DE69021518T2

DE69021518T2 - 1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-5-nitropyridin-3-carbonsäure-1-azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylester-Isomere.

Info

Publication number: DE69021518T2
Application number: DE69021518T
Authority: DE
Inventors: John P Carter; Waclaw J Rzeszotarski
Original assignee: Marion Merrell Dow Inc
Current assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1989-12-14
Filing date: 1990-12-12
Publication date: 1996-01-04
Anticipated expiration: 2010-12-13
Also published as: CA2031937C; EP0432751A3; ATE126190T1; JP3029051B2; CA2031937A1; EP0432751B1; EP0432751A2; AU6791690A; AU633386B2; ES2078288T3; JPH04270279A; DE69021518D1; US4975437A

Description

1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-5-nitropyridin-3-carbonsäure-1-azabicyclo- [2.2.2]oct-3-ylester-Isomere und ihre nichttoxischen Säureadditionssalze sind nützliche Calciumagonisten, die als Kardiotonika und bei der Behandlung von kardiovasculären Störungen, wie Stauungsinsuffizienz, verwendet werden.
Seit dem letzten Jahrhundert ist die wesentliche Rolle von Calciumionen bei der Muskelkontraktion gut bekannt. Im Gegensatz zur Skelettmuskulatur bei der die Wirkungen der Calciumionen innerhalb der Zelle auftreten, hängt die Steuerung der glatten Muskulatur und des Herzmuskels in einem großen Ausmaß von der extrazellulären Calciumkonzentration ab. Daher spielt die Regulierung des extrazellulären Calciums eine entscheidende Rolle bei der Behandlung verschiedener kardiovaskulärer Störungen.
Die am häufigsten verwendeten Mittel zur Regulierung dieser Ionen sind Calciumantagonisten oder Calciumkanal-Blocker. Vereinfachend sind dies Verbindungen, die den Eintritt der Calciumionen in die Zellen "verlangsamen" und dabei die Stärke oder Kontraktilität des Herzmuskels vermindern, wodurch der Blutdruck erniedrigt wird. Zusätzlich finden diese Mittel in der Behandlung von Angina Verwendung, die durch anomale Vasokonstriktion von Koronararterien hervorgerufen wird und von klassischer durch Anstrengung hervorgerufene Angina (classical effort associated angina).
Eine weitere, wesentlich kleinere Klasse von Mitteln, die diese Ionen regulieren, sind Calciumagonisten oder Calciumkanal-Aktivatoren. Diese Verbindungen begünstigen die Bewegung von Calciumionen durch die Zellwand und erhöhen daher die Kontraktilität. Sie können bei der Behandlung von Störungen von vermindertem Schlagvolumen, wie Stauungsinsuffizienz, verwendet werden. Alternativ dazu können sie als Hilfsmittel bei pharmakologischen Untersuchungen von Calciumkanälen verwendet werden.
1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-5-nitro-4-(2-trifluormethylphenyl)-3-pyridincarbonsäuremethylester [BAY K 8644, M. Schramm, G. Thomas, R. Toward, G. Frankowiak, Nature 303, (1983), 535; Deutsches Patent 3 447 169 und Europäische Patentveröffentlichung 186 028], dessen pharmakologische Eigenschaften gründlich untersucht worden sind, ist ein Prototyp eines Dihydropyridin-Calciumagonisten. Er ruft starke positiv inotrope Wirkungen hervor. H. Rogg et al. [Biochem. Biophys. Res. Commun. 118, (1984), 842; Europäisches Patent 111 453 und 111 455] haben 4-[2-(Difluormethoxy)phenyl]-1,4,5,7- tetrahydro-2-methyl-5-oxofuro[3,4-b]pyridin-3-carbonsäureethylester (CGP 28392) offenbart und seine Fähigkeit beschrieben die Konzentration von extrazellulären Calciumionen dosisabhängig zu erhöhen.
Die Auswirkungen der Stereochemie auf die biologischen Wirkungen dieser Art von pharmakologischem Mittel wurden von R.P. Hoffe U.T. Ruegg, A. Hof und A. Vogel [J. Cardiovasc. Pharmacol. 2, (1985), 689; Britisches Patent 2 148 895 und Deutsches Patent 3 438 884] beschrieben. Racemischer 4-(4-Benzofurazanyl)-1,4-dihydro-2,6-dimethyl-5-nitropyridin-3-carbonsäure-2-propylester (202-792) steigert bei niedrigen Depolarisationsniveaus die Kontraktion von Aortenringen bei Kaninchen, das typische Ergebnis von Calciumagonismus, es hemmt aber bei hohen Depolarisationsniveaus die Kontraktion und Aufnahme von radioaktivem Calcium. Das R-Enantiomer hemmt ebenfalls die Kontraktion und Aufnahme von radioaktivem Calcium und zeigt keine stimulierende Wirksamkeit. Das S-Enantiomer jedoch verschiebt die Konzentration-Antwort-Kurve für depolarisationsinduzierte Kontraktion in fast paralleler Weise nach links; es steigert die Kontraktion. Diese Verbindung steigert bei allen Depolarisationsniveaus abhängig die Aufnahme von radioaktivem Calcium. Somit verhalten sich die Stereoisomeren dieses Dihydropyridins, abhängig von ihrer Stereochemie, wie ein Calciumeintritts-Blocker oder ein Calciumeintritts-Verstärker.
