DE69017990T2

DE69017990T2 - Phosphorylierte derivate von l-dopa und zusammensetzungen phosphorylierte derivate von l-dopa und zusammensetzungen.

Info

Publication number: DE69017990T2
Application number: DE69017990T
Authority: DE
Inventors: Michael P Osber; John M Pawelek
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1989-04-07
Filing date: 1990-04-02
Publication date: 1995-08-10
Anticipated expiration: 2010-04-03
Also published as: DE69017990D1; EP0418375A1; DK0418375T3; ES2073024T3; EP0418375B1; ATE120200T1; WO1990012016A1; US5100654A; EP0418375A4

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Technisches Feld der Erfindung

Die Erfindung betrifft phosphorylierte L-Dopa-Derivate und diese enthaltende Zubereitungen sowie Verfahren zur Erhöhung des Melaningehalts in Haut und Haaren von Säugern unter Verwendung dieser Zubereitungen.

Hintergrundinformation

Das U.S. Patent 4 508 706 beschreibt die Herstellung und die Verwendung von phosphorylierten Derivaten von L-3,4- Dihydroxyphenylalanin ("L-Dopa" oder "L-DOPA"), worin die Phosphoryl-Gruppen über eine Sauerstoffbindung sowohl an den 3' oder 4'-Positionen des Phenylalaninrings verestert sind. Diese Isomere werden im allgemeinen als "Dopa-Phosphate" oder "P-DOPA" oder "p-dopa" bezeichnet. Unter Verwendung von Mausmelanomzellen in Kultur als Modell wurde gefunden, daß bei relativ hohen Konzentrationen (10&supmin;&sup4;-10&supmin;³M) Dopaphosphate die Melaninbildung erhöhen und Cytotoxicität fördern (Pawelek J. and Murray M., Cancer Research, 46, 493-497, (1986)). Es wurde gezeigt, daß diese Wirkungen primär auf die enzymatische Entfernung der Phosphorylgruppen und der folgenden Bildung von L-Dopa zurückzuführen sind. Es ist durch viele frühere Studien etabliert, daß L-Dopa in hohen Konzentrationen auf pigmentproduzierende Zellen cytotoxisch wirkt und auch enzymatisch durch solche Zellen in Melanin umgewandelt werden kann (z.B. Pawelek J., J. Investigative Dermatology, 66, 201-209, (1976).
Auch unter Verwendung von Mausmelanomzellen in Kultur wurde festgestellt, daß geringe Konzentrationen von Dopa-Phosphaten (10&supmin;&sup5;-10&supmin;&sup6;M) nicht cytotoxisch waren und selbst keine feststellbare Wirkung auf die Pigmentproduktion dieser Zellen aufweisen. Jedoch stimulierten Dopaphosphate bei diesen niedrigen Konzentrationen ein Hormonbindesystem in den Zellen und erhöhten die zelluläre Antwort auf das Hormon "Melanotropin" (auch bezeichnet als "Melanozyten stimulierendes Hormon" oder "MSH") (McLane, J., Osber, M. and Pawelek, J., Biochem. Biophys. Research Communications, 145, 719-725, (1987). Eine wichtige Feststellung, die sich bei den Untersuchungen von geringen Konzentrationen von Dopa-Phosphaten ergab, war das L-Dopa selbst bei solchen Konzentrationen nicht das MSH-bindende System der Zellen zu stimulieren scheint. Diese Untersuchungen erweckten die Möglichkeit, daß die Phosphorylgruppen mit L-Dopa verestert bleiben müssen, um das MSH-bindende System zu stimulieren.
Unter Verwendung haarloser, pigmentierter Mäuse und pigmentierter Meerschweinchen wurde festgestellt, daß Dopa-Phosphate, nicht aber L-Dopa, die Pigmentierung in der Haut erhöhen. Diese Wirkung wurde am besten beobachtet, wenn Dopa-Phosphate in Verbindung mit geringen Dosen ultravioletten Lichts angewendet wurden (Pawelek J., et al, "Advances in Pigment Cell Research" in Progress in Clinical and Biological Research, Volume 256, J.E. Bagnara, ed. Alan R. Liss, Inc., N.Y., pp. 143-154, (1988); Agin P.P., Sayre R.M. and Pawelek J., Pigment Cell Research, 1, 137-142), (1987). Unter Verwendung von Melanomzellen in Kultur, Mäusen und Meerschweinchen wurde festgestellt, daß ultraviolettes Licht den Melaningehalt in der Säugerhaut durch Stimulierung des MSH-bindenden Systems zu erhöhen scheint, ebenso wie bei Dopa-Phosphaten (Bolognia J., Murray M. and Pawelek J., J. Invest. Dermatology, im Druck, (1989)). EP 238 826 beschreibt eine hautbräunende Zusammensetzung, die ein Indolderivat enthält.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es ist eine Aufgabe der Erfindung, phosphorylierte Derivate von L-Dopa bereit zu stellen.
Eine andere Aufgabe der Erfindung besteht darin, Zusammensetzungen und Verfahren zur Erhöhung des Melaningehalts in der Haut und im Haar von Säugern bereit zu stellen. Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, die Wirksamkeit von Dopa-Phosphaten bei der Erhöhung des Melaningehalts in Haut und Haaren von Säugern zu erhöhen.
Es wird angenommen, daß die Phosphoryl-Gruppe in L-Dopa intakt sein muß, damit die Dopa-Phosphate in wirksamer Weise das Säugerpigment-System stimulieren. Biologische Flüssigkeiten sind jedoch reich an Phosphatase-Enzymen, die Phosphat-Gruppen entfernen können. Ein erstes Merkmal der Erfindung ist die Substitution der Sauerstoffbindung zwischen Phosphoryl-Gruppen und dem Phenylalaninring mit Atomen, die nur in geringem Ausmaß oder überhaupt nicht von Phosphotase-Enzymen erkannt werden, wie Kohlenstoff-, Stickstoff- oder Schwefelatome. Ein zweites Merkmal der Erfindung ist es, hydrophobe Seitenketten an die substituierten Dopa-Phosphate anzuheften, um die Hydrophobizität der Moleküle zu erhöhen, und somit das Potential zur Penetration in die Epidermis der Säugerhaut zu erhöhen.
Die obigen Ziele und weitere Ziele, Gegenstände und Vorteile werden erfindungsgemäß bereitgestellt durch ein phosporyliertes Derivat von L-Dopa der Formel
worin, wenn X (R'O)&sub2; -Z ist und Z CH&sub2;&submin;, N, S oder eine andere Bindung als Sauerstoff bedeutet und wobei diese Bindung die Phosphatgruppe gegen Hydrolyse durch Phosphatase-Enzyme in Geweben und biologischen Flüssigkeiten resistent macht, dann Y OQ bedeutet, worin Q Alkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen ist, oder
worin X OQ ist und Y dann (R'O)&sub2; Z bedeutet, worin R' Wasserstoff oder ein pharmazeutisch verträgliches Kation ist, ausgewählt aus der aus Natrium, Kalium, Calcium, Magnesium, Triethanolamin und Trishydroxymethylaminomethan bestehenden Gruppe und R ein Anteil ist, der die Hydrophobie erhöht und aus der aus Wasserstoff, einem Alkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, einem Alkenyl mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen, einem Alkinyl mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen, einem Aryl, einem Cycloalkyl mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen, einem Heterocyklus mit einem oder mehreren Heteroatomen, ausgewählt aus der aus Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff bestehenden Gruppe oder ein Steroid ist.
Die Erfindung betrifft auch eine Zusammensetzung zum Erhöhen des Melaningehalts in Haut und Haaren von Säugern, beispielsweise Menschen, enthaltend (a) eine wirksame Melanin erhöhende Menge wenigstens eines phosphorylierten Derivats von L-Dopa der Formel
worin, wenn X (R'O)&sub2;P-Z ist und Z CH&sub2;, N, S oder eine andere als eine Sauerstoffbindung bedeutet und wobei diese Bindung die Phosphatgruppe gegen Hydrolyse durch Phosphatase-Enzyme in Geweben und biologischen Flüssigkeiten resistent macht, dann Y OQ bedeutet, worin Q Alkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen ist, oder
worin X OQ ist und Y dann (R'O)&sub2;PZ, worin R' oder ein pharmazeutisch verträgliches Kation ist, ausgewählt aus der aus Natrium, Kalium, Calciun, Magnesium, Triethanolamin und Trishydroxymethylaminomethan bestehenden Gruppe und R ein Anteil ist, der die Hydrophobie erhöht und aus der aus Wasserstoff einem Alkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, einem Alkenyl mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen, einem Alkinyl mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen, einem Aryl, einem Cycloalkyl mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen, einem Heterocyklus mit einem oder mehreren Heteroatomen, ausgewählt aus der aus Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff bestehenden Gruppe, Cholesterol, Steroiden und (b) einem pharmazeutisch verträglichem Träger, beispielsweise einem festen, flüssigen oder verflüssigtem gasförmigen Verdünnungsmittel oder einer sterilen und/oder einer physiologischen isotonischen wässrigen Lösung.

