitzt, die reaktionsfähig gegenüber der bindungsfähigen Gruppe des Immobilisierungsträgers ist, und (c) die Verbindung des Addukts und der Kombination zur Bildung des immobilisierten Proteins. Nach jedem dieser Verfahren kann das Nucleophil eine L-Aminosäure, ein L-Aminosäurederivat, ein Amin oder ein Alkohol mit einer Seitenkette mit einem kennzeichnenden reaktiven Substituenten sein, wie z. B. Sulfhydryl, Hydroxyl, aktiviertes Hydroxyl, Amino, aktivierter Ester, Olefinyl, Azidyl, Hydrazinyl, Phosphoramidoyl, Boryl, Ferrocenyl, Ferro-Komplexen und Mischungen daraus. Ein weiteres erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Proteins umfaßt (a) das Kombinieren eines Immobilisierungsträgers mit einem Verbindungsarm zur Bildung einer kovalent verbundenen Kombination, wobei der Immobilisierungsträger mindestens eine bindungsfähige Gruppe besitzt und der Verbindungsarm eine flexible oder semi-flexible Kette ist, die einerseits eine spezifisch reaktive Gruppe trägt, die in bezug auf die bindungsfähige Gruppe nicht reaktionsfähig ist oder nicht reaktionsfähig gemacht wird und andererseits eine weitere funktionelle Gruppe trägt, die in bezug auf die bindungsfähige Gruppe des Markers reaktionsfähig ist, (b) die Verbindung der Kombination mit einem Nucleophil zur Bildung einer Zwischenform, wobei das Nucleophil vorzugsweise eine L-Aminosäure, ein L-Aminosäurederivat, ein Amin oder ein Alkohol mit einer Seitenkette ist, die einen reaktiven Substituenten trägt, der in bezug auf die spezifisch reaktive Gruppe der Kombination reaktionsfähig ist, und (c) die Verknüpfung der Zwischenform und eines Proteins in einem nicht-neutralen Medium und in Gegenwart eines Carboxypeptidase-Enzyms zur Bildung des immobilisierten Proteins. Noch ein weiteres Verfahren umfaßt die Schritte (a) Verknüpfung eines Nucleophils mit einem Immobilisierungsträger zur Bildung einer Zwischenform, wobei das Nucleophil vorzugsweise eine L-Aminosäure, ein L-Aminosäurederivat, ein Amin oder ein Alkohol mit einer Seitenkette ist, die einen reaktiven Substituenten trägt, und der Immobilisierungsträger mindestens eine spezifisch reaktive Gruppe besitzt, die in bezug auf den reaktiven Substituenten des Nucleophils reaktionsfähig ist, und (b) Verknüpfung eines Proteins und der Zwischenform in einem nicht-neutralen Medium und in Gegenwart eines Carboxypeptidase-Enzyms zur Bildung des immobilisierten Proteins.
Nach jedem der erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Proteins ist es bevorzugt, daß das Carboxylende des Proteins mit dem Immobilisierungsträger verknüpft ist. Der Immobilisierungsträger kann anorganisch oder organisch sein. Weiterhin kann der Immobilisierungsträger in Form von porösen oder semi-porösen Mikropartikeln, Mikrokügelchen, Kügelchen, Kugeln, Gelpartikeln, Fasern, Plättchen, Platten oder partikulären Materialien vorliegen.
Die Erfindung bietet weiterhin Verfahren zu Herstellung eines durch ein bioaktives Agens aufgebesserten Proteins. Ein solches Verfahren umfaßt (a) die Verknüpfung eines Proteins und eines Nucleophils in einem nicht-neutralen Medium und in Gegenwart eines Carboxypeptidase-Enzyms zur Bildung eines Addukts, und (b) die Verbindung des Addukts und eines bioaktiven Agens zur Bildung des aufgebesserten Proteins, wobei das bioaktive Agens mindestens eine spezifisch reaktive Gruppe trägt, die in bezug auf den reaktiven Substituenten des Addukts reaktionsfähig ist. Ein anderes Verfahren umfaßt die Schritte (a) Verknüpfung eines Proteins und eines Nucleophils in einem nicht-neutralen Medium und in Gegenwart eines Carboxypeptidase-Enzyms zur Bildung eines Addukts, (b) Kombinieren eines bioaktiven Agens und eines Verbindungsarms zur Bildung einer kovalent verbundenen Kombination, wobei das bioaktive Agens mindestens eine bindungsfähige Gruppe besitzt und der Verbindungsarm eine flexible oder semi-flexible Kette ist, die einerseits eine spezifisch reaktive Gruppe trägt, die in bezug auf den reaktiven Substituenten des Addukts reaktionsfähig ist, und andererseits eine weitere funktionelle Gruppe besitzt, die reaktionsfähig gegenüber der bindungsfähigen Gruppe des bioaktiven Agens ist, und (c) die Verbindung des Addukts und der Kombination zur Bildung des aufgebesserten Proteins. Vorzugsweise ist das Nucleophil eine L-Aminosäure, ein L-Aminosäurederivat, ein Amin oder ein Alkohol mit einer Seitenkette, die einen kennzeichnenden reaktiven Substituenten trägt, der aus der Gruppe bestehend aus Sulfhydryl, Hydroxyl, aktiviertes Hydroxyl, Amino, aktivierter Ester, Olefinyl, Azidyl, Hydrazinyl, Phosphoramidoyl, Boryl, Ferrocenyl, Ferro- Komplexen und Mischungen daraus gewählt wird.
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung eines durch ein bioaktives Agens aufgebesserten Proteins umfaßt (a) die Verknüpfung eines Nucleophils mit einem bioaktiven Agens zur Bildung einer Zwischenform, wobei das Nucleophil vorzugsweise eine L-Aminosäure, ein L-Aminosäurederivat, ein Amin oder ein Alkohol mit einer Seitenkette ist, die einen reaktiven Substituenten trägt, und das bioaktive Agens mindestens eine spezifisch reaktive Gruppe besitzt, die in bezug auf den reaktiven Substituenten des Nucleophils reaktionsfähig ist, und (b) Verknüpfung eines Proteins und der Zwischenform in einem nicht-neutralen Medium und in Gegenwart eines Carboxypeptidase-Enzyms zur Bildung des aufgebesserten Proteins. Ein alternatives Verfahren zur Herstellung eines aufgebesserten Proteins umfaßt (a) das Kombinieren eines bioaktiven Agens mit einem Verbindungsarm zur Bildung einer kovalent verbundenen Kombination, wobei das bioaktive Agens mindestens eine bindungsfähige Gruppe besitzt und der Verbindungsarm eine flexible oder semi-flexible Kette ist, die einerseits eine spezifisch reaktive Gruppe trägt, die in bezug auf den reaktiven Substituenten der Kombination reaktionsfähig ist und andererseits eine weitere funktionelle Gruppe trägt, die in bezug auf die bindungsfähige Gruppe des Markers reaktionsfähig ist, und (b) die Verbindung eines Nucleophils mit der Kombination zur Bildung einer Zwischenform, wobei das Nucleophil vorzugsweise eine L-Aminosäure, ein L-Aminosäurederivat, ein Amin oder ein Alkohol mit einer Seitenkette ist, die einen reaktiven Substituenten trägt, der in bezug auf die spezifisch reaktive Gruppe der Kombination reaktionsfähig ist, und (c) die Verknüpfung eines Proteins und der Zwischenform in einem nicht-neutralen Medium und in Gegenwart eines Carboxypeptidase-Enzyms.
Nach den Verfahren zur Herstellung eines immobilisierten Proteins oder eines durch ein bioaktives Agens aufgebesserten Proteins ist es bevorzugt, daß das Nucleophil eine L-Aminosäure, ein L-Aminosäurederivat oder ein Amin unter basischen Kopplungsbedingungen und ein Alkohol unter sauren Kopplungsbedingungen ist.
Die Erfindung schließt auch Verfahren zur funktionellen Reaktion eines Proteins unter Verwendung eines nach den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten immobilisierten Proteins ein. Weiterhin sind Verfahren zur Durchführung einer Bioreaktion mit einem bioaktiven Agens unter Verwendung eines nach den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Proteins, das ein bioaktives Agens trägt, eingeschlossen.
Nach den erfindungsgemäßen Verfahren ist es bevorzugt, daß der "kennzeichnende reaktive Substituent" und die "spezifisch reaktive Gruppe" aus den folgenden Paaren gewählt sind: (a) eine Sulfhydryl-Gruppe und eine organometallische Gruppe, (b) eine Olefinyl- Gruppe und eine Dienyl-Gruppe, (c) eine polare olefinische Gruppe und ihr korrespondierendes Monomer oder substituierte Formen desselben, (d) eine Affinitätskomplexe bildende Verbindung und deren Substrat, (e) ein Paar hydroborierter olefinischer Gruppen, (f) eine aromatische Amino-Gruppe und eine Epoxy-Gruppe, ein aktiverter Ester oder eine Aldehyd-Gruppe, (g) eine Azidyl- oder Hydrazinyl-Gruppe und eine aromatische Amino-Gruppe, (h) ein aromatischer Alkohol und eine aktivierte Ester-Gruppe und (i) ein Hydrazin und eine reduzierende Zucker-Gruppe.
Es ist nach den erfindungsgemäßen Verfahren weiterhin bevorzugt, daß die Verbindungsarm-Kette ein Polymer oder Oligomer aus Amid-, Ester-, Karbonat-, Urethan-, Ether-, Glycidyl-, Olefin- oder Hydrokarbongruppen oder eine aliphatische Gruppe von etwa 2 bis 20 Atomen oder eine aromatische Gruppe aus etwa 1 bis 5 Ringen ist.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Abb. 1A ist eine graphische Darstellung der pH-Abhängigkeit des Einbaus von Serin in einen Antikörper im Verhältnis zur Zeit bei 0ºC.
Abb. 1B ist eine graphische Darstellung der pH-Abhängigkeit des Einbaus von Serin in einen Antikörper im Verhältnis zur Zeit bei 25ºC.
Abb. 1C ist eine graphische Darstellung der pH-Abhängigkeit des Einbaus von Serin in einen Antikörper im Verhältnis zur Zeit bei 37ºC.
Abb. 2 ist eine graphische Darstellung des Effekts der Inkubationszeit auf den Einbau von Serin.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Bis zur vorliegenden Erfindung existierte kein allgemeines Verfahren zur hochselektiven Anlagerung einer Hilfssubstanz an eine einzelne Stelle eines Proteins. Die vorliegende Erfindung löst dieses Problem, indem sie eine präzise Kontrolle der Stelle am Protein bietet, an die die Hilfssubstanz gebunden wird. Diese Kontrolle bewirkt, daß die Hilfssubstanz an eine spezifische Stelle am Protein bindet, die möglichst weit von den funktionalen Bereichen des Proteins entfernt ist, z. B. das Carboxylende.
***Genauer gesagt basiert die vorliegende Erfindung auf der Entdeckung, daß L-Aminosäuren, L-Aminosäurederivate, Amine und Alkohole unter basischen Carboxypeptidase-Katalysebedingungen durch Kondensations- oder Transpeptidierungsreaktion oder unter sauren Carboxypeptidase-Katalysebedingungen durch Umesterungsreaktion mit den Carboxylenden biologisch aktiver Proteine verknüpft werden können (die primäre Kopplungsreaktion). Siehe J. S. Fruton in "Advances in Enzymology", A. Meister, Ed. Vol. 53, 1982. John Wiley & Sons New York, pp 239-306 für einen generellen Übersichtsartikel zur proteinasekatalysierten Synthese von Peptidbindungen, dessen Offenbarung hierin durch Zitat eingeschlossen ist. Im Hinblick auf fast alle funktionalen Proteine, und insbesondere Antikörper, liegt das Carboxylende der Peptidkette oder Peptidketten in einem Bereich ihrer dreidimensionalen Struktur, der fast immer weit entfernt vom Bereich des aktiven Zentrums ist. Bei Antikörpern liegt dieses Ende z. B. im konstanten Bereich, der weit entfernt von der aktiven, variablen Region des Antikörpers ist. Folglich bietet die Verknüpfung der Hilfssubstanz mit dem Carboxylende des Proteins die angestrebte Kontrolle.
Wie in der vorangehenden Zusammenfassung der Erfindung beschrieben, wird die angefügte Substanz auf einem von zwei Synthesewegen mit dem Carboxylende des Proteins verbunden. Im ersten wird das Nucleophil separat mit dem Protein verbunden, so daß ein Addukt des Proteins und des Nucleophils gebildet wird. Das Addukt wird dann direkt an die Hilfssubstanz gekoppelt oder indirekt über eine Kombination aus Verbindungsarm und Hilfssubstanz verbunden.
Im zweiten Syntheseweg werden das Nucleophil und die Hilfssubstanz direkt gekoppelt oder indirekt über einen Verbindungsarm verbunden, so daß eine Zwischenform gebildet wird. Die Zwischenform wird dann mit dem Carboxylende des Proteins verknüpft.
Diese Synthesewege sind im folgenden Schema dargestellt. Beide Synthesewege funktionieren auf zwei Versionen, abhängig davon, ob die Hilfssubstanz direkt oder indirekt mit dem Nucleophil verknüpft wird. Schema Weg 2
ProCO&sub2;H ist ein Protein. R-X ist das Nucleophil, d. h. Aminosäure oder aliphatisches Amin, wobei R die Seitenkette und X die anfügende Amin- oder Hydroxygruppe ist. ASub ist eine angefügte Substanz. VArm ist ein Verbindungsarm. SGR ist eine spezifisch reaktive Gruppe. Der Buchstabe n steht für die Zahlen 0 und 1. Die Auswahl von X, R, SRG und dem Weg hängt von den funktionalen Gruppen des Proteins und den Löslichkeiten der Reaktionspartner ab.

