JPH04506454A - 生物活性材料のタンパクへの酵素的結合 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 生物活性材料のタンパクへの酵素的結合技術分野 本発明は、固定化および標識化されたタンパクに関し、ざらにタンパクの生物活 性薬剤への結合に関する。さらに詳しくは、本発明は、標識、固定化支持体およ び生物活性薬剤をタンパクの特異的部位に結合させる方法に関する。

発明の背景 生物活性なタンパクの機能が、しばしば、他の物質との組合せによって高められ 得ることは、よく知られている。ある反応を触媒したり、分離を行うために使用 する場合には、タンパクを固定化して、反応効率を高め、工程を簡単化すること ができる。検出薬剤として使用する場合には、タンパクを標識して測定を容易に することができる。生物体と複合体を形成したり、生物体を治療するのに使用す る場合には、タンパクを生物活性薬剤と組み合わせて（以下、「増大化」と称す る）、治療有効性の達成を助けることができる。

タンパクを固定化する方法は、反応部位を局在化させたり、経済的な回収率を向 上させるので望ましい。また、一般的に、固定化タンパクは、遊離タンパクに比 べて、化学的な攻撃や温度およびｐＨの変化によって、はとんど活性を失わない 。

タンパクを標識化または増大化する方法は、そのタンパクの定量化、局在化、特 異性および反応性を促進するので望ましい。さらに、得られた組合せは、臨床分 析および治療用の組合せおよび／または強力な手段である。

固体支持体上へのタンパク固定化には、数多（の技術が存在する。

タンパクは、不活性な支持体上へ物理的に吸着させることもできるし、二官能性 のリンカ−アームとの反応によって、支持体に共有結合させることもできる。ま た、マイクロカプセル化、ゲルへの閉し込め、および（イオン交換樹脂との）複 合体形成も、結合させて固定化することができる。

標識および生物活性薬剤をタンパクに結合させるには、数多くの技術が存在する 。これら技術の大部分は、標識または薬剤と、タンパク中に繰り返して存在する アミノ基などのタンパクの官能基との反応を必要とする。このような基の繰り返 しには、タンパクの立体配座によって結合から遮蔽されているものもあるが、他 の多くは露出しており、標識原子団または生物活性薬剤との結合に利用可能であ る。その結果得られるのは、様々な非特異的部位に標識または生物活性薬剤が結 合したタンパクの混合物である。

固定化、標識化または増大化のためのこれら技術のいずれかを用いるには、いく つかの基準を満足しなければならない。第１は、タンパクが最適な反応性を有す るための正確な空間的配向である。タンパクは、その活性部位を支持体、標識ま たは生物活性薬剤から遠ざけて配向し、これらの部位が機能的作用に利用可能と なるように結合する場合、最もよく機能する。第２は、少なくとも非結合型タン パクに匹敵するようなタンパク活性および特異性を発揮することである。第３に 、これは特に固定化に適用することができるが、繰り返して使用し得る能力およ び高密度で充填し得る能力である。第４は、タンパクの活性部位内または近傍に 支持体、標識または薬剤が結合することを回避することである。さもなければ、 その結果として生ずる機能的能力の損失は、しばしば、不適切な反応性や、より 多くのタンパクを使用する必要性の原因となる。

今日研究されている最も重要なタンパクの具体例の１つは、抗体　゛である。抗 体の抗原結合部位内または近傍に固定化支持体、標識基または生物活性薬剤が結 合することを最小限に抑える必要性は、広（認識されている。

このような最小化を行うためのある方法は、標識基、生物活性薬剤、または固定 化支持体との反応の前に、抗原を抗体に結合させることを包含する。このように して、抗原は抗体結合部位を反応から遮蔽する。しかし、この遮蔽法の成功は限 られている。抗原に対する抗体の親和性は高いが、抗体／抗原複合体と遊離の抗 体／抗原との開の平衡によって、遊離の抗体は反応可能となる。これは予見可能 な否定的な結果を招く。加えて、抗原をｙＡ識基、生物活性薬剤または固定化支 持体に曝らすことは、しばしば、そのような物質が抗原に結合する結果となる。

どのような種類のタンパクをも固定化、標識化または増大化する公知の方法は、 タンパクの機能的能力を維持することには程遠い。

タンパクの反応性は、一般には、低下する。適切な空間的配向および充填密度が 、しばしば欠けている。また、その結果として、多くの付随する経済性、毒性、 反応性および非特異性に関する問題が発生する。従って、標識、支持体または生 物活性薬剤をタンパクに結合させる、より良好で、より特異的な方法が必要とさ れている。

それゆえ、タンパクの機能的活性部位または部位群から遠く離れた部位において 、これらタンパクを標識化、固定化または生物活性的に増大化する方法を開発す ることが、本発明の１つの目的である。

また、タンパクを不活性な固定化支持体に共有結合させることによって固定化す ることも、本発明の１つの目的である。本発明の別の目的は、標識をタンパクの 特異的部位に共有結合させることである。

別の目的は、生物活性薬剤をタン、＜り上の特異的位置に共有結合させることで ある。本発明のさらなる目的は、タンパクが、機能的活性部位へ妨害されずに接 近することを可能にする正確な空間的配向および充填密度を有するように、これ らタンパクを固定化することこれらの目的および他の目的は、タンパクを固定化 、標識化および増大化する方法に関する本発明によって達成される。一般的に、 この方法は、固定化支持体、標識または生物活性薬剤（以下、「補助物質」と称 する）を、タンパクの機能および性能への妨害が最小限に抑えられるか、あるい は排除されるような特異的部位にてタンパクに結合させることを包含する。好ま しくは、この特異的部位は、タンパクの活性部位から非常に遠く離れている。

特に、本発明の方法は、２つの主要な反応を包含する。第１（以下、「主力、プ リング反応」と称する）では、エキソペプチダーゼ酵素を用いることによって、 アミノ酸、アミノ酸誘導体、アミンまたはアルコール（以下、請求核試薬」と称 する）がタン／ｆりのカルボキシ末端へ酵素的にカップリングする。第２（以下 、「主結合反応」と称する）では請求核試薬の側鎖が、補助物質に結合した特異 的反応性基に結合する。

本発明の方法は、主カップリング反応または主結合反応のいずれを先に行うかに よって、選択的な合成経路で実施することができる。

これら２つの経路は、発明の詳細な説明と題された次節に与えられたスキームに 描かれている。

第１の合成経路は、あらゆるサイズおよび溶解度の反応物で用いることができる 。まず、特性側鎖を有する核試薬を、主カップリング反応によって、タンパクの カルボキシ末端またはカルボキシエステル末端にカップリングさせる。このカッ プリングは請求核試薬を、タンパクのカルボキン末端に付加する（縮合）か、あ るいはカルボキン末端を形成するアミノ酸残基を核試薬で置換する（アミノ酸ま たはアミンでペプチド転移、またはアルコールでエステル交換する）か、あるい は末端アミノ酸エステル残基のアルコール性基を核試薬で置換する。次いで、得 られた請求核試薬付加体を、側鎖の特性を利用した主結合反応によって補助物質 に結合させる。付加体は、補助物質へ直接的に結合させるか、あるいは二官能性 のリンカ−アームを介して間接的に結合させる。いずれの場合にも、結合反応は 請求核試薬の側鎖と、補助物質またはリンカ−アーム上の特異的反応性基との間 で起こる。

第２の合成経路は、反応媒体中における反応物のモル濃度が比較的に迅速な酵素 カップリングを行うのに充分である場合に用いることができる。まず請求核試薬 を主結合反応によって補助物質に結合させ、補助物質および核試薬の中間体を形 成する。この結合は、求核試薬の側鎖と補助物質との直接反応、または補助物質 に予め結合させたリンカ−アームを介して間接的に行うことができる。次いで、 該中間体を、主カップリング反応によってタンパクのカルボキシ末端に結合させ る。アミノ酸、アミノ酸誘導体、アミンまたは請求核試薬でのペプチド転移、縮 合およびエステル交換のいずれもが、この主カップリング反応にて用いることが できる。

本発明の方法に使用されるタンパクは、生物学的に活性なポリペプチドである。

酵素、酵素阻害物質、ペプチドホルモン、ＤＮＡ結合タンパク、リイーディング フレームタンパク、転写酵素、抗体、Ｆ、ゎ切断型抗体、抗体断片、調節タンパ ク、２残基程度の小さなペプチド、および他の様々な機能性タンパクが含まれる が、これらには限定されない。

本発明の方法に使用するのに好ましいタンパクは、モノクローナル抗体およびポ リクローナル抗体である。好ましいクラスの抗体には、生物系における抗原、あ るいは生物系または無生物系における夾雑物を検出し、生物活性薬剤を特異的部 位へ運搬し、疾患および生体の機能障害を診断し、生物系または無生物系におい て抗原を他の物質から分離し、生物系または無生物系から抗原を除去するように 機能するものが含まれる。特に好ましい具体例は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、Ｉ ｇＭ、またはＩｇＧクラスの免疫タンパクに由来する哺乳類の免疫グロブリンタ ンパクである。

本発明の方法に使用されるアミノ酸求核試薬は、反応性置換基を備えた側鎖を有 するα−アミノ酸またはアミノ酸誘導体である。あるいは、それが補助物質でも ある場合には、単純な非機能性の側鎖を有していてもよい。第１の合成経路を用 いた場合、側鎖は、アミノ酸求核試薬がタンパクのアミノ酸に対して特性を有す るように選択される。この設計によれば、タンパクのアミノ酸よりむしろアミノ 酸求核試薬は、選択的に、かつ優先的に、りンカーアームまたは補助物質の特異 的反応性基と反応する。第２の合成経路を用いた場合、このような特性は、使用 することはできるが、主力・ノブリング反応が所望の選択性を与えるので、必ず しも必要ではない。

本発明の方法に使用される請求核試薬はアミノ酸求核試薬によく似ている。それ は、その骨格に沿って、あるいは、その他端に、反応性置換基を有するＣ８〜Ｃ ８゜の脂肪族、芳香族またはアリール脂肪族の第１級アミンである。アミノ酸側 鎖の性質に関する上記の条件は、アミンを第１および第２の合成経路に用いる場 合にも適用される。

本発明の方法に使用される請求核試薬は、その骨格に沿って、あるいは、その他 端に、反応性置換基を有する脂肪族、芳香族またはアリール脂肪族の０１〜Ｃ２ ゜第１アルコールである。

本発明の方法に使用されるリンカ−アームは、その末端として、（１）求核試薬 の側鎖と反応性である特異的反応性基、および（２）補助物質の結合基と反応す る他の官能基を有する柔軟性または半柔軟性鎖である。

本発明に有用な固定化支持体は請求核試薬の側鎖との選択的な反応に特異的な反 応性基で、またはリンカ−アームの他方の官能基と反応する結合基で官能化され ていてもよい無機または有機の物質である。支持体は、生物学的に不活性であっ て、使用媒体に不溶の多孔性または半身孔性の物質である。

生物活性薬剤には、望ましい生化学的効果または治療効果を与えるように作用す るものが含まれる。それらは請求核試薬の側鎖との反応に特異的な反応性基で、 またはリンカ−アームの他方の官能基と反応する結合基で官能化されていてもよ い。化学療法剤、酸化剤または還元剤、細胞毒性剤、抗癌剤、放射活性剤、抗生 物質、抗有糸分裂薬、抗感染薬、重金属剤、抗ウィルス剤、溶解剤、キレート化 基などが含まれる。

本発明に有用な標識には、蛍光基、燐光基、比色定量基、放射活性基、ルミネセ ンス基、分光基、核磁気共鳴基、電子スピン共鳴基および測定手段によって検出 しうる理化学的性質を有する他の基が含まれる。これらの標識は請求核試薬の側 鎖との反応に特異的な反応性基で、またはリンカ−アームの他方の官能基との反 応性を有する結合基で官能化されていてもよい請求核試薬は、放射活性原子を有 する場合には、標識としても機能しつる。

主カップリング反応を行う酵素はエキソペプチダーゼである。それらは、塩基性 条件下（縮合およびペプチド転移）または酸性条件下（エステル交換）で、ペプ チド鎖のＣ末端で特異的に作用してペプチド結合を形成または変形し、使用され る反応条件下では比較的安定である。

本発明の方法に好ましいエキソペプチダーゼ群は、セリンカルボキンペプチダー ゼである。これらの酵素のいくつかは、カルボキシペプチダーゼＹとして知られ ているが、中性または塩基性の側鎖を有するアミノ酸またはアミンに特異的であ る。いくつかの池の部類のカルボキシペプチダーゼ酵素は、酸性の側鎖を有する アミノ酸に特異的である。エキソペプチダーゼ酵素の特異性と、タンパクニ結合 させるべき核試薬の中性、酸性または塩基性との相関関係は、本発明の方法によ れば適当である。

タンパクと核試薬との間における酵素触媒反応の条件には、ｐＨの調節、温度、 濃度およびインキュベーション時間が含まれる。

また、本発明は、標識化、固定化または増大化タンパクを用いる方法に関する。

標識タンパクの使用法は、標識タンパクおよびそれが作用する物質を結合させる こと、過剰の標識タンパクを除去すること、および、この物質と反応した標識タ ンパクの量を測定することを包含する。

特に、この方法は、それぞれ抗体または酵素による抗原または酵素の基質／阻害 剤の検出に有用である。

固定化タンパクの使用法は、タンパクの性質によって示される公知の様式で進め られる。タンパクは、好ましくは、酵素、抗体、ＤＮＡ結合タンパクまたは調節 タンパクである。好ましい使用は、酵素触媒反応、抗体−抗原の腹合体形成、反 応の調節およびＤＮＡまたは酵素の分離および／または精製を包含する。この方 法のある利点は、反応性部位から遠く離れた特異的な一定部位にて固定化される ので、固定化タンパクを、より効率的に、かつ容易に除去することができること である。別の利点は、すべての分子が同じ方同に整列し、活性部位を露出させて いる場合に、固定化タンパクの充填密度を増大させる能力である。

また、タンパクに結合した生物活性薬剤の使用法は、生物活性薬剤およびタンパ クの性質によって示される公認の様式で進められる。

タンパクおよび生物活性薬剤の作用は、協同的であって所望の効果を生ずる。タ ンパクは、薬剤をメンブレンの向こう側へ輸送するか、あるいは、それを液体、 媒体または細胞中へ吸収させるためのキャリアーとして作用しうる。また、それ は、薬剤をメンブレンの向こう側へ輸送させないようにするか、あるいは、それ を液体、媒体または細胞中へ吸収させないようにするための吸収阻害剤として作 用しうる。さらに、薬剤を選択的な組織部位またはレセプターへ向かわせるため の商標的輸送手段として作用しうる。この方法の利点は、活性部位から解放され ていることにより、反応効率および組織選択性が増大することである。

要約すると、本発明は、補助物質に結合したタンパクを形成する方法に関する。

このようなある方法は、（ａ）特性反応性置換基を備えた側鎖を有するアミノ酸 、アミノ酸誘導体、アミンまたはアルコールである核試薬を、エキソペプチダー ゼ酵素の触媒作用によって、タンパクにカップリングさせ、付加体を形成する工 程と、（ｂ）付加体を、該付加体の特性反応性置換基に対して相関的に反応性で ある特異的反応性基を有する補助物質またはそのリンカ−アームとの組合せに結 合させ、結合タンパクを形成する工程とからなる。タンパクを補助物質に結合さ せる別の方法は、（ａ）反応性置換基を備えた側鎖を有するアミノ酸、アミノ酸 誘導体、アミンまたはアルコールである核試薬を、この核試薬の反応性置換基に 対して反応性である反応性基を有する補助物質またはそのリンカ−アームとの組 合せに結合させ、中間体を形成する工程、および（ｂ）該中間体を、エキソペプ チダーゼ酵素の非中性触媒作用によって、タンパクにカップリングさせ、結合タ ンパクを形成する工程を含む。