KURZE ERLÄUTERUNGEN DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt eine Reihe von Balkendiagrammen, die die Tyrosinase- Aktivität in kultivierten Melanomzellen unter Hinzufügen von MSH für p-Dopa und für die erfindungsgemäßen Verbindungen herausstellt.
Fig. 2 ist eine Reihe von Balkendiagrammen, die die Tyrosinase-Aktivität in kultivierten Melanomzellen unter Zugabe von MSH für p-Dopa und für erfindungsgemäße Verbindungen herausstellt.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft Analoga von phosphorylierten L-Dopa, worin die Phosphatgruppe an die 3'-Position des Phenylalaninrings über eine Kohlenstoff-Bindung gebunden ist, und Zusammensetzungen derselben und Verfahren zum Erhöhen des Melaningehalts von Haut und Haaren menschlicher Säuger unter Verwendung solcher Zubereitungen. Ferner ist die 4'-Position des Phenylalaninrings durch eine Hydroxylgruppe besetzt, die modifiziert (substituiert) werden kann durch Addition von anderen Verbindungen, wie Methyl-, Ethyl- oder Butylseitenketten oder anderen solcher Ketten, welche die Hydrophobizität des Moleküls erhöhen.
Ferner betrifft die Erfindung phosphorylierte L-Dopa- Analoga, worin die Phosphatgruppe an die 3'-Position des Phenylalaninrings über eine Stickstoff- oder Sauerstoffbindung oder Bindung dieser Art, die von Sauerstoff verschieden ist, gebunden ist und die die Phosphatgruppe gegen Hydrolyse durch Phosphatase-Enzyme in Geweben und biologischen Flüssigkeiten resistent macht und Zusammensetzungen, welche dieselbe enthalten sowie Verfahren zum Erhöhen des Melaningehalts von Säugerhaut und Säugerhaar unter Verwendung dieser Zubereitungen.
Zusätzlich ist die Erfindung auch auf Analoga von phosphoryliertem L-Dopa gerichtet, worin die Phosphatgruppe an die 4'-Position des Phenylalaninrings über eine Kohlenstoff-, Stickstoff- oder Schwefelbindung oder irgendeine Bindung gebunden ist, die von Sauerstoff verschieden ist und die die Phosphatgruppe gegenüber Hydrolyse durch Phospatase-Enzyme resistent macht und auf Zubereitungen, welche dieselbe enthalten sowie Verfahren zur Erhöhung des Melaningehalts in Haut und Haaren von Säugern unter Verwendung solcher Zubereitungen. In dem Fall, in dem das Phosphat an die 4'-Position des Phenylalaninrings gebunden ist, ist die 3'-Position des Phenylalaninrings durch eine Hydroxylgruppe besetzt, die durch Addition anderer Verbindungen wie Methyl-, Ethyl- oder Butylseitenketten oder andere Ketten, die die Hydrophobizitiät des Moleküls erhöhen, modifiziert sein kann.
Die Salzformen, die erfindungsgemäß äußerst nützlich sein können, sind diejenigen, wo Kationen pharmazeutisch verträgliche Kationen sind, ausgewählt aus der aus einund mehrwertigen Metallkationen, Triethanolamin, Tris(hydroxymethyl)aminomethan und ähnlichen Kationen die nicht schnell oxidiert oder reduziert werden, bestehenden Gruppe.
Beispielhafte Metallkationen, die erfindungsgemäß nützlich sind, sind Natrium, Kalium, Calcium und Magnesium und ähnliche. Schnell zu oxidierende oder reduzierende Kationen, die zur Durchführung der Erfindung nicht eingesetzt werden sollen, schließen Eisen und Kupfer ein. Bevorzugte Kationen zur erfindungsgemäßen Verwendung schließen die nicht oxidierbaren und nicht reduzierbaren Kationen ein wie Triethanolamin, Tris(hydroxymethyl)aminomethan, Natrium und Kalium.
In dem Fall, in dem die Zusammensetzung oral oder parenteral verabreicht werden soll, wird die Auswahl des Kations von der Krankengeschichtedes Patienten abhängen, ist der Patient beispielsweise auf einer salzfreien Diät, sollte das Kation nicht Natrium sein.
In Formel (I) bedeutet Alkyl einen geradkettigen oder einen verzweigten Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen. Ein niederes Alkyl mit 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen ist bevorzugt. Nicht begrenzende Beispiele solcher Alkylreste sind Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, Pentyl, Isopentyl, Hexyl, Isohexyl, Heptyl, Isoheptyl, Octyl und Isooctyl.
In der Formel (I) von R bedeutet Cycloalkyl einen cyklischen Kohlenwasserstoffrest mit drei bis acht Kohlenstoffatomen. Die Cyclopentan- und Cyclohexanringe sind bevorzugt. Nicht begrenzende Beispiele von Cycloalkyl sind Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl und Cyklooctyl.
In Formel (I) für R, bedeutet Alkoxy einen geradkettigen oder verzweigten Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, der über ein Sauerstoffatom gebunden ist. Ein niederes Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist bevorzugt. Ein Alkoxyrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist insbesondere bevorzugt. Nicht begrenzende Beispiele von Alkoxy sind Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropoxy, Butoxy, Isobutoxy, Pentoxy, Isopentoxy, Hexoxy, Isohexoxy, Heptoxy, Isoheptoxy, Octoxy oder Isooctoxy.
In der Formel (I) für R bedeutet Aryl einen aromatischen Rest mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen. Besonders bevorzugte Arylreste sind Phenyl, Naphthyl und Biphenyl. Auch schließt Aryl substituiertes Aryl ein, wie Phenoxy und Phenylthio.
In Formel (I) können Alkyl, Cycloalkyl, Alkoxy, Aryl, Alkinyl, Alkenyl und Heterocyclen nicht substituiert oder durch einen oder mehrere Substituenten wie Halogen, beispielsweise Chlor, Fluor, Jod und Brom, Nitro, Cyano, Hydroxy oder Amino substituiert sein. Aryl, Heteroaryl und Cycloalkyl können ebenfalls durch ein Alkyl mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen substituiert sein.