Weg 1

Nach Weg 1 ist der erste Schritt die primäre Bindungsreaktion zur Bildung des Addukts aus Protein und Nucleophil. Sie wird durch Exopeptidase-Katalyse unter nichtneutralen Bedingungen ausgeführt.
Die spezielle Auswahl der L-Aminosäure, des L-Aminosäurederivats, des Amins oder des Alkohols als Nucleophil im ersten Schritt hängt von der Identität der Aminosäuren des Proteins und dem kennzeichenden Charakter der Seitenkette des Nucleophils ab. Die Seitenkette des verknüpften Nucleophils dient als Bindungsstelle der spezifisch reaktiven Gruppe der angefügten Substanz oder der Kombination aus Verbindungsarm und angefügter Substanz. Sie hat eine Struktur, die entweder nicht in den Aminosäuren des Proteins dupliziert ist, oder deutlich reaktiver in bezug auf die spezifisch reaktive Gruppe der Kombination oder Hilfssubstanz ist, als die Aminosäureseitenketten des Proteins. Sie wird ebenfalls so ausgewählt, daß eine direkte Reaktion mit diesen Seitenketten vermieden oder minimiert wird.
Diese von der Seitenkette des Nucleophils auferlegte Selektivität wird durch ihren reaktiven Substituenten erreicht. Dieser Substituent kann ein Sulfhydryl, Olefinyl, Amino, Azidyl, Hydrazinyl, Epoxy, Hydroxyl, aktiviertes Hydroxy, in welchem der Aktivator eine gute Abgangsgruppe wie Tosyl, Mesyl und Benzoyl ist, eine Säuregruppe wie Carboxyl-, Phosphor- oder Schwefel-, ein aktivierter Ester wie ein gemischtes Anhydrid, Carbodiimido, Iminylamidinyl, Imidazo, Pivaloylester, Neopentylester und dergleichen, Phosphoramidoyl, Ferrocenyl, Ferro-Komplexe, Boryl und ähnliche funktionelle Gruppen sein.
Im zweiten Schritt in Weg 1 wird die primäre Bindungsreaktion durch Verknüpfung der Seitenkette des Nucleophils entweder mit der Hilfssubstanz oder deren Kombination mit dem Verbindungsarm ausgeführt. In beiden dieser Variationen steht die spezifisch reaktive Gruppe der Kombination oder Hilfssubstanz so mit dem reaktiven Substituenten der Seitenkette in Wechselbeziehung, daß die Seitenkette und die Hilfssubstanz oder Kombination leicht miteinander reagieren, ohne daß andere Gruppen des Proteins wesentlich betroffen werden.
Um diese selektive Reaktivität der primären Bindungsreaktion zu erreichen, sind der reaktive Substituent und die spezifisch reaktive Gruppe einander als Paare von Gruppen zugeordnet. Einige Ausführungsformen dieses Paars zeigen nichtkompetetive Bindung, die im wesentlichen keine anderen Gruppen des Proteins betrifft. Diese beinhalten z. B. (1) eine Sulfhydryl- und eine organometallische Gruppe, vorzugsweise eine quecksilberhaltige organometallische Gruppe oder Alman-Reagenz, die besonders nützlich in bezug auf Antikörper sind, da Antikörper natürlicherweise keine freien Sulfhydrylgruppen, wie z. B. Cystein, in oder in der Nähe ihrer aktiven Zentren beinhalten;
(2) eine Olefinyl-Gruppe und eine Dienyl-Gruppe, die ein Diels-Alder-Addukt bilden;
(3) eine Phosphoramidoyl-Gruppe und eine Metallophosphoramidoyl- oder Metallophosphat-Gruppe, die koordinativ gebundene Komplexe bilden;
(4) eine Affinitätskomplexe bildende Verbindung und deren korrespondierendes Substrat, z. B. Carboanhydrase und Sulfanilamid oder Biotin und Avidin, die Affinitätskomplexe bilden;
(5) eine Ferrocenyl-Gruppe oder ein Ferro-Komplex und ein magnetisches Material, das gegenüber dem Reaktionsmedium inert gemacht wurde, z. B. eine teflonbeschichtete Metalldrahtspule, die ein magnetisches Paar bilden;
(6) eine Chelatgruppe und eine chelatisierte Komponente, wie Ethylendiamintetraacetat und ein Übergangsmetall, die ein Chelat bilden;
(7) eine polare olefinische oder substituierte olefinische Gruppe und das korrespondierende Monomer, die durch radikalische Mechanismen unter milden Bedingungen polymerisieren und ein Polymer bilden, z. B. N-Acryloyllysin und Acrylamid;
(8) ein Paar olefinischer Gruppen, die hydroboriert und anschließend mit Silbernitrat und einer schwachen Base zur Bildung des reduzierten, gekoppelten Olefin-Olefin- Addukts behandelt werden können; und
(9) eine photoreaktive Arylketogruppe und eine freie Radikale stabilisierende Gruppe mit einer radikal-labilen C-H-Bindung, wie Benzoylphenylalanin und eine Benzyl-, Allyl- oder Arylalkyl-Gruppe, die zur Bildung eines Addukts zwischen dem Ketocarbon und dem C-H-Carbon der freie Radikale stabilisierenden Gruppe photolysiert werden können. Vorzugsweise werden solche freie Radikale stabilisierende Gruppen wie. Polyamid, Polyzimtsäureamid, Polystyren, oder fluorenhaltige Polymere (Trägermaterialien), Porphyrin oder Fluorescein (Marker) und benzylsubstituierte bioaktive Agenzien in deutlich höheren Konzentrationen eingesetzt als das an das Arylketo-Nucleophil gekoppelte Protein, so daß die photolytische Addition des Proteins an sich selbst in hohem Maße benachteiligt ist (siehe J. C. Kauer, et al., J. Biol. Chem., 261, 10695 (1986)).
Andere Ausführungsformen dieses Paars zeigen kompetetive Bindung in bezug auf die funktionalen Gruppen des Proteins, können jedoch so kontrolliert werden, daß eine im wesentlichen selektive Reaktion der Seitenkette und der angefügten Substanz oder Kombination erlangt wird. Diese beinhalten z. B.
(1) eine aromatische Aminogruppe und eine Epoxy-Gruppe, einen aktiviertem Ester oder eine Aldehyd-Gruppe, vorzugsweise eine aromatische Epoxy- oder Aldehyd- Gruppe, die unter Bildung eines Stickstoff-Kohlenstoff-Addukts und unter leicht sauren Bedingungen unter Protonierung der Amin-Gruppen des Proteins zur Reaktion gebracht werden können;
(2) eine Azidyl- oder Hydrazinyl-Gruppe und ein aromatisches Amin, die durch Bestrahlung mit UV-Licht unter Bildung eines substituierten Amins und unter leicht sauren Bedingungen unter Protonierung der Amin-Gruppen des Proteins zur Reaktion gebracht werden können;
(3) ein aromatischer Alkohol (z. B. phenolische Gruppe) oder ein aromatisches Amin und ein aktivierter Ester, die unter Bildung eines Esters bzw. Amids und unter leicht sauren Bedingungen unter Protonierung der Amin-Gruppen des Proteins zur Reaktion gebracht werden können; und
(4) ein Hydrazin und ein reduzierender Zucker, die ein Osazon bilden. Die Bedingungen und Verfahren zur Durchführung der Bindungsreaktionen der Seitenketten und der spezifisch reaktiven Gruppen sind Stand der Technik. Siehe z. B. "Reagents for Organic Synthesis" von Fieser & Fieser, John Wiley & Sons, New York, Vol.
I-X, 1967-1975, dessen Offenbarung hierin durch Zitat eingeschlossen ist. Die Bedingungen werden im allgemeinen annähernd Umgebungstemperatur (0 bis 38ºC) und verdünnte bis mäßige Konzentrationen der Reaktionspartner sein. Die Verfahren werden im allgemeinen Rührkesselreaktoren, Entfernung von Nebenprodukten und langsame Reagenszugaben einschließen. Eine weitere Bedingung ist die Aufrechterhaltung einer Minimalkonzentration jedes Reaktanden, der mit mehr als einer Gruppe in der Reaktionsmischung reagieren kann. Zum Beispiel muß eine minimale Konzentration der Hilfssubstanz oder Kombination bei der Bindungsreaktion aufrechterhalten werden, um die Wahrscheinlichkeit der unerwünschten Nebenreaktionen der spezifisch reaktiven Gruppe mit dem Protein zu minimieren.

Weg 2

Nach Weg 2 werden das Nucleophil und die Hilfssubstanz oder ihre Kombination mit einem Verbindungsarm zunächst durch die primäre Bindungsreaktion zur Bildung einer Zwischenform verknüpft. Dieser Schritt kann durchgeführt werden unter Verwendung (1) jeglichem der oben beschriebenen Paare aus reaktiven Substituenten und spezifisch reaktiven Gruppen; (2) der weiter unten für den Verbindungsarm beschriebenen Paare aus Bindungsgruppen und anderen funktionellen Gruppen, oder (3) jedem der bekannten Verfahren zur Bildung einer Amid-, Ester-, Ether-, Imino-, Carbonat-, Urethan- (Carbamat-), Kohlenstoff-Kohlenstoff-, Kohlenstoff-Stickstoff-, Schwefel-Kohlenstoff-, Schwefel- Sauerstoff-Kohlenstoff oder Kohlenstoff-Sauerstoff-Bindung. Verfahren zur Bildung dieser Bindungen und die hierdurch gebildeten einzelnen Gruppen sind Stand der Technik. Siehe z. B. "Chemical Reagents for Protein Modification", CRC Press Inc., R. L. Lundblad & C. M. Noyes ed. 1984; "Basic Principles of Organic Chemistry", J. D. Roberts and M. Caserio, Benjamin Press, 1975, deren Offenbarungen hierin durch Zitat eingeschlossen sind.
Nach diesem Weg hängt die Auswahl der einzelnen Vorgehensweise zur Bindung der Hilfssubstanz oder Kombination an das Nucleophil nicht von der Struktur des Proteins ab. Jede stabil bindende Gruppe, die für die chemischen Strukturen des Nucleophils und der Hilfssubstanz oder der Verbindungsarm-Kombination geeignet ist, ist angemessen, da diese Bindungsreaktion nicht in Gegenwart des Proteins durchgeführt wird.
Der zweite Schritt im Weg 2 verbindet die Zwischenform mit dem Protein durch die primäre Kopplungsreaktion des Nucleophil-Abschnitts der Zwischenform mit dem Carboxylende des Proteins. Dies wird unter Carboxypeptidase-Katalyse unter nicht-neutralen Bedingungen durchgeführt. Die Selektivität dieser Reaktion ist angemessen, da dies die in Gegenwart des Proteins durchgeführte ist. Das Schema des 2. Weges nutzt diese Besonderheit zum größtmöglichen Vorteil, da es die primäre Kopplungsreaktion an letzter Stelle in der Reaktionssequenz plaziert, wodurch die potentielle Beeinflussung durch die primäre Bindungsreaktion ausgeschlossen wird.
Der zweite Schritt im Weg 2 besitzt einige begleitende Parameter, die im wesentlichen auf die Reaktionseffizienz gerichtet sind. Die Reaktionspartner sollten ausreichende Löslichkeit im Reaktionsmedium aufweisen, um relativ leichte Kopplung zu erlauben. Im allgemeinen wird diese Löslichkeit vorzugsweise etwa 0,05 bis 2 M für die Reaktionspartner und 1 bis 100 uM für das Enzym sein. Wenn die Löslichkeiten der Reaktionspartner der Kopplungsreaktion niedriger liegen, wird bevorzugt Weg 1 angewandt.
Spezifische Ausführungsformen der Marker, Trägermaterialien und bioaktiven Agenzien, die über den Syntheseweg 2 mit Proteinen verbunden werden können, sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Aminosäuren zur Kopplung von Markern, bioaktiven Agenzien und Trägermaterialien an Antikörper (mögliche Anwendungen sind zusammen mit den chemischen Namen der Aminosäuren aufgeführt)
Metallchelat
Platin zur Elektronenmikroskopie und als Röntgenstrahlen-Marker
Cobalt zur Strahlentherapie
Fluorescenyl-NHCSNH(CH&sub2;)&sub4;CH(NH&sub2;)CO&sub2;H
Lysylfluorescen
Fluoreszenz-Marker

