DK175464B1 - Transformeret Shigella - Google Patents

Description

DK 175464 B1

Opfindelsens baggrund I

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til modifikation af genomet H

af en entero-invasiv vildtypestamme af Shigella, således at stammen i det væ- I

5 sentiige ikke kan invadere celler og væv i en inficeret vært og i det væsentlige H

ikke kan sprede sig i inficerede celler og mellem inficerede og ikke-inficerede I

celler i værten og ikke kan producere toxiner, som vil dræbe betydelige antal af I

værtens celler. Den foreliggende opfindelse angår især en sådan modificeret I

stamme af Shigella, som kan anvendes til immunisering af en vært mod I

10 vildtypestammen af Shigella.

Shigellose eller bacillær dysenteri er en sygdom, som er endemisk i hele verden.

Sygdommen udgør et særligt alvorligt sundhedsproblem i tropiske områder og udviklingslande, hvor Shigella dysenteriae 1 og S. flexneri er dominerende. I 15 industrialiserede lande er det vigtigste ætiologiske agens S. sonnet, selv om der forekommer sporadiske tilfælde af shigellose på grund af S. flexneri, S. boydii og visse entero-invasive Escherichia coli.

Det primære trin i patogenesen af bacillær dysenteri er invasion af den humane 20 colonslimhinde med Shigella (23). Slimhinde-invasion indebærer flere trin, der omfatter bakteriernes indtrængen i epitelceller, intracellulær formering, drab af værtsceller samt endelig spredning til tilgrænsende celler og til bindevæv (9, 41, 55, 56). Den samledé proces, som sædvanligvis er begrænset til slimhindeoverfladen, medfører en stærk inflammatorisk reaktion, som medfører abscesser og I 25 ulcerationer (23, 41, 55).

I Selv om dysenteri er karakteristisk for shigellose, kan der først forekomme vandig I diarré. Diarré er tilsyneladende et resultat af forstyrrelser i colonreabsorption og I forøget jejunal udskillelse, hvorimod dysenteri er en ren colonproces (20, 41). Der I 30 kan også observeres systemiske manifestationer under forløbet af shigellose, I hovedsagelig i tilfælde, der skyldes S. dysenteriae 1. Disse omfatter toksisk I megacolon, leukæmoide reaktioner og hæmolytisk-uræmisk syndrom ("HUS").

I Sidstnævnte er en hovedårsag til mortalitet på grund af shigellose i udviklingsom- I råder (11, 22, 38).

I 35 I DK 175464 B1 Η H Rollen af Shiga-toxin, der produceres i høje niveauer af S. dysenteriae 1 (6), og

Sh/ga-lignende toxiner ("SLT"), som produceres i lave niveauer af S. flexneri og S.

sonnei (19, 30), ved de fire hovedstadier af shigellose (dvs. invasion af enkelte epitelceller, vævsinvasion, diarré og systemiske symptomer) er ikke klarlagt, se 5 en oversigtsartikel af O’Brien og Holmes (32). Plasmider på 180-220 kilobaser ("kb") er essentielle i alle Shigella-arter for invasion af enkelte epitelceller (41, 42, H 44). Dette omfatter indtrængen, intracellulær formering og tidligt drab af værts- H celler (4, 5, 46). Rollen af Shiga-toxin og SLT på dette stadium er uklar. De ser ikke ud til at spille en kritisk rolle for intracellulær formering og tidligt drab (4, 12, 10 46). Imidlertid er der ved ingen af de hidtil udførte eksperimenter blevet fore- taget en sammenligning af isogene mutanter i et relevant celleassaysystem. Der er for nylig fundet tegn på, at Shiga-toxin er cytotoksisk for primære kulturer af humane colonceller (27). Vævsinvasion kræver yderligere kromosom-kodede pro- dukter, blandt hvilke er glatte lipopolysaccharider ("LPS") (44, 57), det ikke- 15 karakteriserede produkt af Kcp-locus (8, 44) og aerobactin (24, 28). Et område af S. /7exner/-kromosomet, der er nødvendigt for væskepro-duktion i kanin-ileum- slynger, er blevet lokaliseret til rha-mtl -områderne og nær ved lysin-decarboxy- lase-locus (44). Imidlertid er der ikke fremført dokumentation for, at evnen til at forårsage væskeakkumulering skyldes SLT fra S. flexneri. Shiga-toxinets rolle for 20 opståelsen af de systemiske komplikationer ved shigellose er således stadigvæk hypotetisk. Imidlertid kan Shiga-toxin mediere vaskulær beskadigelse, eftersom I kapillærlæsioner, der observeres ved HUS, ligner de læsioner, der observeres i I cerebrale kar hos dyr, som injiceres med dette toxin (1, 2, 22).

I 25 En mutant, som mangler Shiga-toxin eller SLT, kunne indikere disse toxiners rolle I i sygdomsprocessen. S. dysenteriae 1, som producerer den største mængde af I dette cytotoxin, kunne transformeres til en sådan Shiga-toxin-negativ mutant I ("Tox'") og kunne egne sig bedst til påvisning af toxinets rolle - på trods af, at

Sekizaki et al. (48) har opnået en sådan mutant, som ved et HeLa-celleassay og I 30 Sereny-testen (49) så ud til at være lige så invasiv som vildty pestammen. Mere I betydningsfuldt er, at en sådan Tox'-mutant kunne anvendes til fremstilling af en mutant, som ikke kan invadere og derefter i væsentlig grad formere sig i en værts I celler og heller ikke i væsentlig grad kan sprede sig i værtens inficerede celler og I derfra til værtens ikke-inficerede celler og heller ikke kan producere toxiner, som

dræber betydelige antal inficerede såvel som ikke-inficerede værts-celler. Som I

følge heraf kunne Tox’-mutanten anvendes til immunisering af en vært mod en I

vildtypestamme af Shigella. I

DK 175464 B1 I

5 KORT BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN I

En Tox'-mutant af en vildtypestamme af S. dysenteriae 1 fremstilles genetisk ved I

allel-udskiftning med et in Wtro-mutageniseret Shiga-toxin-gen. Virkningen af I

denne mutation i celleassaysystemer og dyr viser, at mutanten kan gensplejses I

10 yderligere til dannelse af en mutant, som i det væsentlige ikke kan invadere og I

derefter sprede sig i og blandt værtsceller og ikke kan producere Sh/ga-toxiner i I

værtsceller.

