PT91177B

PT91177B - Metodo para modificar o genoma de uma estirpe selvagem de shigella

Info

Publication number: PT91177B
Application number: PT91177A
Authority: PT
Inventors: Philippe Sansonetti; Annick Fontaine
Original assignee: Pasteur Institut; Inst Nat Sante Rech Med
Priority date: 1988-07-15
Filing date: 1989-07-14
Publication date: 1995-09-12
Also published as: ATE106941T1; US20050031644A1; US20060257940A1; DK65790A; EP0351322A1; AU620630B2; AR242989A1; ZA895371B; DE68915876D1; CA1324970C; JP2006280378A; KR900702025A; DK175464B1; EP0351322B1; OA09440A; ES2054058T3; US7138126B2; US7439053B2; JP2005013234A; PT91177A

Description

Antecedentes da invenção

A presente invenção refere-se a um método para modificar o geno. ma de uma estirpe selvagem en t e r o - in v as i v a de Shigella de tal manei_ ra que a estirpe não possa invadir, substancialmente as células e te_ eidos de um hospedeiro infectado e não possa dissemi nar-se , substan cialmente, nas células infectadas e entre as células infectadas e não infectadas do hospedeiro nem possa produzir toxinas que matarão números substanciais das células do hospedeiro. A presente invenção refere-se em particular a uma estirpe de Shigella modificada de tal modo que pode utilizar-se para imunizar um hospedeiro contra a esti_r pe selvagem de Shigella.

A shiguelose ou disenteria bacilar é uma doença mundial endémica. A doença apresenta um problema de saúde pública particu1 armente grave nas regiões tropicais e nos países em desenvolvimento onde pr£ dominam a Shigella dysenteriae 1 e S.flexneri. Nos países industria lizados o agente etiológico principal é a S. sonnei ainda que casos esporádicos de shiguelose sejam detectados e provenientes da S.flegi neri, S.hoydii e de certas Escherichia coli entero-invasivas.

A primeira fase da patogenia da disenteria bacilar é a invasão da mucosa do cólon humano pela Shigella (23). A invasão das mucosas abrange várias fases que incluem a penetração da bactéria nas células epiteliais, multiplicação intracelular, a morte de células hospedeiras e finalmente inseminação para as células adjacentes e para o tecido conectivo (9, 41, 55, 56). 0 processo global que usualmente é limitado à superfície da mucose conduz a uma reacção inflamatci ria acentuada que é responsável pelos abcessos e pelas úlceras (23, 41,55).

Ainda que a disenteria seja caracteristica da shiguelose, esta pode ser procedida por diarreia aquosa. A diarreia parece ser o resultado de perturbações de reabsorção colónica e secreção aumentada do jejuno enquanto que a disenteria constitui um processo puramente colónico (20, 41). As manifestações istémicas também se podem obsejr var no decurso da shiguelose principalmente nos casos devidos a S. dysenteriae 1. Estes incluem o megacólon tóxico, reacções leucemóides e a síndrome urémico-hemo1ítica (HUS). Esta última é a causa principal de mortalidade por shiguelose nas áreas em desenvolvimento ( 1 1, 22, 38 ) .

papel da toxina de Shiga produzida em níveis elevados pela S. dysenteriae 1 (6) e das toxinas idênticas á toxina de Shiga (SLΓ ) produzidas em baixos níveis pelas S.flexneri e S.sonnei (19, 30) nos quatro estádios principais da shiguelose, isto é a invasão das células epiteliais individuais, a invasão dos tecidos, a diarreia e os sintomas sistémicos, não está bem esclarecida.

Para uma revisão consultar 0'Brien and Holmes (32). Os plasmídeos de 180-220 kilobases (kb) são essenciais para todas as espécies de Shigella para a invasão das células epiteliais individuais (41, 42, 44). Isto inclui a entrada, a multiplicação intracelular e a mor te precoce das células hospedeiras (4, 5, 46). 0 papel da toxina de Shiga e das SLT neste estádio não é claro. Estas nao parecem desempenhar um papel crucial na multiplicação intracelular e na morte rá_ pida (4, 12, 46). Contudo, nenhuma das experiências que se realizaram compararam os mutantes isogénicos por meio de um sistema de ensaio celular relevante.

Provas recentes indicam que a toxina de Shiga é citotóxica nas culturas primárias de células colónicas humanas (27). A invasão do tecido requer produtos codificados cromossomicamente adicionais en3 tre os quais 1ipopo 1issacáridos smooth (LPS), (44, 57), o produto não caracterizado do locus Kcp (8, 44) e aerobactina (24, 28).

Uma região dos cromossomas de S. flexneri necessária para prodjj ção de líquido nas alsas do íleo do coelho foi localizada nas regiões de rha-mtl e perto do locus da 1isina-desc arboxi1 ase (44). Contudo não foi preciso juntar qualquer prova para demonstrar a capacidade para provocar a acumulação de líquidos devido às SLT de S.flexneri. Assim, o papel da toxina de Shiga para provocar complicações sisténM cas da shiguelose é ainda hipotético. Contudo a toxina de Shiga pode induzir danos vasculares uma vez que as lesões capilares observadas nos HUS assemelham-se às observadas nos vasos cerebrais de animais infectados com aquela toxina (1, 2, 22).

mutante a que falta a toxina de Shiga ou uma SLT podia indicar o papel destas toxinas no processo de doença. A S. dysenteriae 1, que produz a quantidade mais elevada desta citotoxina, podia ser transformada num mutante toxina de Shiga negativo (Tox-) e servir para indicar de melhor forma o papel da toxina-- apesar de Sekizaki et al (48) terem obtido um mutante destes que se comportou num ensaio de células de Hela como invasiva e no teste de Sereny como a es tirpe selvagem. Mais importante é o mutante destes Tox- poder ser utilizado para preparar o mutante que não invadiria, sub s t a n c i a 1 me _n te, as células e portanto não se multiplicaria nas células do hosp£ deiro e nem se disseminaria, substancialmente, nas células do hosp£ deiro infectado e a partir destas nas células não infectadas do hos pedeiro e que também não produziria toxinas que matassem números substanciais de células do hospedeiro infectadas ou não infectadas. Daqui resultaria que o mutante Tox- podia utilizar-se para imunizar um hospedeiro contra a estirpe selvagem de Shigella.

Resumo da Invenção

Preparou-se, por meio de recombinação genética um mutante Toxduma estirpe selvagem de S.dysenteriae 1, mediante a troca de alelos com um gene de toxina de Shiga mutageneizado in vitro. 0 efeito dejs ta mutação nos sistemas de ensaio com células e com animais mostrou que o mutante podia ser transformado por tecnologia genética para proporcionar ainda uma mutante que não pode invadir, substancialmen. te, e em seguida disseminar-se em e entre as células do hospedeiro nem produzir toxinas de Shiga nas células hospedeiras.

