JP2006280378A - 形質転換した赤痢菌 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】赤痢菌野生株が宿主の細胞および組織に侵入するために必要な第一のタンパク質をコードする第一の遺伝子、および赤痢菌野生株が宿主の感染細胞内および感染細胞と非感染細胞間で拡散するために必要な第二のタンパク質をコードする第二の遺伝子を不活性化あるいは欠損するように形質転換することにより、課題とする改変赤痢菌を得ることができる。
【選択図】なし
Description
in vitroで変異誘発させたShiga−毒素遺伝子で対立遺伝子を交換することにより、志賀赤痢菌1野生株のTox−変異株を遺伝子操作する。細胞アッセイ系や動物でのこの突然変異の作用から、変異株を更に遺伝子操作して実質的に侵入できず、次いで宿主細胞内及び間で拡散できず、しかも宿主細胞内でShiga−毒素を産生できない変異株を提供しうることが示されている。
a)志賀赤痢菌1が宿主細胞及び組織に侵入するために必要な蛋白質をコ―トする志賀赤痢菌1の遺伝子、例えば、鉄のキレート化及び/又は志賀赤痢菌1への鉄の輸送に必要な蛋白質をコードする遺伝子(例えば、志賀赤痢菌1のエンテロバクチン(enterobactin)又はエンテロケリン(enterochelin)遺伝子)をin vitroで変異誘発させたもの;及び
b)感染細胞内及び感染細胞と非感染細胞との間に志賀赤痢菌1が拡散するために必要な蛋白質をコードする志賀赤痢菌1 の遺伝子、例えば、細胞内−細胞間拡散遺伝子(例えば、icsA又はvirG遺伝子)をin vitroで変異誘発させたもの。
Centre National de Referencee des Shigelles of Institut Pasteur (パリ、フランス)から入手した野生型の抗生物質感受性の志賀赤痢菌1 菌株SC500 から全DNAを調製した(50)。DNA10μg をEcoRI(Amersham,Buckinghamshire,英国)で消化し、0.7%のアガロースゲル上に載置した。3.5〜4.5kbの断片を電気溶離した。精製した断片0.1μgを、1μgのcos−連結し、EcoRIで切断し、脱リン酸したλGT11アーム(Stratagene Cloning System,サンディエゴ,米国)に連結し、販売元の指示に従ってPakagene System(Progema Biotee,Madison,米国)を使用してパッケージングした。次いで、パッケージングしたDNAを大腸菌Y1090(59)にトランスフェクトした。次に、λGT11バンクを、A.D.O’Brien,U.S.U.S.H.Bethesda,MD,米国から入手したSLT1のBサブユニットに特異的なモノクローナル抗体である13C4(54)でスクリーニングした。103個の組換えファージをLBソフトアガー中のY1090上にまいた。プレートを37℃で12時間インキュベートした。予め10mMのイソプロピルチオガラクトシド(“IPTG”)溶液(Sigma,St Louis,MO,米国)に漬けたニトロセルロースフィルター(Schleicher及びSchull,Dassel,西独)をプレートに適用し、次いで、42℃で2.5時間インキュベートした。フィルターをプレートから取り出し、PBS−ミルク(1×PBS中脱水低脂肪ミルク50g/l)中、37℃で1時間インキュベートし、1×PBSで5回洗い、希釈していないハイブリドーマ細胞上清中の13C4モノクローナル抗体と共に1時間インキュベートした。PBS−ミルクで5回洗った後、アルカリ性ホスファターゼと抱合した羊抗マウスIgG抗体(Biosys,Compiegne,フランス)の1/200希釈液を含有するPBS−ミルク中、37℃で、1時間、フィルターをインキュベートした。フィルターを再度1×PBSで洗い、染色溶液(ニトロ−ブルーテトラゾリウム0.33mg/l、リン酸5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル0.16mg/l(両化合物共Sigma製)、100mMトリスHClpH9.5、100mM NaCl、50mM MgCl2)中に置いた。陽性のクローンをプラーク精製し、Y1089にトランスフェクトした(59)。