Nicht begrenzende Beispiele von heterocyklischen Ringen für R in Formel (I) schließen Furan, Furfural, Pyrrol, Pyrrolidine, Pyrrolin, Prolin, Pyrazol, Pyridin, Thiophen, Imidazol, Oxazol, Thiazol, Pyrimidin, Purin, Chinolin und Carbazol ein.
In Formel (I) bezieht sich Steroid auf eine Familie von Verbindungen, die den Perhydro-1,2-cyclopentanphenanthrenring enthalten. Nicht begrenzende Beispiele dieser Steroide schließen Cholesterol, Estradiol, Progesteron, Testosteron und Androsteron ein.
Pharmazeutisch verträgliche Träger, die zur Durchführung der Erfindung nützlich sind, sind bekannt und schließen ein zur Injektion, destiliertes Wasser, zur kontrollierten Freisetzung, Mikrokapseln, die Carboxymethylen-Copolymere enthalten, zur transdermalen Freisetzung, Acrylamide, und zur topischen Applikation, kosmetische Grundlagen.
Falls erwunscht, enthält die erfindungsgemäße Zubereitung wenigstens ein Additiv, ausgewählt aus der aus Lösungsmitteln, Duftstoffen, Sonnenschutzmitteln, Konservierungsmitteln und Chelatbildnern bestehenden Gruppe.
Zur Durchführung der Erfindung nützliche kosmetische Basen sind bekannt und schließen Lotionen, Cremes, Salben und Puder ein. Beispiele solcher Basen können in den U.S. Patentschriften 4 228 151, 4 282 206 und 2 949 403 gefunden werden.
Lösungsmittel zur erfindungsgemäßen Verwendung schließen Ethanol, Isopropylalkohol, Benzylalkohol, Öle, beispielsweise Öl von gemahlenen Nüssen, destilliertes und/oder entmineralisiertes Wasser, physiologische Kochsalzlösung u.ä. ein. Die spezifischen ausgewählten Lösungsmittel werden von dem Applikationsverfahren abhängen.
Duftstoffe zur Herstellung von Zubereitungen zum Tönen oder Sonnenbräunen sind bekannt, diese bedürfen keiner weiteren Diskussion.
Es mag auch wünschenswert sein, ein Konservierungsmittel den erfindungsgemäßen Zubereitungen hinzuzufügen, wenn sie für topische Applikationen verwendet werden.
Konservierungsmittel sind bekannt, beispielhaft sind Methylparaben, "DOWACIL 2000" und Propylparaben zu nennen.
Sonnenschutzmittel zur topischen Verwendung gemäß der Erfindung schließen die meisten im Handel erhältlichen Sonnenschutzmittel ein, insbesondere diejenigen, die durch die Monogaphie On Suncreens, Fed. Register, Par 2, 43 (Aug.25, 1978) als sicher und wirksam beschrieben sind. Zusätzliche Sonnenschutzmittel sind beispielsweise in den U.S.-Patentschriften 4 264 581, 2 949 403 und 4 256 664 beschrieben.
Da solche Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen phosphorylierten L-DOPA Derivate enthalten, durch reduzierbare oder oxidierbare Kationen, beispielsweise Kupfer oder Eisen, oder auch durch überschüssige Mengen mehrwertiger Kationen wie Calcium oder Magnesium deaktiviert werden können, ist es häufig wünschenswert, daß solche Zubereitungen Chelatbildner enthalten, von denen viele, wie Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) bekannt sind.
Falls erwünscht können zur Verringerung der Azidität oder der Basizität der Zubereitungen Basen, Säuren oder Puffer gemäß dem Wissen des Fachmanns hinzugefügt werden.
Werden sie topisch auf die Säugerhaut, transdermal oder oral verabreicht, erhöhen die Zubereitungen den Melaningehalt von Haut und Haaren. Anstiege im Melaningehalt sind am deutlichsten, wenn die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in Verbindung mit niedrigen Dosen ultravioletten Lichts verwendet werden. Dieses UV-Licht oder die UV-Bestrahlung wird während oder nach der Verabreichung der die Melaninbildung verstärkenden Zubereitung angewendet. Diese Dosen ultravioletten Lichts erzeugen allein geringen oder keinen Anstieg des Melaningehalts der Haut.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird auch ein Tönungsverfahren für einen Menschen bereitgestellt auch für solche, die nur eine geringe Konzentration von epidermalen Melanozyten aufweisen, beispielsweise Menschen, die an Vitiligo oder anderen Störungen oder Hypopigmentation, beispielsweise Okulokutaneous Albinismus, Nevus Depigmentosus, Ito-Hypomelanosis, idiopathische Guttathypomelanosis und Pityriasis alba leiden. Eine hervorragende Übersicht über Hypopigmentierung findet sich in Jean L. Bolognia und John M. Pawelek, Journal of the American Dermatology, Vol. 19, No. 2, Part 1, Augut 1988, 217-258.
Die erfindungsgemäßen phosphorylierten L-DOPA Derivate sind in den Melanin erhöhenden Zubereitungen für gewöhnlich in Konzentrationen, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zubereitung, von etwa 0,05 bis etwa 1,0 Gew.% vorhanden. Eine bevorzugte Konzentration von phosphorylierten L-DOPA Derivaten gemäß der Erfindung ist etwa 0,02 Gew.%. Die erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten Phosphat-Gruppen, die enzymatisch nicht gespalten werden können. Das bedeutet, daß das erfindungsgemäße p-Dopa eine biologisch wirksame Verbindung ist und nicht nur eine "Vorrats"-Verbindung für Dopa, welches durch enzymatische Spaltung bereit gestellt wird. Da das Phosphat nicht abgespalten wird, bedeutet dies auch, daß keine Beschränkung im Hinblick auf die zu verwendende Konzentration besteht, weil das Material nicht als depigmentierendes Mittel wirkt, da freies Dopa und freie Radikale nicht gebildet werden.
Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die folgenden nicht begrenzenden Beispiele erläutert.

