DE68915876T2

DE68915876T2 - Transformiertes Shigella.

Info

Publication number: DE68915876T2
Application number: DE68915876T
Authority: DE
Inventors: Annick Fontaine; Philippe Sansonetti
Original assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1988-07-15
Filing date: 1989-07-13
Publication date: 1994-09-22
Anticipated expiration: 2009-07-14
Also published as: US7439053B2; KR900702025A; DK65790A; JPH03500368A; EP0351322A1; EP0351322B1; OA09440A; JP3608742B2; AU3879589A; PT91177A; JP2005013234A; DK175464B1; PT91177B; ZA895371B; ATE106941T1; ES2054058T3; US20060257940A1; AR242989A1; JP4277957B2; DE68915876D1

Description

Stand der Technik

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Modifikation des Genoms eines entero-invasiven Wildstammes von Shigella, so daß der modifizierte Stamm praktisch kaum in Zellen und Gewebe eines infizierten Wirtes eindringen kann und sich praktisch kaum innerhalb infizierter Zellen und zwischen infizierten und nichtinfizierten Zellen des Wirtes ausbreiten kann und keine Toxine produzieren kann, die eine bedeutende Zahl von Wirtszellen abtöten. Diese Erfindung betrifft insbesondere einen solchen modifizierten Stamm von Shigella, der zur Immunisierung eines Wirtes gegen den Wildstamm von Shigella verwendet werden kann.
Die Shigellose oder bakterielle Dysenterie ist eine Krankheit, die in der ganzen Welt endemisch ist. Diese Krankheit stellt besonders in tropischen Regionen und Entwicklungsländern ein ernstes Problem des Gesundheitswesens dar, wo Shigella dysenteriae 1 und S. flexneri überwiegen. In den Industrieländern wird die Krankheit hauptsächlich durch S. sonnei ausgelöst, es treten jedoch auch sporadische Fälle von Shigellose auf, die durch S. flexneri, S. boydii und bestimmte entero-invasive Escherichia coli verursacht werden.
Der erste Schritt in der Pathogenese der bakteriellen Dysenterie besteht im Eindringen von Shigella in die menschliche Colonschleimhaut (23). Das Eindringen in die Schleimhaut geht in mehreren Schritten vor sich, umfassend das Eindringen der Bakterien in die Epithelzellen, die intrazelluläre Vermehrung, das Abtöten der Wirtszellen und schließlich die Ausbreitung auf benachbarte Zellen und auf Bindegewebe (9, 41, 55, 56). Der Gesamtprozess, der normalerweise auf die Schleimhautoberfläche beschränkt bleibt, führt zu einer starken Entzündungsreaktion, die für Abszesse und Geschwürbildung verantwortlich ist (23, 41, 55).
Die Dysenterie ist für Shigellose zwar charakteristisch, jedoch kann auch eine wäßrige Diarrhoe vorausgehen. Die Diarrhoe scheint durch eine Störung der Resorption im Colon und eine gesteigerte jejunale Sekretion zustandezukommen, wohingegen die Dysenterie ein reiner Colonprozess ist (20, 41). Im Verlauf der Shigellose können auch systemische Manifestationen auftreten, hauptsächlich bei den durch S. dysenteriae 1 verursachten Fällen. Diese systemischen Manifestationen umfassen toxisches Megacolon, leukämieartige Reaktionen und hämolytisch-urämisches Syndrom ("HUS"). Das letztere stellt die Haupttodesursache durch Shigellose in Entwicklungsländern dar (11, 22, 38).
Die Rolle des Shiga-Toxins, das durch S. dysenteriae 1 in hoher Konzentration produziert wird (6), und von Shiga-ähnlichen Toxinen ("SLT"), die von S. flexneri und S. sonnei in niedriger Konzentration produziert werden (19, 30), in den vier Hauptstadien der Shigellose (d.h. Eindringen in einzelne Epithelzellen, Eindringen in Gewebe, Diarrhoe und systemische Symptome) ist noch unklar. Ein Überblick findet sich in O'Brien und Holmes (32). Plasmide mit 180 bis 220 Kilobasen ("kb") sind in allen Shigella-Arten für das Eindringen in einzelne Epithelzellen essentiell (41, 42, 44). Dies umfaßt den Eintritt, die intrazelluläre Vermehrung und das frühe Abtöten von Wirtszellen (4, 5, 46). Die Rolle von Shiga-Toxin und SLT in diesem Stadium ist unklar. Sie scheinen bei der intrazellulären Vermehrung und dem frühen Abtöten keine entscheidende Rolle zu spielen (4, 12, 46). Jedoch wurden bei keinem der durchgeführten Experimente isogene Mutanten in einem relevanten Zelltestsystem miteinander verglichen. Kürzlich wurde gezeigt, daß Shiga-Toxin für primäre Kulturen menschlicher Colonzellen zelltoxisch ist (27). Für das Eindringen in Gewebe sind weitere chromosomal codierte Produkte erforderlich, zu denen glatte Lipopolysaccharide ("LPS") (44, 57), das nichtcharakterisierte Produkt des Kcp-Locus (8, 44) und Aerobactin (24, 28) zählen. Es wurde herausgefunden, daß ein Bereich des S. flexneri-Chromosoms, der für die Flüssigkeitsproduktion in den Ileumschleifen des Kaninchens notwendig ist, in den rhamtl-Regionen und nahe des Lysin-Decarboxylase-Locus liegt (44). Jedoch konnte nicht nachgewiesen werden, daß die Fähigkeit, eine Flüssigkeitsansammlung zu bewirken, auf den SLT von S. flexneri beruht. Somit ist die Rolle des Shiga-Toxins bei der Auslösung der systemischen Komplikationen von Shigellose noch hypothetisch. Jedoch weiß man, daß das Shiga-Toxin Gefäßschäden verursachen kann, denn die in HUS beobachteten Schäden der Kapillargefäße gleichen denjenigen, die in Gehirngefäßen von Tieren festgestellt wurden, denen dieses Toxin injiziert worden war (1, 2, 22).
Die Rolle dieser Toxine im Krankheitsprozess könnten mit Hilfe einer Mutante gezeigt werden, der das Shiga-Toxin oder SLT fehlen. S. dysenteriae 1, das die größte Menge dieses Zelltoxins produziert, könnte zu einer solchen Shiga-Toxin-negativen Mutante ("Tox&supmin;") transformiert werden und könnte am besten dazu dienen, die Rolle des Toxins zu zeigen -- ungeachtet Sekizaki et al. (48), die eine solche Mutante erhalten hatten, die im HeLa-Zelltest und im Sereny-Test (49) genauso invasiv war wie der Wildstamm. Noch wichtiger wäre es, eine solche Tox&supmin;-Mutante zur Herstellung einer Mutante zu verwenden, die nicht in Zellen eindringen kann und sich praktisch kaum noch innerhalb der Wirtszellen vermehren kann und die sich ferner praktisch kaum innerhalb der infizierten Wirtszellen und von dort zu nichtinfizierten Zellen des Wirts ausbreiten kann und die außerdem keine Toxine produzieren kann, die eine bedeutende Zahl von infizierten wie auch nichtinfizierten Wirtszellen abtöten. Folglich könnte die Tox&supmin;-Mutante zur Immunisierung eines Wirtes gegen einen Wildstamm von Shigella verwendet werden. Zusammenfassung der Erfindung Eine Tox&supmin;-Mutante eines Wildstammes von S. dysenteriae 1 wird gentechnisch hergestellt, indem ein allelischer Austausch mit einem in vitro-mutagenisierten Shiga-Toxin-Gen durchgeführt wird. Die Wirkung dieser Mutation in Zelltestsystemen und bei Tieren zeigt, daß die Mutante gentechnisch weiter verändert werden kann, um eine Mutante bereitzustellen, die praktisch kaum in die Wirtszellen eindringen und sich sodann innerhalb und zwischen den Wirtszellen ausbreiten kann und die keine Shiga-Toxine in Wirtszellen produzieren kann.
Außerdem wird die Tox&supmin;-Mutante des Wildstammes von S. dysenteriae 1 erfindungsgemäß weiterhin gentechnisch verändert, indem ein allelischer Austausch durchgeführt mit
a) einem in vitro-mutagenisierten Gen von S. dysenteriae 1, das ein Protein codiert, welches für S. dysenteriae 1 zum Eindringen in die Zellen sowie die Gewebe eines Wirtes notwendig ist, wie z.B. einem Gen, das ein Protein codiert, welches für die Chelatbildung mit Eisen und/oder den Transport von Eisen in S. dysenteriae 1 notwendig ist, (z.B. einem Enterobactin- oder Enterochelin-Gen von S. dysenteriae 1); und
b) einem in vitro-mutagenisierten Gen von S. dysenteriae 1, das ein Protein codiert, welches für S. dysenteriae 1 zur Ausbreitung innerhalb infizierter Zellen und zwischen infizierten und nichtinfizierten Zellen notwendig ist, wie z.B. einem Gen für die intrainterzelluläre Ausbreitung (z.B., einem ics-A- oder vir-G-Gen).
Ferner wird eine Mutante eines Wildstammes von S. flexneri gemäß dieser Erfindung gentechnisch verändert, indem ein allelischer Austausch durchgeführt wird mit
a) einem in vitro-mutagenisierten Gen von S. flexneri, das ein Protein codiert, welches für S. flexneri zum Eindringen in die Zellen wie auch Gewebe eines Wirtes notwendig ist, wie z.B. einem Gen, das ein Protein codiert, welches für die Chelatbildung mit Eisen und/oder den Transport von Eisen in S. flexneri notwendig ist (z.B. einem Aerobactin-Gen von S. flexneri); und
b) einem in vitro-mutagenisierten Gen, das ein Protein codiert, das für S. flexneri zur Ausbreitung innerhalb und zwischen den Zellen des Wirtes notwendig ist, wie z.B. einem ics-A-Gen.
Außerdem werden gemäß dieser Erfindung die erfindungsgemäßen Mutanten von Shigella zur Herstellung von Impfstoffen gegen die Wildstämme von Shigella verwendet.