次に、DNAを溶原菌から調製した(13)。大腸菌JM83のプラスミドベクターpUC8のEcoRI部位でサブクローニングした(58)。上記のように、但し、次のような変更を行って、モノクローナル抗体13C4で大腸菌JM83のサブクローンをテストした:乾燥したニトロセルロースフィルターをプレート上に置き、PBS中2mg/lのポリミキシンB溶液2mlをフィルター上に加えた。次に、PBS−ミルクインキュベーションを始める前に、プレートを37℃で45分間インキュベートした。SLT1のBサブユニットを含む大腸菌JM83中のサブクローン pHS7201が同定された。
サブクローンpHS7201では、4.2kb EcoRI DNA断片内に全Shiga−毒素オペロンが含まれている。スペクチノマイシン耐性をコードし、T4翻訳転写停止信号が各側にあるインターポゾンΩ(37)を挿入することによってAサブユニット遺伝子のin vitroでの変異誘発を実施した。ΩはHindIII2kb断片として精製され、その末端にはDNAポリメラーゼIのクレノウ断片が充填されていた。次に、ΩをHpaI線状化pHS7201に連結させて、図に示すような組換えプラスミドpHS7202を生成した。次に、変異誘発した配列を含有する6.2kb EcoRI断片を精製し、自殺プラスミドベクターpJM703.1(51)のEcoRI部分に連結させて図に示すような組換えプラスミドpHS7203を生成した。大腸菌SM10のゲノムに組み込まれているラムダファージに含まれるpir機能をイントランス(in−trans)でその欠損R6K源に補足したときのみにpJM703.1は複製する(21)。大腸菌SM10はその染色体に統合されている広範な宿主域のIncP−型プラスミドRP4の転移遺伝子も含有している。従って、pJM703.1は、RP4からのMob部位を含有している(51)ために、SM10λpir(21)で可動化されうる。このようにして、pHS7203は菌株SM10λpir中で安定して保持されており、次に、野生型志賀赤痢菌1株SC500に抱合的に移行させた。セロファン膜上で交配を行い、チアミン、メチオニン、トリプトファン及びニコチン酸を各々10μg/mlの濃度、グルコース0.2%及びスペクチノマイシン50μg/mlを補ったM9最少培地でプレーティングすることにより選択した。選択培地上で増殖しているコロニーを精製し、特異的なウサギの抗血清(Diagnostics Pateur)で凝集させることにより志賀赤痢菌1と同定した。
SC500及びSC501並びに各々その非侵入性誘導体であるSC502及びSC503(これらは、細胞の侵入に必要な大きな発病性プラスミドpHS7200の自発的治癒(すなわち消失)により得た)を鉄欠乏培地200ml中で48時間増殖させた。ガラス器具は6N HClで予備処理し、鉄を含まない水でよくすすいだ。培地はCaCl215μg/ml、カザミノ酸5mg/ml、グルコース2mg/ml、チアミン50μg/ml、L−トリプトファン20μg/ml、ニコチン酸10μg/ml及びヒトトランスフェリン(Sigma)150μg/mlを補ったM9塩を含有していた。細菌は食塩水で2回洗い、3mlのPBSに再懸濁させた。最終濃度0.2mg/mlでリゾチームを加えた。室温(25℃)で30分間インキュベートした後、EDTA 0.5M(pH8)30μlを加え、細胞を氷浴に移し、超音波処理した。超音波処理抽出物をフィルター滅菌し、−20℃で凍結保存した。フィルター滅菌した培養上清及び細菌抽出物を、10%の牛胎児血清(Gibco)を補ったN−グルタミン(Gibco,Paisley,スコットランド,英国)及びEarle塩を有する最少必須培地で増殖させたHeLa細胞への細胞毒性についてアッセイした。マイクロタイタープレート内で細胞培養培地(100μl)を順次希釈した。各ウェルには100μl中に2×104個の細胞を接種した。次に、プレートを5%CO2中、37℃で24時間インキュベートした。ウサギポリクローナル血清及び13C4モノクローナル抗体の両者で中和アッセイを実施した。プレートを光学顕微鏡で調べてからGiemsa染色した。抽出物蛋白質1mg当りの50%細胞毒性用量(CD50)として細胞毒性を計算した。