Tabelle 1 (Fortsetzung)

(NO&sub2;)&sub2;C&sub6;H&sub3;NH(CH&sub2;)&sub4;CH(NH)CO&sub2;H
Bisnitrophenyllysin
Fluoreszenz-Marker
Antigen-Marker
Biotin-Gruppe zur Komplexanlagerung an Avidin-Harz oder als Label zur enzymatischen Detektion
H&sub2;C=HCH&sub2;NH + CH&sub3;CH=CHCH=CHCO&sub2;-angefügte Substanz

Diels-Alder

Zur Verbindung mit einem Harz oder einer anderen angefügten Substanz

H&sub2;OCHCONH(CH&sub2;)&sub4;CH(NH&sub2;)CO&sub2;H + H&sub2;C=CHCONH-(H oder angefügte Substanz) Radikalische Polymerisation

Magnetischer Prozeß

Verbindungsarm

Es gibt mehrere Gründe, die erfindungsgemäßen Verbindungsarm-Versionen der Wege 1 und 2 zu wählen. Erstens kann die Umgebung des Carboxylendes die Annäherung einer großen, sperrigen Hilfssubstanz verhindern. Zweitens besitzt die Hilfssubstanz unter Umständen keine funktionellen Gruppen, die spezifisch reaktionsfähig mit der Seitenkette des Nucleophils sind. Drittens vergrößert der Verbindungsarm den Abstand zwischen der Hilfssubstanz und dem Protein, was zur Aufrechterhaltung der Proteinaktivität beitragen kann. Viertens kann das Protein leichter eine räumliche Konformation annehmen, die geeignet für seine Reaktivität ist. Fünftens wird die Veränderung der Proteinkonformation durch Trägermaterial-Annäherung abgeschwächt oder verringert.
Die Struktur des Verbindungsarms schließt funktionelle Gruppen an den Enden einer flexiblen oder semi-flexiblen Kette ein. Eine der funktionellen Gruppen ist die obengenannte spezifisch reaktive Gruppe, die mit der Seitenkette des Nucleophils reagiert. Die andere funktionelle Gruppe des Verbindungsarms wird so ausgewählt, daß sie leicht mit verfügbaren Bindungsgruppen der Hilfssubstanz reagieren kann. Selbstverständlich wird dieses Paar von Gruppen am Verbindungsarm so ausgewählt, daß sie sich gegenseitig bei Bindungs- und Kombinationsreaktionen nicht wesentlich störend auswirken.
In beiden Synthesewegen wird der Schritt der Kombination von Verbindungsarm und angefügter Substanz vor der Bindungsreaktion mit dem Nucleophil durchgeführt. Da das Protein und das Nucleophil während dieses Schrittes nicht vorhanden sind, stehen viele Reaktionen zur Verfügung. Wenn die Bindungsgruppe der Hilfssubstanz eine Aldehydgruppe ist, kann die andere funktionelle Gruppe ein Amin (Schiffsche Base als Produkt), eine aktivierte Säure wie ein Iminocarboxy-, Carboxyalkoxy- oder Säurehalogenid (Amid als Produkt) oder Epoxy (substituiertes Amin als Produkt) sein. Wenn die Bindungsgruppe der Hilfssubstanz eine Hydroxygruppe ist, kann die andere funktionelle Gruppe eine aktivierte Säure oder Ester (Ester als Produkt) oder ein aktiviertes Alkyl wie Halogenalkyl, Alkyltosyl oder Alhylmesyl (Ester als Produkt) sein. Wenn die Bindungsgruppe der Hilfssubstanz eine Säuregruppe ist, kann die andere Gruppe ein Amin (Amid als Produkt) oder ein aktiviertes Hydroxyl (Ester als Produkt) sein. Wenn die Bindungsgruppe der Hilfssubstanz ein Chelatbildner ist, kann die andere funktionelle Gruppe eine Gruppe mit gebundenem Metall sein. Andere Paare von Reaktionspartnern schließen wasserlösliches Carbodiimid und Amino; N-Acylsuccinimid und Amino; und Olefin und Dien; sowie die unter Teil (3) der primären Bindungsreaktion für Weg 2 beschriebenen ein. Selbstverständlich ist auch die entgegengesetzte Reaktionsrichtung möglich.
Die Hauptkette des Verbindungsarms kann jede sein, die eine flexible oder semiflexible Kette darbietet. Eingeschlossen sind Polymere und Oligomere von Amiden Peptiden), Olefinen, Estern, Carbonaten, Urethanen, Ethern, Glycidyl, Epoxiden und ähnlichen. Ebenfalls eingeschlossen sind Alkylen- und Kohlenwasserstoffketten. Die Länge der Hauptkette kann von etwa 2 bis etwa 100 Atomen oder Monomereinheiten, vorzugsweise von etwa vier bis etwa 20 Atomen oder Monomereinheiten betragen. Beispiele der Hauptkette schließen Hexylenyl, Decylenyl, Poly(4-Aminobuttersäure), Poly(Glycyl), Poly(Glycylalanyl), Poly(4-Hydroxybuttersäure), Polylakton, Poly(Bisphenol-A- Diglycidylether) und Polyacrylamid ein.

Proteine

Die Protein-Arten (einschließlich Peptide ab einer Größe von nur zwei Resten), die nach der vorliegenden Erfindung verknüpft werden können, sind aktive Proteine mit Polypeptidketten, welche reaktive Carboxylenden besitzen. Beispiele von geeigneten Proteinen schließen Enzyme, Enzyminhibitoren, Hormone einschließlich Peptidhormone, Antikörper, Fab-beschnittene Antikörper, funktionale Proteine, Transkriptasen, Leserahmen- Proteine, DNA-bindende Proteine und andere biologisch aktive Polypeptide ein.
Im Hinblick auf Markierung sind monoklonale und polyklonale Antikörper, leichte und schwere Antikörperketten, Fragmente von Antikörpern, Epitopstellen von Antikörpern, chimäre Antikörper, CDR-Antikörper, DNA-bindende Proteine, Enzyme und Leserahmen- Proteine als Proteine bevorzugt. Wie hier verwendet, schließt der Term "Fragmente von Antikörpern" variable oder konstante Regionen von Antikörperketten, Fab- oder F(ab')2- und Fc-Fragmente, leichte und schwere variable Ketten, Epitopbereiche von leichten oder schweren Antikörperketten, Kombinationen solcher Bereiche und Ketten, und Rekombinationen eines bestimmten Fragments mit einem komplementären Fragment, das aus dem selben Antikörper oder einer anderen Antikörper-Quelle stammt, zur Bildung von zum Beispiel chimäre Mensch-Maus-Antikörpern, die menschliche konstante Bereiche tragen, oder veränderten menschlichen Antikörpern, die hypervariable Segmente tragen, welche von Antikörpern abweichenden Säuger-Ursprungs stammen, ein. Die Antikörper und Antikörper- Fragmente sind allgemein nützlich bei der Diagnose von Krankheiten, Fehlfunktionen oder erblichen Funktionsstörungen. Die Antikörper sind weiterhin allgemein nützlich bei Auftrennungstechniken und zum Nachweis antigenen Materials. Eingeschlossen sind Säuger- Immunglobulinproteine der Immunoprotein-Klassen IgA, IgD, IgE, IgM oder IgG.
Im Hinblick auf Immobilisierung sind mono- oder polyklonale Antikörper als Proteine bevorzugt.
Im Hinblick auf bioaktive Agenzien sind mono- oder polyklonale Antikörper, Peptidhormone, Histokompatibilitätsproteine, Polypeptidinhibitoren, Peptidtoxine, Strukturproteine (z. B. Collagen), globuläre Proteine und fibrilläre Proteine als Proteine bevorzugt.

Nucleophil, gewählt als L-Aminosäure

Eine große Vielfalt von L-Aminosäurenucleophilen kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Allgemein schließen diese Alpha-L-Aminosäuren mit neutralen, basischen oder sauren Seitenketten ein, wobei die Seitenketten die oben erwähnten reaktiven Substituenten enthalten können. Die Auswahl der L-Aminosäure zur Markierung von Antikörpern, Verknüpfung von Proteinen mit Immobilisierungsträgern oder Verknüpfung von bioaktiven Agenzien mit Proteinen ist im allgemeinen auf das ausgewählte Enzym und Protein abgestimmt. Bestimmte Enzyme verknüpfen spezifische Aminosäuren mit den Carboxylenden von Proteinen. Zum Beispiel koppelt CPD-Y allgemein Aminosäuren mit neutralen oder basischen Seitenketten an Antikörper. Bestimmte andere Enzyme, die Cystein und/oder Serin an ihren enzymatischen Zentren verwenden und aus pflanzlichen oder mikrobiellen Quellen gewonnen werden, koppeln Aminosäuren mit sauren Seitenketten an Proteine.
Weiterhin zeigt das L-Aminosäurenucleophil zur Durchführung der Bindungsreaktion einen kennzeichnenden Reaktionscharakter. Dies erlaubt seine selektive Verknüpfung mit der Hilfssubstanz oder deren Kombination mit einem Verbindungsarm. Der kennzeichnende Charakter resultiert aus dem reaktiven Substituenten der Seitenkette des Nucleophils, wie oben erläutert. Dieser reaktive Substituent kann eine Sulfhydryl-, Hydroxy-, aktivierte Hydroxyl, Phosphoramidoyl-, Hydrazinyl-, Amino-, Azidyl-, Epoxy-, Säure-, Boryl-, aktivierte Ester-, Ferrocenyl-, Ferro-Komplex- oder Olefinyl-Gruppe sein, sowie Mischungen daraus und andere funktional reaktive Gruppen.
Ausführungsformen dieser L-Aminosäurenucleophile schließen aliphatische L-Aminosäuren wie Monoamino-Monocarbonsäuren, z. B. Glycin, Alanin, Valin, Norvalin, Leucin, Isoleucin und Norleucin (nützlich als radioaktiver Marker); Hydroxyaminosäuren wie Serin, Threonin und Homoserin; schwefelhaltige Aminosäuren wie Methionin, Cystin, Cystein und Taurin (zur Bindung eines Verbindungsarms oder einer Hilfssubstanz); Diamino- Monocarbonsäuren wie Orthinin, Lysin und Arginin (zur Bindung eines Verbindungsarms oder einer Hilfssubstanz); und Monoamino-Dicarboxylsäuren wie Aspartat und Glutamat (zur Bindung eines Verbindungsarms oder einer Hilfssubstanz) ein. Auch aromatische L-Aminosäuren wie Phenylalanin und Tyrosin; heterozyklische L-Aminosäuren wie Histidin und Tryptophan; und olefinische L-Aminosäuren wie 2-Amino-2-Tryptophan; und L-Aminosäuren wie 2-Amino-2-Vinyl-Essigsäure (zur Bindung eines Verbindungsarms oder einer Hilfssubstanz) sind in die Gruppe der L-Aminosäuren nach der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Weitere L-Aminosäuren sind jene mit geschütztem C-terminalen Ende. Dies schließt z. B. Amide, Anilide, Hydrazide, Ester und dergleichen ein.
Bevorzugte Klassen von L-Aminosäurenucleophilen schließen aliphatische L-Aminosäuren, Hydroxy-L-Aminosäuren, deren aktivierte Derivate, Phosphoramidoyl- L-Aminosäuren, schwefelhaltige L-Aminosäuren, Diamino-Monocarbonsäuren, aktivierte Ester-Aminosäuren, aromatische L-Aminosäuren und heterozyklische L-Aminosäuren ein. Besonders bevorzugte Ausführungsformen schließen Serin, Alanin, Phenylalanin, Taurin, Lysin, Arginin, 2-Aminopent-4-en-Säure, und Cystein ein. Ebenfalls eingeschlossen sind carboxyl-geschützte L-Aminosäuren wie Amide und Ester.