これら２つの方法のいずれかによれば、補助物質は、固定化支持体、標識または 生物活性薬剤であってもよい。これらの方法には、・リンカ−アームの自由端を 終結させる特異的な反応性官能基を有する、リンカ−アームに共有結合した補助 物質の組合せを用いるのが好ましい。塩基性の触媒作用条件下では請求核試薬は 、アミノ酸、アミノ酸誘導体またはアミンであることが好ましい。酸性の触媒作 用条件下では請求核試薬は、アルコールであることが好ましい。さらに、触媒作 用条件には、迅速なインキ１ベージＪン時間を含めることが好ましい。アミノ酸 求核試薬は、脂肪族アミノ酸、ヒドロキシアミノ酸、含硫アミノ酸、ジアミノモ ノカルボン酸、芳香族アミノ酸、複素環式アミノ酸、およびそれらの活性化誘導 体を包含する。

アミノ酸求核試薬は、セリン、タウリンまたはアラニンであることが好ましい。

いずれの方法にわけるタンパクも、抗体、酵素、酵素阻害剤、タンハクホルモン 、ＤＮＡ結合タレバク、調節タンパクまたはＤＮＡＮシリディングフレームタン パクでありうる。タンパクがモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であ り請求核試薬が抗体の重鎮のカルボキシル末端に実質的に完全に結合することが 好ましい。

また、タンパクは、ＩｇＧ免疫タンパクであることが好ましい。

エキソペプチダーゼ酵素は、カルボキシペプチダーゼ、好ましくはセリンまたは システィンカルボキシペプチダーゼでありうる。

また、本発明は、標識タンパクを調製する方法にも関する。この方法は、タンパ クと、標識されたアミノ酸、アミノＭＩＰ！導体、アミンまたはアルコールの核 試薬とを、非中性媒体中、エキソペプチダーゼ酵素の存在下で、カブブリングさ せることからなる。標識は、蛍光、核磁気、燐光、比色定置、磁気、電子共鳴ま たは分光により測定しうる。本発明によるある特定の方法は、（ａ）タンパクと 、好ましくは、スルフヒドリル、辷ドロキシル、活性化ヒドロキシル、オレフィ ニル、活性化エステル、アミノ、アジジル、ヒドラジニル、ホスホルアミドイル 、ボロニル、フェロセニル、フェロ複合体およびそれらの任意の混合物からなる 群から選択される特性反応性置換基を備えた側鎖を有する核試薬とを、非中性媒 体中、エキソペプチダーゼ酵素の存在下でカップリングさせて付加体を形成する こと、（ｂ）少なくとも１つの反応性基を有する標識と、該特性反応性置換基と 相関的に反応性である特異的反応性基だけでなく、該標識の反応性基に対して反 応性である別の官能基をも有する柔軟性または半柔軟性鎖であるリンカ−アーム とを結合させて組合せを形成すること、および（Ｃ）該付加体と該組合せとを結 合させて標識タンパクを形成することからなる。別のＩ！ｌｌｉ！ｉ化法は、（ ａ）少なくとも１つの結合基を有する標識と、標識の結合基に対して非反応性で あるか、あるいは非反応性にする特異的反応性基だけでな（、標識の結合基に対 して反応性である他の官能基をも有する柔軟性または半柔軟性の鎖であるリンカ −アームとを結合させて組合せを形成すること、（ｂ）該組合せと、該組合せの 特異的反応性基に対して反応性である反応性置換基を備えた側鎖を有する核試薬 とを結合させて中間体を形成すること、および（Ｃ）タンパクと該中間体とを、 非中性媒体中、エキソペプチダーゼ酵素の存在下で結合させて標識タンパクを形 成することからなる。ＩＩ識タンパクを調製するさらに別の方法は、（ａ）反応 性置換基を備えた側鎖を有する核試薬と請求核試薬の反応性置換基に対して反応 性である反応性基を有する標識とを結合させて中間体を形成すること、および（ ｂ）タンパクと該中間体とを、非中性媒体中、エキソペプチダーゼ酵素の存在下 で結合させることからなる。

得られた標識タンパクは、アミノ酸、アミノ酸誘導体、アミンまたはアルコール の標識求核試薬を、そのカルボキシル末端に力、、プリングまたは置換したタン パクを含んでいてもよい。好ましくは、求核試薬は、カルボ牛ン末瑞に、実質的 に排他的にカップリングまたは置換されている。タンパクがモノクローナル抗体 またはポリクローナル抗体であり請求核試薬がセリン、タウリン、またはアラニ ンであることが好ましい。さらに、標識求核試薬は放射活性であることが好まし い。

本発明によるタンパクＩｊＩ識化法では、タンパク濃度が約ｌμＭ〜約１ｍＭで あり、酵素濃度が約１ｐＭ−１ｍＭであることが好ましい。酸性カップリング条 件下では請求核試薬はアルコールであることが好ましい。塩基性カップリング条 件下では請求核試薬は、アミノ酸、アミノ酸誘導体、またはアミンであること； 力・ノブリング反応が少なくとも５秒間行われること；および、請求核試薬およ び酵素が、水性混合物中で結合されることが好ましい。この混合物は、（ａ）タ ンパクと核試薬とを組合せ、ｆｉ含物を形成すること、（ｂ）ａ合物のｐＨを約 ２．０〜１０．５の範囲内に調節すること、および（Ｃ）酵素をａ合物に添加す ることによって形成されつる。

また、本発明は、抗原の存在を検出する方法を提供する。この方法は、（ａ）抗 原に対して特異的な免疫反応性を有する標識抗体を、抗原を含んでいる疑いのあ る試料と結合させて慣合体を形成する工程、（ｂ）慢合体を形成していない標識 抗体を除去する工程、および（Ｃ）慢合体中に存在する標識抗体の量を測定する 工程を含む。

さらに、本発明は、固定化タンパクを調製する方法を提供する。

このようなある方法は、（ａ）タンパクと核試薬とを、非中性媒体中、エキソペ プチダーゼ酵素の存在下でカップリングさせ、付加体を形成する工程、および（ ｂ）付加体と、付加体の特性反応性置換基に対して相関的に反応性である少なく とも１つの特異的反応性基を有する固定化支持体とを結合させて固定化タンパク を形成する工程を含む。別の方法は、（ａ）タンパクと核試薬とを、非中性媒体 中、エキソペプチダーゼ酵素の存在下でカップリングさせて付加体を形成する工 程、（ｂ）少なくとも１つの結合基を有する固定化支持体と、該付加体の特性反 応性置換基に対して相関的に反応性である特異的反応性基だけでなく、支持体の 結合基に対して反応性である別の官能基をも有する柔軟性または半柔軟性績であ るリンカ−アームとを結合させ、共有結合した組合せを形成する工程、および（ ｃ）該付加体と該組合せとを結合させて固定化タンパクを形成する工程からなる 。いずれの方法によっても請求核試薬は、特性反応性置換基、例えばスルフヒド リル、ヒドロキシル、活性化ヒドロキシル、アミン、活性化エステル、オレフィ ニル、アジジル、ヒドラジニル、ホスホルアミドイル、ボロニルフェロセニル、 フェロ攪合体およびそれらの任意の混合物を備えた側鎖を有するアミノ酸、アミ ノ酸誘導体、アミンまたはアルコールでありうる。

本発明に従って固定化タンパクを調製する別の方法は、（ａ）少なくとも１つの 結合基を有する固定化支持体と、該結合基に対して非反応性であるか、あるいは 非反応性にする特異的反応性基だけでな（、支持体の結合基に対して反応性であ る池の官能基をも有する柔軟性または半柔軟性の鎖であるリンカ−アームとを結 合させ、共有結合した組合せを形成すること、（ｂ）該組合せと、好ましくは組 合せの特異的反応性基に対して反応性である反応性置換基を備えた側鎖を有する アミノ酸、アミノ酸誘導体、アミンまたはアルコールである核試薬とを結合させ て中間体を形成すること、および（Ｃ）該中間体とタンパクとを、非中性媒体中 、エキソペプチダーゼ酵素の存在下でカップリングさせて固定化タンパクを形成 することからなる。さらに別の方法は、（ａ）好ましくは反応性！ｆ置換基備え た側鎖を有するアミノ酸、アミノ酸誘導体、アミンまたはアルコールである核試 薬と請求核試薬の反応性置換基に対して反応性である少なくとも１つの特異的反 応性基を有する固定化支持体とを結合させ、中間体を形成する工程、および（ｂ ）タンパクと該中間体とを、非中性媒体中、エキソペプチダーゼ酵素の存在下で カップリングさせて固定化タンパクを形成する工程からなる。

本発明の固定化タンパクを調製する方法のいずれかによれば、タンパクのカルボ キシル末端が支持体に結合することが好ましい。支持体は無機または有機であり うる。さらに、支持体は、多孔性または半歩孔性の微粒子、マイクロビーズ、球 体、ゲル粒子、繊維、小板、ンートまたは粒状物でありうる。

さらに、本発明は、生物活性薬剤によって増大したタンパクを調製する方法を提 供する。このようなある方法は、（ａ）タンパクと核試薬とを、非中性媒体中、 エキソペプチダーゼ酵素の存在下でカップリングさせて付加体を形成すること、 および（ｂ）該付加体と、該付加体の反応性置換基に対して相関的に反応性であ る少なくとも１つの特異的反応性基を宵する生物活性薬剤とを結合させ、増大し たタンパクを形成することからなる。別の方法は、（ａ）タンパクと核試薬とを 、非中性媒体中、エキソペプチダーゼ酵素の存在下でカップリングさせ、付加体 を形成する工程、および（ｂ）少なくとも１つの結合基を有する生物活性薬剤と 、付加体の反応性置換基に対して相関的に反応性である特異的反応性基だけでな く、生物活性薬剤の結合基に対して反応性である他の官能基をも有する柔軟性ま たは半柔軟性鎖であるリンカ−アームとを結合させて共有結合した組合せを形成 する工程、および（Ｃ）該付加体と該組合せとを結合させ、増大したタンパクを 形成する工程からなる。好ましくは請求核試薬は、スルフヒドリル、ヒドロキシ ル、活性化ヒドロキシル、アミノ、活性化エステル、オレフィン基、アジジル、 ヒドラジニル、ホスホルアミドイル、ボロニル、フェロセニル、フェロ複合体お よびそれらの任意の混合物からなる群から選択された特性反応性置換基を備えた 側鎖を有するアミノ酸、アミノ酸誘導体、アミンまたはアルコールである。

生物活性薬剤によって増大したタンパクを調製する別の方法は、（ａ）反応性置 換基を備えた側鎖を有するアミノ酸、アミノ酸誘導体、アミンまたはアルコール である核試薬と、該求核試薬の反応性置換基に対して反応性である少なくとも１ つの特異的反応性基を有する生物活性薬剤とを結合させて中間体を形成すること 、および（ｂ）タンパクと該中間体とを、非中性媒体中、エキソペプチダーゼ酵 素の存在下でカップリングさせ、増大したタンパクを形成することを含む。増大 したタンパクを形成する代わりの方法は、（ａ）少なくとも１つの結合基を有す る生物活性薬剤と、付加体の各々の置換基に対して相関的に反応性である特異的 反応性基だけでな（、生物活性薬剤の結合基に対して反応性である他の反応性基 をも有するリンカ−アームとを結合させ、共有結合した組合せを形成すること、 および（ｂ）該組合せの特異的反応性基に対して反応性である反応性置換基を備 えた側鎖を有するアミノ酸、アミノ酸誘導体、アミンまたはアルコールである核 試薬と、組合せとを結合させ、中間体を形成すること、および（ｃ）タンパクと 該中間体とを、非中性媒体中、エキソペプチダーゼ酵素の存在下でカップリング させることを包含する。

固定化タンパクを調製する方法または生物活性薬剤によって増大したタンパクを 調製する方法によれば請求核試薬は、塩基性力、２プリング条件下ではアミノ酸 、アミノ酸誘導体またはアミンであり、酸性カップリング条件下ではアルコール であることが好ましい。

また、本発明は、本発明の方法に従って製造された固定化タン、ｆりを用いるこ とによって、タンパクを機能的に反応させる方法を包含する。さらに、本発明の 方法に従って製造された生物活性薬剤を有するタンパクを用いることによって、 生物活性薬剤との生体反応を行う方法を包含する。

本発明の方法によれば、「特性反応性基」および「特異的反応性基」は、以下の 対から選択することが好ましい：（ａ）スルフヒドリル基および有機金属基、（ ｂ）オレフィン基およびジェニル基、（ｃ）極性オレフィン基およびその対応す るモノマーまたはその置換形、（ｄ）アフィニティー複合体を形成する化合物お よびその基質、（ｅ）１対のホウ水素化オレフィン基、（【）芳香族アミ７基お よびエポキシ活性化エステルまたはアルデヒド基、（ｇ）アジジルまたはヒドラ ジニル基および芳香族アミ７基、（ｈ）芳香族アルコールおよび活性化エステル 基、および（ｉ）ヒドラジンおよび還元糖基。

また、本発明の方法によれば、リンカ−アーム鎖は、アミド、エステル、ウレタ ン、エーテル、グリシジル、オレフィンまたは炭化水素基、あるいは約２〜２０ 個の原子を有する脂肪族基、あるいは約１〜５個の環を有する芳香族基のポリマ ーまたはオリゴマーであることが好ましい。

図面の簡単な説明 図ＩＡは、Ｏ″Ｃにおける抗体中へのセリン導入のｐＨ依存性を時間に対して表 したグラフである。

図ＩＢは、２５℃における抗体中へのセリン導入のｐＨ依存性を時間に対して表 したグラフである。

図ＩＣは、３７℃における抗体中へのセリン導入のｐＨ依存性を時間に対して表 したグラフである。

図２は、インキュベーション時間がセリン導入に及ぼす影響をグラフで表した図 である。

発明の詳細な説明 本発明がなされるまでは、補助物質をタンパクの単一部位へ非常に選択的に結合 させる一般的な方法は存在しなかった。本発明の方法は、補助物質が結合するタ ンパク部位を正確に制御することによって、この問題点を解消する。この制御に よって、補助物質は、タンパクの機能性部位からできる限り遠く離れたタンパク 上の特異的部位、すなわちカルボキシル末端に結合する。

さらに詳しくは、本発明は、アミノ酸、アミノ酸誘導体、アミンおよびアルコー ルが、塩基性のエキソペプチダーゼ触媒作用条件下では縮合またはペプチド転移 反応によって、また、酸性のエキソペプチダーゼ触媒作用条件下ではエステル交 換反応によって、生物学的に活性なタンパクのカルボキシル末端に力・ノブリン グすることができる（主カップリング反応）という知見に基づいている。プロテ イナーゼの触媒作用によるペプチド結合の合成に関する一般的な総説としては、 ジェイ・ニス・フルートン（Ｊ、Ｓ、　Ｆｒｕｔｏｎ）、ｒ酵素学における進歩 （Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）Ｊ中、エイーｖイスター（ Ａ、輩ｅｉｓｔｅｒ）編、第５３巻、１９８２年、ジョン・ワイリー・アンド・ サンズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ）、二ニーヨーク、第２３９〜３ ０６頁を参照。

その開示内容は参照資料として、ここに援用する。はとんどすべての機能性タン パク、特に抗体に関して、ペプチド鎖のカルボキシル末端は、その３次元構造の 中で、はとんど常に活性部位領域から遠く離れている領域内に存在する。抗体に おいては、例えば、この末端は、抗体の活性な可変領域から遠く離れた所定領域 内に存在する。

従って、補助物質をタンパクのカルボキシ末端に結合させれば請求められている 制御が与えられる。

上記の発明の概要で述べたように、結合した物質は、２つの合成経路のいずれか によって、タンパクのカルボキシ末端に結合させる。

第１では請求核試薬を、タンパクに対して別個にカップリングさせ、タンパクお よび核試薬の付加体を形成する。次いで、この付加体を、補助物質へ直接的に結 合させるか、リンカ−アーム−補助物質の組合せを介して間接的に結合させる。