Ähnliche Ergebnisse sind für ß-Amino-4-(2-chlorphenyl)-1,4-dihydro-6-methylpyridin-3- carbonsäureethylester [H 160/51; U.S. Patent 4 532 248 und Deutsches Patent 3 130 041] von P. Gjorstrup, H. Harding, R. Isaksson und C. Westerlund [Eur. J. Pharmacol. 122, (1986), 357] beschrieben worden. Es wurde herausgefunden, daß die optischen Isomere dieser Dihydropyridine entgegengesetzte Wirkungen im Katzenpapillarmuskel und der Rattenpfortader aufweisen. Das (+)-Enantiomer hemmt die Wirkungen von Calciumionen und vermindert deshalb die Kontraktionsstärke dieser Gewebe, wohingegen das (-)-Enantiomer Calciumwirkungen stimuliert, und es wurde gefunden, daß es die Kontraktionsstärke signifikant erhöht.
Wie leicht zu erkennen ist, besitzt eine Vielfalt von strukturell verschiedenen Dihydropyridinen eine Calciumagonistenwirksamkeit. Tatsächlich behaupten P. Gjorstrup et al. [Eur. J. Pharmacol. 122, (1986), 357-361]: "Die strukturellen Charakteristika, die für ein spezifisches Einpassen eines Agonisten (in die Calciumkanäle) verantwortlich sind, scheinen mehr als zweifelhaft zu sein".
Relativ wenige Calciumkanal-Modifikatoren mit einem basischen Amin in dem Alkylteil eines 1,4-Dihydropyridin-3-carbonsäureesters sind beschrieben worden. Die vaskulären Wir kungen und Wirkungen auf das Herz eines weiteren Calciumagonisten, 2-(2-Pyridyl)ethyl-3- anilinocarbonyl-4-(2-chlorphenyl)-1,4-dihydro-2,6-dimethylpyridin-3-carboxylat (YC-170), sind von Y. Hattori, H. Nakaya. N. Tohse und M. Kanno [J. Pharmacol. Exp. Ther. 238, 670] beschrieben worden. Dieses Mittel erzeugt eine positiv inotrope Wirkung im isolierten Meerschweinchenvorhof und induziert Kontraktion in isolierten Kaninchenaortenringen. Dieser Agonist verursacht jedoch eine Abnahme der kontraktilen Spannung im teilweise durch eine niedrige Kaliumkonzentration depolarisierten Vorhof und erzeugt eine relaxierende Wirkung auf die mit einer hohen Kaliumkonzentration vorkontrahierten Aorta. Diese Ergebnisse zeigen, daß YC-170 sich nicht nur als ein Calciumagonist verhalten kann, sondern auch, abhängig von dem zellulären Membranpotential, als ein Calciumantagonist. Im allgemeinen weisen Ester von 1-Azabicyclo[2.2.2]octan-3-ol mit Aryl- oder Aralkylcarbonsäuren calciumkanalblockierende Wirksamkeiten auf (L. Noronha-Blob, C. Richard, D. C. U' Prichard, Biochem. und Biophys. Res. Commun. 147, (1987), 182-188).
Die hier beschriebenen neuen Isomere des 1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-5- nitropyridin-3-carbonsäure-1-azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylesters sind wirksame Calciumkanal- Agonisten, was durch ihre Fähigkeit, die physiologische Bewegung von Calciumionen zu erhöhen und die durch Calcium bedingte Kontraktilität glatter Muskulatur zu steigern, nachgewiesen ist. Diese Wirkungen zeigen, daß diese Isomere als kardiotonische Mittel und bei Herzstörungen, wie Stauungsinsuffizienz, nützlich sind.
Die Erfindung stellt eine Gruppe von vier Stereoisomeren der Formel I zur Verfügung
wobei die Asymmetriezentren a und b gleich oder verschieden sein können und entweder die absolute R- oder S-Konfiguration aufweisen. Die Erfindung betrifft ebenfalls die pharmazeutisch verträglichen Salze der vorstehenden Verbindungen, Arzneimittel, die solche Verbindungen enthalten und ihre Verwendung zur Erzeugung kardiotonischer Wirkungen und bei der Behandlung von Stauungsinsuffizienz.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind neue 1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-5-nitropyridin-3-carbonsäure-1-azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylester-Isomere der vorstehenden Formel und die pharmazeutisch verträglichen Salze davon. Die Verbindungen sind wirksame Calciumkanal-Agonisten, wodurch sie als kardiotonische Mittel und zur Behandlung kardiovaskulärer Störungen, wie Stauungsinsuffizienz, verwendbar sind. Die Erfindung schließt daher Arzneimittel ein, die für solche Anwendungen bestimmt sind, die eine wirksame Menge der einzelnen Isomere und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen. Die Erfindung schließt ebenfalls Verfahren zur Verwendung solcher Zusammensetzungen als Calciumkanal-Agonisten und zur Behandlung einer Vielfalt kardiovaskulärer Störungen ein.