Nucleophil, gewählt als Amin

Das Aminnucleophil schließt jedes C&sub2; bis C&sub2;&sub0; primäre Amin ein, das einen weiteren reaktiven Substituenten entlang seiner Hauptkette trägt wie oben beschrieben. Alternativ kann es, soweit es ebenfalls die Hilfssubstanz darstellt, eine einfache, nicht-funktionale Seitenkette besitzen. Zusätzlich dazu, daß es das Decarboxy-Analog des Aminosäurenucleophils ist, kann das Aminnuclophil auch eine Seitenkette tragen, die durch Hydroxy-, Sulfhydryl-, aktivierte Hydroxyl-, Epoxy-, Amino-, Azidyl-, Olefinyl-, aktivierte Ester-, Hydrazinyl-, Phosphoramidoyl-, Boryl-, Iminyl-, Amidinyl-, Ferrocenyl-, Ferro-Komplex- oder andere funktional reaktive Gruppen substituiert ist. Alternativ kann es, soweit es ebenfalls die Hilfssubstanz darstellt, eine einfache, nicht-funktionale Seitenkette besitzen.

Nucleophil, gewählt als Alkohol

Das Alkoholnucleophil schließt jeden C&sub1; bis C&sub2;&sub0; primären Alkohol ein, der einen weiteren reaktiven Substituenten entlang seiner Hauptkette trägt. Der reaktive Substituent kann eine Hydroxyl-, Sulfhydryl-, aktivierte Hydroxyl-, Epoxy-, Amino-, Azidyl-, Hydrazinyl-, Olefinyl-, aktivierte Ester-, Phosphoramidoyl-, Boryl-, Iminyl-, Amidinyl-, Ferrocenyl-, Ferro-Komplex-Gruppe, sowie Mischungen daraus und andere funktional reaktive Gruppen sein. Alternativ kann es, soweit es ebenfalls die Hilfssubstanz darstellt, eine einfache, nichtfunktionale Seitenkette besitzen.

Marker

Marker für die Proteine nach der vorliegenden Erfindung schließen markierte oder gekennzeichnete Aminosäuren mit einer Vielzahl von Substituenten oder Atomen, die durch konventionelle Techniken detektierbare Eigenschaften besitzen, ein. Solche Eigenschaften schließen Photoaffinität, Magnetismus, Radioaktivität, Fluoreszenz, enzymatische Aktivität, Elektronendichte (Röntgenstrahlen), kernmagnetische Resonanz, Elektronenspinresonanz, Antigenität und Phosphoreszenz ein. Zum Beispiel können Aminosäuren mit beiden, ¹&sup4;C- oder ³H-Atomen markiert werden. Weiterhin können die Aminosäuren mit bekannten Fluorszenzfarbstoffen, Porphyrinen, kolorimetrischen Farbstoffen, reaktiven Gruppen oder Antigenen oder enzymatischen Substraten gekennzeichnet werden, die spektroskopische, photographische oder radiometrische Detektion erlauben. Siehe E. T. Koh, et al., Biotechniques, 7, s. 596 ff. (1989); S. Borman, "Bioconjugate Chemistry Attracts Growing Interest" in der Ausgabe vom 8. Mai, 1989 von "Chemical and Engineering News" s. 25 ff1, deren Offenbarungen hierin durch Zitat eingeschlossen sind.

Enzyme

Enzyme mit der Fähigkeit zur:Verknüpfung des Nucleophils mit dem Protein sind Carboxypeptidasen, d. h. Enzyme mit der Fähigkeit, spezifisch am Carboxylende von Peptidketten zu wirken. Siehe J. S. Fruton in "Advances in Enzymology" im Kapitel mit dem Titel "Reagents for Protein Modification" wie oben zitiert. Sie bilden oder transformieren Peptidbindungen und sind unter den verwendeten Reaktionsbedingungen relativ stabil.
Carboxypeptidase-Enzyme sind allgemein dafür bekannt, die C-terminale Peptidbindung in Polypeptiden zu spalten. Sie zeigen alternative enzymatische Aktivitäten, die pH-abhängig sind. Zum Beispiel können durch die pH-abhängige Aktion von Carboxypeptidase Y Transpeptidierungs-, Umesterungs- und Kondensations-Produkte gebildet werden.
Bevorzugte erfindungsgemäße Carboxypeptidasen schließen Serin- und Cystein- (z. B. Hydroxy- und Thiol-) Carboxypeptidasen ein. Bestimmte der Serin- und Cystein-Enzyme sind in der Lage, Aminosäuren und aliphatische Amine mit neutralen oder basischen Seitenketten an die Carboxylenden von Proteinen anzufügen. Beispiele dieser Enzyme schließen Carboxypeptidase Y (CPD-Y), Penicillocarboxypeptidase S-1 und S-2, Carboxypeptidase C und CN, Malz-Carboxypeptidase I und II, Phaseolin; sowie Carboxypeptidase A, Carboxypeptidase B und Metalloproteasen, die ausschließlich die Kondensationsreaktion durchführen, ein. Bestimmte andere der Serin-Carboxypeptidasen sind in der Lage, Aminosäuren und aliphatische Amine mit sauren Seitenketten an die Carboxylenden von Proteinen anzufügen.
Carboxypeptidase Y ist ein bevorzugtes Enzym zur Verwendung in dieser Erfindung. CPD-Y ist ein Enzym aus Hefepilzen, das einen Serin-Rest in seinem katalytischen Zentrum enthält, und durch seine Fähigkeit charakterisiert ist, abhängig vom pH der Reaktionsmischung verschiedene Reaktionen zu katalysieren. Weiterhin ist CPD-Y ein bevorzugtes Enzym zur Verwendung im erfindungsgemäßen Markierungsprozeß, da es schnell transpeptidiert.
Es versteht sich, daß das Enzym zur Aufrechterhaltung oder Verbesserung der Stabilität und der entsprechenden Aktivität immobilisiert oder chemisch modifiziert werden kann. Es versteht sich weiterhin, daß das Enzym von Hefe stammend, tierischen, pflanzlichen oder mikrobiellen Ursprungs sein kann. Enzyme, die durch Verfahren des molekularen Klonings natürlich vorkommender Enzyme oder synthetisch durch Mutation oder Rekombination hergestellter Enzyme produziert werden, sind ebenfalls in der Erfindung eingeschlossen.

Immobilisierungsträger

In der vorliegenden Erfindung nützliche Immobilisationsträger sind anorganische oder organische Materialien, die so funktionalisiert sind, daß eine Reaktion zwischen dem Nucleophil oder Verbindungsarm und dem Trägermaterial stattfinden kann. Wenn erstere Reaktion durchgeführt wird, so wird das Trägermaterial mit einer der oben erwähnten spezifisch reaktiven Gruppen funktionalisiert. Wenn letztere Reaktion durchgeführt wird, so wird das Trägermaterial mit der zur anderen oben erwähnten funktionalen Gruppe gehörigen Bindungsgruppe funktionalisiert. In diesem Fall kann der reaktive Substituent auch mit ferromagnetischen Gruppen chelatbildend sein. Der Immobilisierungsträger hat dann den entsprechenden Charakter zur Bindungsherstellung. Bei einer ferromagnetischen Gruppe kann das Trägermaterial magnetischer Draht sein, der gegenüber dem Medium inert gemacht wird, z. B. mit Teflon. Leitung eines Stromes durch den Draht baut die magnetische Anziehungskraft auf, die zur Bindung benötigt wird. Alternativ kann ein außerhalb des Systems befindlicher Magnet (d. h. außerhalb des chromatografischen Mediums) verwendet werden, um die Bindung an das Trägermaterial zu verursachen. Bei der chelatbildenden Gruppe kann das Trägermaterial ein immobilisiertes Metall oder eine andere Chelatverbindung sein.
Das Trägermaterial kann ein poröser oder semi-poröser Feststoff sein. Vorzugsweise ist es biologisch inert und unlöslich. Materialien, die als Trägermaterialien verwendet werden können, schließen Fasern, Platten, Mikrokugeln, Partikel, Mikropartikel, Kügelchen, Mikrokügelchen, Plättchen, Membranen und dergleichen ein.
Die Oberfläche des erfindungsgemäßen Immobilisierungsträgers ist vorzugsweise porös. Die Verwendung von Substanzen mit einer porösen Oberfläche, so wie im wesentlichen kugelförmige Polymer-Kügelchen oder Mikrokugeln aus Agarose, ermöglicht große Oberflächen zur Proteinanlagerung mit hoher Dichte. Eine Oberfläche gilt als porös, wenn die Mehrzahl der Poren im Material ausreichend groß ist, um die Wanderung des Proteins in das Innere der Kugeln zu erlauben. Die Größe und Form des Trägermaterials kann abhängig vom einzelnen Protein und seiner beabsichtigten Verwendung stark variiert werden.
Die Immobilisierungsträger schließen eine große Bandbreite von Substanzen ein. Die Auswahl des Trägermaterials hängt jedoch von der Auswahl des Nucleophils und/oder des Verbindungsarms sowie der beabsichtigten Verwendung des immobilisierten Proteins ab. Die Kopplungsreaktionen, das Nucleophil, die spezifisch reaktive Gruppe und die reaktive Gruppe sind alle wie oben beschrieben kompatibel. Im einzelnen wird das Trägermaterial so gewählt, daß das Nucleophil, bevorzugt gegenüber jeder anderen reaktiven Stelle am Protein, leicht an das Trägermaterial oder die Kombination aus Trägermaterial und Verbindungsarm bindet. Zum Beispiel kann Cystein als Aminosäurenucleophil zur Verknüpfung mit einem Protein ohne Sulfhydrylgruppen, z. B. einem Antikörper, verwendet werden. Eine spezifisch reaktive Gruppe des Trägermaterials oder Trägermaterial-Verbindungsarms wird ausgewählt, die mit dem Sulfhydryl-Anteil reaktionsfähig ist, z. B. eine organometallische Gruppe wie eine organische Quecksilberverbindung. Alternativ kann 2-Amino-Hex-4-en-Säure das L-Aminosäurenucleophil sein, und eine spezifisch reaktive Gruppe für das Trägermaterial kann eine sein, die spezifisch mit der ungesättigten Seitenkette reaktionsfähig ist, wie z. B. durch eine Diels-Alder-Reaktion. Eine andere Alternative ist die Auswahl eines Photoaffinitäts-Markers wie einer N-Hydroxy-Succinimidyl-4-Azidosalizylsäure-Seitenkette und eines Arylamins als spezifisch reaktive Gruppe an der angefügten Substanz. Diese Salizyl-Seitenkette soll vor der Photoaddition mit der Epsilon-Aminogruppe eines Lysins gekoppelt werden, so daß sie gegenüber den Aminogruppen des Proteins nicht reaktiv sein wird. Photoreaktion unter z. B. UV-Licht führt die gewünschte Photobindungsreaktion durch. Bei der Verwendung eines Verbindungsarms dienen darüberhinaus verfügbare Gruppen am Trägermaterial als reaktive Gruppe. Die andere funktionelle Gruppe des Verbindungsarms wird angemessenerweise so gewählt, daß sie an die reaktive Gruppe bindet.