第２の合成経路では請求核試薬および補助物質を、直接的に結合させるか、ある いはリンカ−アームを介して間接的に結合させ、中間体を形成する。次いで、こ の中間体を、タンパクのカルボキシ末端に結合させる。

これらの合成経路は、以下のスキームに描かれている。両方の合成経路は、補助 物質を核試薬へ直接的に結合させるか、あるいは間接的に結合させるかによって 、２通りの形式で実施される。

スキーム ＰｒｏＣＯＸ−Ｒ−ＳＲＧ　−（ＡＳｕｂ）　Ｐ　ｒｏｃＯＸ　−Ｒ−５ＲＧ− （Ｌ　ｉ　ｎｋ）　−（ＡＳｕｂ）ＰｒｏＣＯＸ−Ｒ−３ＲＧ−（Ｌｉｎｋ）　 ｎ−（ＡＳｕｂ）経路　２ ＳＲＧ−（ＡＳｕｂ）　５ＲＧ−（Ｌｉｎｋ）−（ＡＳｕｂ）Ｘ−Ｒ−５ＲＧ− （Ｌｉｎｋ）ｎ−（ＡＳｕｂ）＋ ＰｒｏＣＯＸ−Ｒ−３ＲＧ−（Ｌｉｎｋ）　ｎ−（ＡＳｕｂ）ＰｒｏＣＯＪはタ ンパクである。Ｒ−Ｘ［式中、Ｒは側鎖であり、Ｘは結合性アミンまたはヒドロ キシ基である］は請求核試薬、すなわちアミノ酸または脂肪族アミンである。Ａ Ｓｕｂは結合した物質である。Ｌｉｎｋはリンカ−アームである。ＳＲＧは特異 的反応性基である。文字ｎは数０または１である。Ｘ、　Ｒ，ＳＲＧおよび経路 の選択はタンパクの官能基および反応物の溶解度に依存する。

経路　１ 経路ｌによれば、第１工程は主カップリング反応であり、タンパクと核試薬の付 加体を形成する。該反応は、非中性条件下、二手ソペブチダーゼ触媒により達成 される。

第１工程における核試薬としての個々のアミノ酸、アミノ酸誘導体、アミンまた はアルコールの選択は、タンパクのアミノ酸の同一性および核試薬の側鎖の特性 に依存する。カップリングする核試薬の側鎖は、結合物質またはリンカ−アーム −結合物質の組合せの特異的反応性基に対する結合部位として作用する。それは 、タンパクのアミノ酸の非二重性であるか、またはタンパクのアミノ酸側鎖より も組合せまたは補助物質の特異的反応性基に対してより高い反応性であるかのい ずれかの構造を有する。また、これら側鎖との直接反応を回避または最小限とす るように選択される。

求核試薬側鎖によるこの選択性は、その反応性置換基により達成される。この置 換基は、スルフヒドリル、オレフィニル、アミノ、アジジル、ヒドラジニル、エ ポキシ、ヒドロキシル、アクチベーターがトシル、メシルおよびベンゾイルのよ うな容易な脱離基である活性化ヒドロキシ、カルボキシル、リン酸基またはスル ホン基のような酸基、混合無水物、カルボジイミド、イミニルアミジニル、イミ ダゾ、ピバロイルエステル、ネオペンチルエステル等のような活性化エステル、 ホスホルアミドイル、フェロセニル、フェロ複合体、ボロニルおよび同等の反応 性官能基とすることができる。

経路１の第２工程において、主結合反応は請求核試薬側鎖を補助物質またはリン カ−アームとの組合せのいずれかに結合させることにより達成される。これら両 方の変形において、組合せまたは補助物質の特異的反応性基は、側鎖および補助 物質または組合せが実質的にタンパクの他の基を包含することなく容易に反応す るように該側鎖の反応性置換基と相関させる。

この主結合反応の選択反応性を得るため、反応性置換基と特異的反応性基を対と して相関させる。この対のいくつかの具体例は、本質的にタンパクの他の基を包 含しない非競合結合を示す。これらは、例えば： （１）スルフヒドリルおよび有機金属基、好ましくは、有機水銀基またはアルマ ン試薬（Ａｌｍａｎ　ｒｅａｇｅｎｔ）　；それは、抗体は天然ではその活性部 位内または近傍に遊離スルフヒドリル基、すなわち、システィンを有しないため 、抗体の場合に特に有用である： （２）オレフィン基とジェニル基、それは、ディールズーアルダー付加体を形成 する； （３）ホスホルアミドイル基とメタロホスホルアミドイルまたはメタロホスフェ ート基、それは、配位結合複合体を形成する：（４）アフィニティー腹合する化 合物とその対応する基質、例えば、カルボニック・アンバイトラーゼとスルファ ニルアミドまたはビオチンとアビジン、それは、アフィニティー複合体を形成す る。

（５）フェロセニル基またはフェロ複合体と反応媒体に対して不活性にした磁気 物質、例えば、テフロン被覆鉄線コイル、それは、磁気カップルを形成する： （６）キレート化する基とキレート化される部分、例えば、エチレンジアミン四 酢酸と遷移金属で、キレートを形成する：（７）極性オレフィンまたは置換オレ フィン基と対応するモノマー、それは、温和な条件下、遊離ラジカル手段により 、例えば、Ｎ−アクリロイルリジンおよびアクリルアミドを高分子化し、ポリマ ーを形成する； （８）一対のオレフィン基、それは、ホウ水素化され、ついで硝酸銀および弱塩 基で処理され、還元され、力・７ブリングしたオレフィン−オレフィン付加体を 形成する；および（９）光化学反応アリールケト基とラジカル−不安定Ｃ−Ｈ結 合を有する遊離ラジカル安定化基、例えば、ベンゾイルフェニルアラニンとベン ジル、アリルまたはアリールアルキル基、それは、光分解し、ケト炭素と遊離ラ ジカル安定化基のＣ−Ｈ炭素の開にて付加体を形成することができる。好ましく は、ボッアミド、ポリシンアミド、ポリスチレンまたはフルオレン含有ポリマー （支持体）、ポルフィリンまたはフルオレセイン、（標識）およびベンジル置換 生物活性薬剤のような遊離ラジカル安定化基を、タンパクのそれ自体への光分解 付加が非常に疎んじられるように、請求核試薬にカップリングするタンパクより も有意に高濃度にて用いる（ジェイ・シー・カウアー（Ｊ、Ｃ，Ｋａｕｅｒ）ら 、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ 、）　、２６ユ、１０６９５　（１９８６）参照）。

この対の他の具体例はタンパクの官能基に関して競合結合を示すが、側鎖と結合 物質または組合せの実質的な選択反応が得られるように調整することができる。

これらは、例えば：（１）芳香族アミ７基とエポキシ、活性化エステルまたはア ルデヒド基、好ましくは、芳香族エポキシまたはアルデヒド基、それは、反応し て窒素−炭素付加体を形成し、わずかに酸性条件下にてタンパクのアミン基をプ ロトン化することができる：（２）アジジルまたはヒドラジニル基と芳香族アミ ン、それは、ＵＶ光の照射により反応し、置換アミンを形成し、わずかに酸性条 件下にてタンパクのアミン基をプロトン化することができる： （３）芳香族アルコール（例えば、フェノール基）または芳香族アミンと活性化 エステル、それは、反応して、各々、エステルまたはアミドを形成し、わずかに 酸性条件下、タンパクのアミン基をプロトン化することができる：および（４） ヒドラジンおよび還元糖、それは、オサゾンを形成する。

側鎖と特異的反応性基の結合反応を行うための条件および操作は当該分野におい て公知である。例えば、フィーサー＆フィーサー（Ｆ　１ｅｓｅｒ＆　Ｆ　１ｅ ｓｅｒ）による「有機合成のための試薬」、ジョン・ワイリー＆サンズ（Ｊ　ｏ ｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆　Ｓ　ｏｎｓ）　、二ニーヨーク、Ｖｏｌ。

１−Ｘ、１９６７〜１９７５参照、その開示を参考のためここに挙げる。条件は 、一般に、はぼ室温（０〜３８℃）であり、反応体の適度の濃度まで希釈する。

操作は、一般に、反応器の撹拌、副生成物の除去および試薬のゆっくりした添加 を包含する。さらなる条件は、反応混合物中に１つ以上の基と反応しうるいずれ の反応体も最小濃度に維持することである。例えば、結合反応における補助物質 または組合せの最小濃度は、特異的反応性基とタンパクとの望ましくない副反応 の機会が最小限であるように維持すべきである。

経路　２ 経路２によれば請求核試薬および補助物質またはそのリンカ−アームとの組合せ は、第１に主結合反応により結合して中間体を形成する。この工程は、（１）前 記のいずれかの反応性置換基と特異的反応性基対；　（２）リンカ−アームにつ いて以下に記載する結合基と他の官能基対；または（３）アミド、エステル、エ ーテル、イミノ、カルボネート、ウレタン（カルバメート）、炭素−炭素、炭素 −窒素、硫黄−炭素、硫黄−酸素−炭素または炭素−酸素結合を形成するいずれ かの公知方法を用いることにより達成することができる。これらの結合を形成す る方法およびそれにより形成された個々の基は当該分野において公知である。例 えば、「タンパク修飾用の化学試ｉＪ　、ンー・アール・ンー・プレス・インコ ーポレイション（ＣＲＣＰｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、）　、アール・エル・ランドブラ ッド＆シー・エム・ノイエス（Ｒ，Ｌ、　Ｌｕｎｄｂｌａｄ＆Ｃ，Ｍ、　Ｎｏｙ ｅｓ）編、１９８４；「有機化学の基礎原理」、ジェイ・ディー・ロバーツおよ びエム・カセリオ（Ｊ、Ｄ、ＲｏｂｅｒｔｓおよびＭ、　Ｃａｓｅｒｉｏ）　、 ベンジャミン・プレス（Ｂｅｎｊａａ＋ｉｎ　Ｐｒｅｓｓ）　、１９７５参照、 これらの開示を参考のためここに挙げる。

補助物質または組合せを核試薬に結合させる個々の方法の選択は、この経路によ ればタンパクの構造に依存しない請求核試薬および補助物質またはリンカ−アー ム組合せの化学構造に適しているいずれの安定な結合基も、この結合反応がタン パクの存在下にて行われないため十分である。

経路２の第２工程は、中間体の核試薬部とタンパクのカルボキシ末端との主力、 ブリング反応を介して該中間体を該タンパクにカップリングさせる。それは、非 中性条件下、エキソペプチダーゼ触媒作用により達成される。この反応の選択性 は、タンパクの存在下にて行われるものとしてそれを適合させる。経路２のスキ ームは、主カップリング反応が反応式における最後に位置し、主結合反応からの 干渉の可能性を排除しつるので、この特性を最も有利に利用している。

経路２の第２工程は、主として反応効率に関するいくつかの付随的パラメーター を有する。反応体は、比較的容易にカップリングを起こすことができるように、 反応媒体中にて十分な溶解性を有していなければならない。一般に、この溶解性 は、反応体では、約０゜０５〜２Ｍであり、酵素では、１〜１００μＭであるこ とが好ましい。カップリング反応の反応体の溶解性がこれよりも小さい場合、経 路１を用いることが好ましい。

合成経路２によりタンパクにカップリングさせることのできる標識、支持体材料 および生物活性薬剤の個々の具体例を表１に示す。

表１ 標識、生物活性薬剤および支持体を抗体に力・ノブリングさせるためのアミノ酸 （アミノ酸の化学名と一緒に適用性を列挙する）ＨＯＣＨ，ＣＨ（ＮＨｌ）Ｃｏ 、ＨＨｔＮＣＨ＊ＣＨｔＳＯｓＨ１（ＯＨ）Ｃ＠ＨＩＣＦ１．ＣＨ（ＮＨ，）Ｃ ｏ、Ｈセリン　タウリン　ヨードチロシン ”Ｈ，”Ｃ’Ｈ，”Ｃ，”Ｓ　””［，１３１１放射活性標識　放射活性標識　 監射盾塁盗達ＨＪＣＨ＊ＣＨｚＰＯ＋ＨＦＣｓＨ−ＣＨｔＣＨ（ＮＨｌ）ＣＯｔ Ｈアミノエタンホスホン酸　フルオロフェニルアラニン３Ｈ％１４Ｃ，”Ｐ　Ｎ ＭＲ標識 放射活性標識 表　１　（つづき） Ｃ）Ｉｔ−−−−ＣＨ−−−−ＣＯＮＨＣｓＨ，ＣＨ２Ｃ）Ｉ（ＮＨ２）ＣＯＪ Ｎ）１．　ＮＨ。

ｐｔ　金属キレート およびＸ−線標識 照射療法用のコバルト フルオレセニルＮＨＣＳＮＩ（（ＣＨｊ）、ＣＨ（ＮＨ，）ＣＯ，Ｈリシルフル オレンセン 蓋光盗鷹 （ＮＯｚ）　ｔｃａＨＪＨ（ＣＨｔ）４ＣＨ（ＮＨ）ＣＯＪビスニトロフェニル リジン 蛍光標識 仄厘孫摩 表　１　（つづき） アビジン−樹脂への複合体結合用または酵素検出用の標識としての互ヱヱｙｇ− −−−−−−−−−−−−−−−一一−−−−−−−−Ｈ，Ｃ＝ＨＣＨ，ＮＨ＋ 　ＣＨ３ＣＨ＝ＣＨＣ）Ｉ＝ＣＨＣＯ，−（結合物質）Ｈ，Ｃ＝ＣＨＣ０ＮＨ（ Ｃｕｔ）。ＣＨ（ＮＨｌ）Ｃｏ、）ｌ　＋　Ｈ，Ｃ＝ＣＨＣ０ＮＨ−（Ｈまたは 結合物質）塁！ユ乏互止血旦王北 リンカ−アーム 本発明によれば、経路１および２のリンカ−アーム変形を選択する理由は、幾つ かある。第１に、カルボキシル末端の環境が、大きく、バルキーな補助物質の接 近を妨げる可能性があることである。

第２に、補助物質が核試薬の側鎖と特異的反応性である官能基を含有しない可能 性があることである。第３に、リンカ−アームが、タンパクの活性保持に寄与し うる、補助物質とタンパクとの間の距離を増加させることである。第４に、タン パクが、その反応性に適した空間的配向をより自由に採りつることである。第５ に、それが、牛でリアー物質の接近により起こるタンパクのフンファメーション の変化を減少または最小にすることである。

リンカ−アームの構造は、柔軟性ないしは半柔軟性鎖の末端に官能基を含む。該 官能基の１つは請求核試薬の側鎖と反応する、前記の特異的反応性の基である。

補助物質上の使用可能な結合基と容易に反応するようにリンカ−アームのその池 の官能基を選択する。勿論、リンカ−アームのこの１対の基は、これらを結合反 応おいて使用する場合、一方が実質的に他を妨害しないように選択する。

両者の合成経路においては、リンカ−アームおよび結合物質を結合させる工程は 請求核試薬との結合反応の前に完了する。タンパクおよび核試薬はこの工程の間 は存在しないので、用いうろこの種の反応は非常に多い。補助物質の結合基がア ルデヒド基である場合、その他の官能基はアミン（シッフ塩基生成物）、イミ７ カルボキシ、カルボキシアルコキシもしくは酸ハライド（アミド生成物）のよう な活性化酸またはエポキシ（置換アミン生成物）であってもよい。