Ainda de acordo com a presente invenção a mutante Tox- da estir pe selvagem S. dysenteriae 1 é ainda modificada por tecnologia gen_é tica mediante a troca de alelos com:

a) um gene mutageneizado in vitro de S. dysenteriae 1 que codifica uma proteína necessária para a S. dysenteriae 1 invadir as células do hospedeiro assim como os tecidos, gene este que codifica para uma proteína necessária para a formação de com plexos de ferro e ou para o transporte de ferro na S. dysenteriae 1 (por exemplo, um gene de enterobactin ou um gene de enterochelin de S. dysenteriae 1; e

b) um gene mutageneizado in vitro de S. dysenteriae 1 que codifica uma proteína necessária para que a 5. dysenteriae 1 se dissemine nas células infectadas e entre as células infectadas e não infectadas tal como um gene de disseminação intra-intracelular (por exemplo, um gene ics A ou um gene vir G).

Ainda de acordo com a presente invenção transformou-se por tecno logia genética uma estirpe selvagem de 5. flexneri por permuta aléli_ ca com:

a) um gene mutageneizado in vitro de 5. flexneri codifica uma proteína necessária para que a S. flexneri invada as células

do hospedeiro assim como os tecidos, gene este que codifica uma proteína necessária para a formação de complexos de ferro e/ou para o transporte de ferro na 5. flexneri (por exemplo, um gene de aerobactin de S. flexneri); e

b) um gene mutageneizado in vitro que codifica uma proteína necessária para a S. flexneri se disseminar em e entre as célq las do hospedeiro tal com um gene ics A.

Ainda com o aspecto da presente invenção as mutantes de Shigella desta invenção são utilizadas para preparar vacinas contra a estirpe selvagem de Shigella.

Breve descrição das figuras

A Figura representa esquematicamente a clonagem do operon da t_q xina de Shiga e a mutagénese in vitro do génese da subunidade A da toxina de Shiga no Exemplo 2.

Nos plasmídeos pHS7201, pHS72O2 e pHS7203 na Figura: As linhas sólidas indicam as sequências a partir do gene da subunidade A; As linhas a ponteado indicam as sequências do gene da subunidade B; e as linhas com riscas indicam as sequências a partir do elemento de inserção_ru.

Descrição Detalhada da Presente Invenção

Proporciona-se um método para modificar uma estirpe selvagem de uma Shigella entero-iηvasiva de tal maneira que a estirpe modificada pode ser utilizada para a preparação de uma vacina contra a esti_r pe selvagem a estirpe selvagem de Shigella. A estirpe selvagem de Shigella é modificada de tal forma que não se pode invadir e em seguida mu 11iρ1icar-se , substancialmente, nas células infectadas de um hospedeiro, particu 1 armente de um hospedeiro humano e não podem di_s

seminar-se substancialmente nas células infectadas e das células iq fectadas para as células não infectadas do hospedeiro nem produzir toxinas que matam números substanciais de células infectadas do hoq pedeiro assim como de células não infectadas. 0 método envolve a transformação do genoma (por exemplo, um plasmídeo de grande virulência pHS7200) da estirpe selvagem de Shigella, tal como uma S.fle_x neri, de tal maneira que o gene(s), de a estirpe selvagem que codifica uma ou mais proteínas necessárias para que a estirpe invada as células infectadas do hospedeiro assim como os tecidos, (por exemplo, um gene de aerobac t ina) , e que codifica para uma ou mais das prote_í nas necessárias para que a estirpe se dessimine em e entre as células do hospedeiro (por exemplo um gene ics A (60, 61), são completa ou parcialmente eliminados ou permanentemente inactivados de preferência pelo menos removidos parcialmente. Para a transformação do g_e noma duma estirpe selvagem tal como a S. dysenteriae 1 o método de preferência envolve também a remoção total ou parcial ou permanente inactivação, de preferência pelo menos a remoção de uma parte do ge_ ne(s) de preferência exactamente o gene de subunidade A que codifica para a toxina de Shiga.

No método da presente invenção os genes da estirpe selvagem de Shigella podem ser removidos parcial ou totalmente ou inactivados permanentemente dum modo convencional, por exemplo, por meio duma troca alélica com genes m j t a g en e i z ado s in vitro, onde pelo nenos po_r ções significativas foram de preferência eliminadas. A este respeito é preferível que os genes mutageneizad os não sejam simplesmente ina£ tivados por meio de transposões que são inseridos nos genes e que p£ dem perder-se dos genes quando estes são reproduzidos in vivo em ge_ rações de Shigella subsequentes quando se preparam as vacinas da pre sente invenção. De preferência os genes mutageneizados têm porções significativas delectadas e genes marcadores compatíveis com a vacj. na apropriados inseridos, de preferência nessas delecções. Estes g£ nes marcadores permitem a Shigella transformada deste modo ser faci_L mente identificada. Os genes marcadores preferidos são os genes de resistência aos metais pesados, tais como o mercúrio, os arsenatos, arsenitos, antimónio, cádmio, zinco e/ou genes de resistência ao co_ balto (62, 63, 64, 65).

As células da estirpe modificada podem cultivar-se e em seguida atenuar-se de um modo convencional. As células em seguida podem ser misturadas com veículos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, por exemplo, numa solução de cloreto de sódio aquosa e, facultativ_a mente, com excipientes convencionais, por exemplo, um agente detergente aceitável em farmácia para formar uma vacina contra a estirpe selvagem. A vacina pode ser formulada para conter uma concentração final de substância celular numa escala entre 0,2 e 5 mg/ml, de pre ferência entre 0,5 e 2 mg/ml. Após a formulação, a vacina pode ser incorporada num contentor estéril que em seguida é selado e conservado a baixa temperatura, por exemplo, à temperatura de 4°C ou pode ser liofilizada.

A fim de induzir a imunidade num hospedeiro humano para uma estirpe selvagem de Shigella, podem se administrar uma ou mais doses da vacina formulada de um modo adequado, com doses contendo cerca de

CT-1 0 células de Shigella 1iofi1iza d as. A vacina pode ser admirus trada por via oral, de um modo convenciona 1.

tratamento pode consistir numa única dose da vacina ou em várias doses durante um certo período de tempo.

Os exemplos que se seguem ilustram a presente invenção.

EXEMPLOS

A menos que indicado de um outro modo, os processos e técnicas de clonagem e transformação utilizados nos Exemplos são os mesmos descritos de um modo geral em Maniatis et al, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982).

As estirpes utilizadas nos Exemplos de 1 a 6 e os seus conteúdos em plasmidicos ou fágicos são indicados no Quadro I.

Foram utilizados dois meios nos Exemplos: meio mínimo M9 ( N a 2 HPO4. I2H2Q: 15 g/1, KH₂PO^: 3 g/1, NaCl : 0,5 g/1, NH^Cl : 1 g/1, Mg 50^. 7H2Ú^: 0,05 g/1) e Trypto Casein Soja Broth (Diagnostics Pasteur, Marnes a Coquette, France).