Die bevorzugte erfindungsgemäße Verbindung ist (+a, -b) 1,4-Dihydro-3,6-dimethyl-4-(3- nitrophenyl)-5-nitropyridin-3-carbonsäure-3-azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylester.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Form eines pharmazeutisch verträglichen Säureadditionssalzes verwendet werden, das die Nützlichkeit der freien Base aufveist. Solche Salze, die durch in der Technik gut bekannte Verfahren hergestellt werden, werden sowohl aus anorganischen als auch organischen Säuren gebildet, zum Beispiel: Malein-, Fumar-, Benzoe-, Ascorbin-, Pamoa-, Bernstein-, Bismethylensalicyl-, Methansulfon-, Ethandisulfon-, Essig-, Oxal-, Propion-, Wein-, Salicyl-, Zitronen-, Glucon-, Milch-, Äpfel-, Mandel-, Zimt-, Citracon-, Asparagin-, Stearin-, Palmitin-, Itacon-, Glycol-, p- Aminobenzoe-, Glutamin-, Benzolsulfon-, Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-, Schwefel-, Cyclohexansulfamin-, Phosphor- und Salpetersäuren. In dem Umfang, in dem die erfindungsgemäßen Verbindungen als optische Isomere vorliegen können, sollen sowohl die Isomere als auch das racemische Gemisch als von der Erfindung umfaßt gelten. Zusätzlich sind alle möglichen anderen isomeren Formen der erfindungsgemäßen Verbindungen von der Erfindung umfaßt.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können oral oder parenteral in üblichen Dosierungseinheitsformen, wie Tabletten, Kapseln, Injektionen, Aerosolen oder dergleichen, durch Inkorporation der geeigneten Dosis einer Verbindung der angegebenen Formel mit Trägern, entsprechend den anerkannten pharmazeutischen Verfahrensweisen, verabreicht werden.
Bevorzugt wird eine Verbindung oder ein Säureadditionssalz davon an einen tierischen Organismus oral als Tablette oder Kapsel verabreicht, die eine ausreichende Menge zur Erzeugung der gewünschten Wirksamkeit enthält. Jede Dosierungseinheit wird den wirksamen Bestandteil in einer Menge von etwa 10 mg bis etwa 400 mg enthalten, bevorzugt von etwa 30 mg bis etwa 200 mg. Vorteilhafterweise werden gleiche Dosen 2 bis 4 mal täglich verabreicht, wobei die tägliche Dosierungsmenge etwa 60 mg bis etwa 600 mg, bevorzugt etwa 100 mg bis etwa 300 mg, beträgt.
Die verwendeten pharmazeutischen Träger können zum Beispiel entweder ein Feststoff oder eine Flüssigkeit sein. Laktose, Kaolin, Rohrzucker, Talk, Gelatine, Agar, Pektin, Gummi arabicum, Magnesiumstearat, Stearinsäure und dergleichen sind beispielhaft für feste Träger. Syrup, Erdnußöl, Olivenöl, Wasser und dergleichen sind beispielhaft für flüssige Träger. In ähnlicher Weise können die Träger oder Verdünnungsmittel ein beliebiges, in der Technik gut bekanntes Zeitverzogerungsmittel, wie Glycerinmonostearat oder Glycerindistearat, allein oder mit einem Wachs, enthalten.
Es kann eine große Vielfalt von pharmazeutischen Formen verwendet werden. Daher kann die Zubereitung, falls ein fester Träger verwendet wird, tablettiert werden, als Pulver oder Pellet in eine Hartgelatinekapsel eingebracht werden oder in Form einer Pastille ("troche") oder Pastille ("lozenge") vorliegen. Die Menge des festen Trägers wird in einem hohen Maße variieren, sie wird aber bevorzugt bei etwa 25 mg bis etwa 1 g sein. Falls ein flüssiger Träger verwendet wird, wird die Zubereitung als Syrup, Emulsion, Weichgelatinekapsel, sterile Injektionsflüssigkeit, wie eine Ampulle, oder eine wässrige oder nichtwässrige flüssige Suspension vorliegen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können durch Veresterung der Enantiomeren von 1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-5-nitropyridin-3-carbonsäure mit den Enantiomeren von 1-Azabicyclo[2.2.2]octan-3-ol (3-Chinuclidinol) hergestellt werden. Die Säure wurde durch Kondensation von 3-Nitrobenzaldehyd mit n-Butylamin hergestellt, wodurch ein Imin erhalten wurde, das durch weitere Kondensation mit 1-Nitro-2-propanon 4-(3-Nitrophenyl)-3-nitro-3-buten-2-on liefert. Cycloaddition dieses Ketons zu 3-Aminobut-2-ensäure-2-cyanoethylester, hergestellt durch Aminierung von Acetessigsäure-2-cyanoethylester, liefert den 2-Cyanoethylester von 1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-5-nitropyridin-3-carbonsäure, aus dem die Säure durch alkalische Hydrolyse erhalten wird. Die Aufspaltung der Säure wird durch Umkristallisation des Brucinsalzes aus Methanol erreicht. Die Enantiomeren von 3-Chinuclidinol werden durch das Verfahren von B. Ringdahl, B. Resul und R. Dahlbom [Acta. Pharm. Seuc. 16, (1979), 281] erhalten.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung. Die Temperatur ist in Grad Celsius ausgedrückt; die NMR-Signale sind mit Tetramethylsilan als internem Standard in ppm- Tieffeld angegeben.