Kurze Beschreibung der Figur

Die Figur zeigt schematisch die Clonierung des Shiga-Toxin-Operons und die in vitro-Mutagenese des Gens der Shiga-Toxin-A-Untereinheit in Beispiel 2. In den Plasmiden pHS7201, pHS7202 und pHS7203 in der Figur zeigen durchgezogene Linien Sequenzen aus dem A-Untereinheit-Gen; schattierte Linien zeigen Sequenzen aus dem B-Untereinheit-Gen; und gestreifte Linien zeigen Sequenzen aus dem Ω-Insertionselement.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Ein Verfahren zur Modifikation eines entero-invasiven Shigella-Wildstammes wird bereitgestellt, so daß der modifizierte Stamm zur Herstellung eines Impfstoffes gegen den Wildstamm von Shigella verwendet werden kann. Der Wildstamm von Shigella wird so modifiziert, daß er nicht eindringen und sich sodann praktisch kaum innerhalb infizierter Zellen eines Wirtes, insbesondere eines menschlichen Wirtes, vermehren kann und daß er sich praktisch kaum innerhalb infizierter Zellen und von infizierten zu nichtinfizierten Zellen des Wirtes ausbreiten kann und daß er keine Toxine produzieren kann, die eine bedeutende Zahl von infizierten wie auch nichtinfizierten Wirtszellen abtöten. Das Verfahren umfaßt die Transformation des Genoms (z.B. des Hochvirulenz-Plasmids pHS7200) des Wildstammes von Shigella, wie z.B. eines S. flexneri, so daß ein Gen (Gene) des Wildstammes, die ein oder mehrere Proteine codieren, welche für den Stamm zum Eindringen in Zellen wie auch Gewebe eines infizierten Wirtes notwendig sind (z.B. ein Aerobactin-Gen), und die ein oder mehrere Proteine codieren, welche für den Stamm zur Ausbreitung innerhalb und zwischen den Zellen des infizierten Wirtes notwendig sind (z.B. ein ics-A- Gen [60, 61]), vollständig oder teilweise entfernt oder permanent inaktiviert, vorzugsweise mindestens teilweise entfernt werden. Zur Transformation des Genoms eines Wildstammes, wie z.B. eines S. dysenteriae 1, umfaßt das Verfahren vorzugsweise außerdem die teilweise oder vollständige Entfernung oder permanente Inaktivierung, vorzugsweise zumindest die teilweise Entfernung, des Gens (der Gene), vorzugsweise gerade des A- Untereinheit-Gens, welches das Shiga-Toxin codiert.
Im erfindungsgemäßen Verfahren können die Gene des Wildstammes von Shigella in herkömmlicher Art und Weise vollständig oder teilweise entfernt oder permanent inaktiviert werden, z.B. durch allelischen Austausch mit in vitro mutagenisierten Genen, von denen zumindest wesentliche Teile vorzugsweise entfernt worden sind. Unter Berücksichtigung dieser Punkte werden bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Impfstoffe die mutagenisierten Gene vorzugsweise nicht einfach mit Hilfe von Transposons inaktiviert, die in die Gene insertiert werden und die aus den Genen wieder verlorengehen können, wenn sie in vivo in den folgenden Shigella-Generationen reproduziert werden. Vielmehr werden vorzugsweise wesentliche Teile der mutagenisierten Gene deletiert und vorzugsweise geeignete Impfstoff-kompatible Markergene innerhalb solcher Deletionen insertiert. Solche Markergene ermöglichen die einfache Identifizierung des auf diese Weise transformierten Shigella-Stammes. Die bevorzugten Markergene sind Schwermetall-Resistenz- Gene, wie z.B. das Quecksilber-, Arsenat-, Arsenit-, Antimon-, Cadmium-, Zink- und/oder Cobalt-Resistenz-Gen (62, 63, 64, 65).
Die Zellen des modifizierten Stammes können gezüchtet und dann in herkömmlicher Art und Weise abgeschwächt werden. Sodann können die Zellen mit herkömmlichen pharmazeutisch verträglichen Trägern (z.B. einer wäßrigen Kochsalzlösung) und gegebenenfalls mit herkömmlichen Excipienten (z.B. einem pharmazeutisch verträglichen Detergens) gemischt werden, wodurch ein Impfstoff gegen den Wildstamm hergestellt wird. Der Impfstoff kann so formuliert werden, daß er Zellmaterial in einer Endkonzentration von 0,2 bis 5 mg/ml, vorzugsweise 0,5 bis 2 mg/ml, enthält. Nach der Formulierung kann der Impfstoff in einen sterilen Behälter eingebracht werden, der sodann versiegelt und bei einer niedrigen Temperatur (z.B., 4ºC) gelagert wird, oder er kann gefriergetrocknet werden.
Wenn in einem menschlichen Wirt eine Immunität gegen einen Wildstamm von Shigella induziert werden soll, können eine oder mehrere Dosen des geeignet formulierten Impfstoffs in Dosierungen verabreicht werden, die etwa 10&sup9; bis 10¹¹ lyophilisierte Shigella-Zellen enthalten. Der Impfstoff kann oral in herkömmlicher Art und Weise verabreicht werden. Die Behandlung kann aus einer Einzeldosis Impfstoff oder aus mehreren Dosen die über eine bestimmte Zeitspanne gegeben werden, bestehen.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung dieser Erfindung.