Exemplo 1_-- Clonagem do operão da Toxina da Shiga

Preparou-se um DNA total (50) a partir de uma estirpe selvagem sensível aos an t.i b i ó t i cos de S. dysenteriae 1 estirpe SC500 obtida do Centro Nacional de Referência das Shigella do Institut Pasteur de Paris, França. Digeriram-se 10 yjg de DNA com EcoRI (Amersham, Buckinghamshire R.U.) e mergulhou-se em gel de agarose 0,7?ó. Os fraq mentos compreendidos entre 3,5 e A,5 Kb foram eluídos electricamen te. Ligaram-se 0,1 yjg de Fragmentos purificados com 1 jjg deÀGT11 arms coligado, EcoRI cortado desf0sforí1 a do (Stratagene Cloning System, San Diego, Estados Unidos da América do Norte) e embalado utiiizando-se 0 Packagene System, (Progema Biotec, Madison, Estados Unidos da América do Norte) de acordo com as recomendações dos fornecedores. 0 DNA embalado foi em seguida transfectado para E. coli Y1 090( 59 ). 0 banco de/^GT11 foi depois sondado com 13C4, um anticor.

po monoclonal específico para a subunidade B de SLT1(54) obtida de

A.D. O'Brien, U.S.U.S.H., Bethesda, MD, Estados Unidos Unidos da Anw rica do Norte. Os fagos recombinantes, 1θ\ foram plaqueados em Y1090 colocada em agar mole LB. As placas foram incubadas à temperatura de 37°C durante 12 horas. Aplicou-se um filtro de n i t r oce lu lo se (Schle_i cher and Schull, Dassel, República Federal da Alemanha), previamente embebido em solução de isopropi1tioga1actosido 10 mM (IPTG) (Sigma, St Louis, MO, EUA), na placa, e em seguida incubou-se à temperatura de 42°C durante 2,5 horas.

filtro foi retirado da placa e incubado durante 1 hora à tempe. ratura de 37°C em meio leite-PBS (50 g/1 de leite meio gordo desidra. tado em 1 x PB5), lavado cinco vezes com 1 x PBS e incubado durante 1 hora com o anticorpo monoclonal 1304 na fase sobrenadante de céljj las de hibridoma não diluída. Após cinco lavagens em °BS-leite, o filtro foi incubado durante 1 hora à temperatura de 370c em PBS-le_i te contendo uma diluição a 1/200 de anti-anticorpo IgG de murganho em carnairo, cõnjugado com fosfatase alcalina (Biosys, Comp iégne , F rari ce). 0 filtro foi lavado ainda com 1 x PBS e colocado numa solução de fingimento: 0,33 mg/1 de nitro azul de tetrazol, 0,16 mg/1 de fo£ fato de 5-bromo-4-cloro-3-indo1ilo (ambas provenientes da Sigma), 100 mM Tris HC1 pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgC^· ^Os elones positivos fo. ram plaqueados, purificados e transfectados para Y1089 (59). Preparou-se em seguida DNA a partir do lisogeno (13). Realizou-se a sua elonagem no sítio EcoRI do vector plasmídico pVC8 na E. coli J M 8 3 (58). Os subclones de E.coli JM83 foram testados com anticorpo nono clonal 1 3 C 4 como se descreveu anter iormente , com as modificações se guintes: aplicou-se na placa um filtro de ni t roce 1 u 1 ose seco e adicionaram-se 2 ml duma solução de polimixina B a 2 mg/1 em PBS, no t£ po do filtro. A placa em seguida foi incubada à temperatura de 37°C durante 45 minutos antes de se iniciar a incubação em PBS-1eite.I deq

1- 10 tificou-se o subclone pHS 7201 na E. coli JM83, que continha a subunidade B de SLT1.

V e r i f i c o u - s e que o subclone pHS 7201 da E. coli JM83 apresentou um sinal mais forte no ensaio de imunomancha da colónia na presença do anticorpo monoclonal 13C4 do que a estirpe principal SC500 devido a um efeito de dosagem do gene. 0 mapa da restrição da toxina de 5h_i ga codificando a região do pHS 7201 foi idêntico ao mapa de SLT1 (14). 0 gene de subunidade de A verificou-se possuir um único sítio Epa 1 localizado 310 pb a jusante do codão de iniciação ATG onde se podia inserir uma cassete como descrito no Exemplo 2.

Exemplo 2 -- Mutaqénese in vitro da toxina de Shiqa do gene de subunidade A operão da toxina de Shiga completo está contido num fragmento de DNA de 4,2 kb EcoRI no subclone pHS 7201. A mutagénese in vitro do gene de subunidade A foi realizada por inserção do interposão -TL (37) que codifica a resistência à espectinomicina e que é flanqueado de cada lado pelos sinais de paragem da transcrição da tradução T4. 0 ómega foi purificado sob a forma de um fragmento Hind III de 2 kb e as suas extremidades preenchidas pelo fragmento de Klenow de DNA polimerase I. Em seguida o ómega foi ligado ao pHS 7201 linear_i zado com Hpa I para gerar plasmídeo recombinante pHS 7201 como se mostra na Figura. 0 fragmento EcoRI de 6,2 kb contendo a sequência mutageneizada foi em seguida purificado e ligado com o sítio EcoRI do vector plasmídico suicida pJM 703,1 (51) para gerar o plasmídeo recombinante pHS 7203 como se mostra na Figura.

plasmídeo pJM 703,1 replica-se somente se a sua origem defic£ ente em R6K é complementada em -Trans pela função pir contida no fg go lambda integrado no genoma da E. coli SM10 (21). Esta estirpe

1 também contém, integrados nos seus cromossomas, os genes de transfe rência do plasmídeo RPA do tipo -IncP do hospedeiro completo. 0 pla£ mídeo pJM 703,1 pode portanto ser mobilizado pelo lambda pir SM10 (21) porgue contém o sítio Mob do RPA (51). 0 plasmídeo pHS 7203 foi portanto mantido de modo estável na estirpe lambdapir SM10 e em seguida transferido conjugalmente para na S. dysenteriae 1 estirpe SC 500, tipo selvagem. Os acasalamentos foram realizados em membranas de celofane, a selecção foi obtida por colocação em meio mínimo M 9 complementado com tiamina, metionina, triptofano e ácido nicotínico numa concentração de 10^jg/ml cada, 0,2% de glucose e 50^jg/ml de espectinomicina. As colónias que se desenvolveram em meio selectivo foram purificadas e identificadas como S. dysenteriae 1 por aglutinação com antisoro de coelho específico (diagnóstico Pasteur).