Bioaktive Agenzien

Eingeschlossen in die Erfindung ist ein Verfahren zur Verknüpfung eines bioaktiven Agens mit einem Protein an einer Stelle, die weit entfernt vom aktiven Zentrum liegt. Diese bioaktiven Agenzien können vom Protein zu Stellen getragen oder transportiert werden, wo sie eine erwünschte Reaktion durchführen.
Das bioaktive (biologisch aktive) Agens schließt physiologisch oder pharmakologisch wirksame Substanzen ein, die im Körper lokal oder systemisch wirken. Beispiele von biologisch aktiven Substanzen schließen Peptidmedikamente, Proteinmedikamente, desensibilisierende Wirkstoffe, Antigene, Impfstoffe, Anti-Infektiva, Antibiotika, antimikrobielle Verbindungen, Antiallergene, steroidale entzündungshemmende Wirkstoffe, Dekongestionsmittel, Miotika, Anticholinergika, Sympathikomimetika, Sedativa, Hypnotika, psychische Energiespender, Tranquilizer, androgenische Steroide, Östrogene, progestative Wirkstoffe, humorale Wirkstoffe, Prostaglandine, Analgetika, Antispasmotika, Antimalariamittel, Antihistamine, herzaktive Wirkstoffe, nicht-steroidale entzündungshemmende Wirkstoffe, Antiparkinsonmittel, antihypertonische Wirkstoffe, Betarezeptorenblocker, Nährstoffe, Metallverbindungen, Antikrebsmittel wie fluorierte Nucleotide, Nucleotidanaloga, Cytosinarabinozid, 5-Fluorurazil, Ricin-A, Tetanustoxin, zyklische therapeutische Peptide wie Anamyzin, Erythromyzin, Cyclosporin, AZT und Alkaloide ein. Auch vielfältige Formen der biologisch aktiven Agenzien können verwendet werden. Formen wie ungeladene Moleküle, Molekülkomplexe, Salze, Ether, Ester und Amide sind eingeschlossen.
Die bioaktiven Agenzien sind so funktionalisiert, daß sie spezifisch reaktive Gruppen zur direkten Verknüpfung mit dem Nucleophil tragen. Alternativ können geeignete verfügbare Bindungsgruppen am bioaktiven Agens mit der anderen funktionellen Gruppe am Verbindungsarm zur Reaktion gebracht werden. Vorzugsweise wird diese Funktionalisierung mit einer schon im Agens vorliegenden Gruppe durchgeführt.

Bedingungen der primären Kopplungsreaktion

Die Bedingungen der primären Kopplungsreaktion begünstigen wirkungsvoll Kondensation, Transpeptidierung oder Umesterung gegenüber Peptidspaltung. Wie aus der folgenden Diskussion der Anwendung der primären Kopplungsreaktion an Antikörper-Protein ersichtlich ist, beinhalten diese Bedingungen allgemein die Kontrolle des pH, der Temperatur, der Konzentrationen der Reaktionspartner, der Enzymkonzentration und der Inkubationszeit.
Die Bedingungen der Kondensation und Transpeptidierung sind basisch, was ferner für Peptidspaltung durch Hydrolyse ungünstig ist. Sie liegen in einem pH-Bereich, in dem die Amingruppe des Nucleophils nicht protoniert ist, d. h. es liegt in Form der freien Base vor. Typischerweise liegt dieser Bereich etwa zwischen pH 8,5 und 11. Die Auswahl der Kondensation gegenüber der Transpeptidierung wird kinetisch dadurch getroffen, daß die Transpeptidierung schnell beendet ist, während die Kondensation langsam stattfindet. Im wesentlichen findet die Transpeptidierung zwischen 5 Sekunden und 1,4 Stunden statt, während die Kondensation zwischen 2 und 24 Stunden stattfindet.
Umesterung findet unter mäßig sauren Bedingungen statt, die ungünstig für die Hydrolyse sind. Vorzugsweise liegt der pH unter etwa 6 und über etwa 3. Eine hohe molare Konzentration ist ebenfalls wichtig für die Umesterung.
Die Reaktionstemperatur liegt im funktionalen Bereich des Enzyms, vorzugsweise bis etwa 40ºC.
Die Konzentrationen der Reaktionspartner und des Enzyms werden so eingestellt, daß optimale Resultate erzielt werden. Im allgemeinen werden die höchstmöglichen Konzentrationen von Enzym, Nucleophil und Protein verwendet, die mit nennenswerter Reaktionsrate der primären Kopplungsreaktion übereinstimmen. Vorzugsweise liegt das Protein in Konzentrationen von etwa 1 uM bis etwa 1 M vor, besonders bis zu 1 mM, wenn das Protein ein Antikörper ist. Das Nucleophil oder das Zwischenprodukt, das das Nucleophil beinhaltet, liegt vorzugsweise in Konzentrationen von mindestens 0,05 molar und besonders in Konzentrationen von etwa 0,1 bis 2 molar vor. Das Enzym liegt vorzugsweise in Konzentrationen von etwa 1 pM bis 1 mM vor.
Die Inkubationszeit (Reaktionszeit) des Proteins und des Nucleophuls beträgt von etwa 0,2 bis 10 Stunden, bevorzugt von 1,0 bis 8 Stunden bei der Kondensation, während sie bei der Transpeptidierung und Umesterung von 30 Sekunden bis etwa 1,5 Stunden beträgt.

Spezifische Ausführungsformen, Antikörper-Protein

Der pH der Reaktion zwischen einem Antikörper und einem Nucleophil bestimmt die vorherrschende Enzymaktivität, die von den Carboxypeptidase-Enzymen gezeigt wird. Bei verschiedenen pH-Werten sind verschiedene Reaktionswege möglich. Der Einbau eines Nucleophils durch Kondensation, Transpeptidierung oder Umesterung hängt davon ab, welcher Reaktionsweg in der Inkubationsmischung vorherrscht.
Bei neutralen pH-Werten wird die Hydrolyse von Peptidbindungen (Peptidase- Aktivität) im allgemeinen als die vorherrschende Aktivität angesehen. Wenn der pH ansteigt, nimmt die Hydrolyse-Aktivität ab und die Kondensations und Transpeptidierungsreaktionen werden zu den vorherrschenden Aktivitäten des Enzyms. Wenn der pH auf einem Wert gehalten wird, der das Nucleophil in Form der freien Base vorliegen läßt, typischerweise von etwa 8,5 bis 10, bevorzugt 9,5, werden die Transpeptidierungs- und Kondensationsreaktion begünstigt, wobei erstere kinetisch begünstigt ist (d. h. schnell abläuft). Typischerweise wird die Transpeptidierungsreaktion gegenüber der Kondensation bevorzugt, weil sie schnell in etwa 30 Sekunden bis etwa 1 Stunde abläuft. Wenn der pH niedrig liegt, wie etwa zwischen 3,0 und 6,0, und die molaren Konzentrationen des Alkoholnucleophils hoch sind, ist die Umesterung begünstigt. Diese Reaktion spaltet den C-terminalen Aminosäurerest des Proteins ab und substituiert das Alkoholnucleophil durch Enzymverlagerung.
In verschiedenen Studien wurde die pH-Abhängigkeit der Addition von Aminosäurenucleophilen durch Kondensation mit einem Antikörper untersucht und die Einzelheiten werden im folgenden Beispielsabschnitt beschrieben. Die Ergebnisse dieser Studien, wie in Abb. 1 gezeigt, zeigen, daß der Nucleophil-Einbau bei höheren Temperaturen und höheren pH-Werten stärker ist. Bei einem pH von 7,5 wurde ein anfänglicher Anstieg der Nucleophileinlagerung beobachtet, dem eine Abnahme der Einlagerung und dann ein weiterer Anstieg folgte. Die erste Einlagerung stammt von der Transpeptidierung. Die Abnahme der Einlagerung wurde durch teilweisen Verlust der eingebauten Nucleophile durch die unerwünschte Hydrolysereaktion verursacht. Die zweite Einlagerung rührt von der langsameren Anfügung des Nucleophils durch Kondensation her.
Der Effekt, der durch Variation der Konzentrationen der Reaktionspartner in der Inkubationsmischung hervorgerufen wird, wurde ebenfalls untersucht und die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Wie oben allgemein angegeben, beeinflußt die Konzentration direkt die Rate und Quantität des Einbaus. Die Einzelheiten der Untersuchung werden im folgenden Beispielsabschnitt dargelegt. Tabelle 2 Effekt der Variation der Inkubationsbedingungen auf die Kondensationsreaktion
a Zeitdauer der Markierungs-Inkubation bei 37ºC, pH 9,5
b In der Inkubationsmischung gemessene Konzentration (AK = Antikörper)
c Aus der Stammlösung berechnet
d Molares Verhältnis. Wie im Verfahrensabschnitt beschrieben berechnet. Die Daten zeigen Ergebnisse eines einzelnen representativen Experiments. Jedes Experiment wurde mehrfach mit gleichen Ergebnissen wiederholt.
e Durchgeführte Messung oder Veränderung im Vergleich zum Standardverfahren (Einzelheiten siehe Text)
Die Verteilung des Nucleophils (markierte Aminosäure) zwischen den Carboxylenden der schweren und leichten Ketten des Antikörpers wurde ebenfalls untersucht und die Einzelheiten werden in Beispiel 4 dargelegt. Die Ergebnisse deuten an, daß die markierte Aminosäure bevorzugt in die schwere Kette eingebaut wird. Mindestens etwa 70 Prozent des eingebauten Nucleophils befindet sich an der schweren Kette. Generell werden L-Isomere von Aminosäuren durch dieses Verfahren eingebaut, wobei der Einbau im wesentlichen vollständig an den Carboxylenden der schweren Ketten von Antikörpern erfolgt.
Obwohl die leichte Kette des Antikörpers durch diese Reaktion in gewissem Maße markiert wird, befindet sie sich nicht in der Nähe des Antigen-bindenden Bereichs. Daher wird nur ein geringer Einfluß auf die Funktion des Antikörpers als Resultat dieser Interaktion festgestellt, wenn überhaupt einer.
Die Antigenbindungskapazität der markierten Antikörper im Vergleich zu der von unmarkierten Antikörpern wurde ebenfalls untersucht (siehe Beispiele 5 und 6). Bei Anti- Aspararinsynthetase-Antikörpern wurde die mittlere Bindungskapazität als 100, I Prozent der Bindungskapazität bei 0,6 eingebauten Serinen pro Antikörper bestimmt. Die wie in Tabelle 2 markierten Anti-F1-Antikörper wurden ebenfalls zur Bestimmung ihrer Bindungskapazität untersucht. Die Bindungskapazität wurde für den monoklonalen Antikörper als 105 Prozent, und für den polyklonalen Antikörper als 114 Prozent im Vergleich zu unmarkierten Kontrollen bestimmt. Diese Werte sind Mittelwerte aus vier Messungen. Die leichten Steigerungen, die bei den markierten Antikörpern im Verhältnis zu den Kontrollen gefunden wurden, rühren von experimentellen Fehlern her und sind nicht signifikant. Diese Ergebnisse zeigen keinen signifikanten Verlust in der Antigenbindungskapazität als Folge der Verknüpfung mit dem Marker.
Ähnliche Reaktionsbedingungen aus Temperatur, pH und Konzentrationen können für den Einbau jeglichen Aminosäure- oder Aminnucleophils oder jeglicher Zwischenform wie oben erwähnt aufgestellt werden.