Beispiele

Wenn nicht anders angegeben sind die in den Beispielen verwendeten Clonierungs- und Transformationsverfahren und -techniken die gleichen wie diejenigen, die in Maniatis et al., "Molecular Cloning -- A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, (1982), allgemein beschrieben werden.
Die in den Beispielen 1 bis 6 verwendeten Stämme und die darin enthaltenen Phagen oder Plasmide sind in Tabelle I zusammengestellt.
In den Beispielen wurden zwei Medien verwendet: M9-Minimalmedium (Na&sub2;HPO&sub4; 12H&sub2;O: 15 g/l KH&sub2;PO&sub4;: 3 g/l, Nacl: 0,5 g/l, NH&sub4;Cl: 1 g/l, MgSO&sub4; 7H&sub2;O: 0,05 g/l) und Trypto-Casein- Soja-Brühe (Diagnostics Pasteur, Marnes la Coquette, Frankreich).

Beispiel 1 -- Clonierung des Shiga-Toxin-Operons

Die Gesamt-DNA wurde aus einem Antibiotika-sensitiven S. dysenteriae 1-Wildtypstamm SC 500 hergestellt (50), der vom "Centre National de Référence des Shigelles" vom Institut Pasteur, Paris, Frankreich, erhalten wurde. 10 ug DNA wurden mit EcoRI (Amersham, Buckinghamshire, GB) gespalten und auf ein 0,7% Agarosegel aufgetragen. Fragmente im Bereich von 3,5 bis 4,5 kb wurden elektroeluiert. 0,1 ug gereinigte Fragmente wurden an 1 ug cos-ligierte, EcoRI-gespaltene, dephosphorylierte λ-gt11-Arme (Stratagene Cloning System, San Diego, USA) ligiert und unter Verwendung des Packagene Systems (Progema Biotec, Madison, USA) gemäß den Empfehlungen des Herstellers verpackt. Anschließend wurde die verpackte DNA in E. coli Y1090 transfiziert (59). Die λ-gt11-Bank wurde sodann mit 13C4 abgesucht, einem monoclonalen Antikörper, der für die B-Untereinheit von SLT1 spezifisch ist (54) und der von A.D. O'Brien, U.S.U.S.H., Bethesda, MD, USA, erhalten wurde. 10³ rekombinante Phagen wurden auf Y1090 in LB-Weichagar plattiert. Die Platten wurden 12 Stunden bei 37ºC inkubiert. Ein Nitrocellulose-Filter (Schleicher und Schüll, Dassel, BRD), das vorher in eine 10 mM Lösung von Isopropylthiogalactosid ("IPTG") (Sigma, St. Louis, MO, USA) getaucht worden war, wurde auf die Platte aufgelegt und diese sodann 2,5 Stunden bei 42ºC inkubiert. Das Filter wurde von der Platte entfernt und eine Stunde bei 37ºC in PBS-Milch (50 g/l dehydratisierte fettarme Milch in 1 x PBS) inkubiert, fünfmal mit 1 x PBS gewaschen und eine Stunde mit dem monoclonalen Antikörper 13C4 in seinem unverdünnten Hybridomzellüberstand inkubiert. Nach fünf Waschgängen in PBS-Milch wurde das Filter eine Stunde bei 37ºC in PBS-Milch inkubiert, die eine 1/200-Verdünnung von Schaf-anti-Maus-IgG-Antikörper, gebunden an alkalische Phosphatase enthielt (Biosys, Compiegne, Frankreich). Das Filter wurde erneut in 1 x PBS gewaschen und in die Färbelösung aus 0,33 mg/l Nitro-Tetrazoliumblau, 0,16 mg/l 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (beide Verbindungen von Sigma), 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM Nacl und 50 mM MgCl&sub2; gelegt. Positive Clone wurden Plaque-gereinigt und in Y1089 transfiziert (59). Anschließend wurde die DNA aus den lysogenen Zellen hergestellt (13). Die Subclonierung wurde in die EcoRI-Stelle von Plasmidvektor pUC8 in E. coli JM83 durchgeführt (58). Die Subclone von E. coli JM83 wurden mit dem monoclonalen Antikörper 13C4 getestet, wobei das vorstehend beschriebene Verfahren mit den folgenden Modifikationen eingesetzt wurde: ein trockenes Nitrocellulosefilter wurde auf die Platte aufgelegt und 2 ml einer 2 mg/l Polymyxin B-Lösung in PBS oben aufs Filter zugegeben. Sodann wurde die Platte 45 Minuten bei 37ºC inkubiert und anschließend die Inkubation in PBS-Milch gestartet. Der Subclon pHS7201 in E. coli JM83, der die B-Untereinheit von SLT1 enthielt, wurde identifiziert.
Es wurde gefunden, daß der Subclon pHS7201 von E. coli JM83 im Kolonie-Immunoblot-Test in Gegenwart des monoclonalen Antikörpers 13C4 aufgrund der Gen-Dosis-Wirkung ein stärkeres Signal zeigte als der Elterstamm SC500. Eine Restriktionskarte des Shiga-Toxin-codierenden Bereichs in pHS7201 war mit derjenigen von LTS1 (14) identisch. Es zeigte sich, daß das A-Untereinheit-Gen eine einzige Hpal-Stelle besitzt, die 310 Bp stromabwärts vom ATG-Startcodon liegt, wo eine Kassette, wie in Beispiel 2 beschrieben, eingefügt werden konnte.

Beispiel 2 -- In vitro-Mutagenese des Shiga-Toxin-A-Untereinheit-Gens

Beim Subclon pHS7201 ist das gesamte Shiqa-Toxin-Operon in einem 4,2 kb großen EcoRI-DNA-Fragment enthalten. Die in vitro-Mutagenese des A-Untereinheit-Gens wurde durchgeführt, indem das Interposon Ω (37) insertiert wurde, das die Spectinomycin-Resistenz codiert und an beiden Seiten durch T4-Translation-Transkription-Stopp-Signale flankiert ist. Ω wurde als ein 2kb großes HindIII-Fragment gereinigt und seine Enden durch das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I aufgefüllt. Anschließend wurde Ω an HpaI-linearisiertes pHS7201 ligiert, wodurch das rekombinante Plasmid pHS7202 erhalten wurde, wie in der Figur gezeigt. Das 6,2 kb große EcoRI-Fragment, das die mutagenisierte Sequenz enthielt, wurde sodann gereinigt und mit der EcoRI-Stelle des Suizid-Plasmidvektors pJM703.1 (51) ligiert, wodurch das rekombinante Plasmid pHS7203 erhalten wurde, wie in der Figur gezeigt. pJM703.1 kann sich nur replizieren, wenn sein defizienter R6K-Ursprung durch die pir-Funktion in-trans komplementiert wird, die im Lambda-Phagen enthalten ist, der im Genom von E. coli SM10 eingebaut ist (21). Dieser Stamm enthält, eingebaut in sein Chromosom, auch die Transfer-Gene des IncP-Typ-Plasmids für einen großen Wirtsbereich, RP4. pJM703.1 kann somit durch SM10 λ pir (21) mobilisiert werden, da es die Mob-Stelle aus RP4 enthält (51). Somit war pHS7203 im Stamm SM10 λ pir stabil enthalten und wurde sodann in den S. dysenteriae 1-Wildtypstamm SC500 durch Konjugation übertragen. Die Paarungen wurde auf Cellophan-Membranen durchgeführt und die Selektion durch Plattierung auf M9-Minimalmedium erhalten, das mit Thiamin, Methionin, Tryptophan und Nicotinsäure in einer Konzentration von jeweils 10 ug/ml, 0,2% Glucose und 50 ug/ml Spectinomycin angereichert war. Die auf dem Selektionsmedium wachsenden Kolonien wurden gereinigt und durch Agglutination mit einem spezifischen Kaninchen-Antiserum (Diagnostics Pasteur) als S. dysenteriae 1 identifiziert.
Der allelische Austausch zwischen dem chromosomalen Shiga-Toxin-Gen des Wildtyps und dem in vitro-mutagenisierten Shiga-Toxin-Gen wurde durch Kolonie-Blot-Immuntest gezeigt, wobei der monoclonale Antikörper 13C4 verwendet wurde, um S. dysenteriae 1-Zellen, die einen Tox&supmin;-Phänotyp exprimieren, nachzuweisen.
Das Vorliegen der Tox&supmin;-Modifikation in den Genomen der S. dysenteriae 1-Zellen wurde mit einer Sonde verifiziert, die aus dem 655 Bp großen HindIII-HincII-Fragment hergestellt wurde, das einen Teil des A-Untereinheit-Gens und das gesamte B-Untereinheit-Gen aus dem vorstehend beschriebenen 4,2 kb großen EcoRI-Fragment enthielt, welches das gesamte Shiga-Toxin-Operon enthielt. Auch das vorstehend beschriebene 2 kb große HindIII-Fragment, das das Ω-Interposon enthielt, wurde als Sonde verwendet (37). Die als Sonden eingesetzten DNA- Fragmente wurden durch Nick-Translation (39) mit ³²P-markiertem 5'-dCTP (Amersham) markiert. Die Gesamt-DNA wurde aus zwei Tox&supmin;-Clonen hergestellt und durch Hybridisierung mit der Shiga-Toxin-Sonde und der Ω-Sonde analysiert. Die DNA-Fragmente wurden nach dem Verfahren von Southern (53) aus Agarose-Gelen auf Nitrocellulose-Filter (Schleicher und Schüll) übertragen. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 65ºC durchgeführt, sodann wurde bei 65ºC in 6xSSC gewaschen. Die Sonden zeigten, daß das 4,2 kb große EcoRI-Fragment aus S. dysenteriae 1, das die Toxin-Gene enthält, in den Tox&supmin;-Mutanten durch das 6,2 kb große Fragment ersetzt worden war, welches mit beiden Sonden hybridisierte. Dieses Ergebnis zeigte, daß sich die flankierenden Regionen auf beiden Seiten des mutagenisierten Toxingens in pHS7203 mit ihren Gegenstücken im SC500-Genom neu kombiniert hatten, wodurch das Wildtyp-A-Untereinheit-Gen durch das mutierte Gen ersetzt worden war.
Einer dieser Tox&supmin;-Clone, SC501, wurde für die weitere Untersuchung ausgewählt und Clon SC501 beim "Centre Nationale de Cultures de Microorganismes", Institut Pasteur, Paris, Frankreich, am 30. Juni 1988 unter der Hinterlegungsnummer I-774 hinterlegt.