A permuta aiélica entre os cromossomas do gene de Toxina de Sh^i ga tipo selvagem e do gene mutageneizado da Toxina de Shiga, in vitro, foi demonstrada pelo imunoensaio de mancha de colónia utilizar^ do-se o anticorpo monoclonal 13CA para detectar células de S. dysen teriae 1 que expressam um fenotipo Tox-.

A presença da modificação Tox- nos genomas das células de S. dy_ senteriae 1 foi verificada com uma sonda construída a partir de um fragmento Hind III- H i n c II de 655 bp contendo parte do gene de subunidade A e o gene de subunidade B completo do fragmento EcoRI de A,2 Kb, referido anteriormente, que contém o operão completo da Tox_i na de Shiga. 0 fragmento Hind III de 2 Kb, referido anteriormente, contendo mterposão YY foi também utilizado como uma sonda (37). Os fragmentos de DNA utilizados como sondas, foram marcados por tradução de corte (39) com S'-dCTP marcado com 32p (Amersham). 0 D'JA total foi preparado a partir de 2 ciones Tox- e analisado por hibridação com a sonda de Toxina de Shiga e a sonda JA_ . Os fragmentos de

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DNA foram transferidos dos geles de agarose para filtros de nitrocelulose (Sehlucher and 5chϋ 11) pelo método de Southern (53). A hibridação realizou-se à temperatura de 6 5⁰ C durante a noite e a lavagem foi feita à temperatura de 65-ⁿC em 6 x SSC.

As sondas mostraram gue o fragmento EcoRI de 4,2 Kb da S. dyseri teriae 1 que contém os genes de Toxina, tinha sido substituído, nas mutantes Tox-, pelo fragmento de 6,2 Kb que hibridou com ambas as sondas. Este resultado mostrou que as regiões f1anquead oras de cada lado do gene da toxina mutageneiza d o no pHS 7 20 3 tinha recombinado com os seus parceiros no genoma SC500, portanto substituindo o gene de subunidade A do tipo selvagem pelo gene mutageneiza do.

llm destes clones Tox-, SC501, foi escolhido para estudo posterior e o clone SC501 depositado no Centro Nacional de Culturas de Micro_r ganismos do Institut Pasteur de Paris, França, sob o número de acej. tação 1-774, em 30 de Junho de 1988.

Exemplo 3-- Ensaio de citoxicidade, desenvolvimento com células HeLa , separação de macrófaqos e_toxicidade nas a 1s a s do íleo d o coelho e_no macaco

Desenvolveram-se durante A8 horas em 200 ml de meio isento de ferro as estirpes SC500 e 5C501 assim como as suas derivadas não iri vasivas SC 502 e SC5O3 respectivamente, (obtidas por recuperação es pontânea) (isto é, perda) do plasmídeo pHS 7200 de grande virulência que é necessário para a invasão de células. 0 material de vidro foi pré-tratado com ácido clorídrico 6N e lavado extens ι vamente com água isenta de ferro. 0 meio continha sais M9 complementados com 15 yjg/ml de CaCl2> 5 mg/ml de casamino-ácidos, 2 mg/ml de glucose, 50 ^ig/ml de tíamina, 20 yjg/ml de L -1 r i p t o f ano , 10^ig/ml de ácido nicotínico e

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150 yjg/ml de transferrina humana (Sigma).

As bactérias foram lavadas duas vezes com solução de cloreto de sódio e ressuspensas em 3 ml de PBS. Adicionou-se lisozima com uma concentração final de 0,2 mg/ml. Após 30 minutos de incubação à teni peratura ambiente (25°C), adicionaram-se 30 jjl de EDTA 0,5M, pH8 e transferiram-se as células para um banho de gelo e agitaram-se. Os extractos agitados foram esterilizados por filtração e conservados congelados à temperatura de -20°C. Os subrenadantes da cultura dos filtros esterilizados e os extractos bacterianos foram analisados r£ lativamente à citotoxicidade com células HeLa desenvolvidas em meio essencial mínimo com sais de Earle e N-glutamina (Gibco, Paisley, Es cócia, Reino Unido), complementado com soro fetal de vitela a 1 0?ó (Gibco). As diluições em série foram realizadas em meio de cultura de células (100 JjI) numa placa microtitu1adora. Cada cavidade foi inq culada com 2 x 10^ células em 100 y1. As placas foram em seguida incubadas 'a temperatura de 37°C sob 5% de CO2 durante 24 horas. Os eq saios de neutralização realizaram-se com soro policlonal de coelho e com anticorpo monoclonal 13C4. As placas foram examinadas sob micros copia de fase luminosa, em seguida coradas com Giemsa. A citotoxicA dade foi calculada sob a forma de 50% de dose citotóxica (CD 50) por mg de proteína do extracto.

Determiη ou-se a multiplicação de bactérias nas células HeLa (46). As monocamadas não confluentes de células HeLa em placas de culturas de tecidos em plástico de 35 mm (Becton Dickinson Labware, Oxnard,

CA, EUA) foram inoculadas com bactérias ressuspensas em 2 ml de meio mínimo essencial (MEM, Gibco) com uma infecção múltipla (MDI) de 100 centrifugadas durante 10 minutos a 2.200 x g e incubadas durante 30 minutos à temperatura de 37^ιΊ0 para permitir a penetração. As plq cas foram em seguida lavadas três vezes com solução salina equilibrq

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da de Earle (EBBS, Gibco) e cobertas com 2 ml de MEM com 25 ^jg/ml de gentamicina. Este momento foi definido como o tempo zero (TO).

Após uma hora de incubação à temperatura de 3 7 °C as preparações foram novamente lavadas com EBSS e cobertas com 2 ml de MEM isento de antibiótico (Tq ) . Continua-se a incubação durante mais três horas (T-] - T^). Removeram-se duas placas de hora a hora. Uma placa foi lavada três vezes com EBSS e corada com Giemsa para se calcular a percentagem de células HeLa infectadas. A outra foi lavada cinco vezes com EBSS para se eliminar bactérias extrace 1 u 1 ares viáveis. As células foram tripsinizadas , contadas e lisadas com desoxicolato de sódio em água destilada a 0,5%. As diluições foram plaqueadas em Trypticase Soy Agar. Calculou-se o número médio de bactérias por cé_ lula HeLa infectada. Repetiram-se as experiências quatro vezes. As curvas de crescimento intracelular foram desenhadas e calculou-se a inclinação da fase exponencional.

ensaio para a libertação de macrófagos e morte foi realizado (A) utilizando-se macrófagos J 7 7 4 (52) mantidos em R Ρ ΜI 1640 (E1 o w Laboratories Inc., McLean, VA, EUA) complementado com complemento de soro total de vitela inactividado (Gibco) e 2 mM de glutamina (Gibco). Dezoito horas antes da infecção, marcaram-se 7 x 10^ macrófagos em placas de cultura de tecidos em plástico de 35 mm (Becton Dickira son Labware) em meio de cultura contendo 0,5 ^jCí de £ ^H J uridina por ml (Amersham).