Demonstration der Anknüpfung

Die Ergebnisse einiger Experimente, in denen andere Aminosäuren als radioaktive Marker verwendet wurden, sind in Tabelle 3 gezeigt. Die Kondensationsreaktionen wurden im allgemeinen wie in Beispiel 9 beschrieben durchgeführt und wie in Beispiel 3 beschrieben auf die Marker-Einlagerung geprüft. Die Konzentrationen von Antikörper und Aminosäure, die in Tabelle 3 gezeigt sind, entsprechen tatsächlichen gemessenen Konzentrationen. Die Konzentration der Carboxypeptidase Y ist aus der Konzentration der verwendeten Stammlösung berechnet. Die Werte der Marker-Einlagerung werden als eingebaute Marker pro Antikörpermolekül abzüglich der Werte der Kontrolle, die unter den selben Bedingungen ohne Enzymzugabe inkubiert wurde, angegeben. Tabelle 3 Kondensation zur Anknüpfung des Nucleophils
a Zeitdauer der Markierungs-Inkubation bei 37ºC, pH 9,5
b In der Inkubationsmischung gemessene Konzentration (AK = Antikörper)
c Aus der Stammlösung berechnet
d Molares Verhältnis.
Zur Markierungsreaktion verwendete Aminosäure
Obwohl eine quantitative Variation in der Stärke der Marker-Einlagerung bei Doppelexperiment-Bedingungen beobachtet wurde, lag diese innerhalb des experimentellen Fehlers. Die Variation rührte möglicherweise von der Schwierigkeit der zur genauen Bewertung der Marker-Einlagerung nötigen Abtrennung her. Hohe Konzentrationen von ungebundenem Marker wurden im wesentlichen vollständig und schnell von relativ kleinen Konzentrationen des Antikörpers abgetrennt. Kleine Mengen des Markers blieben jedoch manchmal zurück, was zu quantitativen Schwankungen der gemessenen Marker-Einlagerung führte. Aus diesem Grunde war es nötig, eine Kontrollprobe ohne Carboxypeptidase Y bei jeder Bestimmung einzuschließen. Als zusätzliche Vorsichtsmaßnahme wurde der hintere Anteil des Antikörper-Peaks nicht in das Quantitionsverfahren einbezogen.
Wie in Tabelle 3 gezeigt ist, baut das Enzym Alanin etwa in gleichem Maße wie Serin ein. Es stellte sich weiterhin heraus, daß das Enzym Taurin, eine Aminosäure, die üblicherweise nicht in Proteinen gefunden wird, ebenfalls einbaut. Es zeigte sich jedoch, daß die Einlagerung von Taurin etwas durch die Löslichkeit der freien Aminosäure limitiert wurde.
Dieses Verfahren der Verbindung eines Antikörpers mit einem Nucleophil bietet ein Verfahren zur Immobilisierung, Markierung oder Aufbesserung von Antikörpern ohne Verlust der Antigen-Bindungskapazität. Dies ist auf die primäre Kopplungsreaktion des Nucleophils mit dem Antikörper durch Kondensation, Transpeptidierung und Umesterung zurückzuführen.
Verschiedene Nucleophile können unter Verwendung ähnlicher experimenteller Parameter mit anderen funktionalen Proteinen verknüpft werden. Das Aminosäure- oder Aminnucleophil, Enzym, Protein und bioaktive Agens, der Marker oder Immobilisierungsträger werden jedoch im allgemeinen so ausgewählt, daß die spezifische Verknüpfung gesteigert und die unspezifische Verknüpfung vermindert wird. Auf diese Weise kann das bioaktive Agens, der Marker oder Immobilisierungsträger weit entfernt vom funktionalen Zentrum eines Proteins an dieses gebunden werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter beschrieben. Diese Beispiele sollen den Rahmen der Erfindung, der in der vorhergehenden Beschreibung gesetzt wurde, nicht einschränken. Variationen innerhalb des Konzepts der Erfindung sind für die Fachleute offensichtlich.
Die Beispiele 1-8 sind Standardverfahren zur Kondensation, Transpeptidierung und Umesterung. Beispiel 9 veranschaulicht die Kondensation. Die Beispiele 10 und 11 veranschaulichen die Transpeptidierung. Die Beispiele 12 und 13 veranschaulichen die Umesterung.

Beispiel 1

Antikörper-Preparation

Monoklonale Anti-Asparaginsynthetase-Antikörper und monoklonale und polyklonale Anti-F1-ATPase-Antikörper stammten aus Laborvorräten. Vorräte von monoklonalen Antikörpern wurden in Form von Maus-Ascites-Tumorflüssigkeiten gewonnen und Vorräte polyklonaler Antikörper wurden aus Kaninchenserum gewonnen. Antikörper beiden Ursprungs wurden durch Zugabe von festem Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 50% des Sättigungswertes aufgereinigt. Das gefällte Protein wurde durch Zentrifugation gesammelt und in einer minimalen Menge von 10 mM Tris-HCL [Tris, Tris(hydroxymethyl)aminomethan] (pH 7,5) gelöst. Die Präparation wurde dann einer zweiten Ammoniumsufatfällung unterzogen bis ein Sättigungswert von 50% erreicht war. Der Niederschlag wurde dann durch Zentrifugation gesammelt. Die gereinigten Antikörper wurden in einer minimalen Menge Wasser gelöst und für 18 bis 24 Stunden gegen 10 mM Natriumbicarbonat bei 4ºC dialysiert. Dieser Dialyseschritt war notwendig, um das restliche Ammoniumsulfat zu entfernen, das sich als Hemmstoff der Carboxypeptidase Y-Aktivität herausstellte. Die gereinigten Antikörper wurden bis zur Verwendung in Aliquots bei -20ºC gelagert.
Wenn nicht anders angegeben, wurden diese drei Antikörper in den folgenden Beispielen verwendet. Der Term "Antikörper" wie hier verwendet meint monoklonale Anti- Asparaginsynthetase-Antikörper und monoklonale und polyklonale Anti-F1-ATPase- Antikörper.

Beispiel 2

Marker-Präparation

Serin wurde zunächst als ³H-Serin und in späteren Experimenten als ¹&sup4;C-Serin verwendet. Alle anderen verwendeten Aminosäuren waren ³H-Aminosäuren. Radioaktive Aminosäuren wurden von Amersham (Arlington Heights, IL) bezogen. Unmarkiertes Serin stammte von Fluka (Ronkonoma, NY). Radioaktive Aminosäuren wurden mit unmarkierten Aminosäuren auf eine spezifische Aktivität von 0,5 bis 2 mCi pro Millimol verdünnt. Die verdünnte Aminosäure wurde dann durch wiederholte Fällung mit Ethanol bei -20ºC gereinigt. Diese Fällungsschritte waren notwendig, um die unspezifische Bindung der Aminosäure an die Antikörper zu reduzieren. Die Aminosäure wurde als wäßrige Lösung bei 4ºC gelagert.
Die spezifische Aktivität der verdünnten, gereinigten Aminosäure wurde wie folgt bestimmt und in späteren Berechnungen der Marker-Einlagerung verwendet. Die gequenchte meßbare Radioaktivität wurde unter den gleichen Bedingungen bestimmt wie sie bei der Messung der Marker-Einlagerung verwendet wurden. Ein bekanntes Volumen der Aminosäure-Lösung wurde mit 0,1 M Natriumphosphat (pH 6,8) auf 1 ml verdünnt. Diese verdünnte Probe wurde in einem Beckman LS-100 flüssig-Szintillationszähler (Beckman Instruments, Fullerton, CA) mit 10.0 ml 3a70b Szintillationsflüssigkeit (Research Products, Elkgrove, IL) gezählt. Die Aminosäure-Konzentration der Aminosäure-Stammlösung wurde in einem bekannten Volumen durch Assay der Aminogruppen über die Ninhydrin-Gehaltsbestimmung gemessen; siehe S. Moore et al., J. Biol. Chem., 157, 367 (1948). Eine Standardlösung für den Assay wurde hergestellt durch Lösen von Glycin in Wasser bei 0ºC zum Erhalt einer gesättigten Lösung. Die Flüssigkeit wurde von ungelöstem, festen Glycin abgetrennt, auf Raumtemperatur erwärmt und als Standard verwendet. Die Konzentration des Standards wurde als 1,89 M angenommen; siehe J. B. Dalton et al. J. Biol. Chem., 103, 549 (1933). Aus diesen Messungen wurde der gequerichte Wert in CPM/mmol berechnet und in späteren Berechnungen verwendet.

Beispiel 3

Markereinbau-Assays

Die ungebundenen Aminosäuren wurden durch Gelfiltrations-HPLC vom Antikörper getrennt. Eine Probe von 20 ul der Reaktionsmischung nach Inkubation wurde auf eine GPC-300 Gelfiltrationssäule (Synchrom, Linden, IN) aufgetragen und mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 6,8) eluiert. Das zu diesem Zweck verwendete HPLC-System bestand aus einem Zweipumpen-Gradientensystem und einem UVMonitor für variable Wellenlängen hergestellt von ChemResearch (ISCO, Lincoln, NE). Der bei 280 nm überwachte, mit dem Antikörper korrenspondierende Absorptionspeak wurde gesammelt. Um eine vollständige Entfernung der ungebundenen Aminosäuren vom Antikörper zu gewährleisten, wurden lediglich die ersten 3/4 des Absorptionspeaks aufgefangen. Die gesammelte Antikörper-Lösung wurde mit dem Elutionspuffer auf 1 ml verdünnt.
Die Antikörper-Konzentration in der gesammelten Lösung wurde durch Messung der Absorption bei 280 nm unter der Annahme einer Standardabsorption von 1,46 Absorptionseinheiten / mg bestimmt. Die eingebaute Aminosäure wurde durch Zählen von 1,0 ml der gesammelten Antikörper-Lösung unter Verwendung von 10 ml 3a70b Szintillationsflüssigkeit bestimmt. Die Menge des eingebauten Markers wurde unter Verwendung der oben beschriebenen, korrigierten spezifischen Aktivität der Aminosäure berechnet. Die molare Konzentration des Antikörpers wurde unter der Annahme eines Molekulargewichts von 150.000 berechnet; siehe I. Riott et al., Immunology, C. V. Mosby Co., St. Louis, s. 5.3 (1985). Die angegebene Markereinlagerung ist die Differenz zwischen den gemessenen Werten der Proben mit und ohne Carboxypeptidase Y. Die Ergebnisse der Markereinlagerung sind im vorhergehenden Abschnitt "Spezifische Ausführungsformen..." in Zusammenhang mit Abb. 2 diskutiert.

Beispiel 4

Trennung von Antikörper-Ketten

Dieses Beispiel zeigt die Spezifität der Nucleophilverknüpfung mit der schweren Kette eines Antikörpers wie im vorhergehenden Abschnitt "Spezifische Ausführungsformen..." diskutiert. Die Trennung der schweren und leichten Ketten des Antikörpers wurde sowohl an markierten Antikörpern als auch an Kontrollen (unmarkierten Antikörpern) durchgeführt. Die Proben wurden wie oben beschrieben markiert. Im Anschluß an die Inkubation wurden die Antikörper durch Zugabe von Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 50% des Sättigungswertes gefällt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugation gesammelt und das Pellet in einem Denaturierungspuffer (pH 6,8) bestehend aus 100 mM Natriumsulfat, 2 M Harnstoff, 2% Natriumlaurylsulfat (SDS), 1% β-Mercaptoethanol und 25 mM 4-Morpholinoethansulfonsäure (MES) gelöst. Die Probe wurde bei 100ºC für 5 Minuten inkubiert, um die vollständige Denaturierung des Proteins zu gewährleisten. Die Antikörper- Ketten wurden durch Gelfiltrations-HPLC unter Verwendung einer mit dem Denaturierungspuffer equilibrierten Altex TSK-125-Säule (Biorad, Richmond, CA) getrennt. Das Eluat wurde bei 280 nm überwacht. Die mit den schweren und leichten Ketten des Antikörpers korrespondierenden Peaks wurden separat aufgefangen. Die gesammelten Proben wurden mit dem Denaturierungspuffer auf 1,2 ml verdünnt.
Die Menge der in jede Kette eingebauten Aminosäure wurde durch Zählen von 1,0 ml jeder Probe unter Verwendung von 10 ml 3a70b Szintillationsflüssigkeit bestimmt. Aufgrund störender Einflüsse von Komponenten des Denaturierungspuffers konnte die Proteinmenge in jeder Probe nicht mit den oben verwendeten Verfahren oder anderen gewöhnlich angewandten Verfahren bestimmt werden. Ein zu diesem Zweck entwickelter Assay bestand aus der Zugabe von 25 ul 30% Acrylamid, 0,8% Bisacrylamid zu 50 ul der zu untersuchenden Probe. Die Mischung wurde durch Zugabe von 1,5 ul 10% Ammoniumpersulfat und 1 ul N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin polymerisiert. Die störenden Pufferkomponenten wurden durch Waschen mit 2 Aliquots (2 ml) 10% Trichloressigsäure, 3 Aliquots (2 ml) 10% Essigsäure und 2 Aliquots (2 ml) 5% Methanol, 7,5% Essigsäure von der verfestigten Probe abgetrennt. Das Protein wurde mit Coomassie Blue R-250 Commission on Biological Stains Number 42660) angefärbt. Nach eingehendem Waschen mit 30% Methanol, 7,5% Essigsäure zur Entfernung von ungebundenem Farbstoff wurde der gebundene Farbstoff durch Inkubation mit SDS, Natriumbicarbonat und Methanol eluiert. Die Absorbtion des eluierten Farbstoffs wurde gemessen und der Proteingehalt durch Vergleich mit Standardproteinlösungen, die auf gleiche Weise behandelt wurden, bestimmt.
Der für jede Kette gemessene Proteingehalt und die Aminosäure-Einlagerung wurden zur Berechnung der Marker-Einlagerung pro Polypeptikette herangezogen. Bei diesen Berechnungen wurden die Molekulargewichte der schweren und leichten Ketten als, 50.000 bzw. 25.000 angenommen; siehe I. Roitt et al., vide supra. Die auf den gewonnenen Daten (nicht gezeigt) basierenden Ergebnisse sind im vorhergehenden Abschnitt "Spezifische Ausführungsformen..." diskutiert und zeigen einen Einbau von mindestens 70% in die schwere Kette.