補助物質の結合基がヒドロキシ基である場合、その他の官能基は、活性化酸もし くはエステル（エステル生成物）またはハロアルキル、アルキルトシルもしくは アルキルメシル（エステル生成物）のような活性化アルキルであってもよい。補 助物質の結合基が酸基である場合、他の官能基はアミン（アミド生成物）または 活性化ヒドロキシル基（エステル生成物）であってもよい。補助物質の結合基が 牛レート化剤である場合、その池の官能基は結合金属基であってもよい。反応体 の池の組は、水溶性カルボジイミドおよびアミノ、Ｎ−アシルスクシンイミドお よびアミ／、およびオレフィンおよびジエンならびにパート（３）で述べた経路 ２の主結合反応におけるものを包含する。勿論、反応順序を逆にすることも可能 である。

リンカ−アームの骨格は、柔軟性または半柔軟性路を与えるものであればいずれ でもよい。アミド（ペプチド）、オレフィン、エステル、カーボナート、ウレタ ン、エーテル、グリシジル、エポキシドなどのポリマーおよびオリゴマーが含ま れる。また、アルキレン鎖および炭化水素鎖も含まれる。骨格の長さは、約２〜 約１００原子またはモノマー単位であってもよく、好ましくは約４〜約２０原子 またはモノマー単位である。骨格としては、例えば、ヘキシレニル、デシレニル 、ポリ（４−アミノ酪酸）、ポリ（グリシル）、ポリ（グリンルアラニル）、ポ リ（４−ヒドロキシ酪酸）、ポリラクトン、ポリ（ビスフェノールＡジグリシジ ルエーテル）およびポリアクリルアミドが挙げられる。

タンパク 本発明において結合できるタンパクの型（２残基程度のペプチドを含む）は、反 応性カルボキシル末端を含有するポリペプチド鎖をもつ活性タンパクである。適 当なタンパクとしては、例えば、酵素、Ｒ素阻害剤、ペプチドホルモンを含むホ ルモン、抗体、Ｆ　ａｂ　トランケート抗体、機能タンパク、転写酵素、リーデ ィング・フレーム・タンパク、ＤＮＡ結合性タンパクおよびその他の生物学的に 活性なポリペプチドが挙げられる。

標識に関しては、タンパクとして、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、 抗体の軽鎖および重鎮、抗体フラグメント、抗体のエピトープ部位、キメラ抗体 、ＣＤＲ抗体、ＤＮＡ結合性タンパク、酵素およびリーディング・フレーム・タ ンパクが好ましい。本明細書中に使用する「抗体フラグメント」なる語は、抗体 路の可変領域または定常領域、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）ｔおよびＦｃフラグメ ント、軽および重可変鎖、軽または重抗体鎖のエピトープ領域、該領域および鎖 の組合せ、および個々のフラグメントを同一の抗体または異なる抗体源から単離 した相補性フラグメントと組換えて、例えば、ヒト定常領域を有するキメラ・ヒ ト−マウス抗体または異なる哺乳動物からの抗体由来の超可変セグメントを有す る改変ヒト抗体を形成したものを包含する。一般に、抗体および抗体フラグメン トは、病気、障害または遺伝的機能障害の診断において有用である。また、一般 に、該抗体は、抗原物質の分離技術および検出において有用である。これは、■ ｇＡ、ｒｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＧクラスの免疫タンパクからの哺乳動 物免疫グロブリンタンパクを包含する。

固定化に関しては、タンパクとして、モノクローナルまたはポリクローナル抗体 および酵素が好ましい。

生物活性薬剤に関しては、タンパクとして、モノクローナルまたはポリクローナ ル抗体、ペプチドホルモン、組織適合タンパク、ポリペプチド阻害剤、ペプチド ト半シン、構造タンパク（例、コラーゲン）、球状タンパクおよび繊維状タンパ クが好ましい。

アミノ酸として選択される核試薬 本発明においては、種々のアミノ酸求核試薬を使用することができる。一般に、 これらは、側鎖が前記反応性置換基を含有していてもよい中性、塩基性または酸 性側鎖を有するアルファアミノ酸を包含する。抗体を標識する、固定化支持体に タンパクを結合させるまたはタンパクに生物活性剤を結合させるためのアミノ酸 の選択は、一般に、選択する酵素およびタンパクと調整して行う。ある酵素は特 定のアミノ酸をタンパクのカルボキシル末端に結合させる。例えば、一般に、Ｃ ＰＤ−Ｙは、中性または塩基性側鎖を有するアミノ酸を抗体に結合させる。他の ある酵素は、システィンおよび／またはセリンをそれらの酵素部位で利用し、植 物および微生物源由来であり、酸性側鎖を有するアミノ酸をタンパクに結合させ る。

さらに、該結合反応を行うためには、該アミノ酸求核試薬は特有の反応性を示す 。これにより、補助物質またはそのリンカ−アームとの組合せに対する選択的結 合が可能となる。この特有の性質は、前記のとおり請求核試薬の側鎖の反応性置 換基に起因する。この反応性置換基は、スルフヒドリル、ヒドロキシ、活性化ヒ ドロキシル、ホスホルアミドイル、ヒドラジニル、アミノ、アジジル、エポキシ 、酸、ボロニル、活性化エステル、フェロセンチル、フェロ複合体またはオレフ ィニル基、その混合および他の機能性反応性基であってもよい。

これらのアミノ酸求核試薬の具体例は、モノアミ７モノカルボン酸例エバ、クリ シン、アラニン、バリン、ノルバリン、ロイシン、イソロイシンおよびノルロイ シン（放射活性標識として有用）のような脂肪族アミノ酸、セリン、トレオニン およびホモセリンのようなヒドロキシアミノ酸、メチオニン、シスチン、システ ィンおよびタウリン（リンカ−アームまたは補助物質結合用）のような硫黄含有 アミノ酸、オルニチン、リシンおよびアルギニン（リンカ−アームまたは補助物 質結合用）のようなジアミノモノカルボン酸、およびアスパラギン酸およびグル タミン酸（リンカ−アームまたは補助物質結合用）のようなモノアミノジカルボ ン酸を包含する。また、フェニルアラニンおよびチロシンのような芳香族アミノ 酸、ヒスチジンおよびトリプトファンのような複素環式アミノ酸、および２−７ ミ／−２−ビニル酢酸（リンカ−アームまたは補助物質結合用）のようなオレフ ィン性アミノ酸は、本発明のアミノ酸の群に包含される。

さらに、アミノ酸としては、Ｃ−末端が保護されたものが挙げられる。これは、 例えば、アミド、アニリド、ヒドラジド、エステルなどを包含する。

アミノ酸求核試薬の好ましい群は、脂肪族アミノ酸、ヒドロキシアミノ酸、その 活性化誘導体、ホスホルアミドイルアミノ酸、含硫アミノ酸、ジアミノモノカル ボン酸、活性化エステルアミノ酸、芳香族アミノ酸および複素環式アミノ酸を包 含する。特に好ましい具体ｖＡＩ＋ヨ、セリン、アラニン、フェニルアラニン、 タウリン、リシン、アルギニン、２−アミノペンタ−４−二ノイック酸およびシ スティンを包含する。また、アミドおよびエステルのようなカルボキシル保護ア ミノ酸も包含する。

アミンとして選択された核試薬 アミン求核試薬は、前記骨格に沿って、もう１つ別の反応性置換基を有するＣ、 −Ｃ，。第１級アミンのいずれかを包含する。また、それが補助物質である場合 、それは簡単で非官能性側鎖を有していてもよい。また、アミノ酸求核試薬のデ カルボキシ・アナログであることに加え、該アミン求核試薬は、ヒドロキシル、 スルフヒドリル、活性化ヒドロキシル、エポキシ、アミノ、アジジル、オレフィ ン性、活性化エステル、ヒドラジニル、ホスホルアミドイル、ボロニル、イミニ ル、アミンニル、フェロセンチル、フェロ複合体または池の機能性反応性基で置 換された側鎖を有していてもよい。また、それが補助物質でもある場合、それは 簡単な非官能性側鎖を有して請求核試薬は、前記骨格に沿って、もう１つ別の反 応性置換基を有するＣＩ　Ｃｔ。第１級アミンのいずれかを包含する。該反応性 置換基は、ヒドロキシル、スルフヒドリル、活性化ヒドロキシル、エポキシ、ア ミノ、アジジル、ヒドラジニル、オレフィン性、活性化エステル、ホスホルアミ ドイル、ボロニル、イミニル、アミンニル、フェロセンチル、フェロ複合体、そ の混合または他の機能性反応性基で置換された側鎖を有していてもよい。また、 それが補助物質でもある場合、それは簡単な非官能性側鎖を有していてもよい。

標識 本発明によるタンパクの標識は、通常技術による検出に適した性質を有する種々 の置換基または原子を有する、標識されたアミノ酸を包含する。そのような性質 は、光親和性、磁性、放射活性、蛍光、酵素活性、電子密度（Ｘ線）、核磁気共 鳴、電子スピン共鳴、抗原性および燐光を包含する。例えば、アミノ酸はＩ′Ｃ または３Ｈ原子のいずれかで標識できる。さらに、アミノ酸は公知の蛍光染料、 ポリフィリン、比色染料、反応性基および抗原または分光学的検出、写真による 検出または放射検出の可能な酵素基質で標識してもよい。

イー・ティー・コー（Ｅ、Ｔ、Ｋｏｈ）ら、バイオテクニックス（Ｂ　１ｏｔｅ ｃｈｎｉｑｕｅｓ）、７．５９６以下参照（１９８９）、１９８９年５月８日発 行「ケミカル・アンド・エンジニアリング・ニュース（Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎ ｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｎｅｗｓ）Ｊ　（２５頁以下参照）中、ニス・ボ ーマン（Ｓ、Ｂｏｒ＋＊ａｎ）、ｒバイオフンジニゲート・ケミストリー・アト ラクツ・ブローイング・インタレスト（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙＡｔｔｒａｃｔｓ　Ｇｒｏｗｉｎｇ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）Ｊ参照。その 開示を参考のためにここに挙げる。

酵素 求核試薬をタンパクに力・ノブリングさせる能力を有する酵素は、エキンベブチ ダーゼ、すなわち、ペプチド鎖のカルボキシル末端で特異的に作用する能力を有 する酵素である（前記のジェイ・ニス・フルートン（Ｊ、　Ｓ、　Ｆｒｕｔｏｎ ）　ｒアトパンシーズ・イン・エンザイモロジ−（Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｅ ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）Ｊ　、標題タンパク修飾用の試薬（ＲｅａｇｅｎＬｓ　ｆ ｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　１Ｊｏｄｉｒｉｃａｔｉｏｎ）の章参照）。それは、ペ プチド結合を形成または変換し、使用する反応条件下で比較的安定である。

一般に、カルボキシペプチダーゼ酵素は、ポリペプチド中のＣ−末端ペプチド結 合を開裂することが知られている。それは、Ｐ［（依存性の別の酵素活性を示す 。例えば、カルボキシペプチダーゼＹのｐＨ依存性作用により、ペプチド転移反 応、エステル転移反応および縮合生成物が形成されうる。

本発明における好ましいカルボキシペプチダーゼは、セリンおよびシスティン（ 例、ヒドロキシおよびチオール）カルボキシペプチダーゼを包含する。該セリン およびシスティン酵素のいくつかは、中性または塩基性側鎖を有するアミノ酸お よび脂肪族アミンを、タンパクのカルボキシ末端に結合させる能力を有する。こ れらの酵素としては、Ｐｉｔば、カルボキシペプチダーゼＹ　（ＣＰＤ−Ｙ）、 べ二シロカルボキシベブチダーゼＳ−１およびＳ−２、カルボキシペプチダーゼ ＣおよびＣＮ、麦芽カルボキシペプチダーゼＩおよび１１゜ファセオリン、およ びカルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢおよびメタロプロテア ーゼ（これらは縮合反応のみを行う）が挙げられる。他のセリンカルボキシペプ チダーゼ酵素のいくつかは、酸性側鎖を有するアミノ酸および脂肪族アミンをタ ンパクのカルボキシ末端に結合する能力を有する。

カルボキシペプチダーゼＹは、本発明で使用するのに好ましい酵素である。ＣＰ Ｄ−Ｙは、触媒部位にセリン残基を有する酵母菌からの酵素であり、反応混合物 のｐＨに依存する種々の反応を触媒する能力により特徴づけられる。さらに、Ｃ ＰＤ−Ｙは、迅速にペプチド転移させるため、本発明の標識段階において使用す るのに好ましい酵素である。

該酵素は、安定性および適当な酵素活性を保持または改良するために、固定化ま たは化学的に修飾されてもよいものと理解されるべきである。また、該酵素源は 、酵母、動物、植物または微生物であってもよいものと理解されるべきである。

また、モレキニラー・クローニングの技術により生産される酵素、すなわち、天 然に存在する酵素または突然変異もしくは組換えにより合成的に生産されたもの のいずれをも本発明は包含する。

固定化支持体 本発明において有用な固定化支持体は請求核試薬と支持体の間またはリンカ−ア ームと支持体の間で反応が起こるように官能基付与された無機物質または有機物 質である。前者の反応を用いる場合、該支持体は、前記の特異的反応性基で官能 基付与する。後者の反応を用いる場合、該支持体は、その他の前記官能基用結合 基で官能基付与する。また、この場合は、該反応性置換基はキレート化強磁性基 であってもよい。したがって、固定化支持体は、結合を形成するのに適当な性質 を有する。強磁性基の場合、該支持体は、例えばテフロンで反応媒体に対して不 活性にした磁性ワイヤーであってもよい。ワイヤーに電流を流すと、結合を起こ すのに要する磁性が生じる。また、該系外（すなわち、クロマトグラフ媒体の外 部）の磁石を使用して支持体に対する結合を起こすこともできる。キレート化基 の場合、支持体は固定化金属または他のキレートであってもよい。

該支持体は、多孔性または半身孔性の固体であってもよく、生物学的に不活性か つ不溶性であることが好ましい。支持体として使用してもよい物質としては、繊 維、シート、ミクロスフェア−１粒子、微粒子、ピーズ、ミクロピーズ、小板、 膜などが挙げられる。

本発明の固定化支持体の表面は、好ましくは多孔性である。多孔性表面を宵する 物質、例えば、実質的に球状ポリマー性ピーズまたはアガロースのミクロスフェ ア−を使用すると、タンパクの結合が高密度で広い面積で可能となる。該物質の 大部分の孔の大きさが、タンパクが球内へ移動しうるに十分大きい場合、表面が 多孔性であると考える。支持体の大きさおよび形状は、個々のタンパクおよびそ の意図された使用に応じて、多様に変化してもよい。

該固定化支持体は、多様な物質を包含する。しかしながら、支持体の選択は請求 核試薬および／またはリンカ−アームの選択ならびに固定化タンパクの意図され た使用に依存する。結合反応、求核試薬、特異的反応性基および反応性基はすべ て、前記に矛盾しない。

特に、タンパク上の他のいずれの反応性部位にも優先して請求核試薬が容易に支 持体または支持体−リンカ−アームの組合せに結合するように、支持体を選択す る。例えば、アミノ酸求核試薬としてシスティンを使用して、スルフヒドリル基 を持たないタンパク、例えば抗体に結合させてもよい。該スルフヒドリル部分と 反応するような支持体または支持体−リンカ−アーム特異的反応性基、例えば、 何機水銀化合物のような有機金属基を選択する。また、２−アミノ−へキサ−４ −工／イック酸がアミノ酸求核試薬であってもよく、支持体の特異的反応性基は 、例えば、ディールス・アルダ−反応により、不飽和側鎖と特異的に反応するも のであってもよい。さらに、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドサリ チル酸側鎖のような光親和性標識および結合された物質の特異的反応性基として アリールアミンを選択してもよい。このサリチル酸側鎖は光付加の前にリジンの ニブシロンアミノ基に結合させて、それがタンパクのアミ７基と反応しないよう にすべきである。例えば紫外線下の光反応により、所望の光結合反応が行われる 。さらに、リンカ−アームを用いる場合、支持体上で使用しろる基は、反応性基 のように作用する。該反応性基と結合するように、リンカ−アームのその他の官 能基を適切に選択する。