BEISPIELE

Die folgenden Beispiele beschreiben die Synthese von Dopa-Phosphaten, worin die Phosphoryl-Gruppen an der 3'- Position des Phenylalaninrings über eine Kohlenstoffbindung gebunden sind (bezeichnet als 3' Phosphoryl-Carbonyl-dopa Phosphat oder "3-P-C-D"). Vier Vertreter dieser Moleküle wurden synthetisiert und im Hinblick auf ihre Fähigkeit, das Pigmentsystem zu stimulieren geprüft, nämlich die folgenden
3-P-C-D mit einer 4' Hydroxyl-Gruppe;
3'-P-C-D mit einer 4' Methoxy-Gruppe;
3'-P-C-D mit einer 4' Ethoxy-Gruppe;
3'-P-C-D mit einer 4' Butoxy-Gruppe.
Jede der obigen Verbindungen ist wirksam im Hinblick auf die Stimulierung des Pigmentsystems von Melanomzellen in Kultur. Die Verbindungen sind nicht cytotoxisch bei hohen Konzentrationen, was als Hinweis dafür zu werten ist, daß L-Dopa durch Spaltung der Phosphorylbindungen mittels zellulärer Phosphatase-Enzyme nicht gebildet werden kann. Jede dieser Verbindungen zeigt eine Stimulierung des pigmentären Systems von Meerschweinchen, wenn sie in Verbindung mit geringen Dosen ultravioletten Lichts appliziert werden. Die Ethoxy- und Butoxy Derivate sind in Kultur und an Meerschweinchen am wirksamsten. Die folgenden Schlußfolgerungen ergeben sich aus diesen Prüfungen der biologischen Wirksamkeit:
(a) eine intakte Phosphorylgruppe ist erforderlich für die Stimulierung des Pigmentsystems;
(b) das Hinzufügen von längeren hydrophoben Seitenketten (beispielsweise Pentoxy-, Octoxy-, Dodecoxy- oder verschiedenen Typen von hydrophoben Seitenketten (beispielsweise Steroide, Cholesterol) kann die Wirksamkeit von P-C-D gegenüber dem Pigmentsystem erhöhen;
(c) 4'-P-C-D mit hydrophoben Substituenten in der 3'-Position kann ebenfalls ein potenter Stimulator des Pigmentsystems sein;
(d) die Substitution der Sauerstoffbindungen mit anderen Atomen als Kohlenstoffatomen ergibt wirksame Moleküle.
Nicht begrenzende Beispiele von im Handel erhältlichen Benzaldehyden als Ausgangsmaterialien für die erfindungsgemäßen Verbindungen schließen die folgenden ein:
Hydroxy, Methoxy, Ethoxy, Propoxy, 2-Propoxy, Butoxy, Pentyloxy, Amyloxy, Hexyloxy, Heptyloxy, Octyloxy, Nonyloxy, Decyloxy und Dodecyloxy.

Beispiel 1: 4-Hydroxy-3-chlormethylbenzaldehyd (1)

Durch eine gut gerührte Suspension von 0,1 mol 4-Hydroxybenzaldehyd, 88 ml konzentrierter HCl und 8,8 ml 37%igem wässrigen Formaldehyd wurde HCl-Gas etwa 4 Stunden lang hindurchgeleitet. Aus der Lösung fiel ein Produkt aus. Das Reaktionsgemisch wurde 1,5 Stunden lang gekühlt und dann das Produkt auf einem gesinterten Glastrichter isoliert und insgesamt mit einem Liter kaltem Wasser gewaschen. Schmelzpunkt 123-124 ºC.

Beispiel 2: 2-Hydroxy-5-formylbenzylphosphonsäurediethylester

0,1 mol 4-Hydroxy-3-chlormethylbenzaldehyd wurde in 75 ml Acetonitril gerührt und 0,1 mol Triethylphosphit tropfenweise unter Rühren der Suspension derselben hinzugefügt. Nachdem das gesamte Triethylphosphit hinzugefügt worden war, wurde die Reaktion 4 Stunden am Rückfluß gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Reaktionslösung wurde anschließend filtriert und das Acetonitril in einem Rotationsverdampfer entfernt, wobei ein Feststoff zurück blieb. Dieser wurde umkristallisiert aus THF: Hexan in einem Tiefkühlschrank bei -20 ºC. Das Produkt wurde auf einem Buchnertrichter isoliert und mit -20 ºC kaltem THF gewaschen. Schmelzpunkt 88-88,5 ºC.

Beispiel 3: 2-Hydroxy-5-formylbenzylphosphonsäure (3)

0,1 mol 2-Hydroxy-5-formylbenzylphosphonsäurediethylether wurde 3 Stunden mit 100 ml 6N HCl am Rückfluß gehalten.
Das Produkt wurde während der Bildung abgetrennt. Die Reaktionslösung wurde in einem Kühlschrank gekühlt und das Produkt auf einem Buchnertrichter isoliert und mit kaltem Wasser gewaschen. Schmelzpunkt 252-253 ºC.

Beispiel 4: 5-[4-Hydroxy-3-phosphonomethyl]benzylidenhydantonin (4)

0,1 mol 2-Hydroxy-5-formylbenzylphosphonsäure, 0,1 mol Hydantoin, 0,05 mol Glycin und 100 ml Wasser wurden miteinander gerührt. Der pH-Wert der Lösung wurde auf etwa 9,5 mit 12,5N NaOH eingestellt. Das Reaktionsgemisch wurde auf etwa 85 ºC 3 Stunden lang erwärmt. Die Reaktionslösung wurde anschließend filtriert und das Filtrat auf einen PH-Wert von 1,0 mit konzentrierter HCl eingestellt. Ein Niederschlag bildete sich. Die Suspension wurde über Nacht in einem Kühlschrank belassen und das Produkt auf einem gesinterten Glastrichter isoliert und mit kaltem Wasser gewaschen. Schmelzpunkt 298-299 ºC.

Beispiel 5: 5[4-Hydroxy-3-phosponomethyl]benzylhydantoin (5)

0,1 mol 5[4-Hydroxy-3-phosphonomethyl]benzylidenhydantoin, 165 ml Wasser, 18,2 g 50% NaOH und 3,0 g 5% Pd/C wurden in einen Hydrierer bei 50 psig solange geschüttelt, bis kein Wasserstoff mehr aufgenommen wurde.
Das Reaktionsgemisch wurde dann durch ein Celitpad filtriert und das Pad mit Wasser gewaschen. Der PH-Wert des Filtrats wurde auf pH 1 mit konzentrierter Salzsäure eingestellt und das Wasser mit einem Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wurde umkristallisiert aus kochendem Wasser. Schmelzpunkt 201-203 ºC.