Beispiel 3 -- Tests auf Zelltoxizität, Wachstum in HeLa-Zellen, Makrophagen-Löslösung und Toxizität in Kaninchen-Ileusschleifen und bei Affen

SC500 und SC501 sowie ihre nicht-invasiven Abkömmlinge SC502 bzw. SC503 (erhalten durch spontanes Curing (d.h. Verlust) ihres großen Virulenz-Plasmids pHS7200, das fürs Eindringen in die Zellen notwendig ist), wurden 48 Stunden in 200 ml Eisen-freiem Medium gezüchtet. Die Glasgeräte wurden mit 6 M HCl vorbehandelt und sodann gründlich mit Eisen-freiem H&sub2;O gewaschen. Das Medium enthielt die M9-Salze, angereichert mit 15 ug/ml CaCl&sub2;, 5 mg/ml Casaminosäuren, 2 mg/ml Glucose, 50 ug/ml Thiamin, 20 ug/ml L-Tryptophan, 10 ug/ml Nicotinsäure und 150 ug/ml menschlichem Transferrin (Sigma). Die Bakterien wurden zweimal in Kochsalzlösung gewaschen und anschließend in 3 ml PBS resuspendiert. Lysozym wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,2 mg/ml zugesetzt. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur (25ºC) wurden 30 ul EDTA, 0,5 M, pH 8, zugefügt und die Zellen in ein Eisbad überführt und beschallt. Beschallte Extrakte wurden filtersterilisiert und bei -20ºC gefroren gehalten. Filtersterilisierte Kulturüberstände und Bakterienextrakte wurden auf HeLa-Zellen, die in essentiellem Minimalmedium mit Earle-Salzen und N-Glutamin (Gibco, Paisley, Schottland, GB), angereichert mit 10% fetalem Kälberserum (Gibco), gezüchtet worden waren, auf Zelltoxizität getestet. Reihenverdünnungen mit Zellkulturmedium (100 ul) wurden in eine Mikrotiterplatte eingebracht. Jede Vertiefung wurde mit 2 x 10&sup4; Zellen in 100 ul beimpft. Anschließend wurden die Platten 24 Stunden bei 37ºC in 5% CO&sub2; inkubiert. Neutralisationstests wurden sowohl mit einem polyclonalen Kaninchenserum als auch mit dem monoclonalen Antikörper 13C4 durchgeführt. Die Platten wurden unter einem Licht-Phasen-Mikroskop untersucht und sodann mit Giemsa gefärbt. Die Zelltoxizität wurde als zelltoxische Dosis von 50% (CD50) pro mg Protein des Extraktes berechnet.
Die Vermehrung der Bakterien in den HeLa-Zellen wurde untersucht (46). Nicht-konfluente einschichtige Zellrasen von HeLa-Zellen in 35 mm-Gewebekultur-Schalen aus Kunststoff (Becton Dickinson Labware, Oxnard, CA, USA) wurden mit Bakterien beimpft, resuspendiert in 2 ml essentiellem Minimalmedium ("MEM", Gibco) bei einer Infektionsmultiplizität ("Mol") von 100, 10 Minuten bei 2200 x g zentrifugiert und 30 Minuten bei 37ºC inkubiert, damit der Eintritt stattfinden konnte. Anschließend wurden die Platten dreimal mit Earles eingestellter Salzlösung ("Earl's Balanced Salt Solution") ("EBBS", Gibco) gewaschen und mit 2 ml MEM mit Gentamicin (25 ug/ml) bedeckt. Dieser Zeitpunkt wurde als Zeit 0 definiert (T0). Nach einer Stunde Inkubation bei 37ºC wurden die Präparate erneut mit EBSS gewaschen und mit 2 ml MEM ohne Antibiotikum bedeckt (T1). Die Inkubation wurde weitere drei Stunden fortgesetzt (T1 - T4). Stündlich wurden zwei Platten beiseite genommen. Eine Platte wurde dreimal mit EBSS gewaschen und mit Giemsa gefärbt, um den Prozentsatz der infizierten HeLa-Zellen zu berechnen. Die andere Platte wurde fünfmal mit EBSS gewaschen, um lebensfähige extrazelluläre Bakterien zu entfernen. Die Zellen wurden mit Trypsin behandelt, gezählt und bei 0,5% Natriumdesoxycholat in destilliertem Wasser lysiert. Verdünnungen wurden auf Trypticase-Soja-Agar plattiert. Die durchschnittliche Zahl von Bakterien pro infizierte HeLa-Zelle wurde berechnet. Die Experimente wurden viermal wiederholt. Kurven des intrazellulären Wachstums wurden gezeichnet und die Steigung in der exponentiellen Phase berechnet.
Der Test auf Loslösung und Abtötung von Makrophagen wurde durchgeführt (4), wobei J774-Makrophagen verwendet wurden (52), die in RPMI 1640 (Flow Laboratories Inc., McLean, VA, USA), angereichert mit Komplement-inaktiviertem fetalem Kälberserum (Gibco) und 2 mM Glutamin (Gibco), gehalten wurden. 18 Stunden vor der Infektion wurden 7 x 10&sup5; Makrophagen in 35 mm Gewebekulturschalen aus Kunststoff (Becton Dickinson Labware) in einem Kulturmedium markiert, das 0,5 uCi [³H]-Uridin pro ml (Amersham) enthielt. Die Zellen wurden dreimal mit EBSS gewaschen, sodann wurde 1 ml Bakteriensuspension in RPMI 1640 mit einer MOI von 100 zugegeben. Die Infektion wurde eine Stunde bei 37ºC in 5% CO&sub2; durchgeführt. Anschließend wurden die einschichtigen Zellrasen dreimal mit EBSS gewaschen (T0) und eine Stunde bei 37ºC in 5% CO&sub2; mit 2 ml RPMI, angereichert mit 2 mM Glutamin und Gentamicin, 25 ug/ml, bedeckt (T1). Sodann wurden die Platten dreimal mit EBSS gewaschen und drei weitere Stunden in 5% CO&sub2; bei 37ºC in RPMI-Glucose ohne Gentamicin inkubiert (T1 - T4). Stündlich wurden zwei Platten beiseite genommen, die Kulturen dreimal mit EBSS gewaschen und der Prozentsatz von nicht lebenden Makrophagen unter den Zellen, die noch an der Kunststoffoberfläche anhafteten, durch Färbung mit Trypanblau bestimmt. Anschließend wurde der Prozentsatz der verbliebenen Makrophagen bestimmt, indem die Menge an Radioaktivität gemessen wurde, die in der Schale verblieben war. Anhaftende Zellen wurden mit 1 ml 0,5% Natriumdesoxycholat in destilliertem Wasser lysiert, sodann wurden 100 ul dieses Lysats gefällt und gezählt (4).
Ligierte Ileumschleifen des Kaninchens von 10 cm wurden in ca. 2 kg schweren Kaninchen präpariert, die mit 0,5 ml/kg 6% Natriumpentobarbital anästhesiert worden waren. Impfproben mit 10&sup7; und 10&sup9; CFU in 1 ml Trypticase-Soja-Brühe wurden getestet. Die Kaninchen wurden 18 Stunden später getötet. Die Flüssigkeitsansammlung innerhalb der Schleifen wurde protokolliert und das Verhältnis von Volumen zu Länge ("V/L") berechnet. Teile der infizierten Schleifen wurden in 10% gepuffertem Formalin fixiert. Proben wurden nach Standardverfahren bearbeitet und mit Hämatoxylin-Eosin-Safranin gefärbt.
Acht Rhesus-Affen mit einem Gewicht von 3,5 bis 4,5 kg erhielten intramuskuläre Injektionen von 50 mg Ketaminchlorhydrat (Imalgene 500, Rhòne Mérieux, Lyon, Frankreich). Jedes Tier wurde intragastral mit 1,5 x 10¹¹ SC500- und SC501-Mikroorganismen infiziert, die in 20 ml Trypticase-Soja-Brühe und 14 g/l Natriumbicarbonat (50/50) resuspendiert worden waren. Die Plattierung des Impfmaterials auf Kongorot-Agar zeigte, daß weniger als 1% der Bakterien im Impfmaterial ihre Fähigkeit zum Eindringen (26) verloren hatten. Die Stühle wurden täglich auf Diarrhoe und auf das Vorliegen von Eiter, Schleim und Blut untersucht. Täglich wurde die Intensität jedes dieser Symptome mit 0 bis 3+ bewertet. Die Schwere eines bestimmten Symptoms wurde für jedes Tier als Index ausgedrückt, der die Summe der angesammelten "+" für jedes Symptom darstellt. Bei Affen, die an fulminanter Dysenterie starben, wurde unmittelbar danach eine Autopsie durchgeführt. Proben wurden bearbeitet, wie vorstehend für die Kaninchengewebe beschrieben.