生物活性剤 本発明は、活性部位から離れた部位で生物活性剤をタンパクに結合させる方法を 包含される。これらの生物活性剤は、所望の反応を行う部位までタンパクにより 運搬され輸送される。

該生物活性（生物学的に活性）剤は、体内で局所的または全身的に作用する生理 学的または薬理学的に活性な物質を包含する。生物学的活性剤としては、ペプチ ド医薬、タンパク医薬、減感伸側、抗原、ワクチン、抗感染剤、抗生物質、抗微 生物剤、抗アレルギー剤、ステロイド抗炎症剤、うっ血除去剤、縮瞳薬、抗コリ ン作動薬、交換神経興奮薬、鎮静薬、催眠薬、精神賦活薬、トランキライザー、 男性ホルモン、エストロゲン、ブロゲスタチオナール剤、体液性剤、プロスタグ ランジン、鎮痛薬、鎮痛薬、抗マラリア剤、抗ヒスタミン剤、心活性薬、非ステ ロイド抗炎症剤、抗パーキンソン病薬、抗高血圧剤、β−アドレナリン作動性遮 断剤、栄撃剤、金属化合物、フッ化ヌクレオチド、ヌクレオチド・アナログ、シ トシン・アラビノシト、５−フルオロウラシルのような抗ガン剤、リシン−Ａ１ 破傷風毒素、アナマイシン、エリスロマイシンのような環状治療用ペプチド、シ クロスポリン、ＡＺＴおよびアルカロイドを包含する。

また、該生物活性薬剤の種々の形態を使用してもよい。非電荷分子、分子錯体、 塩、エーテル、エステルおよびアミドのような形態を包生物活性薬剤に官能基付 与して請求核試薬に直接結合するための特異的反応性基を持たせる。また、該生 物活性薬剤上の適当な利用可能な結合基を、リンカ−アーム上のその他の官能基 と反応させることもできる。好ましくは、この官能基付与は該側内にすでに存在 する基により行う。

ま稙皇Ｘ座望魚伴 主結合反応の条件は、ペプチド開裂よりも、縮合、ペプチド転移反応またはエス テル交換反応を効果的に有利にする。以下の、主結合反応の抗体タンパクへの応 用の議論かられかるように、これらの条件は一般に、ｐ）［、温度、反応物濃度 、酵素濃度およびインキュベージジン時間の制御を包含する。縮合およびペプチ ド転移反応の条件は、塩基性であり、これは加水分解によるペプチド開裂に不利 である。それらは請求核試薬のアミン基がプロトン化されない、すなわち、それ が遊離塩の形態にあるようなｐＨ範囲内である。典型的には、この範囲は約ｐＨ ８，５〜１１である。ペプチド転移反応に優先する縮合の選択は、ペプチド転移 反応は迅速に完了させ、一方、縮合はゆっくり行うというように熱力学的に行う 。特に、ペプチド転移反応は５秒〜１．４時間の間で起こり、一方、縮合は２〜 ２４時間の間で起こる。

エステル交換反応は、加水分解に不利となる適度に酸性な条件下で起こる。好ま しくは、ｐＨは約６未満、約３以上である。また、アルコール求核試薬を高いモ ル濃度とすることが、エステル交換反応には重要である。

反応温度は、酵素の機能する範囲であり、好ましくは約４０″Ｃまでである。

反応物および酵素の濃度は最大効果を与えるように調整する。一般に、容易にわ かる主結合反応速度と一致する、酵素求核試薬およびタンパクの可能な限りの最 大濃度を用いる。好ましくは、タンパクは、約１ｍＭ以下ＬＭ、特に、タンパク が抗体の場合は約１ｍＭ以下の濃度で存在させる請求核試薬または核試薬を含む 中間体は、好ましくは、少なくとも０．０５モラー、特に約０．１〜２モラーの 濃度で存在させる。酵素は、好ましくは約１ｐＭ〜１ｍＭの濃度で存在させる。

タンパクおよび核試薬のインキュページ目ン時間（反応時間）は、縮合には約０ ．２〜１０時間、好ましくは１．０〜８時間、ペプチド転移反応またはエステル 転移反応には、約３０秒〜約１．５時間である。

特定の具体例、抗体タンパク 抗体と核試薬との間の反応のｐＨは、カルボキシペプチダーゼ酵素が示す支配的 な酵素活性を決定する。異なる反応経路は異なるｐＨ値において可能である。縮 合、ペプチド転移またはエステル交換による核試薬の導入は、インキュベーショ ン混合物中において、どの反応経路が支配的であるかに依存する。

中性のｐＨ値では、ペプチド結合の加水分解（ペプチダーゼ活性）が支配的な活 性であると一般的には考えられている。ｐＨが増大するにつれて、加水分解活性 は減少し、縮合およびペプチド転移反応が酵素の顕著な活性になる。ｐＨが核試 薬の遊離塩基形を与えるようなレベル、典型的には約８．５〜１１．０、好まし くは９．５に維持される場合、ペプチド転移および縮合反応は有利であり、前者 は反応速度論的に有利である（すなわち、速く起こる）。典型的には、ペプチド 転移反応は、約３０秒〜約１時間で急速に起こるので、縮合より好ましい。ｐＨ が３．０〜６．０のように低く、請求核試薬のモル濃度が高い場合には、エステ ル交換が有利である。この反応は、タンパクのＣ−末端アミノ酸残基を切断し、 酵素転移によって請求核試薬で置換する。

いくつかの研究において、抗体との縮合によるアミノ酸求核試薬の付加のｐｔ− を依存性が調べられたが、その詳細は以下の実施例の部分に説明されている。こ れらの研究の結果は、図１に描かれているように請求核試薬の導入は、高温で、 かつ高ｐＨ値であるほど高いことを示している。ＰＨ７，５では請求核試薬の導 入は、最初は上昇するが、つづいて導入は減少し、次いで再び上昇することが観 察された。第１の導入は、ペプチド転移によるものである。導入の減少は、導入 された核試薬が不利な加水分解反応によって部分的に失われることによる。第２ の導入は、縮合による核試薬の緩慢な付加によるものである。

インキュベージコン混合物中の反応物の濃度変化に起因する影響についても研究 されたが、その結果は表２に示されている。上で概略的に述べたように、濃度は 、導入の速度および量に直接的な影響を及ぼす。研究の詳細は、以下の実施例の 部分に与えられている。

時間　Ａｂ”　Ｓｅｔ’　ＣＰＤ−Ｙ’　ＳＥＲ／Ａｂ’　備考０（ｈｒｓ）　 （ｍｇ／ｍｌ）　（ＩＭ）　（ＩＭ）比８　４．１　２３０　２０　３．３　抗 体濃度１２．７　２３４　２０　４．７　変化１８．８　２３２　２０　１．２ ９　１２．３　０　２０　０．１６　セリン濃度１２．３　１１０　２０　０． １４　変化１２．３　２２０　２０　１Ｊ４ １２．３　３３０　２０　１．６８ １１．５　１０．５　１２２　５　０．１４　ＣＰＤ−Ｙ濃度１０．８　１１２ 　１１　０．１５　変化１１１３　１２０　１６　１．６ ８　７．７　１１１　２０　２．４　共溶媒なし７．７　１７５　２０　４．２ 　３０％グリセリン２７　１０．５　７８　２０　０．４　Ｆｌ−ｆツクａ−ｔ ｋｌｌ、１　７８　２０　１６．９　Ｆｌ（リフローナル１３７℃、ｐＨ９，５ における標識化インキュベーションの時間。

５インキユベ一シヨン混合物中での測定された濃度（Ａｂ・抗体）。

Ｃ保存溶液の濃度から計算された。

４方法の部分で説明したように測定されたモル比。データは単一の代表的な実験 の結果を示している。各実験はは数回繰り返したが、結果は同様であった。

０実施した測定または標準的な方法からの変化（詳細は本文参照）、。

抗体の重鎖および軽鎖のカルボキン末端間における核試薬（標識アミン）酸の分 布についても研究され、その詳細は実施例４に与えられている。その結果は、標 識アミノ酸は重鎮へ優先的に導入されることを示している。導入された核試薬の 少なくとも約７０％は重鎮上に位置している。一般的に、アミノ酸のし異性体は 、この方法によって導入されるが、導入は実質的に完全に抗体の重鎮のカルボ牛 シ末端で起こる。

抗体の軽鎖は、この反応によって、ある程度は標識されるが、それは抗原結合領 域の近くには位置していない。それゆえ、この相互作用の結果として、抗体の機 能に及ぼす影響が、たとえあるにしても、わずかであることは注目される。

非標識抗体と比較した標識抗体の抗原結合能についても研究された。（実施例５ および６を参照）。抗アスパラギンシンターゼ抗体に関し、その平均結合能は、 各抗体あたり０．６個のセリンを導入した場合の結合能のｔｏｏ、ｔ％であると 測定された。表２のように標識された抗Ｆ１抗体についても、その結合能を測定 するための分析が行われた。その結合能は、非標識対照と比較すると、モノクロ ーナル抗体については１０５％であり、ポリクローナル抗体については１１４％ であることが見い出された。これらの値は、４回の測定の平均である。対照と比 較して標識抗体に見られたわずかな上昇は、実験誤差によるものであり、重要で はない。これら値は、標識が結合した結果きして抗原の結合が著しく低下するよ うなことのないことを示している。

アミノ酸またはアミンの核試薬、あるいは中間体のどれかをタンパクに導入する 場合についても、温度、ｐＨ，および濃度に関する同様の反応条件を確立するこ とができる。

接金２血示 他のアミノ酸を放射活性な標識として使用した場合のい（つかの実験の結果が表 ３に示されている。縮合反応は概略的には実施例９に記載したように実施し、ま た、標識の導入については、実施例３に記載したように分析した。表３に示す抗 体およびアミノ酸の濃度は、実際に測定された濃度を示す。カルボ牛／ペプチダ ーゼＹの濃度は使用した保存溶液の濃度から計算された。標識濃度の値は、抗体 １分子あたりに導入された標識数を、酵素を添加することなく同じ条件下でイン キユベートされた対照の値で割ったもので与えられる。

表３ 求核試薬を結合させる縮合 時間　Ａｂｂ　ｍｍｂ　ＣＰＤ−Ｙｃ　［ｍ／Ａｂｄ　ｍｍ”（ｈｒｓ）　（ｍ ｇ／ｍｌ）　（ｄ）　（ｕＭ）　比　タイプ８．５．８．１　１８８　２０　０ ．５　タウリン８．５　１４．６　４４　２０　１．２　アラニン８．５　１８ ．８　２３２　２０　１．２　セリン’３７℃、ｐＨ９，５における標識化イン キュベーションの時間。

５インキユベ一シヨン混合物中での測定された濃度（Ａｂχ抗体）。

２保存溶液の濃度から計算された。

６モル比。

＠標識化反応に使用したアミノ酸。

標識導入量には、ある程度の定置的な変動が、２通りの実験において観察された が、これは実験誤差の範囲内であった。この変動は、おそら（標識の導入を正確 に評価するのに必要な分離が困難であったことによるものである。高温度の非結 合標識は、本質的に完全に、かつ迅速に、比較的少量の抗体から分難された。し かしながら、時々、ある程度少量の標識が明らかに残留したが、それに起因して 、ａｍ導入の定量的な変動が測定された。このことから、各測定には、カルボキ シペプチダーゼＹを欠く対照試料を含めることが必要であった。付加的な注意と して、抗体ピークの尾を引いている部分は定量に含めなかった。

表３に示されて（くるように、酵素は、セリンとほぼ同じ程度でアラニンを導入 する。また、この酵素は、通常はタンパクに見い出されないアミノ酸であるタウ リンを導入することもわかった。しかしながら、タウリンの導入は、遊離のアミ ノ酸の溶解度によって、多少制限されることが見い出された。

抗体を核試薬に結合する方法は、抗原が結合する能力を失わせることなく、抗体 を固定化、標識化または増大化する手段を泥供する。これは、縮合、ペプチド転 移またはエステル交換による請求核試薬の抗体との主カップリング反応によるも のである。

同様の実験パラメータを用いて、種々の核試薬を、他の機能性タンパクに結合さ せることができる。しかしながら、アミノ酸またはアミンの核試薬、酵素、タン パク、および生物活性薬剤、標識または固定化支持体は、一般的には、特異的な 結合を向上させ、非特異的な結合を低減させるように選択される。このようにし て、生物活性°薬剤、標識または固定化支持体を、タンパクに、その機能性部位 から遠く離れて結合させることができる。

本発明は、以下の実施例によって、さらに特徴付けられる。これらの実施例は、 上記の説明に記載されている本発明の範囲を限定することを意味しない。本発明 の概念の範囲内における変化は、当業者に明らかである。

実ｍ例１〜８は、縮合、ペプチド転移およびエステル交換の襟章的な方法である 。実施例９は縮合を例示する。実施例１０および１１はペプチド転移を例示する 。実施例１２および１３はエステル交換を例示する。

抗アスパラギンシンテクーゼモノクローナル抗体および抗−ＦＩＡＴＰａｓｅモ ノクローナルおよびポリクローナル抗体は、実験室スト・１りから得た。モノク ローナル抗体ストックは、マウス腹水腫瘍液の形態で得、ポリクローナル抗体ス トックは、ウサギ血清から得た。いずれの供給源由来の抗体も、固体硫酸アンモ ニウムの添加によって、飽和レベル５０％の濃度まで、精製した。沈殿したタン パクを遠心分離によって収集し、微量の１０貢Ｍ）リス−Ｈ（Ｊ［）リス、トリ ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］　（ｐＨ７，５）に溶解した。次いで、 ５０％飽和レベルに達するまで、該調製物を第２の硫酸アンモニウム処理に付し た。次いで、沈殿物を遠心分離によって集めた。精製した抗体を微量の水に溶解 し、４℃で１８〜２４時間、ｌｏ履ＭＩ！炭酸ナトリウムに対して透析した。こ の透析工程は、カルボキシペプチダーゼＹの活性を抑制するのが判明した残留硫 酸アンモニウムを除去するために必要であった。精製した抗体を、必要になるま で、−２０℃で複数のアリクトノトにして貯蔵した。

他に特記しない限り、以下の各実施例でこれら３つの抗体を使用した。ここで使 用する場合の「抗体」なる語は、抗アスパラギンシンテターゼモノクローナル抗 体、および抗ＦＩＡＴＰａｓｅモノおよびポリクローナル抗体を意味する。

まず、′Ｈ−セリンとしてセリンを使用し、後の実験では１４（、−セリンを使 用した。使用した池のアミノ酸は、全て、′Ｈ−アミノ酸であった。放射性アミ ノ酸はアマ−ジャム（Ａ＊ｅｒｓｈ緘：イリノイ州アーリントン・ハイツ）から 購入した。非［Ｘｆｉセリンはフル力（Ｆｌｕｋａ；ニニーヨーク州ロンコノマ ）から入手した。放射性アミノ酸を非［識アミノ酸で１ミリモル当たり０．５〜 ２ｘＣｉの比放射能に希釈した。次いで、希釈したアミノ酸を、−２０℃でエタ ノールによる沈殿を繰り返すことによって精製した。これらの沈殿工程は、アミ ノ酸の抗体への非特異的な結合を減少させるのに必要であった。

該アミノ酸を、４°Ｃで水溶液として貯蔵した。

希釈し精製したアミノ酸の比放射能を以下のとおり測定し、その後の標識一体化 の計算に使用した。クエンチされた検出可能な放射能を、標識一体化のｆｆ１ｌ ｌ定で使用したものと同一の条件下で測定した。