As células foram lavadas três vezes com EBSS antes da adição de 1 ml de suspensão bacteriana em RPMI 1640 a uma M0I de 100. A infecção foi realizada durante uma hora à temperatura de 37°C sob atmosfera de CO2 θ 5%. As monocamadas foram lavadas três vezes com EBSS (Tg) e cobertas durante uma hora à temperatura de 37°C e atmosfera

de CO2 a 5%, complementadas com 2 ml de RPMI e 2mM de glutamina e geri tamicina a 25 yjg/ml ( T-j ) .

As placas em seguida foram lavadas três vezes com EBSS e incub_a das sob atmosfera de CO2 ^a 5% durante mais de três horas ( T-j - T^) à temperatura de 37°C em glucose RPMI isenta de gentamicina. Retiraram-se duas placas de hora a hora e lavaram-se as culturas três vezes com EBSS e determinou-se a percentagem de macrófagos viáveis eri tre as células que ainda aderiram à superfície do plástico por meio de coloração de azul Tripan. A percentagem de macrófagos residuais foi determinada em seguida por medida da quantidade da radioactividade remanescente na placa. As células aderentes foram lisadas com 1 ml de desoxicolato de sódio a 0,5% em água destilada e precipitou-se e cortou-se 100 deste lisado (4).

Prepararam-se alsas do íleo de coelho ligadas de 10 cm em coelhas de cerca de 2 kg que foram anestesiadas com pentobarbita 1 de sódio a 6 % na quantidade de 0,5 ml/kg.

Testaram-se inóculos de 10? e 10^ CFU em 1 ml de caldo Tripticase de soja. Decorridas 18 horas sacrificaram-se os coelhos. Registou-se a acumulação dos fluidos nas alsas e calculou-se a relação volu me-comprimen10 entre (V/C). As porções das alsas infectadas foram fixadas em formalina tamponada a 10%. Processaram-se os espécimes de acordo com processos convencionais e coraram-se com hematoxilina-eosi.

na-saframina.

I n j e c t a r am-s e por via intramuscular oito macacos rhesus com o pee so de 3,5 a 4,5 kg, com 50 mg de cloridrato de cetamina (Imalgene 500, Rhõne Mérieux, Lyon, França). Cada animal foi inoculado por via intragástrica com 1,5 x 10^ de microrganismos SC 500 e SC501 ressuspejn sos em 20 ml de tripticase de caldo de soja e 14 g/1 de carbonato de hidrogénio e sódio (50/50). Plaqueamento do inóculo em agar de ver1 6 melho cango indicou que menos do que 1 % da bactéria do inoculo tinha perdido a sua propriedade invasiva (26). As fezes foram examinadas diariamente para detecção de diarreia, presença de pús, muco ou sangue. A intensidade de cada um destes sintomas foi classificada cada dia de zero a 3. Para cada animal a gravidade de um dado sintoma foi expressa sob a forma de um index que representava um somatório das + acumuladas para cada sintoma.

Nos macacos que morreram de disenteria fulminante fez-se a autójo sia imediata. As espécies foram processadas como se descreveu anteriormente para os tecidas de coelho.

Resultados

No ensaio de citotoxicidade SM10 Y\pir (pHS7203) não se apresentou citotóxico. Após transferência conjugada de pHS7203 na S.dysentjs

O D riae ensaiaram-se os clones que exibiam o fenotipo Amp Spc¹' através dum ensaio de imunomancha de colónias. Quinze por cento apresentaram um fenotipo Tox-. A SC5O1 exibiu uma citotoxicidade de 347CD50/mg de proteína que era da mesma ordem de grandeza da E. coli Kl 2 (412CD 50/mg), bem conhecida. A citotoxicidade residual de SC5O1 não pode ser neutralizada por um soro policlonal anti-toxina de Shiga.

A presença da mutação Tox- na estirpe SC5O1 não altera significativamente a sua capacidade para se desenvolver intracelularmente nas células HeLa uma vez que a sua taxa de crescimento exponencial,expres sa em gerações/hora foi de 2,610,7 comparada com 2,510,6 para a estir pe SC 500 de tipo se 1vagem.A1ém disso não se pode observar diferença significativa nem eficiência de morte rápida de macrófagos J774 por 5C500 e SC501.0 desprendimento e a aparência das células positivas ao azul de Tripan progrediu com taxas idênticas durante quatro horas,in_ dicando portanto que a libertação de Toxina de Shiga nas células in1 7 fectadas não afectava significativamente nem a taxa de desenvol v imeni to intracelular nem aumentava a morte rápida de células hospedeiras.

efeito das mutações Inv- e Tox- na patogenia da S. dysenteriae 1 no coelho numa experiência com alsas ligadas foi determinada pelo efeito na produção do líquido nas alsas. Os desvios médio e padrão foram computorizados a partir dos resultadas obtidos em seis alsas para cada estirpe com qualquer dos dois inóculos (is.to e 10 e 10 UFC). Para as estirpes ínvasívas (isto é, SC500, Inv⁺, Tox ⁺ e SC501, Inv⁺, Tox^-) com ambos os inóculos, a ausência de produção de toxina de Shiga diminuiu a acumulação de líquidos mas a diferença não era estatisticamente significativa, indicando que a invasão e subsequen te inflamação são as principais responsáveis pela acumulação do líquido. Para estirpes não invasivas, (isto é SC503 Tox⁺ e 5C502 Tox^-) observou-se uma diferença notável, uma vez que apenas a estirpe que produzia a toxina de Shiga extraía a acumulação do líquido. Este fa£ to indica que na experiência com o coelho, a toxina de Shiga é a úni. ca enterotoxina da S. dysenteriae 1 qualquer que seja o papel deseni penhado por esta enterotoxina no decurso da doença.

Os estudos histopato1ógicos mostraram lesões graves incluindo abcessos e úlceras que destróiem numerosas vilosidades com ambos os inóculos, quer com SC500 quer com SC501. Em geral as lesões foram mais graves nas alsas infectadas com a estirpe do tipo selvagem mas a observação de que a diferença era menor indicou que a invasão era o factor principal da patogenia.

As alsas infectadas com 5C502, a estirpe não invasiva Tox⁺, foram alteradas gravemente com intumescência e encurtamento das vilosi. dades, edema e inflamação da lâmina própria, alterações de células epiteliais com grandes quantidades de muco, exsudado das células de goblet e áreas de enterocitos mortos com núcleos picnóticos. Contudo o aspecto mais notável era hemorragias através da camada epitelial. 0 efeito da mutação Tox’ na patogenia da 5. dysenteriae 1 ficou demonstrada nos macacos. Dois animais morreram de disenteria fulminante ao 42 dia em ambos os grupos infectados com SC500 e com SC501 indicando deste modo cada grupo que a toxina de Shiga não é necessá ria para a disenteria letal. Não se puderam observar diferenças siq nificativas no volume das fezes diarreicas e a quantidade de pús e muco ainda que este último fosse difícil de quantificar com exactid ã o .