Ergebnisse

SM10 λ pir (pHS7203) war im Zelltoxizitätstest nicht zelltoxisch. Nach dem konjugativen Transfer von pHS7203 in S. dysenteriae wurden die Clone, die den AmpSSpcR-Phänotyp zeigten, im Kolonie-Immunblot-Test getestet. 5% zeigten einen Tox&supmin;-Phänotyp. SC501 zeigte eine Zelltoxizität von 347 CD50/mg Protein; dies lag in der gleichen Größenordnung wie beim wohlbekannten E. coli K12 (412 CD50/mg). Die verbliebene Zelltoxizität von SC501 konnte durch ein polyclonales anti-Shiga-Toxin-Serum nicht neutralisiert werden.
Durch das Vorliegen der Tox&supmin;-Mutation im Stamm SC501 wurde die Fähigkeit des Stammes, intrazellulär in HeLa-Zellen zu wachsen, nicht signifikant verändert, denn seine exponentielle Wachstumsrate betrug, ausgedrückt in Generationen/Stunde, 2,6 ± 0,7 im Vergleich zu 2,5 ± 0,6 für den Wildtypstamm SC500. Außerdem konnte kein signifikanter Unterschied von SC500 und SC501 in der Wirksamkeit der raschen Abtötung von J774-Makrophagen festgestellt werden. Sowohl die Loslösung der Zellen als auch das Auftreten von Trypanblau-positiven Zellen ging innerhalb von vier Stunden mit ähnlichen Raten vor sich, was zeigt, daß das innerhalb infizierter Zellen freigesetzte Shiga-Toxin weder die intrazelluläre Wachstumsrate signifikant beeinträchtigte noch die rasche Abtötung von Wirtszellen steigerte.
Der Wirkung der Inv&supmin;- und der Tox&supmin;-Mutation auf die Pathogenität von S. dysenteriae 1 im Modell der ligierten Schleifen des Kaninchens wurde durch die Wirkung auf die Flüssigkeitsproduktion innerhalb der Schleifen bestimmt. Aus den Ergebnissen, die für jeden Stamm in sechs Schleifen jeweils mit den beiden Impfproben (d.h. 10&sup9; und 10&sup7; CFU) erhalten wurden, wurden die Durchschnitt- und Standardabweichung berechnet. Bei invasiven Stämmen (d.h. SC500, Inv&spplus;, Tox&spplus;, und SC501, Inv&spplus;, Tox&supmin;) führte bei beiden Impfproben das Fehlen der Shiga- Toxin-Produktion zur Verminderung der Flüssigkeitsansammlung, wobei der Unterschied statistisch nicht signifikant war, was zeigt, daß in erster Linie das Eindringen und die anschließende Entzündung für die Flüssigkeitsansammlung verantwortlich sind. Bei nichtinvasiven Stämmen (d.h. SC503, Tox&spplus;, und SC502, Tox&supmin;) wurde ein erstaunlicher Unterschied deutlich, da nur der Shiga-Toxin produzierende Stamm eine Flüssigkeitsansammlung bewirkte. Dies zeigte, daß das Shiga- Toxin im Kaninchenmodell das einzige Enterotoxin von S. dysenteriae 1 ist, welche Rolle dieses Enterotoxin im Verlauf der Krankheit auch immer spielen mag. Histopathologische Studien zeigten bei beiden Impfproben entweder mit SC500 oder mit SC501 schwere Schäden, einschließlich Abszesse und Geschwüre, die zahlreiche Zotten zerstörten. Im allgemeinen waren die Schäden in den mit dem Wildtypstamm infizierten Schleifen schwerer, jedoch machte die Beobachtung, daß der Unterschied gering war, deutlich, daß das Eindringen der Hauptfaktor der Pathogenität war.
Schleifen, die mit SC502, dem nichtinvasiven Tox&spplus;-Stamm, indiziert waren, waren stark verändert, wobei Schwellung und Verkürzung der Zotten, Ödem und Entzündung der Lamina propria, Veränderungen der Epithelzellen mit großen Mengen Schleim, der aus Becherzellen abgegeben wird, und Bereiche abgetöteter Enterocyten mit pyknotischen Kernen auftraten. Das wichtigste Merkmal jedoch waren Blutungen überall in der Epithelschicht.
Die Wirkung der Tox&supmin;-Mutation auf die Pathogenität von S. dysenteriae 1 wurde bei Affen gezeigt. Sowohl in der Gruppe, die Injektionen mit SC500 erhalten hatte, als auch in der Gruppe, die Injektionen mit SC501 erhalten hatte, starben jeweils zwei Tiere pro Gruppe am Tag 4 an fulminanter Dysenterie; dies zeigt, daß das Shiga-Toxin für die letale Dysenterie nicht erforderlich war. Das Volumen der diarrhoischen Stühle und die Menge an Eiter und Schleim zeigten keine signifikanten Unterschiede, obwohl das letztere nur schwer mit Genauigkeit festgestellt werden konnte. Andererseits war das Vorliegen von Blut bei den mit SC500 infizierten Tieren ein konstantes Merkmal der abnormen Stühle, wohingegen nur bei einem mit SC501 infizierten Tier vorübergehend eine kleine Menge Blut vorlag. Autopsien, die direkt nach dem Verenden der Tiere durchgeführt wurden, zeigten deutliche Unterschiede im Colon-Peritonealmesothel, die insbesondere auf der Oberfläche des Sigmas deutlich wurden, auf der nur im Fall der mit SC500 infizierten Tiere gefleckte hämorrhagische Bereiche festgestellt werden konnten. Im Durchschnitt war die Zahl und Schwere der Abszesse ähnlich, eine eitrige Nekrose der Schleimhaut mit Zerfall in den Lieberkühn-Drüsen jedoch wurde nur an einigen Stellen bei den Tieren festgestellt, die mit SC500 infiziert waren. Auch war bei diesen Tieren die entzündliche Infiltration des Chorions, der unter der Schleimhaut liegenden Gewebe und des Peritoneums stärker ausgeprägt. Außerdem trat die entzündliche Infiltration des Peritonealmesothels, die für die mit SC500 infizierten Tiere, im Vergleich zu den mit SC501 infizierten, charakteristisch war, hauptsächlich perivaskulär auf; dies bestätigte die Ergebnisse von oberflächlichen Untersuchung, die das Vorliegen einer schweren peritonealen Gefäßentzündung nahelegten. Der deutlichste Unterschied wurde jedoch auf der Ebene des Kapillarkreislaufs innerhalb des interglandulären Chorions beobachtet. Affen, die mit SC500 infiziert waren, zeigten Blutungen, wobei die Struktur des oberen Teils der Schleimhaut aufgerissen war. Dabei konnte festgestellt werden, daß Erythrocyten durch Mikroabszesse, welche eine lokale Unterbrechung der Epithelauskleidung zur Folge hatten, ins Darmlumen freigesetzt wurden. Diese Hämorrhagien beruhten offensichtlich auf dem Zerfall der Kapillarschenkel. Andererseits zeigten die mit SC501 infizierten Affen eine Erweiterung der Kapillarschenkel, jedoch keinen Zerfall. Die Zählung der weißen Blutkörperchen, die vor und am Tag 3 nach der Infektion durchgeführt wurde, zeigte: am Tag 0 keinen signifikanten Unterschied der Zahl der polymorphkernigen Leukocyten ("PMN"), außerdem lag keine myeloische Leukämie vor; am Tag 3 waren in den mit SC500 infizierten Affen der Rückgang der Blut-PMN und die Ausprägung der myeloischen Leukämie jeweils stärker betont.