Beispiel 5

Anti-Asparaginsynthetase Antikörper-Immunopräzipitation

Dieses Experiment zeigt, daß die Anbindung des Nucleophils die Antigen- Bindungskapazität des Antikörpers nicht beeinflußt, wie im vorhergehenden Abschnitt "Spezifische Ausführungsformen..." diskutiert.
Antikörper, sowohl wie oben beschrieben markierte als auch Kontrollen, wurden durch Immunopräzipitation untersucht, um ihre Fähigkeit zur Antigenbindung zu bestimmen. Ein Aliquot der Inkubationsmischung wurde untersucht, um das Ausmaß der Markereinlagerung zu bestimmen. Die restliche Inkubationsmischung (80 ul) wurde zu 420 ul Asparaginsynthetase-enthaltendem Pankreas-Extrakt gegeben; siehe C. A. Luehr et al., J. Biochem. Biophys Methods, 3, 151 (1980). Der pH der Mischung wurde auf 7,5 eingestellt. Protein A-Rohextrakt (Sigma Chemical Co., St. Lois, MO) wurde zweimal durch Zentrifugation der Lösung und Suspendieren des Pellets in 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) gewaschen. Der gewaschene Extrakt wurde im 5-fachen Originalvolumen 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) suspendiert. Nach der Inkubation des Antikörpers mit dem Pankreas-Extrakt für 18 Stunden bei 37ºC wurde 1 ml des gewaschenen Protein A-Rohextrakts zugegeben und die Inkubation für weitere 2 Stunden fortgesetzt. Die Mischung wurde dann zentrifugiert, um den Protein A/Antikörper/Asparaginsynthetase-Komplex zu sammeln. Das Pellet wurde zweimal mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) gewaschen und dann für 2 Stunden mit 200 ul einer Assay- Lösung (pH 7,5) enthaltend 100 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM ATP und 10 mM Glutamin inkubiert. Die Feststoffe wurden durch Zentrifugation entfernt und die gewonnene Lösung wurde bei -20ºC zur Aminosäureanalyse gelagert.
Die Aminosäureanalyse wurde durch HPLC-Trennung der Aminosäuren nach Derivatisierung mit β-Mercaptoethanol und o-Phthaldialdehyd durchgeführt; siehe S. Unnithan et al., Anal. Biochem., 136, 195 (1984). Das verwendete HPLC-System bestand aus einem Beckmann Zweipumpen-Gradienten-HPLC-System mit einem Dupont Modell 836 Fluoreszenzdetektor (E. I. Dupont, Des Plains, IL) und Integrator (Spectra-Physics, Santa Clara, CA). Die verwendete Säule war eine Rainin Microsorb C1 Umkehrphasensäule (Rainin Instruments, Woburn., MA). Die Bindungskapazität der Antikörper wurde durch Messung der Hydrolyse von Glutamin zu Glutamat durch die an den Protein A/Antikörper-Komplex gebundene Asparaginsynthetase bewertet. Die Aktivität des gebundenen Enzyms wurde über das Verhältnis der integrierten Flächen der Glutamat- und Glutamin-Peaks bestimmt. Die prozentuale Aktivität der markierten Antikörper relativ zu den unmarkierten Kontrollen wurde aus diesen GIu/Gln-Verhältnissen berechnet. Die Ergebnisse zeigen allgemein, daß die Kapazität der Antikörper mit gebundenem Nucleophil der von freien Antikörpern entspricht. Siehe die Diskussion auf den Seiten 33 bis 35.
Beisniel 6
Anti-F1-ATPase-Antikörper-Immunopräzipitation
Dieses Beispiel zeigt denselben Effekt, der in Beispiel 5 dargestellt ist. Sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper, wie oben beschrieben markiert und unmarkierte Kontrollen, wurden durch Immunopräzipitation untersucht, um ihre Fähigkeit zur Antigenbindung zu bestimmen. Ein Aliquot der Inkubationsmischung wurde untersucht, um das Ausmaß der Markereinlagerung zu bestimmen. Die restliche Inkubationsmischung (80 ul) wurde zu 420 ul einer 0,2 mg/ml Lösung von gereinigter Rinder-F1-ATPase gegeben; siehe A. F. Knowle et al., J. Biol. Chem., 247, 6617 (1972). Der pH der Reaktionsmischung wurde auf 7,5 eingestellt. Protein A-Rohextrakt wurde zweimal durch Zentrifugation der Lösung und Suspendieren des Pellets in 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) gewaschen. Der gewaschene Extrakt wurde im 5-fachen Originalvolumen 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) suspendiert. Nach der Inkubation des Antikörpers mit der Fl-ATPase-Lösung für 18 Stunden bei 37ºC wurde 1 ml des gewaschenen Protein A-Rohextrakts zugegeben und die Inkubation für weitere 2 Stunden fortgesetzt. Die Mischung wurde dann zentrifugiert, um den Protein A/Antikörper/F1-ATPase-Komplex zu sammeln. Das Pellet wurde zweimal mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) gewaschen und dann für 2 Stunden mit 100 ul einer Assay-Lösung (pH 8,0) bestehend aus 50 mM N-[Tris(Hydroxymethyl)Methyl]Glycin (Tricin), 5 mM MgCl&sub2; und 5 mM ATP inkubiert. Die Feststoffe wurden durch Zentrifugation entfernt und die gewonnene Lösung wurde bei -20ºC zur Analyse gelagert. Eine zusätzliche Kontrolle ohne Antikörper wurde in ähnlicher Weise behandelt.
Die ATPase-Aktivität wurde durch Messung des freigesetzten Phosphats bestimmt; siehe S. Unnithan et al., vide supra. Das gebundene Enzym wurde durch die Produktion von anorganischem Phosphat, die über den von der Kontrolle ohne Antikörper gelieferten Wert hinausging, bewertet. Die prozentuale Aktivität der markierten Antikörper relativ zu den unmarkierten Kontrollen wurde aus dem Verhältnis der markierten zu den unmarkierten Aktivitäten berechnet. Die Ergebnisse sind im vorhergehenden Abschnitt "Spezifische Ausführungsformen..." auf den Seiten 33 bis 35 diskutiert.

Beispiel 7

Stabilität von markierten Antikörpern

Die Stabilität des eingebauten Markers unter verschiedenen Lagerbedingungen wurde ebenfalls bestimmt. Für dieses Experiment wurde die Marker-Einlagerung anhand eines Aliquots der Inkubationsmischung untersucht. Die Antikörper in der restlichen Probe wurden mit Ammoniumsulfat gefällt und in Wasser gelöst. Ein Aliquot wurde bei 4ºC und ein weiteres bei -20ºC für 8 Tage gelagert. Im Anschluß an die Lagerungszeit wurde der eingebaute Marker in diesen Proben bestimmt und mit der ersten Probe verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 Marker-Stabilität
a Lagerungsbedingungen im Anschluß an die Markierungs-Inkubation bei 37ºC und pH 9,5.
b Molverhältnis wie im Verfahrensabschnitt bestimmt. Mittelwert aus zwei Messungen.
Mittlere prozentuale Zunahme oder Abnahme im Vergleich zu keiner Inkubation nach Markierungs-Inkubation

Beispiel 8

Spezifität des Einbaus

Um zu verifizieren, daß der Einbau durch Katalyse des Enzyms verursacht wird, wurden L-Serin in verschiedenen Konzentrationen und D,L-Serin durch das Standardverfahren eingebaut. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Der Einbau von D,L-Serin ist mit dem Einbau von L-Serin bei der halben Konzentration des D,L-Serins vergleichbar. Dies kann durch ausschließlichen Einbau des L-Isomers erklärt werden. Diese Stereospezifität wurde für Carboxypeptidase Y unter anderen Bedingungen gezeigt; siehe R. Hyashi et al., J. Biochem., 77, 69 (1975). Unspezifische Adsorption oder andere nichtenzymatische Bindungsweisen, die unter diesen Bedingungen stattfinden könnten, würden den Einbau beider Isomere erwarten lassen. Tabelle 5 Stereospezifität
a Zeitdauer der Markierungs-Inkubation bei 37ºC, pH 9,5
b In der Inkubationsmischung gemessene Konzentration
Aus der Stammlösung berechnet
a Molares Verhältnis. Wie im Verfahrensabschnitt beschrieben berechnet. Verwendeter Marker

Beispiel 9

Standardbedingungen zur Antikörpermarkierung (Kondensation)

Die folgenden Bedingungen und Verfahren zur Marker-Einlagerung durch Kondensation wurden, wenn nicht anders angegeben, in allen Versuchen verwendet. Eine Mischung der Antikörper- und Aminosäure-Stammlösungen wurde hergestellt und mit Wasser bis zu den gewünschten Konzentrationen verdünnt. Der pH dieser Lösung wurde mit pH-Indikatorpapier (Fisher Chemical, Springfield, NJ) gemessen und mit 0,5 M Natriumhydroxid auf 9,5 eingestellt. Aus dieser Lösung wurde eine 4 ul Menge abgenommen und mit 0,1 M Natriumphosphat (pH 6,8) auf 1,0 ml verdünnt. Die Absorption dieser Lösung wurde bei 280 nm mit einem Beckman DU-50 Spektrometer gemessen. Die Konzentration des Antikörpers in der Lösung wurde unter der Annahme einer Standardabsorption von 1,46 Absorptionseinheiten pro mg Antikörper berechnet; siehe A. Good et al., in "Selected Methods in Cellular Immunology", Mishell & Shiigi eds., W. H. Freeman & Co., San Francisco, s. 284 (1980). Die Konzentration der Aminosäure in der Inkubationsmischung wurde durch Zählen einer kleinen Probe der verdünnten Mischung nach weiterer Verdünnung mit 0,1 M Natriumphosphat (pH 6,8) auf 1,0 ml bestimmt. Die Aminosäure-Konzentration wurde aus der Impulsanzahl berechnet unter Verwendung der zuvor bestimmten korrigierten spezifischen Aktivität und der Korrektur der beiden Verdünnungsschritte sowie der unten beschriebenen 5%igen Verdünnung.
Der Rest der unverdünnten Mischung wurde in zwei gleiche Teile aufgeteilt. Zu einem dieser Anteile wurden 5 ul Stammlösung (24,3 mg/ml) von Carboxypeptidase Y (affinitätsgereinigt, E. C.3.4.16.4, frei von Endoproteinase-Kontamination) pro 100 ul Mischung gegeben. Der andere Anteil diente als Kontrolle und wurde entsprechend mit Wasser verdünnt. Sobald diese zwei Lösungen hergestellt waren, wurden sie in einem 37ºC Wasserbad für etwa 8 Stunden inkubiert. Die Proben wurden dann aus dem Wasserbad genommen und entweder sofort analysiert oder eingefroren und so bald wie möglich verwendet. Die Ergebnisse der Variation der Marker-Konzentration sind in der vorhergehenden Tabelle 2 gezeigt und in Verbindung damit diskutiert.

Beispiel 10

Transpeptidierung mit einem Tetrapeptid-Modell

Dieses Beispiel illustriert die Synthese des Tetrapeptids Benzoyl-Thr-Var-Ser-(¹&sup4;C)Ser aus Benzoyl-Thr-Val-Ser-Ser. Etwa 5 bis 10 mM Benzoyl-Thr-Val-Ser-Ser (BTVSS) können in 2 ml 50 mM Natriumcarbonatpuffer (pH 9,5) enthaltend 1 mM EDTA und 0,25 M ¹&sup4;C- Serin gelöst werden. Die Reaktion kann durch Zugabe von 5 uM Carboxypeptidase Y-Enzym gestartet werden. Nach vorgegebenen Zeitintervallen können Proben genommen werden, indem man 0,2 ml Aliquots entnimmt, mit 0,2 ml Azetonitril verdünnt und dann 0,1 ml 0,12 M Essigsäure zugibt.
Die Proben können dann einer Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung einer Umkehrphasen-C-18-Säule mit einem ausgebildeten linearen Gradienten aus zwei Lösungsmitteln unterzogen werden. Ein erstes Lösungsmittel (A) kann 95% 10 mM Natriumacetat, 5% Azetonitril pH 4, 5 sein und das zweite (B) kann 60% Azetonitril sein. Ein Gradient kann in einem 30 minütigen Zeitabschnitt ausgebildet werden und kann durch Mischen der Lösungsmittel A und B im Verhältnis 1 Teil A und 0 Teile B gestartet und mit 40 Teilen A und 60 Teilen B beendet werden. Die Durchflußrate kann bei 1,0 ml pro Minute gehalten werden. Das Peptid solle eluiert werden und frei von Serin und BTVS (hydrolysiertem BTVSS) sein.
Separate Aminosäure-Analyse der HPLC-Fraktion sollte zeigen, daß das Peptid jeweils einen Rest Thr und Val sowie zwei Reste Ser enthält. Die spezifische Aktivität des aus der Aminosäure-Analyse zurückgewonnenen Serins sowie dem des Proteins sollten auf molarer Basis gleich sein.