Beispiel I

1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-5-nitropyridin-3-carbonsäure

60 g (0,57 mol) 1-Nitro-2-propanol und 92 g (0,57 mol) Natriumdichromat wurden 60 ml Wasser zugefügt. Das entstandene Gemisch wurde in einem Eisbad gekühlt und über 2 Stunden wurde eine Lösung von 60ml konzentrierter Schwefelsäure in 50ml Wasser zugesetzt, wobei die Temperatur des Reaktionsgemischs unter 10ºC gehalten wurde. Das Gemisch wurde zusätzliche 5 Stunden gerührt, mit 600 ml Wasser verdünnt und viermal mit Ether extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt und über Magnesiumsulfat getrocknet. Entfernen des Lösungsmittels ergab 62,1 ml einer Flüssigkeit, die während des Stehens kristallisierte. Der entstandenen Feststoff wurde aus Ether kristallisiert, wodurch 36,4 g 1-nitro-2-propanon [¹H-NMR: 5,5 (s, 2H), 2,4 (s, 3H)] erhalten wurde.
Einer Lösung von 64 g (0,42 mol) 3-Nitrobenzaldehyd in Benzol wurden 29,2 g n-Butylamin zugesetzt. Das Gemisch wurde in einem Kolben, der mit einem Dean-Stark-Abscheider ausgestattet ist, zum Rückfluß erhitzt. Nach 90 Minuten hatte sich die theoretische Wassermenge abgeschieden und das Gemisch wurde gekühlt und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, wodurch 84,4 g N-(3-Nitrobenzyliden)-1-butanamin erhalten wurden.
15 g 1-Nitro-2-propanon wurden einer Lösung von 28,6 g (0,39 mol) des Butanamins in 75 ml Essigsäureanhydrid zugesetzt. Es bildete sich fast sofort ein weißer Niederschlag. Das Gemisch wurde leicht erwärmt bis der Feststoff sich löste, gekühlt, 5 Stunden gerührt, vorsichtig auf Wasser gegossen und mit Ether extrahiert. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Nach Aufbewahrung über Nacht bei 0ºC war der Rückstand kristallisiert. Umkristallisation des entstandenen Feststoffs aus Dibutylether ergab 9,3 g 4-(3-Nitrophenyl)-3-nitro-3-buten-2-on [¹H-NMR: 8,4 (m, 2H), 7,7 (m, 2H), 7,5 (s, 1H), 2,5 (s, 3H)].
10 ml Methanol wurden mit 20g (0,13 mol) Acetessigsäure-2-cyanoethylester versetzt. Die Lösung wurde in Eis gekühlt und es wurde 5 Stunden ein langsamer Strom von Ammoniakgas durchgeleitet. Der Reaktionskolben wurde verschlossen und über Nacht bei 0ºC aufbewahrt. Der entstandene Feststoff wurde gesammelt, mit einer geringen Menge Methanol gewaschen und unter Hochvakuum getrocknet, wodurch 11,1 g (0,072 mol) 3- Aminobut-2-ensäure-2-cyanoethylester [¹H-NMR: 4,6 (s, 1H), 4,3 (t, 2H), 2,8 (t, 2H), 2,0 (t, 3H)] erhalten wurde.
100 ml Ethanol wurden mit 11,8 g (0,05 mol) 4-(3-Nitrophenyl)-3-nitro-3-buten-2-on und 7,7 g (0,05 mol) 3-Aminobut-2-ensäure-2-cyanoethylester versetzt. Das Gemisch wurde über Nacht unter Rückfluß erhitzt, gekühlt und filtriert. Der entstandenen gelbe Feststoff wurde mit einer geringen Menge Ethanol gewaschen und unter Hochvakuum getrocknet, wodurch 13,85 g (0,037 mol) 1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-5-nitropyridin- 3-carbonsäure-2-cyanoethylester [¹H-NMR: 10,0 (m, 1H), 8,2 (m, 2H), 7,9 (m, 2H), 5,5 (m, 1H), 4,3 (t, 2H), 3,3 (s, 1H), 2,4 (s, 3H), 2,3 (s, 3H)] erhalten wurde.
50 ml 1,2-Dimethoxyethan wurden mit 7,2 g (0,02 mol) 1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-4-(3- nitrophenyl)-5-nitropyridin-3-carbonsäure-2-cyanoethylester versetzt. Dieser Lösung wurden über 15 Minuten tropfenweise 23 ml 1,0 M Natronlauge hinzugefügt. Nach 4 Stunden wurde das Gemisch mit Wasser verdünnt und dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die wässrige Phase wurde abgetrennt, mit 2 M Chlorwasserstoffsäure angesäuert (pH< 2) und 1 Stunde bei 0ºC aufbewahrt. Der entstandene Feststoff wurde filtnert und uber Nacht unter Hochvakuum getrocknet, wodurch 6,1 g (0,018 mol) feste gelbe 1,4-Dihydro-2,6- dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-5-nitropyridin-3-carbonsäure [¹H-NMR: 9,2 (m, 1H), 8,2 (s, 1H), 7,8 (m, 2H), 7,5 (m, 2H), 5,4 (s, 1H), 2,5 (s, 3H), 2,2 (s, 3H)] erhalten wurden.