細胞毒性アッセイではSM10λpir(pHS7203)は非細胞毒性であった。志賀赤痢菌にpHS7203を抱合的に移した後、AmpSSpcR表現型を示すクローンをコロニーイムノブロットアッセイでテストした。5%がTox−の表現型を示した。SC501は347 CD50/蛋白質mgの細胞毒性を示し、この値は良く知られている大腸菌K12の値(412 CD50/mg)と同程度であった。SC501由来の残りの細胞毒性は抗Shiga 毒素ポリクローナル抗体で中和できなかった。
ヒトにおける状況証拠はShiga−毒素が真の病原性要素であるという仮説を支持している。志賀赤痢菌1の侵入性で毒素産生が低い、塩素酸塩耐性変異株の菌株725を摂取した志願者は、野生株M131を摂取した者より重症度の低い症状を示した(25)。自然に感染した患者では、志賀赤痢菌1に感染したときには他の血清型の赤痢菌に感染したときより、HUSを含めより重篤な症状となるのが普通である(7)。これらは毒素中和抗体を速やかに発達させる(18)。
実施例2の手順を使用して、SC501のエンテロケリンをコードするオペロンをin vitroで突然変異させてSC501を遺伝子操作する。使用する自殺プラスミドベクターpJM703.1は志賀赤痢菌1のエンテロケリンオペロンを含有しており、そのent F、FepE、FepC及びFepDサブユニットの各々は除草剤Biolafosに対する耐性をコードするインターポゾンと除草剤耐性遺伝子の好適プロモータで突然変異させていた。得られたクローンSC504 はTox−及びエンテロケリン−(“Ent−”)である。
実施例2の手順を使用して、SC504のicsA遺伝子をin vitroで突然変異させてSC504を遺伝子操作する。使用した自殺プラスミドベクターpJM703.1はフレクスナー赤痢菌のicsA遺伝子を含有しており(60,61)、これはインターポゾンで突然変異させていた。得られたクローンSC505はTox−,Ent−及びicsA−であり、志賀赤痢菌1に対するワクチンの製造に使用できる。
実施例2の手順を使用して、野生型のフレクスナー赤痢菌のエアロバクチンをコードする遺伝子及びicsA遺伝子を突然変異させてこの菌株を遺伝子操作する。使用した自殺プラスミドベクターは各々インターポゾンで突然変異させてあるフレクスナー赤痢菌のエアロバクチン及びicsA遺伝子を含有している。得られたクローンSC506はエアロバクチン−及びicsA−でありフレクスナー赤痢菌に対するワクチンの製造に使用できる。
実施例1,2及び4の手順を使用して、SC500菌株の志賀赤痢菌由来のDNA断片中のShiga−毒素オペロンのAサブユニット遺伝子内で、唯一のHpa1部位から出発し、400塩基対Bal31を欠損させる。得られた断片をpBR322のP1プロモータを含有する257塩基対断片と再連結させてBサブユニット蛋白質を高度に発現させる。突然変異させた毒素A遺伝子を含有するこの断片を、大腸菌lacプロモータとカナマイシン耐性遺伝子の制御下で起源の複製を含有する条件自殺ベクターにクローニングする。志賀赤痢菌1中で、このベクターは培地内にIPTGが存在するときにのみ複製するであろう。突然変異させたAサブユニット遺伝子から上流に水銀耐性カートリッジ(65)を挿入する。得られたプラスミドを、IPTGの存在下で、野生型志賀赤痢菌1株SC500に形質転換する。得られた赤痢菌クローンのコロニーはHg及びカナマイシン耐性である。この赤痢菌クローンをIPTGなしに数世代に亘り増殖させる。次に、培養物をHg−耐性でカナマイシン−感受性のクローンの存在に関してスクリーニングする。3つのクローンを単離し、更に特徴化する。サザン法により、それらのクローンはもうAサブユニット遺伝子の内部プローブとはハイブリッドを形成しないが、モノクローナル抗体による分析から明らかなようにBサブユニット蛋白質はまだ生成し、もう細胞毒性ではないことが示される。
Claims (2)
- 不活性化されたエンテロケリン遺伝子、不活性化されたicsA遺伝子および不活性化された志賀毒素遺伝子を含む赤痢菌であって、SC505と称され受託番号C.N.C.M.I−1110を有する赤痢菌。
- 請求項1に記載の赤痢菌株から製造されたワクチン。
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