Beispiel 6: 4-Hydroxy-3-phosphonomethylphenylalanin (6)

0,1 mol 5[4-Hydroxy-3-phosphonomethyl]benzylhydantoin, 0,5 mol LiOHxH&sub2;O und 250 ml Wasser wurden 48 Stunden am Rückfluß gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde heiß filtriert und abkühlen gelassen. Der pH-Wert des Filtrats wurde dann auf 1 mit konzentrierter HCl eingestellt. Das Wasser wurde anschließend mittels eines Rotationsverdampfers entfernt. Der Rückstand wurde aus kochendem Wasser mit hinzugefügter Aktivkohle umkristallisiert.
Das Reaktionsschema für die obigen Verbindung (1) bis (6) ist folgendes: Synthese des Hydroxyanalogous Glycin

Beispiel 7: 4-Methoxy-3-chlormethylbenzaldehyd (1a)

0,1 mol 4-Methoxybenzaldehyd, 5 g ZnCl&sub2; und 10 ml 37%iger wässriger Formaldehyd wurden zusammen gerührt. Trockenes HCl-Gas wurde dann 3 Stunden lang durch die Reaktionslösung geleitet. Die Reaktionslösung wurde mit heißem Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde mit Ethanol aufgenommen und das Ethanol in einem Rotationsverdampfer entfernt. Das Produkt wurde aus kochendem Ethanol kristallisiert. Schmelzpunkt 55-57 ºC.

Beispiel 8: 2-Methoxy-5-formylbenzylphosphonsäurediethylester (2a)

In einem Verhältnis von 1:1 wurden 4-Methoxy-3-chlormethylbenzaldehyd und Triethylphosphit gemeinsam erwärmt bis sich kein Gas mehr entwickelte. Die Reaktionslösung wurde anschließend vakuumdestilliert, um das gewünschte Produkt zu ergeben. Kp 172-174 ºC bei einem 1 mm Hg.

Beispiel 9: 5-[4-Methoxy-3-diethylphoshonomethyl]benzylidenhydantoin (3a)

0,1 mol 2-Methoxy-5-formylbenzylphosphonsäurediethylester 0,11 mol Hydantoin, 0,0225 mol Beta-Alanin und 40 ml Essigsäure wurden etwa 7 Stunden lang am Rückfluß gehalten und dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 330 ml mit Wasser verdünnt und das Produkt auf einem Buchner-Trichter isoliert und mit Wasser gewaschen. Schmelzpunkt 206-207 ºC.

Beispiel 10: 5-[4-Methoxy-3-diethylphosphonomethyl]benzylhydantoin (4a)

0,1 mol 5-[4-Methoxy-3-diethylphosphonomethyl]benzylidenhydantoin, 100 ml Wasser, 8,0 g 50% NaOH und 3,0 5% Pd/C wurden gemeinsam in einem Hydrierer bei 50 psig solange geschüttelt bis keine Wasserstoffaufnahme mehr stattfand (etwa 3,5 Stunden). Das Reaktionsgemisch wurde durch ein Celitepad filtriert und das Pad mit Wasser gewaschen. Der pH-Wert des Filtrats wurde auf 1 mit konzentrierter HCl eingestellt. Das Filtrat wurde mit NaCl gesättigt und über Nacht stehen gelassen. Das wässrige Gemisch wurde mit insgesamt etwa 2 l Ethylacetat extrahiert. Das Ethylacetat wurde über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und das Ethylacetat mit einem Rotationsverdampfer entfernt. Schmelzpunkt 121-123 ºC.

Beispiel 11: 5-[4-Methoxy-3-phosphonomethyl]benzylhydantoin (5a)

Zu 0,1 mol 5-[4-Methoxy-3-diethylphosphonomethyl]benzylhydantoin wurden 250 ml trockenes Chloroform und 0,45 mol Bromtrimethylsilan hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde zwei Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel und überschüssiges Bromtrimethylsilan wurden in einem Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand mit 400 ml 95% Ethanol eine Stunde gerührt. Ein Niederschlag bildete sich und wurde auf einem gesinterten Glastrichter isoliert und einmal mit Ethanol/Ether und zweimal mit Ether gewaschen. Schmelzpunkt 255-256 ºC.

Beispiel 12: 4-Methoxy-3-phosphonomethylphenylalanin (6a)

0,1 mol 5-[4-Methoxy-3-phosphonomethyl]benzylhydantoin, 0,4 mol LiOH x H&sub2;O und 285 ml Wasser wurden 24 Stunden am Rückfluß gehalten. Die Reaktionslösung wurde heiß filtriert und abkühlen gelassen. Der pH-Wert der Lösung wurde auf etwa 1,9 mit konzentrierter HCl eingestellt. Das Wasser wurde mit einem Rotationsverdampfer entfernt. Das Produkt wurde aus kochendem Methanol umkristallisiert. Schmelzpunkt 137 ºC.

Beispiel 13: 4-Ethoxy-3-chlormethylbenzaldehyd (1b)

0,1 mol 4-Ethoxybenzaldehyd, 5 g ZnCl&sub2; und 10 ml 37% wässriger Formaldehyd wurden gemeinsam gerührt. Trockenes HCl-Gas wurde durch das Reaktionsgemisch 4 Stunden lang geleitet. Ethylacetat wurde anschließend zu dem Reaktionsgemisch gegeben und die organische Phase mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und das Ethylacetat mit einem Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wurde aus kochendem Methanol umkristallisiert. Schmelzpunkt 74,5-75,5 ºC.

Beispiel 14: 2-Ehtoxy-5-formylbenzylphosphonsäurediethylester (2b)

4-Ethoxy-3-chlormethylbenzaldehyd und Triethylphosphit wurden gemeinsam in einem Verhältnis von 1:1 vermischt und solange erwärmt bis sich kein Gas mehr entwickelte. Die Reaktionslösung wurde vakuumdestilliert, um das erwünschte Produkt zu erhalten. Kp 170-171 ºC bei 0,75 mm Hg.

Beispiel 15: 5-[4-Ethoxy-3-diethylphosphonomethylibenzylidenhydantoin (3b)

0,1 mol 2-Ethoxy-5-formylbenzylphosphonsäurediethylester. 0,11 mol Hydantoin, 0,023 mol Beta-Alanin und 40 ml Essigsäure wurden gemeinsam 7 Stunden lang am Rückfluß gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend auf etwa 400 ml mit Wasser verdünnt. Das Produkt wurde auf einem Buchner-Trichter isoliert und vorsichtig mit Wasser gewaschen.Schmelzpunkt 220-221 ºC.