Schlußfolgerungen

Ergebnisse beim Menschen erhärten die Hypothese, daß das Shiga-Toxin einen echten Virulenzfaktor darstellt. Freiwillige, die Stamm 725, eine invasive, wenig Toxin produzierende, Chlorat-resistente Mutante von S. dysenteriae 1, eingenommen hatten, zeigten weniger ernste Symptome als diejenigen, die den Wildtypstamm M131 eingenommen hatten (25). Patienten, die eine natürliche Infektion durchmachen, entwickeln üblicherweise ernstere Symptome, einschließlich HUS, wenn sie mit S. dysenteriae 1 infiziert wurden, als wenn sie mit anderen Shigella-Serotypen infiziert wurden (7). Sie entwickeln rasch Toxin-neutralisierende Antikörper (18).
Es wurde gezeigt, daß die Tox&supmin;-Mutante von S. dysenteriae 1, SC501, eine Restmenge Zelltoxin erzeugt, die der von E. coli K12 ähnlich ist. Diese Mutante wurde verwendet, um die Rolle dieses Shiga-Toxins in der Virulenz von S. dysenteriae 1 zu untersuchen. Hierfür wurden Zelltests und Tiermodelle eingesetzt.
Tests unter Verwendung von HeLa-Zellen und J774-Makrophagen in einschichtigen Zellrasen haben gezeigt, daß durch die Sekretion des Shiga-Toxins die exponentielle Wachstumsrate innerhalb infizierter Zellen nicht beeinträchtigt wurde, wie eine frühere Untersuchung für SLT in S. flexneri nahegelegt hatte (46). Diese Ergebnisse standen in Übereinstimmung mit der Beobachtung, daß zwei andere, wenig Toxin produzierende Mutanten (25, 48) und außerdem die SC501-Mutante keinen Einfluß auf Keratoconjunctivitis haben (49), von der man weiß, daß sie mit der Fähigkeit von Bakterien, sich innerhalb eines Epithels zu vermehren, in Zusammenhang steht (35). Wie auch schon früher vermutet wurde (4, 12), konnte kein Zusammenhang zwischen der Produktion von Shiga-Toxin und dem frühen Abtöten von Wirtszellen festgestellt werden. Obwohl diese Daten noch in Tests, welche die tatsächliche Infektion besser nachahmen, bestätigt werden müssen, zeigen sie sicherlich, daß das Shiga- Toxin im intrazellulären Stadium der Infektion keine Hauptrolle spielt. Durch das Eindringen scheinen frühe metabolische Vorgänge ausgelöst zu werden, welche viel schneller zur Abtötung der Wirtszellen führen (47) als der langsamer ablaufende Prozess des Shiga-Toxins (12).
Die Infektion von ligierten Darmschleifen des Kaninchens zeigte bei den SC500- und SC501-Impfproben nach 18 Stunden nur geringe Unterschiede in der Schwere der Schleimhautschäden. Möglicherweise führt jedoch die Dauer der Exposition und das Verschließen der Schleifen dazu, daß die Wirkung der Zelltoxin-Produktion maskiert wird und das Eindringen als das Hauptereignis erscheint. Die Analyse der Ergebnisse, die die Enterotoxizität betreffen, gestaltete sich im Fall von invasiven Bakterien schwieriger, da die produzierte Flüssigkeitsmenge, die zwar bei der Tox&supmin;-Mutante mit beiden Impfproben niedriger war, von der durch den Wildtypstamm verursachten Menge nicht signifikant verschieden war. Dies zeigte, daß das Eindringen in die Gewebe ausreicht, um die Reabsorptions-Funktionen des Epithels zu blockieren. Andererseits zeigt der deutliche, zwischen nichtinvasiven Tox&spplus; und Tox&supmin;-Mutanten beobachtete Unterschied, innerhalb der Empfindlichkeitsgrenzen des Kaninchenmodells, daß das Shiga-Toxin das einzige Enterotoxin von S. dysenteriae 1 ist. Dies stimmt mit früheren Studien überein (16, 17, 33). Wenn man jedoch die Flüssigkeitsproduktion durch Inv&spplus;- und Inv&supmin;-Mutanten betrachtet, ändert sich die Art der erzeugten Flüssigkeit mit dem infizierenden Stamm. Invasive Stämme führen zur Produktion einer viskosen, schleimig-eitrigen, manchmal blutigen Flüssigkeit, die möglicherweise das Ausmaß der im Lumen eitrig gewordenen Abszesse, unabhängig von der Menge des erzeugten Shiga-Toxins, widerspiegelt, wohingegen nichtinvasive, Tox&spplus;-Stämme eine wäßrige, manchmal blutige Flüssigkeit hervorrufen, die eher die Enterotoxizität und Zelltoxizität widerspiegelt. Histopathologische Studien von Gewebeproben aus Schleifen, die mit SC502, der Inv&supmin;, Tox&spplus;-Mutante, infiziert waren, zeigten ein deutliches entzündliches Infiltrat der Lamina propria und starke Veränderungen hauptsächlich am Ende der verkürzten Zotten. Hierdurch wurde die Zelltoxizität des Shiga-Toxins auf Enterocyten in vivo bestätigt (27). Das wichtigste Merkmal jedoch war die Infiltration der Epithelauskleidung durch Erythrocyten, die zusammen mit großen Mengen Schleim ins Lumen abgegeben wurden. Diese Beobachtung, die nahelegte, daß entscheidende Veränderungen an den Gefäßen innerhalb der Lamina propria stattgefunden hatten, wurde anschließend im Affenmodell bestätigt.