Beispiel 11

Transpeptidierung mit einem Tetrapeptid-Modell

Dieses Beispiel illustriert die Synthese des Tetrapeptids Benzoyl-Gly-Ala-Pro-Phe- Nil&sub2; aus Benzoyl-Gly-Ala-Pro-Ala. Etwa 10 ul 100 mM Benzoyl-Gly-Ala-Pro-Ala-OH (BGAPA) in Dimethylphthalat (DMP) können mit 19,11 ug1g1 70 mM L-Phenylalaninamid in 5 mM EDTA (pH 6,5) zusammengebracht werden. Die Reaktion kann durch Zugabe von 15 ul von 22 mg/ml Carboxypeptidase Y-Enzym (CPD-Y) gestartet werden. Nach vorgegebenen Zeitintervallen können Proben genommen werden, indem man 10 ul Aliquots entnimmt und mit 200 ul Azetonitril verdünnt. Aliquots können zu den folgenden ungefähren Zeitpunkten genommen werden: Zeitpunkt 0 (vor der Zugabe des Enzyms), 1 Minute, 5 Minuten, 10 Minuten, 20 Minuten, 40 Minuten, 1 Stunde, 2 Stunden und 3 Stunden. Die Proben können dann einer Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung einer Umkehrphasen-C-18-Säule mit einem ausgebildeten linearen Gradienten aus zwei Lösungsmitteln unterzogen werden. Ein erstes Lösungsmittel (A) kann 90% 50 mM Triethylaminphosphat (TEAP) (pH 3) mit 10% Azetonitiril sein und das zweite Lösungsmittel (B) kann 80% Azetonitril mit 20% Lösungsmittel A sein. TEAP kann durch Titration von 50 mM Phosphorsäure mit destilliertem Triethylamin auf pH 3 hergestellt werden. Ein Gradient kann in einem 5 minütigen Zeitabschnitt ausgebildet werden und kann durch Mischen der Lösungsmittel A und B im Verhältnis 1 Teil A und 0 Teile B gestartet und mit 40 Teilen A und 60 Teilen B beendet werden. Die Durchflußrate kann bei 1,5 ml pro Minute gehalten werden. Das BGAPA sollte unter gleichzeitigem Auftreten des BGAPP-Amid- Produkts und des freien Alanins verschwinden. Das Peptid solle eluiert werden und frei von Phenylalaninamid, BGAPA und Ala sein.
Separate Aminosäure-Analyse der HPLC-Fraktion sollte zeigen, daß das Peptid jeweils einen Rest Benzoyl, Gly, Ala, Pro und Phe enthält. Die spezifische Aktivität des aus der Aminosäure-Analyse zurückgewonnenen Phenylalaninamids sowie des Phenylalaninamids im Peptid sollten auf molarer Basis gleich sein.

Beispiel 12

Transpeptidierung mit monoklonalen Anti-Asparaginsynthetase-Antikörpern

Dieses Beispiel illustriert die Synthese von monoklonalen C-Nor-C-(¹&sup4;C)Ser-Anti- Asparaginsynthetase-Antikörpern (Nor-Mab-Ser*) aus monoklonalen Anti- Asparaginsynthetase-Antikörpern (Mab). Etwa 0,2 mM Mab können in 2 ml 50 mM Natriumcarbonatpuffer (pH 9,5) enthaltend 1 mM EDTA und 0,25 M ¹&sup4;C-Serin gelöst werden. Die Reaktion kann durch Zugabe von 5 uM Carboxypeptidase Y-Enzym gestartet werden. Nach vorgegebenen Zeitintervallen können Proben genommen werden, indem man 0,2 ml Aliquots entnimmt, mit 0,2 ml Azetonitril verdünnt und dann 0,1 ml 0,12 M Essigsäure zugibt.
Die Proben können dann einer Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung einer Umkehrphasen-C-18-Säule mit einem ausgebildeten linearen Gradienten aus zwei Lösungsmitteln unterzogen werden. Ein erstes Lösungsmittel (A) kann 95% 10 mM Natriumacetat, 5% Azetonitril pH 4, 5 sein und das zweite (B) kann 60% Azetonitril sein. Ein Gradient kann in einem 30 minütigen Zeitabschnitt ausgebildet werden und kann durch Mischen der Lösungsmittel A und B im Verhältnis 1 Teil A und 0 Teile B gestartet und mit 40 Teilen A und 60 Teilen B beendet werden. Die Durchflußrate kann bei 1,0 ml pro Minute gehalten werden. Das Nor-Mab-Ser* solle eluiert werden und frei von Serin und Mab sein. Separate Aminosäure-Analyse der HPLC-Fraktion sollte zeigen, daß das Nor-Mab-Ser* einen Ser-Rest enthält. Die spezifische Aktivität des aus der Aminosäure-Analyse zurückgewonnenen Serins sowie dem des Nor-Mab-Ser* sollten auf molarer Basis gleich sein.

Beispiel 13

Umesterung unter Verwendung eines Tetrapeptid-Modells

Dieses Beispiel illustriert die Synthese von Benzoyl-Thr-Val-Ser-(¹&sup4;C)-OMe aus Benzoyl-Thr-Val-Ser-Ser. Etwa 5 bis 10 mM Benzoyl-Thr-Val-Ser-Ser (BTVSS) können in 2 ml 50 mM Natriumphosphat/Phosphorsäurepuffer (pH 3,5) enthaltend 1 mM EDTA und 0,25 M ¹&sup4;C-Methanol (MeOH) gelöst werden. Die Reaktion kann durch Zugabe von S uM Carboxypeptidase Y-Enzym gestartet werden. Nach vorgegebenen Zeitintervallen können Proben genommen werden, indem man 0,2 ml Aliquots entnimmt, mit 0,2 ml Azetonitril verdünnt und dann 0,1 ml 0,12 M Essigsäure zugibt.
Die Proben können dann einer Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung einer Umkehrphasen-C-18-Säule mit einem ausgebildeten linearen Gradienten aus zwei Lösungsmitteln unterzogen werden. Ein erstes Lösungsmittel (A) kann 95% 10 mM Natriumacetat, 5% Azetonitril pH 4,5 sein und das zweite (B) kann 60% Azetonitril sein. Ein Gradient kann in einem 30 minütigen Zeitabschnitt ausgebildet werden und kann durch Mischen der Lösungsmittel A und B im Verhältnis 1 Teil A und 0 Teile B gestartet und mit 40 Teilen A und 60 Teilen B beendet werden. Die Durchflußrate kann bei I,0 ml pro Minute gehalten werden.
Das Peptid solle eluiert werden und frei von Methanol und BTVS (hydrolysiertem BTVSS) seht Separate Aminosäure-Analyse sollte zeigen, daß das Peptid jeweils einen Rest Thr und Val sowie einen Ser-Methylester enthält. Die spezifische Aktivität des aus der Aminosäure-Analyse zurückgewonnenen Serinmethylesters sowie dem des Peptids sollten auf molarer Basis gleich sein.

Beispiel 14

Umesterung unter VerwendunE eines monoklonalen Anti-Asparaginsynthetase- Antikörpers

Dieses Beispiel illustriert die Synthese von monoklonalen ¹&sup4;C-Methyl-C-Nor-Anti- Asparaginsynthetase-Antikörper-Estem (*methyl-Nor-Mab) aus monoklonalen Anti- Asparaginsynthetase-Antikörpern (Mab). Etwa 0,2 mM Mab können in 2 ml 50 mM Natriumphosphat/Phosphorsäurepuffer (pH 3,5) enthaltend 1 mM EDTA und 0,25 M 1t-Methanol gelöst werden. Die Reaktion kann durch Zugabe von 5 uM Carboxypeptidase Y-Enzym gestartet werden. Nach vorgegebenen Zeitintervallen können Proben genommen werden, indem man 0,2 ml Aliquots entnimmt, mit 0,2 ml Azetonitril verdünnt und dann 0,1 ml 0,12 M Essigsäure zugibt.
Die Proben können dann einer Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung einer Umkehrphasen-C-18-Säule mit einem ausgebildeten linearen Gradienten aus zwei Lösungsmitteln unterzogen werden. Ein erstes Lösungsmittel (A) kann 95% 10 mM Natriumacetat, 5% Azetonitril pH 4,5 sein und das zweite (B) kann 60% Azetonitril sein. Ein Gradient kann in einem 30 minütigen Zeitabschnitt ausgebildet werden und kann durch Mischen der Lösungsmittel A und B im Verhältnis 1 Teil A und 0 Teile B gestartet und mit 40 Teilen A und 60 Teilen B beendet werden. Die Durchflußrate kann bei 1,0 ml pro Minute gehalten werden. Das *Methyl-Nor-Mab solle eluiert werden und frei von Methyl und Nor- Mab (hydrolysiertem Mab) sein. Separate Aminosäure-Analyse sollte zeigen, daß das *Methyl-Nor-Mab einen Rest Methylserinester enthält. Die spezifische Aktivität des aus der Aminosäure-Analyse zurückgewonnenen Methylserinesters sowie dem des *Methyl-Nor-Mab sollten auf molarer Basis gleich sein.

Claims

1. Verfahren zur Bildung eines Proteins, das an eine Hilfssubstanz gebunden ist, umfassend:

das Verknüpfen eines Nukleophils mit dem Protein in einem nicht-neutralen Medium durch Katalyse mit einem Carboxypeptidase-Enzym zur Bildung eines Addukts, wobei das Nukleophil eine L-Aminosäure, ein L-Aminosäurederivat, ein Amin oder Alkohol mit einer Seitenkette ist, die einen kennzeichnenden reaktiven Substituenten trägt; und

das Binden des Addukts an die Hilfssubstanz oder eine Kombination der Hilfssubstanz mit einem Verbindungsarm zur Bildung des gebundenen Proteins, wobei die Hilfssubstanz oder die Kombination eine spezifisch reaktive Gruppe trägt, die in Bezug auf den kennzeichnenden reaktiven Substituenten reaktionsfähig ist; und

wobei die Hilfssubstanz einen Immobilisierungsträger, einen Marker oder ein bioaktives Agens beinhaltet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das nicht-neutrale Medium ein basisches Medium und das Nukleophil die L-Aminosäure, das L-Aminosäurederivat oder das Amin ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das nicht-neutrale Medium ein saures Medium und das Nukleophil der Alkohol ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, wobei das Protein ein Antikörper, ein Enzym, ein Enzyminhibitor, ein Peptidhormon, ein DNS-Bindungspeptid, ein regulatorisches Peptid oder ein DNS-Leserasterpeptid ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Protein ein Antikörper und das Nukleophil bevorzugt am Carboxylende der schweren Kette das Antikörpers gebunden ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, wobei das Carboxypeptidase- Enzym eine Serin-Carboxypeptidase oder eine Cystein-Carboxypeptidase ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, wobei der kennzeichnende reaktive Substituent aus der Gruppe bestehend aus Sulfhydryl, Hydroxyl, aktiviertes Hydroxyl, Olefinyl, aktivierter Ester, Amino, Azidyl, Hydrazinyl, Phosphoramidoyl, Boryl, Ferrocenyl, Ferro-Komplexen und Mischungen daraus gewählt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, umfassend das Binden des Addukts an eine Kombination des Verbindungsarms mit dem Marker zur Bildung des gebundenen Proteins; wobei der Marker fluoreszierend, kernmagnetisch, phosphoreszierend, kolorimetrisch, magnetisch, radioaktiv oder elektronenresonant ist und eine reaktive Gruppe trägt; und der Verbindungsarm eine flexible oder semi-flexible Kette ist, die die spezifisch reaktive Gruppe trägt, die in Bezug auf die reaktive Gruppe des Markers reaktionsfähig ist.