Beispiel II

(+)-1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-5-nitropyridin-3-carbonsäure

Eine Lösung von 14,5 g (0,033 mol) Brucindihydrat in 300 ml n-Butylacetat wurde mit 12, 5 g (0,033 mol) 1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-5-nitropyridin-3-carbonsäure, hergestellt wie in Beispiel I beschrieben, versetzt. Das Gemisch wurde auf 100ºC erhitzt und mit genügend Methanol (annähernd 100 ml) versetzt, um eine Lösung herzustellen. Das Gemisch wurde über Nacht stehen gelassen, filtriert und der entstandene Feststoff zweimal aus Butylacetat/Methanol umkristallisiert. Die Mutterlaugen aus allen Umkristallisationen wurden zurückbehalten. Die Kristalle wurden in 25 ml 2 M Chlorwasserstoffsäure gelöst und das Gemisch zweimal mit Ethylacetat gewaschen. Die organischen Phasen wurden vereinigt, mit Kochsalzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, wodurch 4,1 g (0,0129 mol) (+)-1,4- Dihydro-2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-5-nitropyridin-3-carbonsäure [[α]D&sub2;&sub0; = +24º] erhalten wurden.

Beispiel III

(-)-1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-5-nitropyridin-3-carbonsäure

Das Lösungsmittel wurde aus den vereinigten Mutterlaugen der Herstellung des (+ )-Isomers, wie in Beispiel II dargestellt, entfernt. Der entstandene Feststoff wurde einmal aus einem Gemisch von n-Butylacetat und Cyclohexan umkristallisiert. Die so erhaltenen Kristalle wurden zweimal aus Ethylacetat/Cyclohexan umkristallisiert. Der entstandene Feststoff wurde in 2 M Chlorwasserstoffsäure gelöst und das Gemisch zweimal mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt, zweimal mit 2 M Chlorwasserstoffsäure gewaschen, einmal mit Kochsalzlösung und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, wodurch (-)-1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-5-nitropyridin-3-carbonsäure [[α]D&sub2;&sub0; = -24,8º] erhalten wurden.

Beispiel IV

(+a, -b)-1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-5-nitropyridin-3-carbonsäure-1- azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylester-fumarat

100 ml Methylenchlorid wurden mit 2 g (0,00625 mol) (-)-1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-4- (3-nitrophenyl)-5-nitropyridin-3-carbonsäure, 1,7 g (0,0065 mol) Triphenylphosphin und 1,4 g (0,0065 mol) Dipyridinyldisulfid versetzt. Das entstandene Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand mit Ethylacetat als Eluierungsmittel über Aiuminiumoxid (Aktivität III) chromatographiert. 100 ml Methylenchlorid wurden mit diesem Thioester und 1,0 g (0,0078 mol) (+)-1-Azabicyclo[2.2.2]octan-3-ol [B. Ringdahl et al., Acta Pharm. Seuc. 16, (1979), 281; L.H. Sternbach, S. Kaiser, J. Am. Chem. Soc. 74, (1952), 2215] versetzt. Eine Lösung von 2,6 g (0,013 mol) Silbertetrafluorborat in 100 ml Benzol wurden zugefügt. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt und zwischen Methylenchlorid und gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung verteilt. Die organische Phase wurde abgetrennt, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Chromatographie des Rückstandes über Aluminiumoxid (Aktivität III), eluiert mit einem Gradienten von Ethylacetat zu 5% Methanol in Ethylacetat, ergaben 350 mg gekoppelter Ester. Dieses Material wurde in 18 ml kochendem 2-Propanol gelöst und es wurden 0,25 g Fumarsäure hinzugefügt. Nach Abkühlen über Nacht wurde die Lösung nochmals zum Rückfluß erhitzt, 3 ml Cyclohexan wurden zugesetzt und das Gemisch wurde abkühlen gelassen. Die Kristalle wurden durch Filtration vereinigt und unter Hochvakuum getrocknet, wodurch 262 mg (+a, -b)-1,4-Dihydro-2,6- dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-5-nitropyridin-3-carbonsäure-1-azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylesterfumarat [Smp.: 144-147ºC] erhalten wurden.
¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): 8,1 (m, 2H), 7,65 (m, 2H), 6,6 (s, 2H), 5,4(s, 1H), 4,9 (m, verdeckt durch HOD), 3,2 - 2,1 (m, 12H), 2,1 - 1,5 (m, 5H); IR (KBr): 2945, 1710, 1530 cm¹; HPLC: (40:15:25, MeOH:THF:H&sub2;O, 5 mM Heptansulfonsäure) Tr = 11,4 Minuten, Kp = 3,5, Whatman partisil 10-ODS-2, 1 ml/Minute; [α]D&sub2;&sub0; = -95,6º (c = 0,90, MeOH);
Analyse berechnet für C&sub2;&sub1;H&sub2;&sub4;N&sub4;O&sub6; C&sub4;H&sub4;O&sub4; 0,5 H&sub2;O: C = 54,25; H = 5,28; N = 10,11
Gefunden: C = 53,92; H = 5,32; N = 9,86