I overensstemmelse med et aspekt af den foreliggende opfindelse gensplejses I

I 15 Tox-mutanten af vildtypestammen af S. dysenteriae 1 yderligere ved allel- I

I udskiftning med: I

I a) et in wfro-mutageniseret gen af S. dysenteriae 1, som koder I

I for et protein, der er nødvendigt for, at S. dysenteriae 1 I

I 20 invaderer en værts celler såvel som væv, såsom et gen, der I koder for et protein, der er nødvendigt for chelatering af I jern og/eller transport afjern ind i S. dysenteriae 1 (fx I et enterobactin- eller enterochelin-gen af S. dysenteriae I 1); og I 25 I b) et in wtro-mutageniseret gen af S. dysenteriae 1, som koder I for et protein, der er nødvendigt for, at S. dysenteriae 1 I spreder sig i inficerede celler og blandt inficerede og I ikke-inficerede celler, såsom et intraintercellulært spredningsgen (fx I 30 et ics A- eller vir G-gen).

I Ifølge endnu et aspekt af den foreliggende opfindelse gensplejses en mutant af en I vildtypestamme af S. flexneri ved allel-udskiftning med: a) et in v/tro-mutagenise- I ret gen af S. flexneri, som koder for et protein, der er nødvendigt for, at S.

I DK 175464 B1

flexneri invaderer en værts celler såvel som væv, såsom et gen, der koder for et I

protein, der er nødvendigt for chelatering af jern og/eller transport af jern ind i

S. flexneri (fx et aerobactin-gen af S. flexneri); og b) et in v/tro-mutageniseret I

gen, som koder for et protein, der er nødvendigt for, at S. flexneri spreder sig i og I

5 blandt værtens celler, såsom et ics A-gen.

Ifølge et yderligere aspekt af den foreliggende opfindelse anvendes Shigella- mutanterne ifølge opfindelsen til fremstilling af vacciner mod vildtypestammerne af Shigella.

I 10

KORT BESKRIVELSE AF FIGUREN

Figuren viser skematisk kloningen af S/7/ga-toxin-operonet samt in Wtro-mutage- nese af S/?/ga-toxin A-underenhedsgenet ifølge eksempel 2. I plasmiderne I 15 pHS7201, pHS7202 og pHS7203 i figuren viser fuldt optrukne linjer sekvenser fra I A-underenhedsgenet; stiplede linjer viser sekvenser fra B-underenhedsgenet; og I skraverede linjer viser sekvenser fra Ω-insertionselementet.

I DETAJLERET BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN

20

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til modificering af en vildtypestamme af en I entero-invasiv Shigella, således at den modificerede stamme kan anvendes til I fremstilling af en vaccine mod vildtypestammen af Shigella. Vildtypestammen af I Shigella modificeres på en sådan måde, at den ikke kan invadere og derefter i 25 væsentlig grad formere sig i en værts inficerede celler, især en human vært, og i I det væsentlige ikke kan sprede sig i de inficerede celler og fra inficerede til ikke- I inficerede celler i værten og ikke kan producere toxiner, som vil dræbe betydelige antal af værtens inficerede samt ikke-inficerede celler. Fremgangsmåden omfatter transformation af genomet (fx det store virulensplasmid pHS7200) af vildtype- I 30 stammen af Shigella såsom en S. flexneri, således at ét eller flere gener af vild- I typestammen, der koder for ét eller flere proteiner, der er nødvendige for, at I stammen invaderer en inficeret værts celler såvel som væv (fx et aerobactin- I gen), og som koder for ét eller flere proteiner, der er nødvendige for, at stammen I spreder sig i og blandt den inficerede værts celler (fx et ics A-gen [60, 61]), helt I 35 eller delvist fjernes eller permanent inaktiveres, fortrinsvis i det mindste delvist

DK 175464 B1 I

fjernes. Med henblik pi transformation af genomet af en vildtypestamme såsom I

en S. dysenteriae 1 omfatter fremgangsmåden fortrinsvis også hel eller delvis I

fjernelse eller permanent inaktivering, fortrinsvis det mindste delvis fjernelse, af I

det eller de gener, fortrinsvis lot A*underenhedsgenet, som koder for Shiga-toxin. I

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan generne af vildtypestammen af

Shigella helt eller delvist fjernes eller permanent inaktiveres på konventionel I

måde, fx ved allel-udskiftning med in Wtro-mutageniserede gener, fra hvilke i det I

mindste betydelige dele fortrinsvis er blevet fjernet. I denne henseende fore- I

10 trækkes det, at de mutageniserede gener ikke blot inaktiveres ved hjælp af transposoner, som indsættes i generne, og som kan mistes af generne, når de reproduceres in vivo i efterfølgende Shigella-generationer, når der fremstilles vacciner ifølge opfindelsen. Snarere er der i de mutageniserede gener fortrinsvis I deleteret betydelige dele deraf, og der indsættes fortrinsvis hensigtsmæssige I 15 vaccinekompatible markørgener i sådanne detioner. Sådanne markørgener gør det I muligt let at identificere således transformerede Shigella. De foretrukne markør- I gener er tung-metalresistensgener såsom kviksølv-, arsenat-, arsenit-, antimon-, I cadmium-, zink- og/eller cobaltresistensgener (62, 63, 64, 65).

I 20 Cellerne fra den modificerede stamme kan dyrkes og derefter svækkes på kon- I ventionel måde. Cellerne kan derefter blandes med konventionelle farmaceutisk I acceptable bærere (fx en vandig saltvandsopløsning) og eventuelt med konven- I tionelle excipienser (fx et farmaceutisk acceptabelt detergent) til dannelse af en I vaccine mod vildtypestammen. Vaccinen kan formuleres til at indeholde en slut- I 25 koncentration af cellemateriale i området fra 0,2 til 5 mg/ml, fortrinsvis fra 0,5 I til 2 mg/ml. Efter formulering kan vaccinen inkorporeres i en steril beholder, som I derefter forsegles og opbevares ved lav temperatur (fx 4°C), eller den kan fryse- I tørres.

I 30 For at inducere immunitet i en human vært over for en vildtypestamme af Shigella I kan der administreres én eller flere doser af den på hensigtsmæssig måde formu- I lerede vaccine i doser, der indeholder ca. 109-10n lyofiliserede Shigella-celler.

I Vaccinen kan administreres oralt på konventionel måde. Behandlingen kan bestå I af en enkelt vaccinedosis eller en række doser over et tidsrum.

I 35 I DK 175464 B1

Opfindelsen vil i det følgende blive beskrevet nærmere under henvisning til nedenstående eksempler.