Beispiel 16: 5-[4-Ethoxy-3-diethylphosphonomethyl]benzylhydantoin (4b)

0,1 mol 5[4-Ethoxy-3-diethylphosphonomethylibenzylidenhydantoin, 135 ml Wasser, 10,84 g 50% NaOH und 3,00 g 5% Pd/C wurden zusammen in einen Hydrierer bei 50 psig geschüttelt bis keine H&sub2;-Aufnahme mehr stattfand. Das Reaktionsgemisch wurde durch ein Celitepad filtriert und das Pad mit Wasser gewaschen. Das Filtrat wurde auf pH 1 mit konzentrierter HCl eingestellt. Die Lösung wurde anschließend mit NaCl gesättigt und über Nacht stehen gelassen. Das Produkt wurde mit Ethylacetat aufgenommen. Das Ethylacetat wurde über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und Ethylacetat anschließend mit einem Rotationsverdampfer entfernt.

Beispiel 17: 5-[4-Ethoxy-3-phosphonomethyl]benzylhydantoin (5b)

Zu 0,1 mol 5-[4-ethoxy-3-diethylphosphonomethyl]benzylhydantoin wurden 250 ml trockenes Chloroform und 0,45 mol Bromtrimethylsilan gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 3 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel und überschüssiges Bromtrimethylsilan wurden mit einem Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wurde mit etwa 400 ml 95% Ethanol 1,5 Stunden gerührt. Es bildete sich ein Niederschlag, der auf einem gesintertem Glastrichter isoliert und mit Wasser gewaschen wurde. Schmelzpunkt 242-244 ºC

Beispiel 18: 4-Ethoxy-3-phosphonomethylphenylalanin (6b)

0,1 mol 5-[Ethoxy-3-phosphonomethyl]-benzylhydantoin, 0,4 mol LiOH x H&sub2;O und 300 ml Wasser wurden gemeinsam 24 Stunden lang am Rückfluß gehalten. Die Reaktionslösung wurde heiß filtriert. Das Filtrat wurde abgekühlt und der pH-Wert auf etwa 2 mit konzentrierter HCl eingestellt. Das Wasser wurde mit einem Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand aus 150 ml kochendem Wasser umkristallisiert.

Beispiel 19: 4-Butoxy-3-chlormethylbenzaldehyd (1c)

0,1 mol 4-Butoxybenzaldehyd, 5 g ZnCl&sub2; und 10 ml 37% wässriger Formaldehy wurden gemeinsam gerührt. HCl-Gas wurde durch die Reaktionslösung etwa 6 Stunden lang durchgeleitet. Die Reaktion wurde anschließend unterbrochen und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur 48 bis 90 Stunden lang gerührt. Anschließend wurde Ethylacetat zum Reaktionsgemisch gegeben und die organische Phase mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und Ethylacetat mit einem Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wurde vakuumdestilliert, um das erwünschte Produkt zu ergeben. Kp 140 ºC bei 1,25 mm Hg.

Beispiel 20: 2-Butoxy-5-formylbenzylphosphonsäurediethylester (2c)

4-Butoxy-3-chlormethylbenzyldehyd und Triethylphosphit in einem Verhältnis von 1:1 wurden solange erwärmt, bis sich kein Gas mehr entwickelte und das Reaktionsgemisch eine leicht orange Färbung angenommen hatte. Das Reaktionsgemisch wurde dann vakuum destiliert, um das erwünschte Produkt zu ergeben. Kp 188 ºC bei 1,4 mm Hg.

Beispiel 21: 5-[4-Butoxy-3-diethylphosphonomethyl]benzylidenhydantoin (3c)

0,1 mol 2-Butoxy-5-formylbenzylphosphonsäurediethylester, 0,11 mol Hydantoin, 0,0225 Mol Beta-Alanin und 40 ml Essigsäure wurden zusammen etwa 6,5 Stunden am Rückfluß gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Ein Feststoff der sich gebildet hatte, wurde auf 500 ml mit Wasser verdünnt und der Feststoff in kleine Stücke zerbrochen. Das Produkt wurde mit einem Buchner-Trichter isoliert und mit Wasser gewaschen. Schmelzpunkt 197,5 - 200,5 ºC. 1,0 g des Produkts wurde umkristallisiert aus einer kochenden Lösung von 10 ml Wasser und 11 ml DMSO. Schmelzpunkt 206,5-207 ºC.

Beispiel 22: 5-[4-Butoxy-3-diethylphosphonomethyl]benzylhydantoin (4c)

0,1 mol 5-[4-Butoxy-diethylphosphonomethyl]benzylidenhydantoin, 115 ml Wasser, 9,61 g 50 % NaoH, 16 ml Ethanol und 3,07 g 5 % Pd/C wurden gemeinsam in einem Hydrierer bei 50 psig geschüttelt bis kein Wasserstoff mehr aufgenommen wurde (etwa 3 Stunden). Das Reaktionsgemisch wurde durch ein Celitepad filtriert und das Pad mit 12,5 % Ethanol gewaschen. Der pH-Wert des Filtrats wurde auf 1 mit konzentrierter HCl eingestellt und das Filtrat mit NaCl gesättigt und über Nacht stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde mit insgesamt etwa 750 ml Ethylacetat extrahiert. Ethylacetat wurde über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und das Ethylacetat mit einem Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wurde in 200 ml siedendem Ethylacetat gelöst und auf 0 ºC über Nacht abgekühlt. Das Produkt wurde auf einem gesinterten Glastrichter isoliert und mit 0 ºC kaltem Ethylacetat gewaschen. Schmelzpunkt 133-134 ºC.

Beispiel 23: 5-[4-Butoxy-3-phosphonomethyl]benzylhydantoin (5c)

Zu 0,1 mol 5-[4-Butoxy-3-diethylphosphonomethyl]benzylhydantoin wurden 25 ml trockenes Chloroform und 0,45 mol Bromtrimethylsilan hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 3 Stunden lang gerührt. Das Lösungsmittel und überschüssiges Bromtrimethylsilan wurden in einem Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wurde eine Stunde lang mit 800 ml 95 % Ethanol gerührt. Ein Niederschlag bildete sich und wurden auf einem gesintertem Glastrichter isoliert und mit Ether gewaschen. Schmelzpunkt 252-253 ºC.