Beispiel V

(-a, -b)-1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-5-nitropyridin-3-carbonsäure-1- azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylester-fumarat

Diese Verbindung wurde aus (-)-1-Azabicyclo[2.2.2]octan-3-ol [B. Ringdahl et al., Acta Pharm. Seuc. 16, (1979), 281; L.H. Sternbach, S. Kaiser, J. Am. Chem. Soc. 24, (1952), 2215] und (-)-1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-5-nitropyridin-3-carbonsäure (Beispiel III) entsprechend dem in Beispiel IV beschriebenen Verfahren hergestellt, wodurch (-a, -b)-1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-5-nitropyridin-3-carbonsäure-1- azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylester-fumarat [Smp.: 141 - 142ºC] erhalten wurde.
¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): 8,1 (m, 2H), 7,7 (m, 2H), 6,6 (s, 2H), 5,5 (s verdeckt durch HOD), 4,9 (m, verdeckt durch HOD), 3,5 - 2,2 (m, 12H), 2,1 - 1,5 (m, 5H); IR (KBr): 2945, 1710, 1530 cm&supmin;¹, HPLC: (40:15:25, MeOH:THF:H&sub2;O, 5 mM Heptansulfonsäure) Tr = 11,4 Minuten, Kp = 3,5, Whatman partisil 10-ODS-2, 1 ml/Minute; [α]D&sub2;&sub0; = +85,6º (c = 1,25, MeOH);
Analyse berechnet für C&sub2;&sub1;H&sub2;&sub4;N&sub4;O&sub6; C&sub4;H&sub4;O&sub4;: C = 55,14; H = 5,18; N = 10,28
Gefunden: C = 54,90; H = 5,29; N = 10,14

Beispiel VI

(+a, +b)-1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-5-nitropyridin-3-carbonsäure- 1-azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylester-fumarat

Dieses Isomer wurde aus (+)-1-Azabicyclo[2.2.2]octan-3-ol [B. Ringdahl et al., Acta Pharm. Seuc. 16, (1979), 281; L.H. Sternbach, S. Kaiser, J. Am. Chem. Soc. 74, (1952), 2215] und (+)-1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-5-nitropyridin-3-carbonsäure (Beispiel II) entsprechend dem in Beispiel IV beschriebenen Verfahren hergestellt, wodurch (+a, +b)-1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-5-nitropyridin-3-carbonsäure- 1-azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylester-fumarat [Smp.:154 - 156ºC] erhalten wurde.
¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): 8,1 (m, 2H), 7,6 (m, 2H), 6,5 (s, 1H), 5,4 (s, 1H), 4,8 (m, verdeckt durch HOD), 3,4 - 2,1 (m, 12H), 2,1 - 1,5 (m, 5H); IR (KBr): 2960, 1710 cm&supmin;¹; HPLC: (40:15:25, MeOH:THF:H&sub2;O, 5 mM Heptansulfonsäure) Tr = 11,2 Minuten, Kp = 3,48, Whatman partisil 10-ODS-2, 1 ml/Minute; [α]D&sub2;&sub0; = -87,4º (c = 1,75, MeOH);
Analyse berechnet für C&sub2;&sub1;H&sub2;&sub4;N&sub4;O&sub6; C&sub4;H&sub4;O&sub4;: C = 55,14; H = 5,18; N = 10,28
Gefunden: C = 55,36; H =5,31; N = 10,49

Beispiel VII

(-a, +b)-1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-5-nitropyridin-3-carbonsäure-1- azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylester-fumarat

Dieses Isomer wurde aus (-)-1-Azabicyclo[2.2.2]octan-3-ol [B. Ringdahl et al., Acta Pharm. Seuc. 16, (1979), 281; L.H. Sternbach, S. Kaiser, J. Am. Chem. Soc. 74, (1952), 2215] und (+)-1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-4-(3-nitrophenyl)-5-nitropyridin-3-carbonsäure (Beispiel II) entsprechend dem in Beispiel IV beschriebenen Verfahren hergestellt. Das Fumarat schmilzt bei 152 - 156ºC.
¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): 8,1 (m, 2H), 7,6 (m, 2H), 6,6 (m, 2H), 5,4(s, 1H), 4,75 (m, verdeckt durch HOD), 3,2 - 2,1 (m, 12H), 2,1 - 1,3 (m, 5H); IR (KBr): 2954, 1708 cm&supmin;¹; HPLC: (40:15:25, MeOH:THF:H&sub2;O, 5 mM Heptansulfonsäure) Tr = 11,6 Minuten, Kp = 3,64, Whatman partisil 10-ODS-2, 1 ml/Minute; [α]D&sub2;&sub0; = -97,6º (c = 12,15, MeOH);
Analyse berechnet für C&sub2;&sub1;H&sub2;&sub4;N&sub4;O&sub6; C&sub4;H&sub4;O&sub4;: C = 55,14; H = 5,18; N = 10,28
Gefunden: C = 55,04; H = 5,40; N = 10,31