Por outro lado a presença de sangue era uma característica cons tante das fezes anormais nos animais infectados com SC5OO, enquanto que apenas um animal infectado com SC5O1 exibiu a presença transitq ria duma ligeira quantidade de sangue.

As autópsias realizadas imediatamente após a morte dos animais, mostraram diferenças óbvias no mesotélio peritoneal colónico que eram particularmente evidentes à superfície da alsa sigmóide em que se pq diam observar sinais hemorrágicos apenas no caso dos animais infectados com SC5OO. Em média o número e a gravidade dos abcessos era s_i milar mas a necrose purulenta da mucosa com destruição das glândulas de Lieberkijhn era observada apenas em algumas áreas nos animais infectados com SC5OO. A infiltração inflamatória no córion, tecidos submucósicos e peritoneu era também mais grave nestes animais. Além disso o infiltrado inflamatório do mesotélio peritoneal que era característico dos animais infectados com SC5OO comparativamente aos infectados com SC5O1 , era, predominantemente, perivascular confirman do deste modo o exame directo que sugeria a presença de uma vasculi. te peritoneal.

Contudo a diferença mais evidente foi observada ao nível da ci_r culação capilar com o córion interg1andu1 ar . Os macacos infectados com SC5OO mostravam interrupções hemorrágicas na estrutura da parte superior da mucosa. Podiam observar-se eritrócitos a libertarem-se no lúmen intestinal através de microabcessos que causavam interrupções locais através da parede epitelial. Estas hemorragias eram, obviamente devidas à destruição das ansas capilares. Por outro lado, os macacos infectados com SC5O1 exibiam dilatação das ansas capilares mas nao exibiam destruição. As contagens dos glóbulos brancos realizadas antes e aos três dias após a infecção mostravam: no dia zero, ausência de diferença significativa no número de células polinucleares (PMN) e ausência de mielemia; e aos dias 3 a libertação de PMN no sangue e a taxa de mielemia eram mais pronunciadas nos macacos infectados com SC500.

Conclusões

Provas circunstanciais nos seres humanos apoiam a hipótese de que a Toxina de Shiga é um factor de verdadeira virulência. A estirpe 725, fornecedora de voluntários, uma estirpe invasora produtora de baixa toxina, mutante resistente a clorato de S. dysenteriae 1 mostrou sintomas menos graves do que os da estirpe do tipo selvagem M131 (25). Os doentes que experimentaram infecção natural, de um modo geral, desenvolveram sintomas mais graves que incluíam HUS quando infe£ tados com S.dysenteriae 1 do que com outros serotipos de Shigella (7). Aqueles desenvolveram rapidamente anticorpos que neutralizavam a toxina (18).

A mutante Tox' de 5. dysenteriae 1, SC5O1, demonstrara produzir uma quantidade residual de citotoxina idêntica à de E. coli K 12. Esta mutante tinha sido utilizada para o estudo do papel desta toxina de Shiga na virulência de S. dysenteriae 1. Utilizaram-se ensaios celulares e experiências com animais mais definitivas.

Os ensaios que utilizaram células HeLa e macrófagos J774 nas mo-'20

nocamadas mostraram que a secreção de toxina de Shiga não afecta a taxa de crescimento exponencial nas células infectadas como sugerira a STL com 5. flexneri num estudo prévio (46). Estes resultados esta vam de acordo com a observação de que outras mutantes produtoras de baixa toxina assim como (25, 48) a mutante SC501, não afectavam a querato conjuntivite (49) que se sabe estar relacionada com a capacidade da bactéria para se multiplicar num epitélio (55). Como também se sugeriu previamente (4, 12), não se pôde observar qualquer corre, lação entre a produção de Toxina de Shiga e a morte precoce das célq las hospedeiras. Ainda que estes resultados necessitassem confirmação em ensaios que mais proximamente imitassem a infecção real, eles cer. tamente indicam que a toxina de Shiga não desempenha um papel princj. pal no estádio intracelular de infecção. A invasão apresenta-se como provocando factos metabólicos precoces que induzem à morte das célu. las hospedeiras (47) dum modo mais rápido do que o processo de actua ção lenta da Toxina de Shiga (12).

A infecção de coelhos com as alsas intestinais ligadas demonstrou apenas ligeiras diferenças na gravidade das lesões da mucosa após 18 horas com inóculos de SC500 ou de SC5O1. Contudo, a duração da exposição e a ligação de alsas pode mascarar o efeito da produção de citotoxina e tornar a invasão no principal facto. São mais difíceis de analisar os resultados que se referem à enterotoxicidade no caso de bactérias invasivas, uma vez que a quantidade de líquido p r_o duzido ainda que menor em ambos os inóculos para a mutante Tox' não era significativamente diferente da provocada pela estirpe de tipo selvagem. Este facto indica que a invasão de tecidos é suficiente pa. ra bloquear as funções de reabsorção do epitélio. Por outro lado, a diferença notória observada entre as mutantes invasiva Tox⁺ e Toxindica que, com os limites de sensibilidade da experiência no coelho, a Toxina de Shiga é a única enterotoxina de S. dysenteriae 1. Este facto está de acordo com estudos prévios (16, 17, 33). Contudo quando se observa a produção de líquidos por mutantes Inv⁺ e Inv^- a natq reza do líquido produzido varia de acordo com a estirpe infectante.

As estirpes invasivas provocam a produção de um líquido viscoso mucopurulento algumas vezes ensanguentado que reflecte, provavelmente, a extensão de abcessos ulcerados no lúmen, independentemente da quaq tidade de Toxina de Shiga produzida, enquanto que as estirpes não iri vasivas Tox⁺, produzem um líquido aquoso, algumas vezes ensanguentado, que é mais o reflexo de enterotoxicidade e citotoxicidade.

Estudos histopato 1 ógicos em amostra de tecido proveniente de a_l sas infectadas com SC5O2, mutantes Inv^-, Tox⁺, mostraram um filtrado inflamatório importante na lâmina própria e, predominantemente, alterações maiores na extremidade de velosidades encurtadas. Este fac. to confirmou a citotoxicidade da Toxina de Shiga sobre enterócitos in vivo (27). Contudo, o aspecto mais evidente foi a infiltração por eritrócitos da parede epitelial espalhados ao longo do lúmen com quaq tidades de muco importantes. Esta observação, que sugere alterações vasculares maiores, ocorreu na lâmina própria e foi confirmada subse quentemente no macaco.

A inoculação intragástrica de SC5OO e SC501 em macacos demonstrou que a disenteria letal fulminante pode ocorrer independentemente da produção da Toxina de Shiga.