Beispiel 24: 4-Butoxy-3-phosphonomethylphenylalanin (6c)

0,1 mol 5-[4-Butoxy-3-phosphonomethyl]benzylhydantoin, 0,4 mol LiOH x H&sub2;O und 25 ml Wasser wurden gemeinsam 24 Stunden am Rückfluß gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde heiß filtriert, das Filtrat abkühlen gelassen und der pH- Wert auf etwa 2 mit konzentrierter Salzsäure eingestellt. Ein öliger Niederschlag wurde erhalten, der aus kochendem Wasser Ethanol umkristallisiert wurde. Ein Reaktionsschema für die Beispiele 7 bis 24 wird nachfolgend dargestellt. Synthese von Alkoxyanaloge

Beispiel 25: Anbinden der P-C Gruppe an die 4'-Position des Phenylalaninrings

In den folgenden Reaktionsschemata sind alle Temperaturen in ºC angegeben. Reaktionsschema I Rückfluß Toluol Essigsäure Raumtemperatur Reaktionsschema II Rückfluß Toluol Essigsäure Raumtemperatur Halogen H, alkyl N,N-Dimethylformamid

Beispiel 26: Stickstoffderivate von phosphorylierten L-DOPA Derivaten

In den folgenden Reaktionsschemata sind alle Temperaturen in ºC angegeben. Reaktionsschema III Rückfluß Raumtemperatur Triethylbenzylammoniumchlorid Isobutylen Reaktionsschema IV Na Citrat Rückfluß excess Raumtemperatur Triethylbenzylammoniumchlorid Isobutylen Reaktionsschema V Rückfluß Raumtemperatur Triethylbenzylammoniumchlorid Toluol Essigsäure Reaktionsschema VI Rückfluß Raumtemperatur Triethylbenzylammoniumchlorid Toluol Essigsäure Reaktionsschema VII Rückfluß Raumtemperatur Toluol Essigsäure R= H, Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Aroyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl Undecyl, Docecyl und Hexadodecyl Triethylbenzylammoniumchlorid Reaktionsschema VIII Rückfluß Raumtemperatur Toluol Essigsäure Triethylbenzylammoniumchlorid

Beispiel 27: Injizierbare Zubereitung

Eine Lösung wurde hergestellt durch Vermischen von 500 mg eines phosphorylierten Derivates von L-DOPA, wie in den Beispielen 6, 12, 18 oder 24 beschrieben, in Form seines Natriumsalzes mit ausreichend sterilem Wasser, um zwei Volumenteile der endgültigen Lösung herzustellen. Diese Lösung wurde in 2 ml Einzeldosis-Ampullen eingebracht.
Die obige Lösung wurde dem Patienten einmal täglich in einer Dosis von 2 ml je Tag verabreicht.

Beispiel 28: Orales System für die kontrollierte Freigabe

Mikrokapseln eines phosphorylierten Derivats von L-DOPA, beispielsweise desjenigen von Beispiel 6, werden hergestellt durch Versprühen von PD-Körnern mit einer Lösung von Carboxymethylen-Polymeren, (wie "CARBOPOL 934P") um eine Überzugsdicke zu erreichen, welche die phosphorylierten L-DOPA Derivate über einen Zeitraum von 8 Stunden freisetzt.
Die obigen mikroverkapselten Körner werden in Hartgelatinekapseln bis zu einer Menge von 500 mg phosphoryliertem DOPA-Derivat je Kapsel eingebracht.
Die Zubereitung wird dem Patienten in einer täglichen Dosis von 500 mg (d.h. eine Kapsel pro Tag) zwei oder 4 Wochen lang verabreicht.

Beispiel 29: Zusammensetzung zur transdermalen Freisetzung

Es wurde ein Gemisch hergestellt, das enthält Gewichtsteile Acrylamid-Copolymer (z.B. "polytrap FLME 203") phosphoryliertes L-DOPA Derivat, z.B. von Beispiel 6 Alkohol und ein Duftstoff
Das obige Gemisch wurde einmal täglich vorzugsweise am morgen über einen Zeitraum von 2 bis 4 Wochen auf die Haut aufgebracht.

Beispiel 30: Bräunungsöl

A. Ein Gemisch wird hergestellt durch Zusammenfügen in der angegebenen Reihenfolge von Gewichtsteile Decyloleat Isopropylmyristat und Propylenglycoldicaprylat/Dicaprat Mineralöl
B. Ein Gemisch wurde hergestellt durch Hinzufügen von 0,01 pbw phosphoryliertem L-DOPA-Derivat z.B. demjenigen der Beispiele 6, 12, 18 oder 24, zu 0,01 pbw "SOLERTAN PB-10" (einem Poly(propyrenglycol)lanolinether).
C. Das Gemisch von Teil B wurde zu dem Gemisch von Teil A hinzugegeben und das erhaltene Gemisch solange gemischt, bis es homogen war.
D. Die Zubereitung von Teil C wird ein- oder zweimal täglich zwei oder 4 Wochen lang auf die Haut aufgebracht.

Beispiel 31: Sonnenbräunungslotion

Ein Gemisch wurde hergestellt, enthaltend Gewichtsteile ICI G-1800 (z.B. Poly[oxyethylen]21 stearylether Isopropylmyristat Konservierungsmittel Stearylalkohol 2-Hydroxy-3,3,5-trimethylhexylester von Benzolsäure butyliertes Hydroxyanisol
Das obige Gemisch wird auf 70 ºC erwärmt und 60 Teile Wasser, auf 70 ºC vorgewärmt, hinzugegeben. Die erhaltene Mischung wurde gerührt und bei Raumtemperatur abkühlen gelassen.
Zu der obigen Mischung wurden anschließend 1 % Zitronensäurelösung, Q.S., zum Erreichen eines pH-Werts von 5,0 gegeben, wonach 0,01 Gewichtsteile eines phosphorylierten L-DOPA- Derivats, beispielsweise nach den Beispielen 6, 12, 18 oder 24, ebenso wie ausreichend ionisiertes Wasser hinzugefügt, um 100 Gewichtsteile einer Lotion zu erhalten.
Die obige Lotion wurde eine halbe Stunde vor Sonnenbestrahlung angewendet. Nach Schwimmen, Schwitzen oder Abtrocknen wie auch nach jeder Stunde in der Sonne wurde die Lotion wiederum aufgetragen.

Beispiel 32: Stimulierung der Pigmentierung und Tyrosinaseaktivität in kultivierten Melanom-Zellen