Die intragastrale Impfung von Makaken mit SC500 und SC501 zeigte, daß die letale fulminante Dysenterie unabhängig von der Shiga-Toxin-Produktion auftreten konnte. In der Menge der Diarrhoe, des Eiters und des Schleims im Stuhl zeigte sich kein signifikanter Unterschied. Das Fehlen von wäßriger Diarrhoe und die gleiche Menge Stuhl stimmten nicht mit früheren Untersuchungen überein, die eine gesteigerte jejunale Sekretion durch das Shiga-Toxin nahelegten (41). Der einzige deutliche Unterschied war das Vorliegen von Blut in dysenterischen Stühlen von Tieren, die mit dem Wildtypstamm infiziert waren. In einer kürzlich veröffentlichten Untersuchung wurde beschrieben, daß unter Patienten mit Shigellose diejenigen, die Stämme mit hoher Zelltoxizität ausschieden, mit größerer Wahrscheinlichkeit Blut im Stuhl hatten (36). Histopathologische Beobachtungen bestätigten das Vorliegen von Gefäßschäden, die insbesondere im Sigma charakteristisch auftraten, da die mit dem Wildtypstamm infizierten Affen einen totalen Zerfall der Kapillarschenkel im Chorion zeigten, wohingegen das Gefäßsystem von Tieren, die mit der Tox&supmin;-Mutante infiziert waren, zwar angeschwollene, jedoch größtenteils intakte Gefäße zeigte. Dies erklärt sicherlich das Auftreten von blutigen Stühlen in der ersteren Gruppe. Außerdem wurden bei der Untersuchung des peritonealen Mesothels Ödeme und eine schwere Gefäßentzündung deutlich. Somit kann es durch die Freisetzung von Shiga-Toxin durch eindringende Bakterien innerhalb der Gewebe örtlich zu einer Steigerung der Schwere der Schleimhautläsion kommen, indem durch die Störung der Chorion-Durchblutung und Veränderungen der Durchblutung sowohl des Peritoneums als auch möglicherweise des Mesenteriums eine lokalen Ischämie hervorgerufen wird. Diese Wirkung scheint auf eine Stelle oder einen Bereich beschränkt zu sein, da die Untersuchung von Nierengewebe in diesem Krankheitsstadium keine Entzündung der Kapillargefäße zeigte (Daten nicht dargestellt). Solche Gefäßveränderungen stimmen möglicherweise mit Untersuchungsergebnissen der hämorrhagischen Colitis, die durch E. coli 0157:H7 (40) ausgelöst war, überein, wobei ein radiologischer Aspekt der ischämischen Colitis beschrieben wurde (34). Diese Stämme erzeugen hohe Spiegel von SLT1 (31), das auf sich teilende Endothelzellen eine direkte zellschädigende Wirkung hat (15).
Ein weiterer Unterschied, der zwischen den mit Tox&spplus;- und Tox&supmin;-Stämmen infizierten Tieren festgestellt wurde, war die Schwere der Schleimhautentzündung und der darauffolgenden Abszesse. In vielen Bereichen des Sigmas und des transversalen Colons traten Schäden mit ähnlicher Intensität auf, jedoch nur die mit SC500 infizierten Tiere zeigten Bereiche mit deutlichem eitrigem Zerfall der Schleimhautgewebe.
Eine höhere Intensität des eitrigen Exsudates wurde in einem noch dramatischeren Abfall der Blut-PMN mit anschließender myeloischer Leukämie am Tag drei der Infektion widergespiegelt. Man vermutet, daß während der Shigellose zusätzlich zum Knochenmark- und zum Gefäß-Kompartiment noch ein drittes PMN-Kompartiment auf Colon-Ebene geöffnet wird. Es ist zu erwarten, daß das Shiga-Toxin die Zahl der innerhalb dieses neuen Kompartiments eingeschlossenen PMN durch Gefäßveränderungen steigert, welche sowohl die Diapedese als auch die direkte Freisetzung von PMN innerhalb der Schleimhautgewebe steigern. Dies würde die rasche und schwere Granulocytopenie, die in Tieren beobachtet wird, die mit dem Wildtypstamm infiziert sind, und die anschließende gesteigerte myeloische Leukämie erklären, die möglicherweise der manchmal im Verlauf einer ernsten Shigellose beobachteten leukämieartigen Reaktion entspricht. In einem solchen Modell wird keine systemische Wirkung des Shiga-Toxins postuliert.
Die vorstehenden Ergebnisse legen somit nahe, daß das Shiga-Toxin nur eine begrenzte Rolle spielt, wenn es innerhalb von Epithelzellen und phagocytischen Zellen intrazellulär freigesetzt wird. Dagegen scheint das innerhalb infizierter Gewebe freigesetzte Shiga-Toxin hauptsächlich durch eine Schädigung der intestinalen Gefäße zu wirken.

Beispiel 4

Unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 2 wird SC501 durch in vitro-Mutagenese seines für Enterochelin codierenden Operons gentechnisch verändert. Der verwendete Suizid-Plasmidvektor pJM703.1 enthält das Enterochelin-Operon von S. dysenteriae 1, wobei jedes seiner ent-F-, Fep-E-, Fep-C- und Fep-D-Untereinheit-Gene mit einem Interposon, das die Resistenz gegen das Herbizid Biolafos codiert, und einem geeigneten Promotor für das Herbizid-Resistenzgen mutagenisiert ist. Der resultierende Clon SC504 ist Tox&supmin; und Enterochelin&supmin; ("Ent&supmin;").

Beispiel 5

Unter Einsatz des Verfahrens von Beispiel 2 wird SC504 durch in vitro-Mutagenese seines ics-A-Gens gentechnisch verändert. Der Suizid-Plasmidvektor verwendete pJM703.1 enthält das ics-A-Gen von S. flexneri (60, 61), das mit einem Interposon mutagenisiert worden ist. Der resultierende Clon SC505 ist Tox&supmin;, Ent&supmin; und ics-A&supmin; und kann zur Herstellung eines Impfstoffs gegen S. dysenteriae 1 verwendet werden.

Beispiel 6

Unter Einsatz des Verfahren von Beispiel 2 wird ein Wildtyp S. flexneri durch in vitro-Mutagenese seines für Aerobactin codierenden Gens und seines ics-A-Gens gentechnisch verändert. Der Suizid-Plasmidvektor, der verwendet wird, enthält das Aerobactin- und das ics-A-Gen von S. flexneri, die beide mit einem Interposon mutagenisiert worden sind. Der resultierende Clon SC506 ist Aerobactin und ics-A&supmin; und kann zur Herstellung eines Impfstoffs gegen S. flexneri verwendet werden.