Não se observou diferença significativa na quantidade de diarreia pús e muco nas fezes. Ausência de diarreia aquosa e quantidade igual de fezes não era consistente com estudos anteriores que sugeriam secreção do jejuno aumentada pela Toxina de Shiga (41).

A diferença evidente era apenas a presença de sangue em fezes di.

sentéricas de animais infectados com a estirpe de tipo selvagem. Uma publicação recente referiu que, entre os doentes portadores de Shigu£ lose, aqueles que eliminam estirpes de citotoxicid ade elevada eram mais susceptíveis de apresentar sangue nas fezes (36). Observações histopatológicas confirmaram a presença de danos vasculares que pareciam particularmente característicos na alsa sigmóide uma vez que os macacos infectados com a estirpe de tipo selvagem exibiam destrui, ção total das alsas capilares no córion enquanto que o sistema vascular de animais infectados com a mutante Tox exibiam vasos túrgidos mas na sua maior parte intactos. Este facto, explica certamente, a presença de fezes sanguinolentas no primeiro grupo. Além disso, a observação do mesotélio peritoneal mostrava edema e vasculite inflamatória grave. Portanto a libertação de Toxina de Shiga pela bactéria invasora nos tecidos pode reforçar localmente a gravidade da Í£. são da mucosa provocando esquémia local através da destruição da ci_r culação sanguínea e alterações do córion do peritóneo assim como, possivelmente a circulação mesentérica. Este efeito parece ser local ou regional uma vez que a observação dos tecidos do rim não evidenciaram vasculite capilar, neste estádio da doença (dados não representados). Estas alterações vasculares podem ser concordantes com as observações provenientes da colite hemorrágica devido a E. coli 0157: H7 (40) em que fora descrito um aspecto radiológico de colite isquémica (34). Estas estirpes produzem níveis elevados de SLT1 (31) que têm um efeito citopático directo nas células endoteliais em divisão (15) .

A gravidade da inflamação mucósica e os abcessos subsequentes Í£ ram outras das diferenças observadas entre os animais infectados com estirpes Tox⁺ e Tox^-· Em muitas áreas do cólon sigmóide e do cólon transverso, as lesões apresentavam-se de intensidade idêntica, mas apenas os animais infectados com SC500 exibiam áreas com destruição purulenta impressionante nos tecidos da mucosa.

A intensidade mais elevada do exsudado purulento era reflectida num desprendimento mais chamático de PMN do sangue com mielemia a seguir ao terceiro dia de infecção. Considera-se que além dos Compaq tímentos vascular e da medula, é aberto um terceiro compartimento de PMN ao nível colónico durante a shiguelose. Espera-se que a Toxina de Shiga aumente o número de PMN libertados neste novo compartimento através de alterações vasculares com aumento da diapedese assim como da libertação directa de PMN dos tecidos da mucosa. Este facto pode contribuir para a rápida e grave granu 1 ocitopenia observada nos animais infectados pela estirpe de tipo selvagem e para a subsequente mielemia mais elevada que pode ser o equivalente de algumas reacções leucemoides observadas no decurso da shiguelose grave. Uma experiência destas não estabelece um efeito sistémico da Toxina de Sh_i ga.

Os resultados anteriores, portanto, sugerem que a Toxina de Shy ga tem um desempenha limitado quando libertada intracelularmente nas células epiteliais e fagócitos. Contudo a Toxina de Shiga libertada nos tecidos infectados parece actuar, predominantemente através da danificação vascular intestinal.

Exemplo 4

Uti1izand o-se o processo descrito no Exemplo 2, preparou-se SC 501 por técnicas de recombinação genética por meio de mutagénese in vitro do seu operão codificador para en t e r o que 1 i na . 0 vector plasm_í dico suicida pJM703.1, que é utilizado, contém o operão de enteroquelina de S. dysenteriae 1, com cada uma das suas subunidades de ge. nes ent F, Fep E, Fep C e Fep D mutageneiza das com um interposão que codifica para a resistência ao herbicida Biolafos e com um promotor apropriado para o gene de resistência ao herbicida. 0 clone resultan te, SC504, é Tox e enteroque1ina 'Ent^- )

Exemplo 3

Uti1izando-se o processo do Exemplo 2 construiu-se SC504 por meio de recombinação genética aplicando mutagénese i η v i t ro aos seus genes ics A. 0 vector plasmídico suicida pJM703.1, que é utilizado, contém o gene ics A de S. flexneri (60, 61), que fora mutageneizado com um interposão. 0 clone resultante, 5C505 , é Tox^-, Ent^- e ics A^- e pode ser utilizado para preparar uma vacina contra S. dysenteriae 1.

Exemplo 6

Uti1izando-se o processo do Exemplo 2 construiu-se por tecnologia genética uma estirpe selvagem de S. flexneri, mediante aplicação de mutagénese i n v i t r o do seu gene codificador para aerobactina e genes ics A. 0 vector plasmídico suicida que é utilizado contém os genes de aerobactina ics A de 5. flexneri cada um dos quais fora mutagene_i zado com interposão. 0 clone resultante SC506, é aerobactina^- e ics A e pode utilizar-se para preparar uma vacina contra S. flexneri.

Exemplo 7

Uti1izando-se o processo descrito nos Exemplos 1, 2 e 4 procedeu-se à delecção de Bal31 de 400 pares de bases, iniciando-se a partir do único sítio Hpa 1 no interior da subunidade A do gene do operão da Toxina de Shiga num fragmento de DNA proveniente de S. dysenteriae 1 da estirpe SC500. 0 fragmento resultante é ligado com um fragmento de 257 pares de bases contendo o prometor P1 de pBR322 permitindo po_r tanto a expressão elevada da proteína de subunidade B. Este fragmento contendo o gene de Toxina A mu t ag e n e i z a d o é clonado num vector su_i cida condicional que contém uma origem de replicação sob o controlo do prometor lac de E. coli e um gene de resistência à canamicina. E£ te vector poderá replicar na S. dysenteriae 1 apenas se está presente IPTG no meio de cultura. A partir da mutante da subunidade A do gene mutageneizado inseriu-se um cartridge'’ (65) de resistência ao mercúrio. 0 plasmídeo resultante transformou-se no interior de uma estirpe S. dysenteriae 1 de tipo selvagem SC5OO na presença de IPTG. As colónias resultantes do clone de Shigella são resistentes ao mercúrio e à canamicina. Estas foram deixadas a desenvolver durante várias gerações na ausência de IPTG. As culturas em seguida foram sondadas para a presença de clones sensíveis à canamicina e resistentes a Hg.

Isolaram-se três clones que se caracterizaram depois. As manchas de Southern mostraram que aqueles já não hibridam com uma sonda interna do gene de subunidade A mas ainda produzem grandes quantidades de proteína de subunidade B como se detectou por análise de anticorpo monocional e que já não eram citotóxicos.