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Beispiel VIII

Die Verstärkung des Calciumeinstroms durch die Plasmamembran

Dieses Versuchssystem wurde entwickelt um die relative Fähigkeit der Verbindungen zur Verstärkung des Calciumeinstroms in Zellen durch spannungsempfindliche Calciumkanäle zu untersuchen. Das Verfahren verwendet einen Fluoreszenzfarbstoff mit hoher Calciumaffinität um Veränderungen der intrazellularen freien Calciumkonzentrationen zu überwachen. Die Zellen werden mit einer geschützten, nichtfluoreszierenden Form des für Calcium empfindlichen Farbstoffs inkübiert. Die Verbindung durchdringt die Zellwand und tritt in die Zelle ein. Dort wird sie durch Enzyme in den Fluoreszenzfarbstoff Quin 2 überführt, der die Zelle nicht verlassen kann. Quin 2 hat eine hohe Affinität zu Calciumionen und wenn Calcium an den Farbstoff gebunden ist, fluoresziert der Komplex, wobei die Fluorszenzintensität proportional zu der Calciumionenkonzentration ist. Spannungsempfindliche Calciumkanäle werden durch den Zusatz von Kaliumchlorid zu dem Medium aktiviert und es tritt Calciumioneneinstrom auf. Die Fluoreszenzzunahme wird gemessen, wodurch ein relatives Maß für den Calciumeinstrom erhalten wird, der Kontrollwert. In einer separaten Küvette werden sowohl Kaliumchlorid als auch die Versuchsverbindung den Zellen verabreicht und die Fluoreszenz wird gemessen. Ein Calciumagonist sollte den Calciumeinstrom in die Zellen erhöhen und folglich eine Fluoreszenzzunahme bewirken. Durch die Fluoreszenzzunahme wird die prozentuale Stimulation über den Kontrollwert hinaus erhalten.
Differenzierte Murinneuronal(Neuroblastom x Gliom(a))hybridzellen (NG108-15), die eine Fülle von spannungsabhängigen Calciumkanälen enthalten, werden als Gewebequelle zur Untersuchung dieser Verbindungen verwendet.
NG108-15-Zellen werden kurz in 10% CO&sub2; bei 37ºC in Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM), dem Glutamin (1,0 mM), fetales Rinderserum (FBS; 10%), Hypoxanthin (100 uM), Aminopterin (1,0 um) und Thymidin (20 uM) zugesetzt sind, kultiviert. Die Differenzierung wurde durch Behandlung mit Dibutyl-cAMP (4 Tage, 1,0 mM) [L. Noronha-Blob, C. Richard, D. U'Prichard, J.Neurochem. 50, (1988), 1381 - 1390] induziert. Die Zellen wurden durch vorsichtiges Bewegen in warmer D1 physiologischer Kochsalzlösung (Zusammensetzung: 137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,17 mM Na&sub2;PO&sub4;, 0,22 mM KH&sub2;PO&sub4;, 5,5 mM Glukose) geerntet. Dispergierte Zellen (5 * 10&sup6; Zellen/ml) wurden 60 Minuten bei 37ºC mit Quin 2-Acetoxymethylester (Quin 2-AM, der calciumspezifische Farbstoff) [100 uM, in Dimethylsulfoxid (DMSO)] inkubiert. Die Kontrollsuspensionen erhielten nur DMSO. Die Zellen wurden dann mit eiskaltem Medium verdunnt, zentrifugiert (1500 x g, 3 Minuten) und zweimal mit eiskaltem HEPES-Puffer (Zusammensetzung: 130 mM NaCL, 5,0 mM KCl, 6,0 mM Glukose, 1,0 mM MgCl&sub2;, 1,0 mM CaCl&sub2; und 20 mM HEPES, pH 7,4) gewaschen.
Die Fluoreszenz wurde mit einem Perkin-Elmer LS-5 Spektrophotometer bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 339 beziehungsweise 492 nm, und einer Spaltbreite von 15 beziehungsweise 20 nm gemessen. Die Zellen (-3 * 10&sup6;/Küvette) wurden bei 37ºC durch einem magnetischen Zellrührer in Suspension gehalten. Die Depolaristion wurde durch KCl (50 mM) induziert oder, wo es angezeigt ist, durch gleichzeitige Zugabe von KCl und dem Calciumagonisten BAY K 8644. Die Fluoreszenzänderung wurde aus der Differenz zwischen den End- und Anfangswerten berechnet. Die Ergebnisse wurden als eine prozentuale Steigerung über die Kaliumchloridstimulation hinaus (Kontrolle) ausgedrückt.
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle I gezeigt. Tabelle I Agonistenwirksamkeit Isomere der Formel I Prozentuale Stimulation über den Kontrollwert hinaus (Referenzstandard)