I 5 EKSEMPLER

Medmindre andet er angivet, er de klonings- og transformationsprocedurer og -teknikker, der er anvendt i eksemplerne, de samme, som generelt er beskrevet i

Maniatis et al., "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor I 10 Laboratory (1982).

De i eksempel 1-6 anvendte stammer og deres fag- eller plasmidindhold er angi- vet i tabel 1.

I 15 Der anvendtes to medier i eksemplerne: M9-minimalmedium I (Na2HP<Vl2H20: 15 g/l, KH2P04: 3 g/l, NaCI: 0,5 g/l, NH4CI: 1 g/l, MgS04*7H20: 0,05 g/l) og Trypto Casein Soja Broth (Diagnostics Pasteur, Marnes la Coquette, H Frankrig).

I 20 I EKSEMPEL 1 I Kloning af Shiga-toxin-operonet I 25 Totalt DNA blev fremstillet (50) ud fra en vildtype antibiotikafølsom S. dysenteriae I 1-stamme SC500, der var opnået fra Centre National de Réféfences des Shigelles

I hos Institut Pasteur, Paris, Frankrig. 10 jig DNA blev skåret med ZrcoRI

I (Amersham, Buckinghamshire, Storbritannien) og sat på en 0,7% agarosegel.

I Fragmenter med en størrelse fra 3,5 til 4,5 kb blev elektroelueret. 0,1 ug 30 oprensede fragmenter blev ligeret til 1 μg cos-ligerede, EcoRI-skårne, dephos-phorylerede λ GTll-arme (Stratagene Cloning System, San Diego, USA) og pakket under anvendelse af Packagene System (Progema Biotec, Madison, USA) ifølge leveran-dørens anbefalinger. Det pakkede DNA blev derefter transficeret til E. co//Y1090 (59). λ GTll-banken blev derefter screenet med 13C4, et monoklo-35 nalt antistof, der er specifikt for B-underenheden af SLT1 (54) og var opnået fra

DK 175464 B1 I

A.D. O’Brien, U.S.U.S.H., Bethesda, MD, USA. 103 rekombinante fager blev ud- I

pladet pi Y1090 i LB-blødagar. Pladerne blev inkuberet ved 37°C i 12 timer. Et I

nitrocellulosefilter (Schleicher og Schiill, Dassel, Vesttyskland), der i forvejen var I

dyppet i en 10 mM isopropylthio-galactosid-(nlPTG")-opløsning (Sigma, St. Louis,

5 MO, USA), blev anbragt pi pladen, som derefter blev inkuberet ved 42°C i 2,5 I

timer. Filteret blev fjernet fra pladen og inkuberet i 1 time ved 37°C i PBS-mælk I

(50 g/l dehydratiseret mælk med lavt fedt-indhold i 1 x PBS), vasket fem gange I

med 1 x PBS og inkuberet i 1 time med det monoklonale antistof 13C4 i en ufor- I

tyndet hybridomcelle-super-natant. Efter fem ganges vask i PBS-mælk blev fil- I

10 teret inkuberet i 1 time ved 37°C i PBS-mælk indeholdende en 1/200 fortynding af fåre-anti-muse-IgG-antistof kon-jugeret med alkalisk phosphatase (Biosys,

Compiégne, Frankrig). Filteret blev på ny vasket i 1 x PBS og anbragt i en farvningsopløsning: 0,33 mg/l nitro-blue tetrazolium, 0,16 mg/l 5-brom-4-chlor- 3-indolylphosphat (begge forbindelser fra Sigma), 100 mM Tris-HCI, pH 9,5, 15 100 mM NaCI, 50 mM MgCI2. Positive kloner blev plaqueoprenset og transficeret til Y1089 (59). DNA blev derefter fremstillet ud fra lysogenet (13). Subkloning blev udført i fcoRI-stedet på plasmidvektoren pUC8 i E. coli JM83 (58). Subkloner af E. coli JM83 blev testet med det monoklonale antistof 13C4 som beskrevet ovenfor I med følgende modifikationer: et tørt nitrocellulosefilter blev anbragt på pladen, og I 20 2 ml af en 2 mg/l polymyxin B-op-løsning i PBS blev anbragt oven på filteret.

I Pladen blev dernæst inkuberet ved 37°C i 45 minutter før påbegyndelse af inku- I bation med PBS-mælk. Subklonen pHS7201 i E. coli JM83 indeholdende B- I underenheden af SLT1 blev identificeret.

I 25 Subklonen pHS7201 af E. coli JM83 viste sig at have et stærkere signal ved et I koloni-immunoblotassay i nærværelse af det monoklonale antistof 13C4 end I forældrestammen SC500 på grund af gendoseringseffekten. Et restriktionskort I over det S/i/ga-toxin-kodende område i pHS7201 var identisk med kortet over I SLTl (14). A-underenhedsgenet viste sig at besidde et unikt Hpal-sted lokaliseret I 30 310 bp nedstrøms for ATG-startkodonen, hvor der kunne indsættes en kassette I som beskrevet i eksempel 2.

I 35 DK 175464 B1 EKSEMPEL 2

In vitro-mutagenese af Shiga-toxin A-underenhedsgenet 5 I subklonen pHS7201 er hele Sh/ga-toxin-operonet indeholdt i et 4,2 kb langt

EcoRl-DNA-fragment. In w'fro-mutagenese af A-under-enhedsgenet blev foretaget ved indsætning af interposonet Ω (37), som koder for spectinomycin-resistens og på hver side er flankeret af T4-translationstranskriptions-stopsignaler. Ω blev op- renset i form af et 2 kb Hindu I-fragment, og dets ender blev udfyldt med Klenow- 10 fragmentet af DNA-polymerase I. Ω blev derefter ligeret til Wpal-line-ariseret pHS7201 til dannelse af det rekombinante plasmid pHS7202 som vist i figuren.