既知の容量のアミノ酸溶液をＯ，１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６，８）テ１．Ｏ ａＲに希釈した。この希釈した試料を、３ａ　７０ｂシンチレ−７−Ｉン液（リ サーチ・プロダクツ（Ｒａｓａａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、イリノイ州エル ググローブ）Ｉｏ、０ｚ＋７を用いて、べ、クマン（Ｂ　ｅｃｋｍａｎ）　ＬＳ −１００液（本ンンチレーンコンカウンター（べ、クマン・インス１゛、７　Ａ メノソ（Ｂｅｃｋｍａｎ　ｌ　ｎｓｔｒｕｍａｎＬｓ）、カリフォルニーｒ州フ ラートン）で計数した。ニンヒドリン・γノセイによるアミ７基のア。

セイによって既知の容量について、アミノ酸ストＩり溶液のアミノミＬａ＋髪を ｇ同定した。ニス・ムーア（Ｓ　、　Ｍ　ｏｏｒｅ）ら、ジャーナル・オブ・バ イオリ／カル・ケミストリー（Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）、１５７ ．３８７（１９４８）！照。０°Ｃで水にグリノンを溶解して飽和溶液を得るこ とによって、このγノセイのためのｔｌＪ溶液を調製した。該液体を未溶解の固 体グリノンと分離し、室温に占め、標準として使用した。該標準の濃度は、１． ８９Ｍであるとみなされた。ジェイ・ビー・ダルトン（Ｊ、Ｂ、ＤａｌＬｏｎ） ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、 　Ｃｈｅｍ、　）、１０３．５４９（１９３３）努照。これらの測定から、ＣＰ Ｍ／ｌリモルのクエンチされた値を算出し、その後の計算に使用した。

ゲル濾過ＨＰＬＣによって非結合アミノ酸を抗体から分離した。

インキユベー７−ン後の反応混合物の２０μＱＩＸ事４をＧ　Ｉ）　Ｃ−３００ ゲル濾過カラム（ジンクロム（Ｓ　ｙｎｃｈｒｏｍ）、インディアナ州リンデノ ）に適用し、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６，８）で溶離した。このために 使用した）（ＰＬＣ系は、複式ポンプグラジェント系およびケムリサーチ（Ｃｈ ｅｍＲｅｓｅａｒｃｈ　；　［Ｓ　ＣＯ；　不）′ラスカ州すンカーン）によっ て！２）？ｉされた可変波長ＵＶモニターからなる。抗体に対応する２８０ｎｍ でモニターされた吸光度ピークを集めた。抗体から非結合アミノ酸を確実に完全 に除去するために、吸光度ピークの最初の４分の３だけを集めた。集めた抗体溶 液を溶離綬衛液でｔＺＱに希釈した。

標準吸光度を１４６吸光度ユニット／ｍｇとみなし、２８Ｏｎ口の吸光度を測定 することによって、集めた溶液中の抗体濃度を測定した。３ａ７Ｏｂｉ＆体シン チレーシ菖ン液１０ｘｆ２を使用して、集めた抗体溶液ｌ、ＯｘＱを計数するこ とによって、一体化したアミノ酸を測定（２だ。上記アミノ酸についての修正し た比放射能を使用して、−（、ト化（、た１ＰＸａの量を算出した。分子量を１ ５０，０００とみなして、該抗体のモル濃度を算出した。アイ・ロイノド（ｒ、 ＲｏｉＬｔ）ら、イムノロノー（ｌ　ａｕｏｕｎｏｌｏｇｙ）、シー・ブイ・モ スバイ・カンパニー（Ｃ、Ｖ　、　Ｍｏ５ｂｙ　Ｃｏ、　）、セントルイス、第 ５３頁（１９８５）ｔＪ照。

報告された標識一体化は、カルボキシペプチダーゼＹ含有試料および不吉試料に ついて得られた値の差である。悸識一体化の結果は、第２図に関連する前記の詳 細な具体例の項で検討されている。

去腫酊 ■庄班盆墓 この実施例は、前記の詳細な具体例の項で検討されたような抗体の重鎮に結合し ている核試薬の特異性を示す。

抗体の重鎮および軽鎖の分離は、標識および対照（非標識）の両抗体で行われる 。ｉｆ試料を上記のようにｔＷ議した。インキュベーンジンの後、該抗体を硫酸 アンモニウムの添加によって飽和度５０％の濃度に沈殿させる。該沈殿物を遠心 分離によって集め、該ベレットを、ｌｏｏｘＭＶｔｔ酸ナトリウム、２Ｍ尿素、 ２％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１％Ｂ−メルカプトエタノールおよび ２５ｉ＋Ｍ４−モルホリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ）からなる変性ｕｉｌｉ液 （ｐＨ６゜８）に溶解した。該試料をｌＯＯｏＣで５分間インキュベートし、タ ンパクを確実に完全に変性させた。抗体鎖を、該変性緩１１液で平衡化したアル テックス（Ａｌｔａｘ）　ＴＳ　Ｋ　−１２５カラム（バイオラッド（Ｂ　１ｏ ｒａｄ）、カリフォルニア州すノテモンド）を用いてゲル濾過ＨＰＬＣによって 分離した。該流出液を２８ｏｒＩＩＩ＋でモニターした。抗体の重鎮および軽鎖 に相当するピークを別々に集めた。集めた試料を変性緩衝液で１．２１１２に希 釈した。

３ａ７０ｂ液体シンチレーシ璽ン液１０ｍＱで各試料り、ＯｘＱを計数すること によって、各鎖中に一体化されたアミノ酸の量を測定した。変性緩衝液成分の妨 害のために、上記で使用した方法または他の一般的に使用される方法によって各 試料中のタンパクの量は測定できなかった。このために開発されたアッセイは、 アッセイしようとする試料５０μＱに３０％アクリルアミド、０．８％バイオア クリルアミド２５μＱを添加することからなっていた。１０％過硫酸アンモニウ ム１．５μρおよびＮ、　Ｎ、　Ｎ’、　Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン １μｅの添加によって混合物を重合した。１０％トリクロロ酢酸２１１ＩＱで２ 回、１０％酢酸２峠で３回および５％メタノール２ｘＱで３回、７５％酢酸で洗 浄して、固化した試料から妨害している緩衝液成分を分離した。タンパクをクマ シー・ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂ　１ｕｅ）　Ｒ−２５０（）ミッション ・オン・バイオロジカル・スティング・ナンバー（Ｃｏｓａ＋１５ｇ１ｏｎ　ｏ ｎ　Ｂ　ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓ　ｔａｉｎｓＮｕｍｂｅｒ）４２６６０）で染 色した。３０％メタノール、７．５％酢酸で広範囲に洗浄して非結合染料を除去 した後、結合した染料を、ＳＤＳ、重炭酸ナトリウムおよびメタノールを用いた インキュページ目ンによって溶離した。溶離した染料の吸光度を測定し、同一方 法でア・７セイした標準タンパク溶液と比較して試料のタンパク含有量を測定し た。

測定したタンパク含有量および各鎖に対するアミノ酸一体化を使用して、ポリペ プチド鎖当たりの標識一体化を計算した。これらの計算では、重鎮および軽鎖の 分子量を各々５０，０００および２５゜ＯｏＯとした。アイ・ロイノド（ｒ　、 　Ｒｏｉｔｔ）ら、上記文献参照。得られたデータ（示されない）に基づいた結 果は、前記の詳細な具体例の項で検討され、重鎖牛歩なくとも７０％の一体化を 示す。

実施例Ｓ 抗アスパラギンシンテターゼ抗体免疫沈降法本実施例は、前記の詳細な具体例の 項で検討されたように請求核試薬の結合が抗体の抗原結合能力に影響を及ぼさな いということを示す。

上記の標識された抗体および対照抗体を免疫沈降法によってアッセイして、それ らの抗原を結合する能力を測定した。該インキュベージコン混合物のアリクオツ ドをアッセイして、標識一体化の程度を測定した。残りのインキュベーション混 合物（８０μＱ）をアスパラギンシンテターゼを含有している膵臓抽出液４２０ μｅに添加した。シー・エイ・ルーア−（Ｃ，Ａ、　Ｌｕｅｈｒ）ら、ジャーナ ル・オン・バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・メリンス（Ｊ　、　Ｂ 　ｉｏｃｈｅｍＢ　１ｏｐｈｙｓ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ）、洛、１５１（１９８０ ）参照。該混合物のｐＨを７．５に調整した。粗タンパク八抽出液（シグマ・ケ ミカル・カンパニー（Ｓ　ｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）、ミズーリ州 セントルイス）を、該溶液を遠心分離し、５０１１Ｍトリス−ＨＣｆ２（ｐＨ７ ，５）中に該ベレットを懸濁することによって２回洗浄した。この洗浄した抽出 液を、その最初の容量の５倍の量の５０ｘＭトリスーＨＣ＋２（ｐＨ７，５）中 に懸濁した。３７°Ｃで１８時間、膵臓抽出液を用いて抗体をインキニべ一トし た後、粗製の洗浄したタンパクＡ抽出液１ｇＩＱを添加し、さらに２時間インキ ュページせンを続けた。次いで、該混合物を遠心分離して、タンパク入／抗体／ アスパラギンシンテターゼ腹合物を集めた。該ベレットを５０　ｘＭ　トリス− ＨＣｌ２（ｐＨ７，５）で２回洗浄し、次イテ、１００１Ｍ　ト’）Ｘ−ＨＣＱ 、１０ｇＭ　ＭｇＣ１２ｔ、１０ｚＭＡＴＰおよび１０１Ｍグルタミンを含有し ているアッセイ溶液（ｐＨ７、５）２００μｇを用いて２時間インキュベートし た。固体物質を遠心分離によって除去し、アミノ酸分析のために、得られた溶液 を−２０℃で貯蔵した。

アミノ酸分析は、Ｂ−メルカプトエタノールおよび。−フタルジアルデヒドによ るデリビティゼーシ震ン（ｄｅｒｉｖｉｔｉｚａｔｉｏｎ）後、アミ／酸（７） ＨＰＬＣ分離によって行われた。ニス・ユニザン（Ｓ、Ｕｎｎｉ〜ｔｈａｎ）ら 、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａ　ｎａｌ、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　 ）、Ｌジ且、１９５（１９８４）参照。使用したＨＰＬＣ系は、デュポン（Ｄ　 ｕｐｏｎｔ）モデル８３６蛍光検出器（イー・アイ・デュポン（Ｅ、［。

Ｄｕｐｏｎｔ）、イリノイ州デス・ブレインズ）および積分器（スペクトラ−フ ィジクス（Ｓ　ｐｅｃｔｒａ−Ｐ　ｈｙｓｉｃｓ）、カリフォルニア州すンタ・ クララ）を装着した複式ポンプグラジェントベックマン（Ｂ　ｅｃｋｍａｎ）　 ＨＰＬＣ系からなる。使用したカラムはレイニン・マイクロソルブ（Ｒａｉｎｉ ｎ　Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ）　Ｃ１逆相カラム（レイニン・インストウルメンツ（ Ｒａｉｎｉｎ　［ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、マサチューセノツ州つ　／　Ｘｌ− ン）であった。抗体の結合能力は、タンパク入／抗体複合物に結合したアスパラ ギンシンテターゼによるグルタミンのグルタメートへの加水分解の測定によって アッセイされた。結合した酵素の活性は、グルタメートおよびグルタミンビーク の積分面積の比によって測定された。非標識対照に対する標識抗体についてのパ ーセント活性は、これらのＧ　ｌ　ｕ／　Ｇ　ｌ　ｎ比から算出された。該結果 は、一般に、結合した核試薬を有する抗体の能力は、遊離抗体と同一であるとい うことを示す。第３０頁および第３１頁の検討を参照。

実施例６ 抗ＦＩＡＴＰａｇｅ抗体免疫沈降法 本実施例は、実施例６に示された同一の効果を示す。

上記の標識されたモノクローナルおよびポリクローナル抗体および非標識対照を 共に免疫沈降法によってアッセイして、それらの抗原に結合する能力を測定した 。インキュベーション混合物のアリクオツドをアッセイし、標識一体化の程度を 測定した。残りのインキュベーション混合物（８０μｅ）を、精製したウシＦｌ −ＡＴＰａｓｅの０゜２ｕ／ｘＱ溶液４２０μｇに添加した。エイ・エフ・／ウ ルズ（Ａ、Ｆ。

Ｋ　ｎｏｗｌｅｓ）ら、ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ 　、　Ｂ　ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）、２４７．６６１７（１９７２）参照。該 反応混合物のｐＨを７．５に調整した。粗タンパクＡ抽出液を、該溶液を遠心分 離し、５ＱｘＭＩ−リス−ＨＣｌ２（ｐＨ７，５）中に該ペレットを懸濁するこ とによって２回洗浄した。この洗浄した抽出液をその初期の容量の５倍の量の５ ＱｘＭトリスーＨＣ＋２（ｐＨ７，５）に懸濁した。３７°Ｃで１８時間、膵臓 抽出液を用いて抗体をインキユベートした後、粗製の洗浄したタンパク八抽出液 １１（ｌを添加し、さらに２時間インキュベーションを続けた。次いで、該混合 物を遠心分離して、タンパク入／抗体／　Ｆ　１−ＡＴ　Ｐａ５ｅｆｉ合体を集 めた。該ベレ、２トを５０Ｊ！ＭトリスーＨＣρ（ｐＨ７，５）で２回洗浄し、 次いで、５０麓ＭＮ−［トリス（ヒドロキシメチル）−メチルコグリシン（トリ シン）、５１Ｍ　ＭｇＣ（ｂおよび５ｚＭＡＴＰからなるアッセイ溶液（ｐＨ８ ，０）１００μＱを用いて２時間インキ１ベートした。該固体物質を遠心分離に よって除去し、得られた溶液を分析のために一２０℃で貯蔵した。さらに、抗体 を欠いた対照を同様に処理した。

Ａ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅ活性は、放出したリン酸塩の測定によって測定した。

ニス・ユニザン（Ｓ　、　Ｕｎｎｉｔｈａｎ）ら、上記文献嘗照。結合した酵素 は、抗体を欠いた対照によって与えられた値以上の無機リン酸塩の生産によって 評価した。標識抗体対非標識抗体の結合能力の割合は、非標識活性に対する標識 活性の比として算出された。結果は、第３０頁および第３１頁の詳細な具体例の 項で検討される。

実施例７ 標識抗体の安定性 種々の貯蔵条件下での一体化標識の安定性も測定した。この実験のだめに、イン キュベーション混合物のアリクオツドについて、標識一体化をアッセイした。残 りの試料中の抗体を硫酸アンモニウムで沈殿し、水に溶解した。アリクオツドを ４℃で貯蔵し、もう一方を一２０℃で８日間貯蔵した。貯蔵期間後、これらの試 料中の一体化標識を測定し、最初の試料と比較した。結果を第４表に示す。

ｔ＝ｏ　Ｏ，５５１００ ８日、４℃　０．６３　１１６ ８日、−２０℃　０．４９　８８ ″３７℃およびｐＨ９，５での標識インキュベーション後の貯蔵条件。

１方法の項に記載したように測定したモル比、２回の測定の平均。

′標識インキュベージ１ン後にインキュベートしなかった場合と比較した活性の 平均増加または減少パーセント。

一体化の特異性 一体化が酵素による触媒作用に依存することを証明するため、種々の濃度のＬ− セリンおよびり、Ｌ−セリンを標準的な方法によって一体化した。これらの結果 を第５表に示す。Ｄ、Ｌ−セリンの一体化は該Ｄルーセリンの濃度の半分のし一 セリンの一体化に匹敵する。Ｌ−異性体だけの一体化によって説明され得るなら ば。この立体特異性は、他の条件下でカルボキシペプチダーゼＹについて示され ていた。アール・フヤシ（Ｒ，Ｈｙａｓｈｉ）ら、ジャーナル・オン・バイオケ ミストリー（Ｊ　、　Ｂ　１ｏｃｈｅｔ　）、ニア、６９（１９７５）参照。

これらの条件下で起こり得る非特異的吸収または結合の他の非酵素的手段は、両 翼性体を一体化することが予想されるであろう。

８　７．９１９Ｂ　２０　１．７　Ｌ−セリン１０．１　１２６　２０　０．９ 　Ｌ−セリン１１３７℃、ＰＨ９，５での標識インキュベーシヨンの時間。

ゝインキ二ベーシ１ン混合物中の測定濃度。

０貯蔵溶液の濃度から算出。

６方法の項の記載に従って測定したモル比。

＠使用した標識。

実施例９ 抗体標識のための標準的な条件（濃縮）特記しない限り、全ての操作について、 濃縮による標識一体化のための以下の条件および方法を使用した。抗体およびア ミノ酸スト・ｌり溶液の混合物を作製し、所望の濃度に水で希釈した。この溶液 のｐＨをｐＨ試験紙（フィ、シャー・ケミカル（Ｆ　１ｓｈｅｒ　Ｃｈｅａ＋１ ｃａｌ）、ニューシャーシー州スプリングフィールド）を用いて測定し、０．５ Ｍ水酸化ナトリウムで９．５に調整した。この溶液から４μＱを取り出し、Ｏ， １Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６，８）で１．ｏｘＱに希釈した。

この溶液の吸光度を、ベックマン（Ｂ　ｅｃｋａ＋ａｎ）　Ｄ　Ｕ　−５０分光 光度計を用いて２８０ｎｍで測定した。標準吸光度を抗体Ｌ１当たり１．４６吸 光度ユニットと仮定して、溶液中の抗体の濃度を計算した。エイ・グツド（Ａ、 Ｇｏｏｄ）ら、セレクテッド・メソッズ・イン・セルーラー・イムノロジー（Ｓ 　ｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉ　＋＋ｕ＋＋ ｕｎｏｌｏｇｙ）、ミシェル−７７ド・シイジ（Ｍｆｓｈｅｌｌ　＆　Ｓｈｉｉ ｇｉ）！ｉ、ダブリュ・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー（Ｗ、　Ｈ， ＦｒｅｅＩｌａｎ　＆Ｃｏ、）、サンフランシスコ、第２８４頁（１９８０）！ 照。インキニベーシ１ン混合物中のアミノ酸濃度を、ざらに０，１Ｍリン酸ナト リウム （ｐＨ６，８）で１ｏｚＱに希釈した後に希釈した混合物の少量試料を計数する ことによって測定した。アミノ酸濃度は、予め測定した修正比放射能を用い、両 希釈および下記５％希釈について修正し、存在する数から計算した。

残りの非希釈混合物を２等分した。これらの部分の一方に、混合物１００μｅ当 たりカルボキシペプチダーゼＹ（親和性精製した、Ｅ。

Ｃ，３，４，ｌ　６．４、エンドプロテイナーゼ汚染がない）ストック溶ｉ（［ ２４，：３Ｍｇ／１Ｑ）５μＱを添加した。他方の部分を対照とし、水で同様に 希釈した。これら２つの溶液を調製した後、それらを３７℃水浴中で約８時間イ ンキュベートした。次いで、該試料を水浴から取り出し、すぐに分析するかまた は冷凍し、できる限り早く使用した。標識の濃度の変化の結果は前記第２表に示 されており、それに関連して検討されている。

本実施例は、テトラペプチド　ベンゾイル−Ｔ　ｈｒ　−Ｖ　ａｌ　−Ｓ　ｅｒ 　−５ｅｒからベンゾイル−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−（１４Ｃ）Ｓｅｔの合成 を示す。約５〜１０ＲＭのベンゾイル−Ｔｈｒ−Ｖａｔ−３ｅｒ−３ｅｒ　（Ｂ ＴＶＳＳ）を、１ｘＭＥＤＴＡおよび０．２５Ｍ　ｌ４−Ｃ−セリンを含有して いる５０ｚＭ炭酸ナトリウムＩ！衝液（ｐＨ９，５）２ｍ１２に溶解し得る。反 応は５μＭカルボ牛ジペプチダーゼＹＲ素の添加によって開始され得る。予め設 定した時間間隔で、アリクオｙトｏ、２ｘＱを取り出し、アセトニトリル０．２ ｘ（ｌで希釈し、次いで、０．１２Ｍ酢酸０．１ｘＱを添加することによって、 反応をサンプリングし得る。

次いで、該試料を、２つの溶媒からなる直線グラジェントで展開された逆相Ｃ− １８カラムを用いて、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に付し得る。第 １溶媒（Ａ）は、ｌｏ＊Ｍ酢酸ナトリウム９５％、５％アセトニトリルｐＨ４， ５であり得、第２（Ｂ）は６０％アセトニトリルであり得る。グラジェントは、 ３０分間かけて展開され得、溶媒ＡおよびＢをＡ１部および８０部の割合で混合 することによって開始され得、Ａ４０部および８６０部で終わる。流速は、１　 、　Ｏｍ９１分に維持され得る。ペプチドが溶出し、セリンおよびＢＴＶＳ（Ｂ ＴＶＳＳを加水分解した）を含まないであろう。

ＨＰＬＣ画分の分離アミノ酸分析は、ペプチドが各々１個のＴ　ｈｒ。

Ｖａｌ残基および２個のＳｅｒ残基を含有することを示すであろう。アミノ酸分 析によって回収されたセリンおよびペプチドのそれの両方の比放射能は、モル基 礎で同一であろう。

実施例１１ テトラペプチドモデルによるペプチド転移本実施例は、テトラペプチド　ベンゾ イル−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　ｌａ　−Ｐ　ｒｏ　−Ａｌａからベンゾイル−Ｇｌｙ− Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＮＨｘの合成を示す。フタル酸ジメチル（Ｄ　Ｍ　Ｐ 　）中１００ｍＭのベンゾイル−Ｇ　ｌｙ　−Ａｌａ　Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＯＨ（ ＢＧＡＰＡ）約１０ｔｔＱを、５１ＭＥＤＴＡ（ｐＨ６，５）中７０ｍＭＬ−フ ェニルアラニンアミド１９．１１μ９／μＱと化合し得る。反応は、２２ｕｌｘ ＱカルボキシペプチダーゼＹ酵素（ＣＰＤ−Ｙ）１５μＱの添加によって開始さ れ得る。予め設定された時間間隔で、アリクｔット１ｏμＱを取り出し、アセト ニトリル２００μｇで希釈することによって、該反応はサンプリングされ得る。

アリクオｙ）は、以下の大体の時間二時間０（酵素を添加する前）、１分、５分 、１ａ分、２０分、４０分、１時間、２時間および３時間で採取し得る。

次いで、該試料を、２つの溶媒からなる直線グラジェントで展開された逆相Ｃ− １８カラムを用いて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に付した。第１溶 媒（Ａ）は、５０１Ｍリン酸トリエチルアミベＴＥＡＰ）（ｐＨ３）９０％およ び１０％アセトニトリルであり得、第２溶媒（Ｂ）は、８０％アセトニトリルお よび２０％ｍｔｓＡテあり得る。ＴＥＡＰは、ｐＨ３に希トリエチルアミンで５ ０１Ｍリン酸を滴定することによって調製し得る。グラジェントは、５分間かけ て展開され、溶媒ＡおよびＢをＡ１部および８０部の割合で混合することによっ て開始され得、Ａ４０部および８６０部で終わる。

流速は、１，５耐／分に維持され得る。ＢＧＡＰＡは、ＢＧＡＰＰ−アミド生成 物および遊離アラニンの付随的出現によって消滅するであろう。ペプチドが溶出 し、フェニルアラニンアミド、ＢＧＡＰＡおよびＡｌａを含まないであろう。

ＨＰＬＣ画分の分離アミノ酸分析は、ペプチドが各々１個のベンゾイル、Ｇｌｙ 、　Ａｌａ、　Ｐｒｏ、およびＰｈｅ残基を含有していることを示すであろう。

アミノ酸分析によって回収されたフェニルアラニンアミドおよびペプチド中のフ ェニルアラニンアミドの両方の比放射能は、モル基礎で同一であろう。

実施例１２ 抗アスパラギンシンテターゼモノクローナル抗体によるペプチド転移 本実施例は、抗アスパラギンシンテターゼモノクローナル抗体（Ｍａｂ）からＣ −Ｎｏｒ−Ｃ−（”Ｃ）Ｓｅｒ抗アスパラギンシンテターゼモノクローナル抗体 （Ｎｏｒ−Ｍａｂ　−Ｓ　ｅｒ”）の合成を示す。約０．２ａＭ　Ｍａｂを、１ ｍＭＥＤＴＡおよび０．２５Ｍ　ｌ４−Ｃ−セリンを含有している５０部Ｍ炭酸 ナトリウム緩衝液（ＧＩＨ９，５）２ＪＩ＋２に溶解し得る。５μＭカルボ牛ジ ペプチダーゼＹ酵素の添加によって、該反応を開始し得る。予め設定された時間 間隔で、アリクｔ７ト０゜２ｚ（ｌを取り出し、アセトニトリル０．２ａ（ｌで 希釈し、次いで、０．１２Ｍ酢ＭＯ，Ｌｚａを添加することによって該反応をサ ンプリングし得る。

次いで、該試料を、２つの溶媒からなる直線グラジェントで展開された逆相Ｃ− １８カラムを用いて高速液体クロマトグラフィーに付し得る。第１溶媒（Ａ）は 、１０１Ｍ酢酸ナトリウム９５％、５％アセトニトリルＰＨ４，５であり得、第 ２（Ｂ）は、６０％アセトニトリルであり得る。グラジェントは３０分間かけて 展開され得、溶媒ＡおよびＢをＡ１部および８０部の割合で混合することによっ て開始され得、Ａ４０部および８６０部で終わる。流速はｌ　、　Ｏ＊Ｑ／分に 維持され得る。Ｎｏｒ−Ｍａｂ　−Ｓ　ｅｔが溶出し、セリンおよびＭａｂを含 まないであろう。分離アミノ酸分析は、Ｎｏｒ−Ｍａｂ　−Ｓ　ｅｔ”が１個の Ｓｅｒ残基を含有していることを示すであろう。アミノ酸分析によって回収され たセリンおよびＮｏｒ−Ｍａｂ−Ｓｅｒ”のそれの両方の比放射能は、モル基礎 で同一であろう。

ス皇画ユＪ テトラペプチドモデルを用いるエステル交換本実施例は、ベンゾイル−Ｔ　ｈｒ 　−Ｖ　ａｌ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｓ　ｅｒからベンゾイル−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｓｅ ｒ（１４Ｃ）ＯＭｅの合成を示す。約５〜１０ＲＭベンゾイル−Ｔｈｒ−Ｖａｌ −３ｅｒ−３ｅｒ　（ＢＴＶＳ　Ｓ）を、ＩＪＩＩＭＥＤＴＡおよび０．２５Ｍ ”Ｃ−メタ／−ル（ＭｅＯＨ）を含有している５０部Ｍリン酸ナトリウム／リン 酸緩衝液（ｐＨ３，５）２ｉ１２に溶解し得る。反応は、５μＭカルボキシペプ チダーゼＹ酵素の添加によって開始され得る。予め設定された時間間隔で、アリ クオｙ）０゜２１を取り出し、アセトニトリル０．２ｚＱで希釈し、次いで、０ ．１２Ｍ酢酸０　１ｘＱを添加することによって該反応をサンプリングし得る。

次いで、該試料を、２つの溶媒からなる直線グラジェントで展開された逆相Ｃ− １８カラムを用いる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に付し得る。第１ 溶媒（Ａ）は１０１Ｍ酢酸ナトリウム９５％、５％アセトニトリルＰＨ４，５で あり得、第２（Ｂ）は６０％アセトニトリルであり得る。グラジェントは、３０ 分間かけて展開され得、溶媒ＡおよびＢをＡ１部および８０部の割合で混合する ことによって開始され得、Ａ４０部および８６０部で終わる。流速は１゜０肩Ｑ ／分に維持され得る。

ペプチドが溶出し、メタノールおよびＢＴＶＳ（ＢＴＶＳＳを加水分解した）を 含まないであろう。分離アミノ酸分析は、ペプチドが各々１個のＴ　ｈｒ、　Ｖ 　ａｔおよびＳｅｒメチルエステルを含有することを示すであろう。アミノ酸分 析によって回収されたセリンメチルエステルおよびペプチドのそれの両方の比放 射能は、モル基礎で同−抗アスパラギンシンテターゼモノクローナル抗体を使用 するエステ酉ヌ迭 本実施例は、抗アスパラギンシンテターゼモノクローナル抗体（Ｍａｂ）からＩ ４ＣメチルＣ−ｎｏｒ−抗アスパラギンシンテターゼモノクローナル抗体エステ ル（！メチルーＮｏｒ−Ｍａｂ）の合成ヲ示ス。約０．２部Ｍ　Ｍａｂを、１部 ＭＥＤＴＡおよび０．２５Ｍ　Ｉ４−Ｃ−メタノールを含有している５０＋＋＋ Ｍリン酸ナトリウム／リン酸緩衝液（ｐＨ３，５）２．ｗＩ２に溶解し得る。反 応は、５μＭカルボ牛ジペプチダーゼＹ酵素の添加によって開始され得る。予め 設定した時間間隔で、アリクオソト０．２１１２を取り出し、アセトニトリル０ ．２１１２で希釈し、次いで、Ｏ，１２Ｍ酢酸０，１ｚＱを添加することによっ て該反応をサンプリングし得る。

次いで、該試料を、２つの溶媒からなる直線グラジェントで展開される逆相Ｃ− １８カラムを用いる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に付し得る。第１ 溶媒（Ａ）は、１０１Ｍ酢酸ナトリウム９５％、５％アセトニトリルｐＨ４，５ であり得、第２（Ｂ）は６０％アセトニトリルであり得る。グラジェントは、３ ０分間かけて展開され得、溶媒ＡおよびＢをＡ１部および８０部の割合で混合す ることによって開始され得、Ａ４０部および８６０部で終わる。流速は１゜０１ 部分に維持され得る。宜メチル−Ｎｏｒ−Ｍａｂが溶出し、メチルおよびＮ　ｏ ｒ　−Ｍ　ａｂ（Ｍ　ａｂを加水分解した）を含まないであろう。分離アミノ酸 分析は、寡メチル−Ｎｏｒ−Ｍａｂが１個のメチルセリンエステル残基を含有す ることを示すであろう。アミノ酸分析によって回収されたメチルセリンエステル およびＸメチル−Ｎｏｒ−Ｍａｂのそれの両方の比放射能はモル基礎で同一であ ろう。

時間 時間 国際調査報告 １＋ｌ＋ＭｓｂｅＭＡｌ　ａｅｅｌｌｅ＆ＩＩＭ　Ｎ。ＰＣＴ／ＵＳ　９０１０ ３６８２国際調査報告 、ＰＣ丁／ＬＩＳ９０１Ｇ３６８２ ＳＡ　３８３１３

Claims (58)