Beispiel IX

Steigerung der durch Calciumionen hervorgerufenen Kontraktilität der glatten Muskulatur

Dieser Versuch ist ein Maß für die Fähigkeit der Versuchsverbindungen durch Calciumionen hervorgerufene Muskelkontraktion zu steigern. Eine Muskelprobe wurde in einer Vorrichtung zur Längenmessung unter Spannung gesetzt und durch Zugabe von Kaliumchlorid (zur Aktivierung der Calciumkanäle) kontrahiert, gefolgt von der Zugabe einer Calciumionenlösung. Die Zugabe eines Calciumagonisten sollte den Einstrom zusätzlicher Calciumionen bewirken und dadurch weitere Muskelkontraktion hervorrufen. Es wurde die niedrigste Konzentration der Versuchsverbindung gemessen, die zur Erzeugung dieser zusätzlichen Kontraktion notwendig war, sowie die erhaltene maximale Kontraktion und die Konzentration bei der sie erreicht wurde.
Das Ileum eines männlichen Albino-Meerschweinchens wurde in 3 - 4 cm lange Segmente zerschnitten. Der Längsmuskel, mit anliegendem Plexus myentericus, wurde vom Zirkularmuskel abgetrennt. Die Gewebe wurden in 10 ml Glasgewebebädern mit Wassermantel, umfassend eine Tyrodeslösung (137 mM Natriumchlorid, 2,7 mM Kaliumchlorid, 1,8 mM Calciumchlorid, 1,1 mM Magnesiumchlorid, 0,4 mM Natriumdihydrogenphosphat und 5,6 mM Dextrose), suspendiert. Die Bäder wurden auf 37ºC gehalten und mit 95% Sauerstoff/5% Kohlendioxid begast. Jede Zubereitung wurde unter einer Ruhespannung von 0,3 g suspendiert. Die Gewebe wurden für 24 Minuten in calciumfreie Tyrodeslösung überführt, wobei die Lösung alle vier Minuten vollständig ersetzt wurde. Dann wurde Kaliumchiorid zugesetzt um eine Badkonzentration von 80 nM zu erzeugen und Calciumlösungen wurden kumulativ zugegeben um die Badcalciumionenkonzentration auf 0,2 - 8,0 mM zu erhöhen. Die Gewebe wurden in normaler Tyrodeslösung und dann calciumfreier Tyrodeslösung reäqiulibriert. Die Steigerung der durch Calcium hervorgerufenen Kontraktionen in Gegenwart des Arzneimittels wurde bestimmt, indem das kumulative Zugabeverfahren wiederholt wurde, nachdem die Gewebe dem Arzneimittel 6 Minuten ausgesetzt waren. Die Reaktionen wurden relativ zur maximalen Kontraktion ausgedrückt, die für Calciumionen in der Abwesenheit des Arzneimittels ermittelt worden war. Die Werte dieses Experimentes sind in Tabelle II gezeigt. Der Grenzwert der Steigerung ist die niedrigste Konzentration der Verbindung, die eine Steigerung der durch Calcium hervorgerufenen Kontraktion bewirkt. Die maximale Steigerung ist die Erhöhung oberhalb der Kontrollansprechempfindlichkeit, ausgedrückt als Prozentsatz des maximalen durch Calcium hervorgerufenen Kontraktionskontrollwertes. Die Konzentrationen der Verbindung, die die maximale Steigerung bewirkt, sind ebenfalls aufgeführt. Tabelle II Isomere der Formel I Grenzwert der Steigerung (nM) Maximale Steigerung (% der maximalen Kontraktion) Konzentration bei maximaler Steigerung (nM) (Referenzstandard)

Claims

1. Verbindung der Formel (I)

in der (a) und (b) Asymmetriezentren sind, die gleich oder verschieden sein können und entweder die absolute R- oder S-Konfiguration aufweisen.

2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei das Zentrum (a) die R-Konfiguration aufweist und das Zentrum (b) die S-Konfiguration aufweist.

3. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die (a)- und (b)-Zentren die S-Konfiguration aufweisen.

4. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die (a)- und (b)-Zentren die R-Konfiguration aufweisen.

5. Verbindung nach Anspruch 1, wobei das Zentrum (a) die S-Konfiguration aufweist und das Zentrum (b) die R-Konfiguration aufweist.

6. Arzneimittel, das eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Verdünnungsmittel enthält.

7. Arzneimittel nach Anspruch 6 zur Erzeugung kardiotonischer Wirkung.

8. Arzneimittel nach Anspruch 6 zur Behandlung von Stauungsinsuffizienz.

9. Verwendung der Verbindung der Formel I nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Arzneimittels.

10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Zusammensetzung zur Erzeugung kardiotonischer Wirkung verwendbar ist.

11. Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Zusammensetzung zur Behandlung von Stauungsinsuffizienz verwendbar ist.