Uti1izando-se o mesmo processo este clone Tox A^- foi construído por tecnologia genética aplicando-se mutagénese in vitro do seu op£ rão codificador para enteroquelina. 0 vector plasmídico suicida que é utilizado contém o operão de enteroquelina de E. coli (66) com cada um dos genes de subunidade ent E, Eep E, Fep C e Fep D com uma de lecção significativa num sítio de restrição em que se inseriu um fraq mento que codifica para a resistência ao arsenito (62) e um promotor apropriado para o gene de resistência ao arsenito. 0 clone resultante é Tox A^- e Ent^-.

Uti1izando-se o mesmo processo, este clone Tox A^- e Ent^- é obtido por tecnologia genética por meio de mutagénese in vitro do seu ge_ ne ics A. 0 vector plasmídico suicida utilizado contém o gene ics A ^χ2 6 de S. flexneri (60, 61), que possui uma delecção significativa num sítio de restrição em que se inseriu um fragmento codificador para a resistência ao cádmio (63, 64), e um promotor apropriado para o gene de resistência ao cádmio. 0 clone resultante Tox A, Ent ics A^- de

S. dysenteriae 1 é caracterizado por um poder invasivo substancialmente reduzido, que o torna apropriado para a preparação duma vacina contra a S. dysenteriae 1 nos seres humanos.

Acredita-se que a presente invenção em muitas das suas vantagens deverá ser entendida a partir da descrição anterior e será evidente que as diversas modificações que se podem realizar no método e na va cina anteriormente referidos sem se afastar do espírito e âmbito dejs ta invenção ou sem alterar todo ou parte das suas vantagens importari tes, os aspectos descritos anteriormente, são meramente aspectos pr£ feridos. As referências anteriormente citadas são as que se seguem.

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-36Quadro 1: estirpes, plasmídeos, fago e suas características importante

Estirpe Espécie	Genotipo	Plasmídeo/ fago	Características importantes
SC $00		eh i,n«d,e rp,«<c	paS72OO	Invasão de células
			Hela
sc $01	S. 4y«<aC«ri«< 1	Chi,a«4, trj.MC, Cox, ipc^f	pas’200	Invasão de células Hela

SC 502	S. 4τ·«°εΐΓΪ«· 1	Chi, a*4, crp,a«c	-	-
SC $0$	3. d7<«oe«ri<c l	thi,n«4,cr?,BeC, cox, >pc^c	-	-
T 1089	A’ ^C°^í	AlieUt69 ocoà* ΔΙοη «r«0l39 • crA hf l AlSof chr: tTnlol	pHC9	Ap^r. ?!L322'l_»e ii
			ACTll	lieSA («hindIIIU-J) «rlU'

c 135 7 ι rlAA * n i nS τ 1U5 * ««»100

T 1090 I. eol i

A 1 «cUl 3 9 proA* A 1 on «r «31 39 pKC9 «CrA «υρΤΓcrpC22: :TnlO~]

Ap^r. ?il322-l.c i9

JM 85 I. cot i	4γ«ΔΙ·«“ΡΡ® «CrA Chi, phiSOdlxcZ ΔΜl5	pOCS	Ap¹⁷, veículo de clona gem
		paS720t	Apr, genes da toxina de Shiga subclonadas em pUC8
		pâS7202	Apr Spc^rnestã inserido no sítio de Hpal de pHS6001
		P&P45	Apr Spr contém o elemento Q
SWlOApir Z. eoli	r«cA, ITA-2 TCiiHu I«^cchi, ehr, leu, «ulll	Xpir	Contém a função pir da origem de replicação de R6K
		pJW703-1	Vector de clonagem suicida, pode ser mo bilizado em SMlOipir
		p3S72O3	genes de toxina mutagenizados clonados em pJM703-lAp^r Sp¹

BLBIOl í. eol 1

M~, KB”, r«cA, «uptM («u2)1ocT, l«u3& proA2 tfcl-1 S-^r

Claims

REIVINDICAÇÕES

1.- Método para modificar uma estirpe selvagem de uma Shigella entero-invasiva para se obter uma estirpe modificada de Shigella que possa ser utilizada na preparação de uma vacina contra a estirpe selvagem de Shigella, caracterizado pelo facto de se transformar o genoma da estirpe selvagem de Shigella de modo que esta não possa invadir substancialmente células de um hospedeiro e não possa disseminar-se substancialmente em células infectadas e de células infectadas para células não infectadas do hospedeiro e não possa produzir toxinas que matem números substanciais de células infectadas do hospedeiro, assim como de células não infectadas; transformando-se o genoma da estirpe selvagem de Shigella de modo que: pelo menos a) um primeiro gene que codifica para uma primeira proteína essencial para a estirpe selvagem de Shigella invadir células, bem como tecidos, do hospedeiro e b) um segundo gene que codifica para uma segunda proteína essencial para a estirpe selvagem de

-38Shigella disseminar-se em células infectadas e de células infectadas para células não infectadas do hospedeiro possam ser total ou parcialmente removidos ou permanentemente inactivados.
2. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar como estirpe de Shigella uma 5. flexneri e o primeiro gene codificar para a produção ou a utilização da aerobactina pela S. flexneri.
3. - Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o segundo gene codificar para a disseminação intra-intercelular.
4, - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar como estirpe de Shigella uma S. dysenteriae 1, cujo genoma é modificado de modo que um terceiro gene, que codifica para a produção ou utilização de Shiga-toxina pela S. dysenteriae 1, seja total ou parcialmente removido ou permanentemente inactivado.
5, - Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de o primeiro gene da

S. dysenteriae 1 codificar para a produção ou utilização de enteroquelina pela S. dysenteriae 1.
6. - Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de o segundo gene codificar para uma disseminação intra-intercelular.
7. - Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de o primeiro gene conter os genes das subunidades ent F, Fep E, Fep C e Fep D do operão de enteroquelina da S. dysenteriae 1.
8. - Método de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo facto de se efectuar a mutagénese de um ou mais dos primeiro, segundo e terceiro genes.
9. - Método de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo facto de se inactivar(em) um ou mais dos primeiro, segundo e terceiro genes por trocas alélicas com um ou mais genes que sofreram mutagénese in vitro, especialmente genes mutantes onde se operaram delecções de porções significativas e especialmente genes mutantes onde foram inseridos genes marcadores.

-4010, - Shigella, caracterizada pelo facto de a)·ter sido modificada por um método de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 9 pelo que pelo menos o primeiro e o segundo genes são totaimente ou parciaimente removidos ou parcialmente inactivados; ou b) ser um descendente da Shigella modificada possuindo essencialmente as mesmas propriedades da Shigella modificada.
11. - Processo para a preparação de uma vacina, caracterizado pelo facto de se misturar uma Shigella de acordo com a reivindicação 10, como ingrediente activo, em uma quantidade compreendida entre 0,2 e 5 mg/ml, de preferência entre 0,5 e 2 mg/ml de material celular, com um ou mais veículos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico.