Technisches Gebiet
-
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung einer
intraokulären Ausspül-Lösung, welche die Risiken einer
Schädigung an intraokulären Geweben verringert, welche verwendet
wird, wenn auf dem Gebiet der chirurgischen Behandlung von
Augenerkrankungen die Operationsstelle innerhalb des Augapfels
liegt, und insbesondere die Risiken einer Verletzung der
intraokulären Gewebe, unter anderem des Hornhaut-Endotheliums,
verringert.
-
So bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung von
L-Ascorbin-2-phosphat-säure (1)
-
oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes derselben zur
Herstellung einer Ausspül-Lösung zur Verhinderung von
Schädigungen an intraokulären Geweben.
Stand der Technik
-
Mit den jüngsten raschen Fortschritten bei den chirurgischen
Techniken auf ophthalmologischem Gebiet sind verschiedene
Augenerkrankungen, bei welchen in der Vergangenheit eine
medikamentöse Therapie die einzige Behandlungsweise war oder bei
welchen praktisch keine verfügbar war, Indikationen für die
Chirurgie geworden und der Umfang derartiger Indikationen dehnt
sich ständig aus.
-
Katarakt-Chirurgie heute kann als die vorherrschendste
chirurgische Behandlung auf ophthalmologischem Gebiet angeführt werden
und die Vitrektomie, welche zur Behandlung von z.B.
proliferativer Vitreoretinitis ausgeführt wird, ist eine weitere Operation,
welche auf diesem Gebiet wohlbekannt ist.
-
Von allen, bei Augenerkrankungen ausgeführten chirurgischen
Verfahren sind die Katarakt-Chirurgie und Vitrektomie als Zahl
der operierten Fälle ausgedrückt die meistvertretenen, an
Stellen innerhalb des Augapfels ausgeführten Operationen. Da diese
Operationen ausnahmslos durch Einschneiden der Hornhaut oder
Sklera, welche die äußerste Schicht des Bulbus bildet, und
Emulgieren oder Ausschneiden und Absaugen des geschädigten
Gewebes mit der Spitze eines in den Augapfel eingeführten
chirurgischen Instruments durchgeführt werden, bergen sie das
Risiko, ein Auslaufen von Kammerwasser oder Glaskörper aus der
Schnittöffnung während der Operation hervorzurufen und damit den
Augeninnendruck zu vermindern. Solange keine Vorsorgemaßnahme
getroffen wird, fügen diese Operationen ferner infolge einer
durch Absaugen der Läsion bewirkten übermäßigen Verminderung des
Augeninnendrucks den intraokulären Geweben organische und
funktionelle Schädigungen zu. Zum Zweck des Ausschließens dieser
Risiken ist es allgemein üblich, während der Operation eine
flüssige Wirkstoffzubereitung zum intraokulären Ausspülen
(nachfolgend als intraokuläre Ausspül-Lösung bezeichnet) fortlaufend
in die Nähe der Operationsstelle zu infundieren. Dieses
Verfahren macht die Verluste an Inhaltsstoffen im Bulbus wieder
wett, welche durch Auslaufen von Kammerflüssigkeit und Absaugen
des geschädigten Gewebes verursacht werden, wodurch es während
der Operation zum Erhalt des Augeninnendrucks innerhalb eines
bestimmten Bereichs beiträgt und zur selben Zeit die Blut- und
Gewebereste auswäscht, um ihre Beeinträchtigung des lokalen
Gesichtsfelds zu verhindern und auf diese Weise ein ungestörtes
Operationsfeld sicherstellen hilft.
-
Weil die intraokulären Gewebe während des chirurgischen
Verfahrens mit einer derartigen intraokulären Ausspül-Lösung an und in
der Nähe der Operationsstelle fortlaufend in Berührung gebracht
werden, ist es bekannt, daß sie in Abhängigkeit von ihrer
Zusammensetzung oder Eigenschaften den intraokulären Geweben eine
vorübergehende oder dauerhafte Schädigung zufügen kann.
-
Schädigungen der Hornhaut, insbesondere des
Hornhaut-Endotheliums, sind von allen Schädigungen der intraokulären Gewebe,
welche durch eine intraokuläre Ausspül-Lösung verursacht werden
können, die beängstigendsten. Das Hornhaut-Endothelium ist die
innerste (hinterste) Schicht der dreilagigen Hornhautstruktur,
eine transparente Haut, welche den vorderen Teil des Auges
bildet und aus dem Epithelium, dem Stroma und dem Endothelium
besteht und aus einer einzigen Schicht regelmäßig angeordneter
Endotheliumzellen gebildet wird, welche ein im allgemeinen
hexagonal angeordnetes Muster zeigen. Obschon das
Hornhaut-Epithelium eine Schicht so dick wie eine Einzelzelle ist, besitzt es
verschiedene, für den physiologischen Normalzustand der Hornhaut
wesentliche Funktionen und spielt daher beim Erhalt der
physiologischen Funktion der gesamten Hornhaut eine wichtige Rolle.
Das Hornhaut-Endothelium regelt den Wassergehalt des Stromas,
was ein Faktor ist, welcher sehr zur Lichtdurchlässigkeit der
Hornhaut und dem selektiven gegenseitigen Durchdringen und dem
Substanztransport zwischen dem Kammerwasser und dem Hornhaut-
Stroma beiträgt, um nur seine Hauptfunktionen anzuführen.
Außerdem dient das Hornhaut-Endothelium als Barriere für den
Substanztransport von der Hornhaut zum Kammerwasser oder umgekehrt,
so daß die für diese Funktionen grundlegende Funktion wirksam
arbeitet (diese Funktion wird nachfolgend als Barrierefunktion
des Hornhaut-Endotheliums bezeichnet). Diese Barrierefunktion
des Hornhaut-Endotheliums wird durch die unversehrten
interzellulären Verbindungskomplexe sichergestellt, welche die
Verbindungslücken zwischen Endotheliumzellen ausfüllen, welche die
freie Wanderung von Substanzen aus dem Kammerwasser in das
Hornhaut-Stroma hemmen. Auf diese Weise steuert das Hornhaut-
Endothelium das selektive Durchdringen und die Überführung von
Wasser und anderen Substanzen auf der Grundlage der
Barrierefunktion und regelt dadurch das Eintritts-Ausgangs-Gleichgewicht
der gesamten Hornhaut, um die Hornhaut in einem gesunden
physiologischen zustand zu erhalten und spielt dadurch eine
unerläßliche Rolle beim Erhalt der Lichtdurchlässigkeit der Hornhaut.
-
Trotz der lebenswichtigen Rolle, welche die
Hornhaut-Endotheliumzellen beim Erhalt der normalen Physiologie und
Lichtdurchlässigkeit der Hornhaut spielen, sind sie, verglichen mit
irgendwelchen anderen intraokulären Geweben und extraokulären
Körpergeweben, gegenüber mit der Chirurgie verbundenen
mechanischen Reizen oder chemischen Reizen, welche auf intraokuläre
Ausspül-Lösungen zurückzuführen sind, äußerst empfindlich und
werden auf diese Weise leicht geschädigt zerstört und
abgestoßen. Es ist weiterhin bekannt, daß sobald bei Primaten die
Endotheliumzellen im Hornhaut-Endothelium einmal vollendet sind,
sie bereits ihre Fähigkeit zum Vermehren durch Zellteilung
verloren haben. Falls daher diese Zellen durch irgendeine
Ursache zerstört und abgestoßen werden, wird die entblößte Fläche
kaum durch Vermehrung der übriggebliebenen Endotheliumzellen
wiederhergestellt, sondern das Wiederherstellen wird
hauptsächlich bewirkt, wenn sich die Zellen in der an die entblößte
Fläche angrenzenden Fläche unter Zudecken der Schädigung in die
geschädigte Fläche ausdehnen. Wenn eine Abschuppung der
Hornhaut-Endotheliumzellen stattfindet, wird auf diese Weise der
Zusammenhang des Hornhaut-Endotheliums wiederhergestellt, der
Gesamtbestand der Zellen, welche das Endothelium bilden, bleibt
aber praktisch nicht wiederhergestellt. Wenn die Zahl toter und
abschuppender Hornhaut-Endotheliumzellen groß ist, ist die
Zelldichte je Flächeneinheit des Hornhaut-Endotheliums deutlich
verringert und wenn dieser Verlust an Endotheliumzellen eine
bestimmte Grenze überschreitet, wird der physiologische Zustand
der Hornhaut durch das Endothelium nicht länger richtig
aufrechterhalten und führt auf diese Weise zum Auftritt einer
irreversiblen Hornhauttrübung und so weiter.
-
Da die Schädigung der Endotheliumzellen von Dauer ist und zu
einer ernsten Störung, wie etwa Hornhauttrübung, führen kann,
ist die wichtigste Anforderung, welche von einer intraokulären
Ausspül-Lösung zur Chirurgie zu erfüllen ist, daß die Lösung
selbst keine nachteilige Wirkung auf das Hornhaut-Endothelium
ausübt. Unter den bekannten Ausspül-Lösungen, welche entwickelt
und hergestellt wurden, um dem vorstehenden Erfordernis soweit
wie möglich zu entsprechen, und heutzutage in Gebrauch sind,
befinden sich Opeguard MA (ein Warenzeichen der Senju
Pharmaceutical Co., Ltd.), BSS (ein Warenzeichen der Alcon Laboratories
Incorporated) und BSS Plus (ein Warenzeichen der Alcon
Laboratories Incorporated).
-
Keine der heutzutage verfügbaren intraokulären Ausspül-Lösungen
entspricht jedoch dem vorgenannten Erfordernis, die
intraokulären Gewebe einschließlich der Hornhaut-Endotheliumzellen völlig
unversehrt zu erhalten, und daher ist eine Grundlagenforschung
zum Entwickeln noch verbesserten Ausspül-Lösungen unternommen
worden.
-
Von den vorgenannten verschiedenen Funktionen des Hornhaut-
Endotheliums, welche für den Erhalt der physiologischen Funktion
der gesamten Hornhaut, d.h. der Funktion des Steuerns des
Wassergehalts des Hornhaut-Stromas, der Funktion des Sicherstellens
einer selektiven Durchdringung und eines Transports
verschiedener Substanzen aus dem Kammerwasser zum Hornhaut-Stroma und
umgekehrt, und der Barrierefunktion des Hornhaut-Endotheliums,
von überragender Bedeutung sind, wird die letztgenannte
Barrierefunktion des Hornhaut-Endotheliums leicht und rasch selbst
durch die geringste auf die Endotheliumzellen ausgeübte
Schädigung beeinträchtigt und ist daher als empfindlicher Indikator
einer Beeinträchtigung des Hornhaut-Endotheliums nützlich.
Überdies kann seine Hydrofunktion experimentell mit hoher
Genauigkeit titriert werden. Aus diesen Gründen hat das Studium der
Barrierefunktion des Hornhaut-Endotheliums in letzter Zeit die
Aufmerksamkeit als eine brauchbare Methode zur Aufklärung des
Einflusses intraokulärer Ausspül-Lösungen auf das Hornhaut-
Endothelium auf sich gezogen. Eine beispielhafte wichtige
Technik
umfaßt das Entfernen des Epitheliums von der Hornhaut, das
Aussetzen der vom Epithelium befreiten Seite der Hornhaut einer
Lösung von 5(6)-Carboxyfluorescein (nachstehend kurz als CF
bezeichnet), welches eine fluoreszierende Substanz ist, und das
Bestimmen der CF-Menge, welche zur vorderen Kammerseite
befördert wird, in zeitlich festgelegten Abständen (Araie: Arch.
Ophthalmol. 104:435, 1986). Es ist bekannt, daß wenn die
Barrierefunktion des Hornhaut-Endotheliums unversehrt ist, die
fluoreszierende Substanz CF praktisch nicht durch das Hornhaut-
Endothelium hindurchgeht, d.h. CF nicht von der Seite des
Epitheliums zur vorderen Kammerseite oder umgekehrt wandert. Wenn
daher die Seite des Epitheliums der Hornhaut einer CF-Lösung
ausgesetzt wird und der Betrag der CF-Wanderung von der Seite
des Endotheliums bestimmt wird, kann das Ausmaß der an den
Verbindungskomplexen der Endotheliumzellen erzeugten Lücken, das
heißt, der Grad der Beeinträchtigung der Barrierefunktion des
Hornhaut-Endotheliums, quantitativ angegeben werden und daraus
kann der Grad der Verletzung der Hornhaut-Epitheliumzellen
ermittelt werden.
-
Auf der anderen Seite ist es bekannt, daß wenn die
physiologische Funktion des Hornhaut-Endothelium beeinträchtigt ist, ein
anormales Eindringen von Wasser in das Hornhaut-Stroma unter
Anschwellen des Stromas und daraus eine Zunahme der Dicke der
Hornhaut als ganzes auftritt. Durch Spülen der Seite des
Endotheliums der aus einem tierischen Auge isolierten Hornhaut mit
einer intraokulären Ausspül-Lösung oder durch Ausspülen der
vorderen Kammer eines tierischen Auges in situ und Messen der in
der Hornhaut hervorgerufenen Dickenänderung kann die Wirkung der
intraokulären Ausspül-Lösung direkt bestimmt werden (H. F.
Edelhauser et al., Arch. Ophthalmol., 93:648 (1975) und Teruo
Yajima et al. Jpn. Rev. Clin. Ophthalmol., 75:1189 (1981)).
Offenbarung der Erfindung
-
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung bemühten sich, eine
Substanz zu entdecken, welche die Gewebetoxizität einer
intraokulären
Ausspül-Lösung beseitigt oder deutlich verringert, und
studierten die Wirkungen verschiedenem neuer intraokulärer
Ausspül-Lösungen, welche durch Hinzufügen verschiedener
Substanzen zu den bekannten intraokulären Ausspül-Grundlösungen
hergestellt wurden, indem sie ein Verfahren zum Beurteilen der
Barrierefunktion des Hornhaut-Endotheliums (in Experiment 1
beschrieben), das eine kultivierte Monoschicht Endotheliumzellen
einsetzt und welches durch Verbessern des vorgenannten
Verfahrens von Shinge et al. aufgestellt wurde, und das vorgenannte in
vitro-Verfahren zum Bestimmen der Hornhautdicke verwendeten. Die
Experimente mittels dieser Zubereitungen zur Beurteilung ihrer
Wirkungen auf die Hornhaut zeigten überraschenderweise, daß ein
bestimmter L-Ascorbinsäure-phosphorsäureester den Beginn einer
Hornhautschädigung hemmt. Die vorliegende Erfindung ist das
Ergebnis des vorstehenden Befundes und darauffolgender
Forschung.
-
So bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine intraokuläre
Ausspül-Lösung, welche dadurch gekennzeichnet ist, daß sie die
bekannte Substanz (I)
-
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz derselben enthält.
Substanz (I) und ihre verschiedenen Salze, wie etwa die
Natrium-, Kalium-, Calcium- und Magnesiumsalze, sind als brauchbare
stabilisierte Ascorbinsäurezubereitungen, wie etwa in der
japanischen Patentanmeldung KOKAI Nr. 62-285759 beschrieben,
bekannt. Andere bekannte Verwendungen für die Substanz (I) und
Salze derselben schließen wie zum Beispiel in der japanischen
Patentanmeldung KOKAI Nr. 63-95287 offenbarte Antioxidantien,
ein wie zum Beispiel in der japanischen Patentanmeldung KOKAI
Nr. 62-198615 offenbartes Mittel zum Verhindern einer Dysplasie
der Eischale, ein wie zum Beispiel in der japanischen
Patentanmeldung KOKAI Nr. 62-175142 beschriebenes Mittel zum
Verhindern einer anormalen Körperform bei Fischen, ein wie zum
Beispiel in der japanischen Patentanmeldung KOKAI Nr. 62-96405
beschriebenes Hautentpigmentierungsmittel, einen wie zum
Beispiel in der japanischen Patentanmeldung KOKAI Nr. 62-63616
beschriebenen Stabilisator für konservierte Erythrozyten, ein
wie in der japanischen Patentanmeldung KOKAI Nr. 62-96408
beschriebenes Munddesodorant ein. Wie vorstehend erwähnt legt
jedoch keine veröffentlichte Literatur die Wirksamkeit der
Substanz (I) und ihrer pharmazeutisch annehmbaren Salze gegen
die Schädigung von Hornhaut-Endotheliumzellen nahe. So wurde
diese Wirkung zum ersten Mal im Verlauf der Entwicklung der
vorliegenden Erfindung entdeckt.
-
Beispiele des pharmazeutisch annehmbaren Salzes der Substanz
(I), welches in der intraokulären Ausspül-Lösung der Erfindung
verwendet werden kann, sind Alkalimetallsalze, wie etwa das
Natriumsalz, Kaliumsalz usw., Erdalkalimetallsalze, wie etwa das
Calciumsalz, Magnesiumsalz und so weiter, und diese Salze können
einzeln oder in Kombination verwendet werden.
-
Zum Formulieren der intraokulären Ausspül-Lösung der
vorliegenden Erfindung kann Substanz (I) vorteilhafterweise in
Kombination mit Natriumchlorid und Kaliumchlorid verwendet werden,
welche gewöhnlich bei der Herstellung intraokulärer
Ausspül-Lösungen verwendet werden. Die Natriumchloridkonzentration liegt
vorzugsweise im Bereich von 80 mMol/l bis 125 mMol/l und die
Kaliumchloridkonzentration liegt vorzugsweise im Bereich von 4
mMol/l bis 10 mMol/l. Unter derartigen anderen Bestandteilen,
welche gewöhnlich bei der Herstellung intraokulärer Ausspül-
Lösungen verwendet werden, befinden sich verschiedene
Elektrolyte,
wie etwa Calciumchlorid, Magnesiumchlorid, Magnesiumsulfit,
Natriumacetat, Natriumphosphat, Kaliumphosphat,
Natriumbicarbonat usw., Kohlenhydrate, wie etwa Glukose usw., Peptide, wie
etwa Glutathion, Glutathiondisulfid usw., und Nukleoside, wie
etwa Adenosin, und so weiter.
-
Die bevorzugte Menge der Substanz (I) oder des pharmazeutisch
annehmbaren Salzes derselben in der intraokulären Ausspül-Lösung
der vorliegenden Erfindung liegt im Bereich von 0,25 mMol/l
- 20,0 mMol/l und bevorzugter im Bereich von 0,5 mMol - 10,0
mMol/l und für noch bessere Ergebnisse im Bereich von 1,0 mMol/l
- 5,0 mMol/l.
-
Der bevorzugte pH der intraokulären Ausspül-Lösung der Erfindung
liegt im Bereich von 7,0 bis 7,5. Ihr osmotischer Druck wird
vorzugsweise auf den Bereich von 260 mOsm - 310 mOsm und
bevorzugter auf den Bereich von 275 mOsm - 305 mOsm eingestellt.
-
Die Wirkungen der intraokulären Ausspül-Lösung der Erfindung auf
den Schutz der Barrierefunktion des Hornhaut-Endotheliums und
den Schutz gegen ein Anschwellen der Hornhaut werden nachstehend
gezeigt.
Versuch 1: Wirkung auf die Barrierefunktion des
Hornhaut-Endotheliums
Verfahren
[Herstellung von Hornhaut-Endotheliumzellen]
-
Die Augäpfel männlicher weißer Kaninchen wurden ausgeschält und
in einem Kulturmedium, welches durch Hinzufügen 10%igen fetalen
Kälberserums zu Dulbeccos modifiziertem MEM (Warenzeichen:
Dulbecco's Modified Eagle Medium "Nissui" 2, Nissui
Pharmaceutical) (nachstehend als DMEM bezeichnet) hergestellt wurde, wurde
die Hornhaut mit einer Schere entlang des Perikornealrings
zerschnitten. Von jeder isolierten Hornhautprobe (8 Augen) wurde
das Endothelium mit der Descemet-Membran abgeschält, in kleine
Stücke geschnitten und mit etwa 5 ml DMEM in einem 75 cm²
Kulturkolben (Warenzeichen: Nunclon Tissue Culture Flask 147589;
hergestellt von Nunc) angesetzt. Nach Haftung der Zellen an den
Kolbenboden wurden etwa 20 ml DMEM zugesetzt und die Zellen
wurden etwa 7 Tage kultiviert, bis das Wachstum auf der
Kolbeninnenwand zusammenfloß. Während dieses Zeitraums wurde das
Medium alle 3 Tage durch frisches ersetzt. Nach Abschluß der
Kultur wurden die Zellen mit 5 ml EDTA-Trypsin (ein 0,01% EDTA
und 0,125% Trypsin enthaltender und keine Calcium- oder
Magnesiumionen enthaltender Phosphatpuffer) verdaut und anschließend
mit einer ausreichenden Menge DMEM vermischt, um die Verdauung
zu beenden. Das Verdaute wurde 2 Minuten bei 1000 Upm
zentrifugiert und die Zellen wurden anschließend gesammelt. Die
geernteten Zellen wurden erneut in DMEM suspendiert und durch ein 200
um-Nylonfilter filtriert, um die Descemet-Membran zu entfernen,
was eine Suspension ausschließlich aus Zellen hinterließ. Diese
Zellsuspension wurde mit DMEM auf 20 ml verdünnt und ein 300 ul-
Anteil der Lösung wurde auf der oberen Oberfläche der
durchlässigen Kollagenmembran angesetzt, welche über die Bodenöffnung
eines Plastikhohlzylinders (10 mm Innendurchmesser x 6 mm Höhe)
angebracht war, der in vier Umfangspositionen 2 mm hohe Schäfte
besaß (Warenzeichen: Cellgen, durchlässige Membran CM-24;
hergestellt von K. K. Koken; nachstehend als "Durchlässigkeitszelle"
bezeichnet). Die Zellen wurden 2 Tage bei 37ºC unter diesen
Bedingungen kultiviert.
[Kultur in Testlösungen]
-
Nach der Kultur wurde die Permeationszelle in eine eine
Testlösung enthaltende 10 cm- (Durchm.) Schale gelegt und die
Endotheliumzellen auf der durchlässigen Kollagenmembran wurden mit
der Testlösung schonend gewaschen. Die Durchlässigkeitszelle
wurde anschließend für 4 Stunden bei 37ºC unter 5% CO&sub2;-95% Luft
in eine getrennte 10 cm- (Durchm.) Schale überführt.
[Testlösungen]
-
Die verwendeten Testlösungen waren die in Beispiel 1
beziehungsweise
2 beschriebenen intraokulären Ausspül-Lösungen und
die intraokuläre Ausspül-Lösung der folgenden Zusammensetzung
(nachstehend als Standardlösung bezeichnet), welche mit den
vorgenannten Testlösungen in Zusammensetzung, pH und osmotischem
Druck identisch war, außer daß 1,2 mMol/l Magnesiumsulfat
anstelle von Substanz (I) enthalten war.
[Zusammensetzung der Standardlösung
(Einheit: mMol/l)]
Magnesiumsulfat
Calciumchlorid
Natriumchlorid
Kaliumchlorid
Natriumacetat
Natriumcitrat
Glukose
Natriumbicarbonat
pH 7,3, osmotischer Druck 290 mOsm
[Bestimmung des Ausmaßes der CF-Durchdringung]
-
CF wurde in jeder Testlösung in einer Endkonzentration von 0,1%
gelöst und die Lösung wurde durch ein 0,45 um-Filter filtriert,
um eine 0,025%ige CF-Lösung (nachstehend als CF-Lösung
bezeichnet) zu ergeben. Die Näpfchen einer einteilig formgepreßten 12-
Näpfchen-Kulturplatte mit 12 zylindrischen Näpfchen, welche
jeweils im Innendurchmesser 23 mm und in der Tiefe 13 mm maßen
(Clusters Dish 3512; hergestellt von Costar), wurden mit 2 ml-
Anteilen der Testlösungen gefüllt. Die mit der entsprechenden
Testlösung inkubierte Durchlässigkeitszelle wurde in umgekehrter
Lage auf einen Bogen Filterpapier gestellt, um die Lösung
innerhalb der Zelle abzusaugen, und anschließend in aufrechter
Lage in das Kulturplattennäpfchen gestellt, welches die
entsprechende Testlösung enthielt. Anßschließend wurden 300 ul der
der einzelnen Testlösung entsprechenden CF-Lösung in die Zelle
gegeben und bei 37ºC unter 5% CO&sub2;-95% Luft kultiviert. Nach
Beginn der Kultur wurden von der Testlösung außerhalb der
Durchlässigkeitszelle in Abständen von 20 Minuten aliquote Anteile
von 200 ul zur Verwendung als Proben zur CF-Bestimmung
entnommen. Nach diesem Probennahmevorgang wurden die Kulturnäpfchen
sofort erneut mit 200 ul-Anteilen der entsprechenden
Testlösungen gefüllt. Jede entnommene Probe wurde 10-fach verdünnt und
die Fluoreszenzintensität der Verdünnung wurde mit einem
Spektrofluorophotometer (Modell F3000, Hitachi) bei einer
Anregungswellenlänge von 497 nm und einer Emissionswellenlänge von 543 nm
gemessen. Die CF-Konzentration wurde anschließend berechnet.
Ergebnisse
-
Wie in Tabelle 1 gezeigt, nahm die CF-Menge, welche die
Monoschicht aus Hornhaut-Endotheliumzellen auf der durchlässigen
Kollagenmembran der Durchlässigkeitszelle während der Inkubation
durchdrang, mit zunehmender Konzentration der Substanz (I) in
der Testlösung ab.
-
Dieses Ergebnis zeigt, daß Substanz (I) das durchdringen von CF
durch die kultivierte Monoschicht aus Hornhaut-Endotheliumzellen
hemmt, was stark darauf hinweist, daß Substanz (I) die
Barrierefunktion des Hornhaut-Endotheliums schützt.
Tabelle 1 Die CF-Durchdringungsmenge
Die CF-Durchdringungsmenge (ug)
Testlösung (Fallzahl)
Standardlösung
Beispiel
Minuten
(Mittelwert ± Standardabweichung)
Versuch 2: Wirkung auf das Anschwellen von kultivierter Hornhaut
Verfahren
Verfahren
-
Die Augäpfel erwachsener Kaninchen wurden gemäß dem Verfahren
von Dikstein et al. (Dikstein S. et al.: J. Physiol., 221:29,
1972) zusammen mit den Bindehäuten und Augenlidern ausgeschält
und jede Probe wurde in einer Hornhaut-Ausspülapparatur fixiert.
Anßschließend wurde die Endotheliumseite der Hornhaut mittels
einer automatischen Infusionsapparatur (KN 204; hergestellt von
Natsume Seisakusho, Ltd.) mit einer der unten angeführten
Testlösungen unter den folgenden Bedingungen bespült: Temperatur der
Ausspül-Lösung 37ºC, Ausspülrate: 0,027 ml/min, Ausspüldruck:
15 mm Hg. Zum Verhindern des Trocknens der Epitheliumseite der
Hornhaut wurde die Epitheliumseite mit Silikonöl (Shin-Etsu
Chemical Industries, Ltd.) geschützt. Die Dicke der Hornhaut
wurde 4 Stunden in Abständen von 1 Stunde mittels eines
Spiegelmikroskops (Warenzeichen: Kohnan Clinical Specular Microscope
400VZ, Kohnan Camera, Ltd.) mit einem Dickenmesservorsatz
gemessen.