Beispiel 7

Unter Einsatz des Verfahren der Beispiele 1, 2 und 4 wird eine Bal31-Deletion von 400 Basenpaaren, angefangen von der einzigen Hpal-Stelle, innerhalb des A-Untereinheit-Gens des Shiga-Toxin-Operons in einem DNA-Fragment aus S. dysenteriae 1 in Stamm SC500 gesetzt. Das resultierende Fragment wird mit einem 257 Basenpaare großen Fragment, das den P1-Promotor von pBR322 enthält, wieder ligiert, wodurch eine hohe Expression des B-Untereinheit-Proteins ermöglicht wird. Dieses Fragment, das das mutagenisierte Toxin-A-Gen enthält, wird in einen konditionalen Suizid-Vektor cloniert, der einen Replikationsursprung unter der Kontrolle des E. coli-lac-Promotors und ein Kanamycin-Resistenzgen enthält. In S. dysenteriae 1 wird sich dieser Vektor nur dann replizieren, wenn IPTG im Kulturmedium vorliegt. Ein Quecksilber-Resistenz-Kassette (65) wird stromaufwärts des mutagenisierten A-Untereinheit-Gens insertiert. Den S. dysenteriae 1-Wildtypstamm SC500 wird in Gegenwart von IPTG mit dem so erhaltenen Plasmid transformiert. Kolonien der resultierenden Shigella-Clone sind Hg- und Kanamycin-resistent. Man läßt sie viele Generationen in Abwesenheit von IPTG wachsen. Sodann werden die Kulturen auf das Vorliegen von Hg-resistenten, Kanamycin-empfindlichen Clonen abgesucht. Drei Clone werden isoliert und weiter charakterisiert. Durch Southern-Blots wird gezeigt, daß sie nicht mehr mit einer für das A-Untereinheit-Gen spezifischen Sonde hybridisieren, daß sie aber noch große Mengen an B-Untereinheit-Protein produzieren, was durch Analyse mit monoclonalen Antikörpern nachgewiesen wurde, und daß sie nicht mehr zelltoxisch sind.
Unter Einsatz des gleichen Verfahrens wird dieser ToxA&supmin;- Clon durch in vitro-Mutagenese seines Enterochelin-codierenden Operons gentechnisch verändert. Der Suizid-Plasmidvektor, der verwendet wird, enthält das Enterochelin-Operon von E. coli (66), wobei jedes seiner ent-F-, Fep-E-, Fep-C- und Fep-D-Untereinheit-Gene eine signifikante Deletion an einer Restriktionsstelle aufweist, in die ein Fragment, das die Resistenz gegenüber Arsenit codiert (62), und ein geeigneter Promotor für das Arsenit-Resistenz-Gen insertiert ist. Der resultierende Clon ist ToxA&supmin; und Ent&supmin;.
Unter Einsatz des gleichen Verfahrens wird dieser ToxA&supmin;- und Ent&supmin;-Clon durch in vitro-Mutagenese seines ics-A-Gens gentechnisch verändert. Der Suizid-Plasmidvektor, der verwendet wird, enthält das ics-A-Gen von S. flexneri (60, 61), das eine signifikante Deletion an einer Restriktionsstelle aufweist, in welche ein Fragment, das die Resistenz gegenüber Cadmium codiert (63, 64), und ein geeigneter Promotor für das Cadmium- Resistenz-Gen insertiert ist. Der resultierende ToxA&supmin;, Ent&supmin;, icsA&supmin; S. dysenteriae 1-Clon ist durch eine wesentlich schwächere Fähigkeit zum Eindringen gekennzeichnet, was dazu führt, daß er zur Herstellung eines Impfstoffes für Menschen gegen S. dysenteriae 1 geeignet ist.
Man geht davon aus, daß die vorstehende Beschreibung diese Erfindung und zahlreiche damit zusammenhängende Vorteile deutlich macht, außerdem wird vorausgesetzt, daß verschiedene Modifikationen im vorstehend beschriebenen Verfahren und beim vorstehend beschriebenen Impfstoff durchgeführt werden können, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen, wobei die vorstehend beschriebenen Ausführungsformen lediglich bevorzugte Ausführungsformen sind.
Auf die folgenden Referenzen wurde vorstehend verwiesen.

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66. Ozenberger et al. 1987. Genetic organization of multiple fep genes encoding ferric enterobactin transport functions in E. coli. J. of Bacteriology. 169(8): 3638-3646. Tabelle I: Stämme, Plasmide, Phagen und ihre relevanten Merkmale Stamm Art Genotyp Plasmid/Phage relevante Merkmale S. dysenteriae 1 E. coli Eindringen in HeLa-Zellen Apr, Clonierungsvehikel Apr, Shiga-Toxin-Gene, subcloniert in pUC8 Apr Spcr Ω i ist an der Hpal-Stelle von pHS6001 insertiert Apr Spcr enthält das Ω-Element enthält die pir-Funktion aus dem R6K-Replikationsursprung Suizid-Clonierungsvektor Apr, kann in SM10 λ pir mobilisiert werden mutagenisierte Toxingene, cloniert in pJM703-1 Apr, Spr

Claims

1. Verfahren zur Modifikation eines Wildstammes eines entero-invasiven Shigella zur Produktion eines modifizierten Stammes von Shigella, der zur Herstellung eines Impfstoffes gegen den Wildstamm von Shigella verwendet werden kann, gekennzeichnet durch die Transformation des Genoms des Wildstammes von Shigella, so daß Shigella praktisch kaum in Zellen eines Wirts eindringen kann und sich praktisch kaum innerhalb infizierter Zellen und von infizierten Zellen zu nicht infizierten Zellen des Wirts ausbreiten kann und keine Toxine produzieren kann, die eine bedeutende Zahl von infizierten wie auch nichtinfizierten Wirtszellen abtöten, wobei das Genom des Wildstamms von Shigella transformiert ist, so daß mindestens a) ein erstes Gen, das ein erstes Protein codiert, welches für den Wildstamm von Shigella zum Eindringen in die Zellen sowie die Gewebe des Wirtes notwendig ist, und b) ein zweites Gen, das ein zweites Protein codiert, welches für den Wildstamm von Shigella zur Ausbreitung innerhalb infizierter Zellen und zwischen infizierten und nicht-infizierten Zellen des Wirts notwendig ist, vollständig oder teilweise entfernt oder permanent inaktiviert sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Shigella ein S. flexneri ist und das erste Gen die Produktion oder Verwendung von Aerobactin durch S. flexneri codiert.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das zweite Gen die intra-interzelluläre Ausbreitung codiert.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Shigella S. dysenteriae 1 ist, dessen Genom modifiziert ist, so daß ein drittes Gen, das die Produktion oder Verwendung von Shiga-Toxin durch S. dysenteriae 1 codiert, vollständig oder teilweise entfernt oder permanent inaktiviert ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das erste Gen von S. dysenteriae 1 die Produktion oder Verwendung von Enterochelin durch S. dysenteriae 1 codiert.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das zweite Gen die intra-interzelluläre Ausbreitung codiert.

7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das erste Gen die Gene der ent F-, Fep E-, Fep C- und Fep D-Untereinheit des Enterochelin-Operons von S. dysenteriae 1 umfaßt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei eines oder mehrere der ersten, zweiten und dritten Gene mutagenisiert sind.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei eines oder mehrere der ersten, zweiten und dritten Gene durch allelischen Austausch mit einem oder mehreren in vitromutagenisierten Gene inaktiviert sind, insbesondere mutagenisierten Genen, bei denen bedeutende Anteile deletiert sind, und insbesondere mutagenisierten Genen, in die Markergene insertiert wurden.

10. Shigella, welcher: a) gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 modifiziert wurde, wobei mindestens das erste und zweite Gen vollständig oder teilweise entfernt oder permanent inaktiviert sind, oder b) ein Abkömmling des modifizierten Shigella ist, der im wesentlichen die gleichen Eigenschaften wie der modifizierte Shigella aufweist.

11. Impfstoff, der aus dem Shigella von Anspruch 10 hergestellt wurde.