【特許請求の範囲】
1. １．エキソペプチダーゼ酵素の触媒作用により、特性反応性置換基を備えた側鎖 を有するアミノ酸、アミノ酸誘導体、アミンまたはアルコールである求核試薬を タンパクにカップリングさせて付加体を形成させ、 該付加体を、該付加体の特性反応性置換基に対して相関的に反応性である特異的 反応性基を有する補助物質またはリンカーアームとの組合せに結合させて結合タ ンパクを形成させることを特徴とする補助物質に結合したタンパクの形成方法。
2. ２．反応性置換基を備えた側鎖を有するアミノ酸、アミノ酸誘導体、アミンまた はアルコールである求核試薬を、該求核試薬の反応性置換基に対して反応性であ る反応性基を有する補助物質またはリンカーアームとの組合せに結合させて中間 体を形成させ、該中間体を、エキソペプチダーゼ酵素の非中性触媒作用により該 タンパクにカップリングさせて結合タンパクを形成させることを特徴とする補助 物質に結合したタンパクの形成方法。
3. ３．補助物質が固定化支持体、標識または生物活性薬剤である請求項１または２ 記載の方法。
4. ４．リンカーアームの遊離末端を終わらせる特異的反応性官能基を有するリンカ ーアームに共有結合した補助物質の組合せを用いる請求項１または２記載の方法 。
5. ５．触媒作用条件が塩基性であり、求核試薬がアミノ酸、アミノ酸、アミノ酸誘 導体またはアミンである請求項１または２記載の方法。
6. ６．触媒作用条件が迅速なインキュベーション時間を包含する請求項５記載の方 法。
7. ７．触媒作用条件が酸性であり、求核試薬がアルコールである請求項１または２ 記載の方法。
8. ８．触媒作用条件が迅速なインキュバーション時間を包含する請求項７記載の方 法。
9. ９．タンパクが、抗体、酵素、酵素阻害剤、タンパクホルモン、ＤＮＡ結合タン パク、調節タンパクまたはＤＮＡリーディング・フレームタンパクである請求項 １または２記載の方法。
10. １０．タンパクが抗体であり、求核試薬が該抗体の重鎖のカルボキシル末端に実 質的に完全に結合している請求項９記載の方法。
11. １１．タンパクがモノクローナル抗体である請求項１０記載の方法。
12. １２．タンパクがポリクローナル抗体である請求項１０記載の方法。
13. １３．タンパクがｌｇＧ免疫タンパクである請求項１０記載の方法。
14. １４．求核試薬がアミノ酸またはアミノ酸誘導体である請求項１または２記載の 方法。
15. １５．アミノ酸またはアミノ酸誘導体が、脂肪族アミノ酸、ヒドロキシアミノ酸 、含硫アミノ酸、ジアミノモノカルボン酸、芳香族アミノ酸、複素環式アミノ酸 およびその活性化誘導体からなる群より選択される請求項１４記載の方法。
16. １６．アミノ酸求核試薬がセリン、タウリンまたはアラニンである請求項１５記 載の方法。
17. １７．酵素がカルボキシペプチダーゼである請求項１または２記載の方法。
18. １８．酵素がセリンまたはシステインカルボキシペプチダーゼである請求項１ま たは２記載の方法。
19. １９．付加体または求核試薬を補助物質に結合させる請求項１または２記載の方 法。
20. ２０．付加体または求核試薬をリンカーアームとの補助物質の組合せに結合させ る請求項１または２記載の方法。
21. ２１．非中性媒体中、エキソペプチダーゼ酵素の存在下、タンパクと標識アノ酸 、アミノ酸誘導体、アンまたはアルコールの求核試薬とをカップリングさせて標 識タンパクを形成させることを特徴とする標識タンパクの製造方法。
22. ２２．非中性媒体中、エキソペプチダーゼ酵素の存在下、タンパクと、スルフヒ ドリル、ヒドロキシル、活性化ヒドロキシル、オレフィニル、活性化エステル、 アミノ、アジジル、ヒドラジニル、ホスホルアミドイル、ボロニル、フェロセニ ル、フェロ複合体およびその混合体からなる群より選択される特性反応性置換基 を備えた側鎖を有するアミノ酸、アノ酸誘導体、アミンまたはアルコールである 求核試薬とをカップリングさせて付加体を形成させ、蛍光、核磁気、燐光、比色 定量、磁気、電子共鳴または分光により測定でき、かつ、少なくとも１つの反応 性基を有する標識と、該特性反応性置換基と相関的に反応性である特異的反応性 基および該標識の反応性基に対して反応性である他の官能基を有する柔軟性また は半柔軟性鎖であるリンカーアームとを結合させて組合せを形成させ、 該付加体と該組合せとを結合させて標識タンパクを形成させることを特徴とする 標識タンパクの製造方法。
23. ２３．蛍光、核磁気、燐光、比色定量または分光により測定でき、かつ、少なく とも１つの結合基を有する標識と、該標識の結合基と非反応性であるか、非反応 性にする特異的反応性基を有し、該標識の結合基に対して反応性である他の官能 基を有する柔軟性または半柔軟性鎖であるリンカーアームを結合させて組合せを 形成させ、該組合せと、該組合せの特異的反応基に対して反応性である反応性置 換基を備えた側鎖を有するアミノ酸、アミノ酸誘導体、アミンまたはアルコール である求核試薬とを結合させて中間体を形成させ、非中性媒体中、エキソペプチ ダーゼ酵素の存在下、タンパクと中間体をカップリングさせて標識タンパクを形 成させることを特徴とする標識タンパクの製造方法。
24. ２４．蛍光、核磁気、燐光、比色定量、磁気、電子共鳴または分光で測定でき、 かつ、求核試薬の反応性置換基と反応性である反応性基を有する標識と、反応性 置換基を備えた側鎖を有するアミノ酸、アミノ酸誘導体、アミンまたはアルコー ルである求核試薬とを結合させて中間体を形成させ、 非中性媒体中、エキソペプチダーゼの存在下、タンパクと中間体とをカップリン グさせて標識タンパクを形成させることを特徴とする標識タンパクの製造方法。
25. ２５．標識求核試薬が放射活性である請求項２１記載の方法。
26. ２６．カップリング条件が酸性であり、求核試薬がアルコールである請求項２１ 、２２、２３または２４記載の方法。
27. ２７．タンパク濃度が約１μＭ〜約１ｍＭである請求項２１、２２、２３または ２４記載の方法。
28. ２８．酵素濃度が約１ｐＭから約１ｍＭまでである請求項２１、２２、２３まで ２４記載の方法。
29. ２９．カップリング条件が塩基性であり、求核試薬がアミノ酸、アミノ酸誘導体 またはアミンである請求項２１、２２、２３または２４記載の方法。
30. ３０．反応を少なくとも約５秒間行う請求項２９記載の方法。
31. ３１．タンパク、求核試薬および酵素を水性混合物中にて組み合わせる請求項２ ９記載の方法。
32. ３２．水性混合物を、 （ａ）タンパクと求核試薬とを結合させて混合物を形成させ、（ｂ）該混合物の ｐＨを、約２．０〜１０．５の範囲内で調整し、および （ｃ）酵素を該混合物に加えることによって形成する請求項２１、２２、２３ま たは２４記載の方法。
33. ３３．請求項２１、２２、２３または２４記載の方法によって生産される標識タ ンパク。
34. ３４．アミノ酸、アミノ酸誘導体、アミンまたはアルコールの標識求核試薬を、 そのカルボキシル末端にカップリングまたは置換したタンパクからなる標識タン パク。
35. ３５．求核試薬が実質的にもっばらカルボキシ末端にカップリングまたは置換し た請求項３４記載の標識タンパク。
36. ３６．タンパクがモノクローナルまたはポリクローナル抗体である請求項３４記 載の標識タンパク。
37. ３７．求核試薬がセリン、タウリンまたはアラニンである請求項３４記載の標識 タンパク。
38. ３８．抗原と特異的に免疫反応性である請求項３４記載の標識抗体を該抗原含有 の疑のある材料と結合させて複合体を形成させ、いずれの非複合化標識抗体をも 除去し、該複合体中に存在する標識抗体の量を測定することからなる抗原の存在 の検出方法。
39. ３９．非中性媒体中、エキソペプチダーゼ酵素の存在下、タンパクと、スルフヒ ドリル、ヒドロキシル、活性化ヒドロキシル、アミノ、活性化エステル、オレフ ィニル、アジジル、ヒドラジニル、ホスホルアミドイル、ボロニル、フェロセニ ル、フェロ複合体およびその混合体からなる群より選択される特性反応性置換基 を備えた側鎖を有するアミノ酸、アミノ酸誘導体、アミンまたはアルコールであ る求核試薬とをカップリングさせて付加体を形成させ、該付加体と、該付加体の 特性反応性置換基に対して相関的に反応性である少なくとも１つの特異的反応性 基を有する固定化支持体とを結合させて固定化タンパクを形成させることを特徴 とする固定化タンパクの製造方法。
40. ４０．非中性媒体中、エキソペプチダーゼ酵素の存在下、タンパクと、スルフヒ ドリル、ヒドロキシル、活性化ヒドロキシル、アミノ、活性化エステル、オレフ ィニル、アジジル、ヒドラジニル、ホスホルアミドイル、ボロニル、フェロセニ ル、フェロ複合体およびその混合体からなる群より選択される特性反応性置換基 を備えた側鎖を有するアミノ酸、アミノ酸誘導体、アミンまたはアルコールであ る求核試薬とをカップリングさせて付加体を形成させ、少なくとも１つの結合基 を有する固定化支持体と、該付加体の特性反応性置換基と相関的に反応性である 特異的反応性基および該支持体の結合基に対して反応性である他の官能基を有す る柔軟性または半柔軟性鎖であるリンカーアームとを結合させて共有結合した組 合せを形成させ、 該付加体と該組合せと結合させて固定化タンパクを形成させることを特徴とする 固定化タンパクの製造方法。
41. ４１．少なくとも１つの結合基を有する固定化支持体と、結合基と非反応性であ るかまたは非反応性にする特異的反応性基および該支持体の結合基に対して反応 性である他の官能基を有する柔軟性または半柔軟性鎖であるリンカーアームとを 結合させて共有結合組合せを形成させ、 該組合せと、該組合せの特異的反応性基に対して反応性である反応性置換基を備 えた側鎖を有するアミノ酸、アミノ酸誘導体、アミンまたはアルコールである求 核試薬とを結合させて中間体を形成させ、 非中性媒体中、エキソペプチダーゼ酵素の存在下、該中間体とタンパクとをカッ プリングさせて固定化タンパクを形成させることを特徴とする固定化タンパクの 製造方法。
42. ４２．反応性置換基を備えた側鎖を有するアミノ酸、アミノ酸誘導体、アミンま たはアルコールである求核試薬と、該求核試薬の反応性置換基に対して反応性で ある少なくとも１つの特異的反応性基を有する固定化支持体とを結合させて中間 体を形成させ、非中性媒体中、エキソペプチダーゼ酵素の存在下、タンパクと中 間体とをカップリングさせて固定化タンパクを形成させることを特徴とする固定 化タンパクの製造方法。
43. ４３．タンパクのカルボキシル末端が支持体にカップリングする請求項３９、４ ０、４１または４２記載の方法。
44. ４４．支持体が無機支持体である請求項３９、４０、４１または４２記載の方法 。
45. ４５．支持体が有機支持体である請求項３９、４０、４１または４２記載の方法 。
46. ４６．支持体が多孔性または半多孔性の微粒子、マイクロビーズ、ビーズ、球体 、ゲル粒子、繊維、小板、シートまたは粒状物質である請求項３９、４０、４１ または４２記載の方法。
47. ４７．非中性媒体中、エキソペプチダーゼ酵素の存在下、タンパクと、スルフヒ ドリル、ヒドロキシル、活性化ヒドロキシル、アミ／、活性化エステル、オレフ ィニル、アジジル、ヒドラジニル、ホスホルアミドイル、ボロニル、フェロセニ ル、フェロ複合体およびその混合体からなる群より選択される特性反応性置換基 を備えた側鎖を有するアミノ酸、アミノ酸誘導体、アミンまたはアルコールであ る求核試薬とをカップリングさせて付加体を形成させ、該付加体と、該付加体の 反応性置換基に対して相関的に反応性である少なくとも１つの特異的反応性基を 有する生物活性薬剤とを結合させて増大化タンパクを形成させることを特徴とす る生物活性薬剤によって増大するタンパクの製造方法。
48. ４８．非中性媒体中、エキソペプチダーゼ酵素の存在下、タンパクと、スルフヒ ドリル、ヒドロキシル、活性化ヒドロキシル、アミノ、活性化エステル、オレフ ィニル、アジジル、ヒドラジニル、ホスホルアミドイル、ボロニル、フェロセニ ル、フェロ複合体およびその混合体からなる群より選択される特性反応性置換基 を備えた側鎖を有するアミノ酸、アミノ酸誘導体、アミンまたはアルコールであ る求核試薬とをカップリングさせて付加体を形成させ、少なくとも１つの結合基 を有する生物活性薬剤と、該付加体の反応性置換基に対して相関的に反応性であ る特異的反応性基および該生物活性薬剤の結合基に対して反応性である他の反応 性基を有する柔軟性または半柔軟性鎖であるリンカーアームとを結合させて共有 結合組合せを形成させ、 該付加体と組合せとを結合させて増大化タンパクを形成させることを特徴とする 生物活性薬剤によって増大するタンパクの製造方法。
49. ４９．反応性置換基を備えた側鎖を有するアミノ酸、アミノ酸誘導体、アミンま たはアルコールである求核試薬と、該求核試薬の反応性置換基に対して反応性で ある少なくとも１つの特異的反応性基を有する生物活性薬剤とを結合させて中間 体を形成させ、非中性媒体中、エキソペプチダーゼ酵素の存在下、タンパクと該 中間体とをカップリングさせて増大化タンパクを形成させることを特徴とする生 物活性薬剤によって増大するタンパクの製造方法。
50. ５０．少なくとも１つの結合基を有する生物活性薬剤と、該結合基に対して非反 応性であるかまたは非反応性にする特異的反応性基および生物活性薬剤の結合基 に対して反応性である他の反応性基を有する柔軟性または半柔軟性鎖であるリン カーアームとを結合させて共有結合組合せを形成させ、 該組合せの特異的反応性基に対して反応性である反応性置換基を備えた側鎖を有 するアミノ酸、アミノ酸導体、アミンまたはアルコールである求核試薬と該組合 せとを結合させて中間体を形成させ、非中性媒体中、エキソペプチダーゼ酵素の 存在下、タンパクと該中間体とをカップリングさせて増大化タンパクを形成させ ることを特徴とする生物活性薬剤によって増大するタンパクの製造方法。
51. ５１．請求項３９、４０、４１または４２記載の方法によって製造される固定化 タンパク。
52. ５２．請求項４７、４８、４９または５０記載の方法によって製造される生物活 性薬剤によって増大するタンパク。
53. ５３．請求項５１記載の固定化タンパクを用いることからなるタンパクを機能的 に反応させる方法。
54. ５４．請求項５２記載の生物活性薬剤を含むタンパクを用いることからなる生物 活性薬剤との生物反応を行う方法。
55. ５５．特性反応性置換基および特異的反応性基が、（ａ）スルフヒドリル基およ び有機金属基、（ｂ）オレフィニル基およびジェニル基、（ｃ）極性オレフィン 基およびその対応するモノマーまたはその置換形、（ｄ）親和性複合化合物およ びその基質、（ｅ）１対のヒドロホウ素化オレフィン基、（ｆ）芳香族アミノ基 およびエポキシ活性化エステルまたはアルデヒド基、（ｇ）アジジルまたはヒド ラジニル基および芳香族アミノ基、（ｈ）芳香族アルコールおよび活性化エステ ル基、および（ｉ）ヒドラジンおよび還元糖基からなる群より選択される請求項 １、２２、３９、４０、４７または４８記載の方法。
56. ５６．リンカーアーム鎖がアミド、エステル、カーボネート、ウレタン、エーテ ル、グリシジル、オレフィンまたは炭化水素基のポリマーまたはオリゴマーであ るか、約２〜２０個の原子の脂肪族基であるか、または約１〜５個の環の芳香族 基である請求項１、２、２２、２３、４０、４１、４８または５０記載の方法。
57. ５７．カップリング条件が塩基性であり、求核試薬がアミノ酸、アミノ酸誘導体 またはアミンである請求項３９、４０、４１、４２、４３、４７、４８、４９ま たは５０記載の方法。
58. ５８．カップリング条件が酸性であり、求核試薬がアルコールである請求項３９ 、４０、４１、４２、４３、４７、４８、４９または５０記載の方法。