Cloudman S91 Maus Melanom-Zellen wurden nach dem Verfahren von John Pawelek, "Methods for Serum-Free- Culture of Neuronal and Lymphoid Cells", siehe S. 61 in Cell Culture Methods for Molecular and Cell Biology, Vol. 4, Editors David W. Barnes, David A. Sarbasku und Gordon H. Sato, Pub: Allan R. Liss, N.Y., N.Y. kultiviert.
Die Zellen wurden mit oder ohne Beta-Melantropine (MSH) (10&supmin;&sup8;M) in den Kulturmedien gezogen. Ferner waren in den Kulturmedien p-Dopa enthalten (beschrieben in U.S.-Patent 4 508 706, dessen gesamter Inhalt in diese Offenbarung eingeschlossen sein soll) oder die 4 Subtypen der Verbindungen der Formel
worin R' H und Q entweder Wasserstoff, eine Methoxy-, Ethoxy- oder Butoxygruppe ist. Die Verbindungen wurden in Konzentrationen von 10&supmin;&sup7;, 10&supmin;&sup5; oder 10&supmin;³M hinzugegeben.
Nach 4 Tagen in Kultur ohne Wechsel der Medien wurden die Zellen aus den Kulturkolben mit EDTA geerntet (Pawelek, "Methods for Serum-Free Culture of Neuronal and Lymphoid Zells", supra), durch Zentrifugieren pelletiert und die Farbe der Pellets visuell durch verschiedene Beobachter unabhängig voneinander festgestellt. Die Zellanzahl wurde mittels Coulter Counter bestimmt und die Zellen in einem nichtionischen Detergenz (Triton X100 Vol/Vol) bei einer Konzentration von 2 x 10&sup6; Zellen/ml Detergenz lysiert. 75 microliter des Zellysats (entsprechend 1,5 x 10&sup5; lysierter Zellen) wurden auf Tyrosinaseaktivität untersucht (siehe Seite 64 in Pawelek, "Methods for Serum-Free Culture of Neuronal and Lymphoid Cells", supra) unter Verwendung der Bildung von Tritiumwasser aus Tritiumtyrosin als Testverfahren.
Die Tyrosinase ist ein Enzym in Pigmentzellen, welches die geschwindigkeitsbegrenzenden Stufen der Melaninsynthese katalysiert. In den meisten Fällen und das schließt die Cloudman Melanomzellen in Kultur ein, ist die Tyrosinaseaktivität proportional zum Melaningehalt der Zellen. Somit ist das Messen der Tyrosinase analog zur Bestimmung des Melanins. Die Einheiten zur Bestimmung der Tyrosinase sind "cpm des gebildeten Tritiumwassers".
Ohne MSH, sind Pigmentierung und Tyrosinaseaktivitäten extrem niedrig, egal ob die verschiedenen Formen des phosphorylierten Dopas zu den Kulturmedien hinzugegeben wurden oder nicht. Die Impulse je Minute des gebildeten Tritiumwassers mittelten sich in den meisten Fällen bei etwa 200. Die Hydroxy- und Ethoxyverbindungen schienen die Tyrosinase zu stimulieren aber in einem geringeren Ausmaß, als wenn MSH den Medien hinzugefügt wurde. Siehe Fig. 1.
MSH selbst erhöhte die Bildung von Tritiumwasser auf etwa 4400 cpm. Wo die verschiedenen Verbindungen hinzugefügt wurden, stimulierten sie die Tyrosinaseaktivität in verschiedenen Ausmaßen über die MSH-Stimulierung (soviel wie etwa um das 2,5-fache in einigen Fällen, wie aus Fig. 2 ersichtlich).
Visuell war das in den Zellpellets vorliegende Melanin proportional zur Tyrosinaseaktivität. Das bedeutet, daß beispielsweise 10&supmin;³M Butoxy- und Ethoxyverbindungen gemeinsam mit MSH eine viel stärkere Pigmentantwort ergaben, als MSH alleine.
Es ist festzustellen, daß MSH mehr oder weniger äquivalent zum UV-Licht ist (siehe Bolognia, Murray and Pawelek, J. Invest. Dermatologv, (1989)). In Kultur wird MSH als synergistisches Mittel für die Phosphodopas verwendet, bei Tieren wird UV-Licht eingesetzt.

Beispiel 33: Stimulierung der Pigmentierung in Meerschweinchen mit Butoxy P-C Dopa und niedrigen Dosen UV-Licht

Ein Meerschweinchen wurde rasiert. Eine frühere Fläche erhielt nur eine Bestrahlung mit Ultraviolett B (UVB) (400mJ/cm² x 4 Tage) + Vehikel. Eine spätere Fläche erhielt UVB + 20 Microliter einer 0,02% Lösung der Butoxyverbindung 4 Tage lang, die manuell mit Latexhandschuhen in einem Vehikel von Tris und Glycerol apliziert wurde (siehe Methodenteil in Bolognia, Murray and Pawelek, J. Invest. Dermatology, (1989), for vehicle and methods of applying compounds, administering UVB, etc.). Die seitlichen Flächen erhielten nur das Vehikel (links) oder nur die Butoxyverbindung (rechts). Die einzige Pigmentbildung trat in der späteren Fläche auf. Der Schluß ist, daß die Butoxyverbindung und UVB in geringen Dosen die Pigmentbildung stimulieren.

Claims

1. Phosphorylierte L-Dopa-Verbindung der Formel

worin, wenn X (R'O)&sub2; -Z ist und Z CH&sub2;, N oder S bedeutet und wobei diese Bindung die Phosphatgruppe gegen Hydrolyse durch Phosphatase-Enzyme in Geweben und biologischen Flüssigkeiten resistent macht,

dann Y OQ bedeutet, worin Q Alkyl mit eins bis zwölf Kohlenstoffatomen ist, oder

worin X OQ ist und Y dann (R'O)&sub2; Z bedeutet, worin R' Wasserstoff oder ein pharmazeutisch verträgliches Kation ist, ausgewählt aus der aus Natrium, Kalium, Calcium, Magnesium, Triethanolamin und Trishydroxymethylaminomethan bestehenden Gruppe und R ein Anteil ist, der die Hydrophobie erhöht und aus der aus Wasserstoff, einem Alkyl mit ein bis zwölf Kohlenstoffatomen, einem Alkenyl mit zwei bis zwölf Kohlenstoffatomen, einem Alkinyl mit zwei bis zwölf Kohlenstoffatomen, einem Aryl, einem Cykloalkyl mit drei bis acht Kohlenstoffatomen, einem Heterocyklus und einem Steroid bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

2. Phosphorylierte L-Dopa-Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 der Formel

3. Phosphorylierte L-Dopa-Verbindung der Formel

worin Q ausgewählt ist aus der aus CH&sub3;, CH&sub3;CH&sub2; und CH&sub3;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2; bestehenden Gruppe.

4. Eine Zusammensetzung zum Erhöhen des Melaningehalts in Säugetierhaut und -Haar, enthaltend (a) eine wirksame melaninerhöhende Menge wenigstens einer phosphorylierten L-Dopa Verbindung nach Anspruch 1 und (b) einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

5. Eine Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin die phosphorylierte L-Dopa-Verbindung der Formel

entspricht.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin die phosphorylierte L-Dopa-Verbindung der Formel

entspricht, worin Q ausgewählt ist aus der aus CH&sub2;, CH&sub3;CH&sub2; und CH&sub3;CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2; bestehenden Gruppe.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 4, die ferner wenigstens einen Zusatzstoff enthält, der aus der aus Sonnenschutzmittel, Konservierungsstoffen, Chelatbildnern, Lösungsmitteln und Säureregulatoren bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin der Träger eine zur topischen Applikation geeignete kosmetische Grundlage ist.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin der Träger ein zur parenteralen Verabreichung geeignetes Lösungsmittel ist.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin der Träger zur oralen Verabreichung geeignet ist.