[Testlösungen]
-
Die verwendeten Testlösungen waren die in Beispiel 1
beschriebene intraokulare Ausspül-Lösung und die Standardlösung.
Ergebnisse
-
Aus dem in der zugehörigen Zeichnung gezeigten Diagramm ist
ersichtlich, daß die mit der die Substanz (I) (3/2 Magnesiumsalz)
enthaltenden intraokulären Ausspül-Lösung gemäß Beispiel 1
ausgespülte Hornhaut, verglichen mit der mit der
Kontrollstandardlösung ausgespülten Hornhaut, den Dickenzuwachs der
kultivierten Hornhaut deutlich hemmte, welcher ein Anzeiger für
anormales Anschwellen des Hornhaut-Stromas ist. Da die
Kontrollstandardlösung ungefähr dieselbe Menge Magnesiumionen
enthielt wie die intraokuläre Ausspül-Lösung von Beispiel 1,
wurde die beobachtete Wirkung der letzten intraokulären Ausspül-
Lösung als der Substanz (I) innewohnende Wirkung angesehen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
-
Die zugehörige Zeichnung zeigt die Dickenzunahmen der Hornhaut,
welche durch Ausspülen der Kaninchenhornhäute verursacht werden.
Die Abszisse stellt die Zeit nach Beginn des Ausspülens dar und
die Ordinate stellt die Änderung (Zunahme) der Hornhautdicke
dar.
Beste Ausführungsart der Erfindung
Beispiel 1:
-
Die folgenden Bestandteile wurden nacheinander in den
angegebenen Mengen in destilliertem Wasser gelöst und die Lösung wurde
mit Salzsäure auf den angegebenen pH eingestellt und aseptisch
filtriert, um eine intraokuläre Ausspüllösung zu ergeben.
[Zusammensetzung
(Einheit: mMol/l)]
Calciumchlorid
Natriumchlorid
Kaliumchlorid
Natriumacetat
Natriumcitrat
Glukose
Substanz (I) (3/2 Magnesiumsalz)
Natriumbicarbonat
pH 7,3; osmotischer Druck 290 mOsm
Beispiel 2:
-
Die folgenden Bestandteile wurden nacheinander in den
angegebenen
Mengen in destilliertem Wasser gelöst und die Lösung wurde
mit Salzsäure auf den angegebenen pH eingestellt und aseptisch
filtriert, um eine intraokuläre Ausspüllösung zu ergeben.
[Zusammensetzung
(Einheit: mMol/l)]
Calciumchlorid
Natriumchlorid
Kaliumchlorid
Natriumacetat
Natriumcitrat
Glukose
Substanz (I) (3/2 Magnesiumsalz)
Natriumbicarbonat
pH 7,3; osmotischer Druck 290 mOsm
Industrielle Anwendbarkeit
-
Die vorliegende Erfindung stellt eine hochsichere intraokuläre
Ausspül-Lösung bereit, die Substanz (I) oder ein pharmazeutisch
annehmbares Salz derselben enthält. Wie vorstehend in den
Versuchen beschrieben, schützt die intraokuläre Ausspül-Lösung die
vorgenannte Barrierefunktion des Hornhaut-Endotheliums und hemmt
das anormale Anschwellen der Hornhaut, von welchem vermutet
wird, daß es infolge einer Unterfunktion des
Hornhaut-Endotheliums auftritt. Daher hat die Verwendung der intraokulären
Ausspül-Lösung der vorliegenden Erfindung eine Verhinderung der
Schädigung des Hornhaut-Endotheliums zur Folge und hilft, die
Hornhaut in einem normalen physiologischen Zustand zu erhalten,
um auf diese Weise die Wahrscheinlichkeit einer Hornhauttrübung
und anderer intraokulärer Gewebestörungen auszuschließen, welche
auf eine unerläßliche intraokuläre Ausspülung bei einem
intraokulären Eingriff zurückzuführen sind, und stellt somit
eine erhöhte Operationssicherheit sicher.