Det 6,2 kb lange EcoRI-fragment, som indeholdt den mutageniserede sekvens, blev derefter oprenset og ligeret med EcoRI-stedet på selvmords-plasmidvekto- ren pJM703.1 (51) til dannelse af det rekombinante plasmid pHS7203 som vist i 15 figuren. pJM703.1 replikerer kun, hvis dets deficiente R6K-origin komplementeres in-trans med pir-funktionen, som er indeholdt i λ-fagen integreret i genomet af E.

coli SM10 (21). Denne stamme indeholder også overførselsgenerne fra det bred- værtsspektrum-IncP-type plasmid RP4 integreret i sit kromosom. pJM703.1 kan I således mobiliseres af SM10 λ pir (21), fordi det indeholder Mob-stedet fra RP4 I 20 (51). pHS7203 blev således bevaret stabilt i stammen SM10 λ pir og blev derefter overført ved konjugation til vildtype S. dysenteriae 1 stamme SC500. Parringer H blev udført på cellofanmembraner, og selektion blev opnået ved udpladning på M9-minimalmedium tilsat thiamin, methionin, tryptophan og nikotinsyre i en koncentration på 10 Mg/ml hver, 0,2% glucose og 50 pg/ml spectinomycin.

I 25 Kolonier, der voksede på selektivt medium, blev oprenset og identificeret som S.

I dysenteriae 1 ved agglutinering med et specifikt kanin-antiserum (Diagnostics

Pasteur).

I Alleludskiftning mellem det vildtype-kromosomale Shiga-toxin-gen og det in vitro- I 30 mutageniserede gen af Shiga-toxin blev påvist ved koloni-blotimmunoassay under anvendelse af det monoklonale antistof 13C4 til detektion af S. dysenteriae 1- celler, som udtrykker en Tox'-fænotype.

I Tilstedeværelsen af Tox'-modifikationen i genomerne af S. dysenteriae 1-cellerne I 35 blev bekræftet med en probe fremstillet ud fra det 655 bp lange Hindlll-HincU-

DK 175464 B1 I

fragment, som indeholdt en del af A-underenhedsgenet og hele B-underenheds- I

genet fra det ovenfor beskrevne 4,2 kb lange EcoRI-fragment, som indeholdt hele I

Sb/ga-toxin-operonet. Det ovenfor beskrevne 2 kb lange fY/ndlll-fragment, som

indeholdt Ω-interposonet, blev også anvendt som probe (37). De DNA-fragmenter, I

5 som blev anvendt som prober, blev mærket ved nick-translation (39) med 32P- I

mærket 5'-dCTP (Amersham). Totalt DNA blev fremstillet ud fra to Tox'-kloner og I

analyseret ved hybridisering med Sb/ga-toxin-proben og Ω-proben. DNA-frag- I

menterne blev overført fra agarosegeler til nitrocellulosefiltre (Schleicher og

Schiill) ved Southern-metoden (53). Hybridisering blev udført ved 65°C natten I

10 over, og der blev udført vask ved 65°C i 6xSSC. Proberne viste, at det 4,2 kb lange EcoRI-fragment fra S. dysenteriae 1 indeholdende toxingenerne var blevet erstattet i Tox'-mutanterne med det 6,2 kb lange fragment, der hybridiserede med begge prober. Dette resultat viste, at de flankerende områder på hver side af det mutageniserede toxingen i pHS7203 var rekombineret med deres modstykker 15 i SC500-genomet, hvorved vildtype-A-underenhedsgenet var blevet erstattet med det muterede gen.

Én af disse Tox'-kloner, SC501, blev udvalgt til yderligere undersøgelse, og klonen SC501 er den 30. juni 1988 deponeret hos Collection Nationale de Cultures de 20 Microorganismes, Institut Pasteur, Paris, Frankrig, med deponeringsnummer 1-774.

EKSEMPEL 3 I

I 25 Assay af cytotoksicitet, vækst i HeLa-celler, makrofag-løsriveise og I toksicitet i kanin-ileum-slynge og i aber I SC500 og SC501 samt deres ikke-invasive derivater henholdsvis SC502 og SC503 I (opnået ved spontan "curing” [dvs. tab] af deres store virulensplasmid pHS7200, I 30 som er nødvendigt for invasion af celler) blev dyrket i 48 timer i 200 ml jernfrit I medium. Glasvarer blev forbehandlet med 6N HCI og skyllet grundigt med jernfrit I H20. Mediet indeholdt M9-salte tilsat 15 Mg/ml CaCI2, 5 mg/ml casaminosyrer, I 2 mg/ml glucose, 50 ng/ml thiamin, 20 Mg/ml L-tryptophan, 10 Mg/ml nikotinsyre I og 150 Mg/ml humant transferrin (Sigma). Bakterierne blev vasket to gange i I 35 saltopløsning og resuspenderet i 3 ml PBS. Lysozym blev tilsat op til en slut- I DK 175464 B1 H koncentration på 0,2 mg/ml. Efter 30 minutters inkubation ved stue-temperatur H (25°C) blev der tilsat 30 μΙ 0,5 M EDTA, pH 8, og cellerne blev overført til et isbad og sonikeret. Soniske ekstrakter blev filtersteriliseret og holdt nedfrosne ved -20°C. Filtersteriliserede kultursupematanter og bakterieekstrakter blev ana- 5 lyseret for cytotoksicitet på HeLa-celler dyrket i minimalt essentielt medium med

Earle's salte og N-glutamin (Gibco, Paisley, Skotland, Storbritannien) tilsat 10% føtalt kalveserum (Gibco). Seriefortyndinger blev udført i celledyrknings-medium (100 μΙ) i en mikrotiterplade. Hver brønd blev inokuleret med 2 x 104 celler i H 100 μΙ. Pladerne blev derpå inkuberet ved 37°C i 5% C02 i 24 timer. Der blev 10 udført neutraliseringsassays både med et polyklonalt kaninserum og det mono- klonale antistof 13C4. Pladerne blev undersøgt under et lysfasemikroskop og derefter farvet med Giemsa. Cytotoksicitet blev udregnet som den 50% cyto- toksiske dosis (CD50) pr. mg protein i ekstrakten.

15 Opformering af bakterier i HeLa-celler blev analyseret (46). Ikke-konfluente monolag af HeLa-celler i 35 mm plastvævskulturskåle (Becton Dickinson Labware,

Oxnard, CA, USA) blev inokuleret med bakterier, resuspenderet i 2 ml minimalt I essentielt medium ("MEM", Gibco) med et infektionsmultiplum ("MOI") på 100, I centrifugeret i 10 minutter ved 2.200 x g og inkuberet i 30 minutter ved 37°C for 20 at tillade indtrængen. Pladerne blev derefter vasket tre gange med Earle's afba- I lancerede saltopløsning ("EBSS", Gibco) og dækket med 2 ml MEM med genta- I mycin (25 μg/ml). Dette blev defineret som tid 0 (TO). Efter 1 times inkubation

I ved 37°C blev præparationerne igen vasket med EBSS og dækket med 2 ml MEM

I uden antibiotikum (TI). Inkubationen blev fortsat i yderligere tre timer (T1-T4).

25 To plader blev fjernet hver time. Én plade blev vasket tre gange med EBSS og I Giemsa-farvet for at beregne procentdelen af inficerede HeLa-celler. Den anden I blev vasket fem gange med EBSS for at eliminere levedygtige ekstracellulære bakterier. Cellerne blev trypsiniseret, talt og lyseret med 0,5% natriumdeoxy- I cholat i destilleret vand. Fortyndinger blev udpladet på Trypticase-sojaagar. Det I 30 gennemsnitlige antal bakterier pr. inficeret HeLa-celle blev beregnet. Eksperi- I menterne blev gentaget fire gange. Der blev tegnet kurver for intracellulær I vækst, og hældningen i den eksponentielle fase blev beregnet.

Der blev udført et assay for makrofag-løsrivelse og -drab (4) under anvendelse af 35 J774-makrofager (52) holdt i RPMI 1640 (Flow Laboratories Inc., McLean, VA,

DK 175464 B1 I

USA) tilsat komplement-inaktiveret føtalt kalveserum (Gibco) og 2 mM glutamin I

(Gibco). 18 timer før infektion blev 7 x 105 makrofager i 35 mm plastvævskul- I

turskåle (Becton Dickin-son Labware) mærket i et dyrkningsmedium indeholdende I

0,5 μΟ [3H]-uridin pr. ml (Amersham). Cellerne blev vasket tre gange med EBSS

5 før tilsætning af 1 ml af den bakterielle suspension i RPMI1640 ved en MOI på I

100. Infektion blev udført i 1 time ved 37°C i 5% C02. Monolag blev derefter I

vasket tre gange med EBSS (TO) og dækket i 1 time ved 37°C i 5% C02 med 2 ml

RPMI tilsat 2 mM glutamin og 25 pg/ml gentamydn (TI). Pladerne blev derefter I

vasket tre gange med EBSS og inkuberet i 5% C02 i yderligere 3 timer (T1-T4) 10 ved 37°C i RPMI-glucose uden gentamydn. To plader blev fjernet hver time, kulturerne blev vasket tre gange med EBSS, og procentdelen af ikke-levedygtige makrofager blandt celler, der stadig adhærerede til plastoverfladen, blev bestemt I ved farvning med Trypan Blue. Procentdelen af resterende makrofager blev der- I efter bestemt ved måling af den mængde radioaktivitet, der var tilbage i skålen.

I 15 Adhærerende celler blev lyseret med 1 ml 0,5% natriumdeoxycholat i destilleret I vand, og 100 μΙ af dette lysat blev udfældet og talt (4).

I Ligerede kanin-ileum-slynger på 10 cm blev fremstillet i kaniner på ca. 2 kg, som I blev anæstetiseret med 0,5 ml/kg 6% natriumpentobarbital. Inokula på 107 og I 20 109 CFU i 1 ml trypticase-sojavæske blev testet. Kaninerne blev aflivet 18 timer I senere. Væskeakkumulering i slyngerne blev målt, og forholdet mellem volumen I og længde ("V/L") blev beregnet. Dele af de inficerede slynger blev fikseret i 10% I bufret formalin. Prøver blev behandlet ved standardprocedurer og farvet med I hematoxylin-eosin-safranin.

I 25 I Otte rhesusaber med en vægt på 3,5-4,5 kg blev injiceret intramuskulært med I 50 mg ketaminchlorhydrat (Imalgene 500, Rhone Mérieux, Lyon, Frankrig). Hvert I dyr blev inokuleret intragastrisk med 1,5 x 1011 SC500- og SC501-mikroorga- I nismer resuspenderet i 20 ml trypticase-sojavæske og 14 g/l natriumhydrogen- I 30 carbonat (50/50). Udpladning af inokulum på Congo-rød agar viste, at mindre end I 1% af bakterierne i inokulum havde mistet deres invasive egenskab (26). Affø- I ringen blev undersøgt dagligt for diarré, tilstedeværelse af pus, slim og blod.

I Intensiteten af hvert af disse symptomer blev gradueret fra 0 til 3+ hver dag. For I hvert dyr blev alvoren af et givet symptom udtrykt som et indeks, som I 35 repræsenterede en sum af de akkumulerede ”+" for hvert symptom. Der blev I DK 175464 B1 foretaget øjeblikkelig autopsi i aber, som døde af fulminant dysenteri. Prøver blev behandlet som beskrevet ovenfor for kaninvæv.

RESULTATER

H

SM10 λ pir (pHS7203) var ikke-cytotoksisk ved cytotoksicitetsassayet. Efter kon-

jugativ overførsel af pHS7203 i S. dysenteriae blev kloner, som udviste Amps SpcR

fænotype, testet ved koloni-immunoblotassay. 5% udviste en Tox'-fænotype.

SC501 udviste en cytotoksicitet på 347 CD50/mg protein, hvilket var af samme H 10 størrelsesorden som den velkendte E. coli K12 (412 CD50/mg). Resterende cyto- toksicitet fra SC501 kunne ikke neutraliseres af et anti-Sh/ga-toxin-polyklonalt serum.

Tilstedeværelsen af Tox‘-mutationen i stamme SC501 ændrede ikke i væsentlig I 15 grad dens evne til at vokse intracellulært i HeLa-celler, eftersom dens væksthas- tighed i den eksponentielle fase, udtrykt i generationer/time, var 2,6 ± 0,7, sam- I menlignet med 2,5 ± 0,6 for vildtypestammen SC500. Desuden kunne der ikke ses I nogen væsentlig forskel i effektiviteten med hensyn til hurtigt drab af J774-mak- rofager af SC500 og SC501. Både celleløsrivelse og forekomst af Trypan Blue- I 20 positive celler forløb med lignende hastigheder i løbet af 4 timer, hvilket tyder på, I at Shiga-toxin frigivet inde i inficerede celler hverken signifikant påvirkede has- I tigheden for intracellulær vækst eller forøgede hurtigt drab af værtsceller.

Virkningen af Inv‘ og Tox'-mutationerne på S, dysenteriae l's patogenicitet i I 25 kaninmodellen med ligerede tarmslynger blev bestemt ved virkningen på væs- keproduktion i slyngerne. Middel- og standardafvigelser blev beregnet ud fra de I opnåede resultater i seks slynger for hver stamme ved det ene af de to inokula I (dvs. 109 og 107 CFU). For invasive stammer (dvs. SC500, Inv+, Tox+ og SC501,

Inv+, Tox') formindskede den manglende Sh/'ga-toxin-produktion væskeakkumule-30 ring ved begge inokula, men forskellen var ikke statistisk signifikant, hvilket tyder på, at invasion og efterfølgende inflammation primært er ansvarlig for væskeakkumulering. For ikke-invasive stammer (dvs. SC503, Tox+ og SC502, Tox ) blev der observeret en bemærkelsesværdig forskel, da kun den stamme, der producerede Shiga-toxin, fremkaldte væskeakkumulering. Dette tydede på, at Shiga-35 toxin i kaninmodellen er det eneste S. dysenteriae 1-enterotoxin, uanset hvilken

DK 175464 B1 I

rolle dette enterotoxin kan spille under sygdommens forløb. Histopatologiske un- I

dersøgelser viste alvorlige læsioner, herunder abscesser og ulcerationer, der øde- I

lagde talrige villi ved begge inokula enten med SC500 eller SC501. Generelt var I

læsionerne alvorligere i slynger, der var inficeret med vildtypestammen, men den I

5 iagttagelse, at forskellen var ubetydelig, indikerede, at invasion var hovedfaktoren I

for patogenicitet. I

Slynger inficeret med SC502, den ikke-invasive Tox+-stamme, blev ændret i I

alvorlig grad med opsvulmen og forkortelse af villi, ødem samt inflammation af I

10 lamina propria, ændringer af epitelceller med store mængder slim udsondret fra I

slimceller og områder med dræbte enterocytter med pyknotiske kerner. Imidlertid I

I var det mest bemærkelsesværdige træk blødninger i hele epitellaget. I

I Virkningen af Tox'-mutationen på patogeniciteten af S. dysenteriae 1 blev påvist i I 15 aber. To dyr døde af fulminant dysenteri på dag 4 i både den gruppe, der var inji- I ceret med SC500, og den gruppe, der var injiceret med SC501, og hver gruppe I tydede således på, at Shiga-toxin ikke var nødvendig for letal dysenteri. Der I kunne ikke observeres nogen signifikante forskelle i volumenet af diarré-afføring I og mængden af pus og slim, selv om sidstnævnte var vanskelig at kvantificere I 20 med præcision. På den anden side var tilstedeværelsen af blod et konstant træk I ved abnormal afføring i dyr inficeret med SC500, hvorimod kun ét dyr, der var I inficeret med SC501, udviste kortvarig tilstedeværelse af en lille smule blod.

I Autopsier, der blev foretaget umiddelbart efter dyrenes død, viste tydelige for- I skelle i det peritoneale mesotelium i colon, hvilke forskelle var særligt tydelige på I 25 overfladen af sigmoideum, hvorpå der kun kunne observeres spredte blødende I områder hos dyr, der var inficeret med SC500. I gennemsnit var antallet og alvo- I ren af abscesser tilsvarende, men purulent nekrose af slimhinden med ødelæg- I gelse i Lieberkiihn-kirtler blev kun observeret i nogle områder i dyr inficeret med I SC500. Inflammatorisk infiltration af chorion, submucosavæv og peritoneum var I 30 også alvorligere i disse dyr. Desuden var den inflammatoriske infiltration af det I peritoneale mesotelium, som var karakteristisk for dyr inficeret med SC500 i I sammenligning med SC501, overvejende perivaskulær, hvilket således bekræfter I den makroskopiske undersøgelse, der antydede tilstedeværelsen af en alvorlig I peritoneal vaskulitis. Imidlertid blev den mest bemærkelsesværdige forskel ob- I 35 serveret, hvad angår kapillærcirkulationen i det interglandulære chorion. Aber I DK 175464 B1 inficeret med SC500 udviste blødninger, der brød strukturen af den øvre del af slimhinden. Der kunne observeres erythrocytter, som blev afgivet til det intes- tinale lumen via mikroabscesser, som forårsagede lokal diskontinuitet af epitel- beklædningen. Det var tydeligt, at disse blødninger skyldtes ødelæggelse af 5 kapillærslyngerne. På den anden side udviste aber inficeret med SC501 dilatation af kapillærslyngen, men ingen diskontinuitet. Tællinger af hvide blodlegemer, der blev udført før og på dag 3 efter infektion, viste: på dag 0, ingen signifikant for- skel i antal af polymorfkernede celler ("PMN"), og myelæmi var fraværende; og på dag 3 var faldet i blod-PMN og graden af myelæmi hver især mere udtalt i aber 10 inficeret med SC500.

Konklusioner

Observationer gjort med mennesker underbygger den hypotese, at Shiga-toxin er 15 en virkelig virulensfaktor. Frivillige forsøgspersoner, som Fik indgivet stamme 725, H en invasiv, lavtoxin-producerende, chlorat-resistent mutant af S. dysenteriae 1, udviste mindre alvorlige symptomer end personer, som fik vildtypestammen M131 I (25). Patienter, som pådrager sig en naturlig infektion, udvikler sædvanligvis al- I vorligere symptomer, herunder HUS, når de inficeres med S. dysenteriae 1 end I 20 med andre Shigella-serotyper (7). De udvikler hurtigt toxin-neutraliserende anti- stoffer (18).

I Tox'-mutanten af S. dysenteriae 1, SC501, har vist sig at producere en rest- I mængde cytotoxin i lighed med E. coli K12. Denne mutant er blevet anvendt til 25 undersøgelse af dette Shiga-toxins rolle for virulensen af S. dysenteriae 1. Celle- I assays og mere definitive dyremodeller er blevet anvendt.

I Assays under anvendelse af HeLa-celler og J774-makrofager i monolag har vist, at udskillelse af Shiga-toxin ikke påvirkede væksthastigheden i den eksponentielle I 30 fase for inficerede celler som antydet for SLT i S. flexneri i en tidligere under- søgelse (46). Disse resultater stemte overens med den observation, at to andre I lavtoxin-producerende mutanter (25, 48) samt SC501-mutanten ikke påvirker I kerato-konjunktivitis (49), som vides at korrelere med bakteriers evne til at I formere sig i et epitel (35). Som også antydet tidligere (4, 12) kunne der ikke I 35 observeres nogen korrelation mellem Sb/ga-toxin-produktion og tidligt drab af 15 DK 175464 B1 værtsceller. Selv om sådanne data skal bekræftes ved assays, som nærmere efterligner den naturlige infektion, viser de tydeligt, at Shiga-tox\n ikke spiller en større rolle ved det intracellulære infektionsstadium. Invasion ser ud til at udløse tidlige metaboliske begivenheder, som medierer drab af værtsceller (47) hurti-5 gere end den langsomt virkende proces med Shiga-toxin (12).

Infektion af ligerede kanin-tarmslynger viste kun små forskelle i alvoren af slimhindelæsioner efter 18 timer med både SC500- og SC501-inokula. Imidlertid kan varigheden af udsættelse og lukning af slynger maskere virkningen af cyto-toxin-10 produktion og gøre invasion til hovedbegivenheden. Resultater angående ente-rotoksicitet var vanskeligere at analysere i tilfælde af invasive bakterier, eftersom den producerede væskemængde, selv om den var lavere i begge inokula for Tox-mutanten, ikke var signifikant forskellig fra den mængde, der fremkaldtes af vildtypestammen. Dette indikerede, at invasion af væv er tilstrækkelig til at 15 blokere epitelets reabsorberende funktioner. På den anden side indikerer den bemærkelsesværdige forskel, der blev observeret mellem ikke-invasive Tox+-og Tox'-mutanter, at Sb/ga-toxin inden for grænserne for kaninmodellens følsomhed er det eneste enterotoxin fra S. dysenteriae 1. Dette stemmer overens med tidligere undersøgelser (16, 17, 33). Når man observerer væskeproduktion frem-20 kaldt af Inv+ og Inv" mutanter, varierer arten af den producerede væske imidlertid i overensstemmelse med den inficerende stamme. Invasive stammer udløser produktion af en viskøs, mucopurulent, undertiden blodig væske, hvilket formodentlig afspejler omfanget af abscesser ulcereret i lumen uanset mængden af produceret Sb/'ga-toxin, hvorimod ikke-invasive, Tox+-stammer producerer en vandig, under-25 tiden blodig væske, som mere er en afspejling af enterotoksicitet og cytotoksi-citet. Histopatologiske undersøgelser af vævsprøver fra slynger inficeret med SC502-, Inv'-, Tox+-mutanten, viste en betydelig inflammatorisk infiltration af lamina propria og større ændringer, hovedsagelig ved spidsen af afkortede villi.

Dette bekræftede Shiga-toxins cytotoksicitet over for enterocytter in vivo (27).

30 Imidlertid var det mest bemærkelsesværdige træk infiltration af epitelbeklædningen med erythrocytter, som blev udsondret til lumen sammen med betydelige mængder slim. Denne observation, som tydede på, at der var forekommet større vaskulære ændringer i lamina propria, blev efterfølgende bekræftet i abemodellen.

35

I DK 175464 B1 I

I 16 I

Intragastrisk inokulation af SC500 og SC501 i makakaber viste, at letal fulminant I

I dysenteri kunne forekomme uden hensyn til Shiga-toxin-produktion. Ingen signifi- I

I kant forskel blev observeret i mængden af diarré, pus og slim i afføringen. Fravær I

I af vandig diarré og tilsvarende mængde afføring stemte ikke overens med tidli- I

I 5 gere undersøgelser, der tydede på forøget jejunal udskillelse på grund af Shiga- I

toxin (41). Den eneste bemærkelsesværdige forskel var tilstedeværelsen af blod i I

I dysenterisk afføring fra dyr inficeret med vildtypestammen. I en nylig artikel er I

I det beskrevet, at det blandt patienter med shigellose var mere sandsynligt, at de, I

som eliminerede stammer med højere cytotoksicitet, havde blod i deres afføring I

10 (36). Histopatologiske observationer bekræftede tilstedeværelsen af vaskulære I

I beskadigelser, som var særligt karakteristiske i sigmoideum, eftersom aber infi- I

I ceret med vildtypestammen udviste total ødelæggelse af kapillærslyngerne i I

I chorion, hvorimod det vaskulære system i dyr inficeret med Tox'-mutanten ud- I

viste opsvulmede, men for det meste intakte blodkar. Dette forklarer tilstedevæ- I

I 15 reisen af blodig afføring i den førstnævnte gruppe. Desuden viste observation af I

I det peritoneale mesotelium ødem og alvorlig inflammatorisk vaskulitis. Invaderen- I

I de bakteriers afgivelse af Shiga-toxin i vævene kan således lokalt forøge alvoren I

I af siimhindelæsionen ved at fremkalde lokal iskæmi ved ødelæggelse af chorion- I

I blodstrømmen og ændringer af den peritoneale og muligvis den mesenteriske I

I 20 cirkulation. Denne virkning ser ud til at være lokal eller loco-regional, eftersom I

observation af nyrevæv ikke viste tegn på kapillær vaskulitis på dette stadium af I

I sygdommen (data ikke vist). Sådanne vaskulære ændringer kan stemme overens I

I med observationer ved blødende colitis på grund af E. coli 0157:H7 (40), hvor der I

I er beskrevet et radiologisk aspekt af iskæmisk colitis (34). Disse stammer produ- ]

25 cerer høje niveauer af SLT1 (31), som har en direkte cytopatisk virkning på endo- I

telceller under deling (15). I

Endnu en forskel, der blev observeret mellem dyr inficeret med Tox+- og Tox - I

stammer, var alvoren af slimhindeinflammation og efterfølgende abscesser. I I

30 mange områder af colon sigmoideum og colon transversum forekom der læsioner I

med lignende intensitet, men kun dyr inficeret med SC500 havde områder med I

betydende purulent ødelæggelse af slimhindevæv.

Højere intensitet af det purulente ekssudat blev afspejlet i et mere dramatisk fald 35 af blod-PMN med deraf følgende myelæmi på dag 3 af infektionen. Det antages, at 17 DK 175464 B1 der ud over et marv-"compartment" og det vaskulære "compartment" åbnes et tredje PMN-"compartment" på colon-niveau under shigellose. Shiga-toxin forventes at forøge antallet af PMIM fanget i dette nye "compartment" ved vaskulære ændringer, som forøger diapedese samt direkte afgivelse af PMN i slimhindevæv.

5 Dette ville forklare den hurtige og alvorlige granulocytopeni, der observeres i dyr inficeret med vildtypestammen, samt efterfølgende højere myelaemi, som kan være en ækvivalent til den leukæmoide reaktion, der undertiden observeres under forløbet af alvorlig shigellose. En sådan model postulerer ikke en systemisk virkning af Shiga-toxin. Ovenstående resultater tyder således på, at Shiga-toxin 10 spiller en begrænset rolle, når det afgives intracellulært i epitelceller og fago-cytiske celler. Shiga-toxin, der afgives i inficerede væv, ser imidlertid ud til hovedsagelig at virke ved intestinal vaskulær beskadigelse.

EKSEMPEL 4 15

Ved at gå frem som beskrevet i eksempel 2 gensplejses SC501 ved in w'tro-mutagenese i sit operon, som koder for enterochelin. Den selvmords-plasmidvektor pJM703.1, der anvendes, indeholder enterochelin-operonet af S. dysenteriae 1, hvor hvert af dets ent F-, Fep E-, Fep C- og Fep D-underenheds-20 gener er mutageniseret med et interposon, der koder for resistens over for herbicidet Biolafos, samt en egnet promotor for herbicid-resistensgenet. Den resulterende klon, SC504, erTox' og enterochelin' ("Ent"’).

EKSEMPEL 5 25

Ved at gå frem som beskrevet i eksempel 2 gensplejses SC504 ved in wtro-mutagenese i sit ics A-gen. Den selvmords-plasmidvektor pJM703.1, der anvendes, indeholder ics A-genet fra S. flexneri (60, 61), som er blevet mutageniseret med et interposon. Den resulterende klon, SC505, er Tox', Ent' og ics A’ og kan anvendes 30 til fremstilling af en vaccine mod S. dysenteriae 1.

35

I DK 175464 B1 I

I 18 I

I EKSEMPEL 6 I

I Ved at gå frem som beskrevet i eksempel 2 gensplejses en vildtype S. flexneri ved I

I in v/tro-mutagenese i sit gen, som koder for aerobactin, og sit ics A-gen. Den I

I 5 selvmords-piasmidvektor, der anvendes, indeholder aerobactin- og ic$ A-generne I

I fra S. flexneri, som hver især er blevet mutageniseret med et interpo-son. Den I

I resulterende klon, SC506, er aerobactin' og ics A' og kan anvendes til fremstilling I

I af en vaccine mod S. flexneri. I

I 10 EKSEMPEL 7 I

I Ved at gå frem som beskrevet i eksempel 1, 2 og 4 foretages en 400 bp lang I

I Øa/31-deletion, der starter fra det unikke Wpal-sted inde i A-underenhedsgenet af I

SP/ga-toxin-operonet i et DNA-fragment fra S. dysenteriae 1 i stammen SC500. I

I 15 Det resulterende fragment religeres med et 257 basepar langt fragment indehol- I

I dende PI-promotoren fra pBR322, hvilket muliggør høj ekspression af B-underen- I

I hedsproteinet. Dette fragment, som indeholder det mutageniserede toxin A-gen, I

I klones i en konditionel selvmordsvektor, som indeholder et replikationsorigin un- I

der kontrol af E. coli lac-promotoren og et kanamycinresistensgen. I S. dysente- I

I 20 riae 1 replikérer denne vektor kun, hvis IPTG er til stede i dyrknings-mediet. En I

I kviksølvresistens-kassette (65) indsættes opstrøms for det mutageniserede A- I

I underenhedsgen. Det resulterende plasmid transformeres i vildtype S. dysenteriae I

I 1-stammen SC500 i nærværelse af IPTG. Kolonier af den resulterende Shigella- I

I klon er Hg- og kanamycinresistente. De lades vokse i mange generationer i fravær I

I 25 af IPTG. Kulturerne screenes derefter for tilstedeværelsen af Hg-resistente kana- I

I mycinfølsomme kloner. Der isoleres tre kloner, som karakteriseres yderligere. I

I Southern blots viser, at de ikke længere hybridiserer med en intern probe af et A- I

I underenhedsgen, men stadig producerer store mængder B-underenhedsprotein, I

I hvilket blev detekteret ved monoklonalt antistof-analyse, og de er ikke længere I

I 30 cytotoksiske. I

I Under anvendelse af samme procedure gensplejses denne Tox A'-klon ved I

I in wtro-mutagenese i sit operon, der koder for enterochelin. Den selvmordsplas- I

I midvektor, som anvendes, indeholder enterochelin-operonet fra E. coli (66), hvor I

I 35 hvert af dets ent F-, Fep E-, Fep C- og Fep D-underenhedsgener har en betydelig I

DK 175464 B1 19 deletion ved et restriktionssted, i hvilket der indsættes et fragment, som koder for resistens over for arsenit (62) og en hensigtsmæssig promotor for arsenitresiens-genet. Den resulterende klon erTox A' og Ent".

5 Under anvendelse af samme procedure gensplejses denne Tox A- og Ent-klon ved in v/tro-mutagenese i sit ics A-gen. Den anvendte selvmordsplasmidvektor indeholder ics A-genet fra S. flexneri (60, 61), som har en betydelig deletion ved et restriktionssted, i hvilket der indsættes et fragment, som koder for resistens over for cadmium (63, 64) og en hensigtsmæssig promotor for cadmiumresistens-10 genet. Den resulterende Tox A*-, Ent*-, ics A'-, S. dysenteriae 1-klon er karakteriseret ved en væsentligt reduceret invasionsevne, hvilket gør den egnet til fremstilling af en vaccine til mennesker mod S. dysenteriae 1.

Det antages, at den foreliggende opfindelse og mange af dens ledsagende fordele 15 vil fremgå af ovenstående beskrivelse, og det er klart, at der kan foretages forskellige modifikationer af den ovenfor beskrevne fremgangsmåde og vaccine uden at fravige opfindelsens ånd og omfang eller ofre alle de materielle fordele, idet de ovenfor beskrevne udførelsesformer kun er foretrukne udførelsesformer. 1

De referencer, hvortil der er henvist i det foregående, er som følger:

I DK 175464 B1 I

I 20 I

Referencer I

I 1. Bridgewater, F.A.I., R.S. Morgan, K.E.K. Rowson og G.P, Wright. I

I 1955. The neurotoxin of Shigella shigae. Morphological and I

functional lesions produced in the central nervous system of I

I rabbits. Br. J. Exp. Pathol. 36:447. I

2. Cavanagh, J.B., J.G. Howard og J.L. Whitby. 1956. The neurotoxin I

H of Shigella shigae. A comparative study of the effects produced I

in various laboratory animals. Br. J. Exp. Hed. 37:272. I

3. Chambers, D.E., D.A. Parks, G. Patterson, R. Roy, J.M. McCord, I

I S. Yoshida, L.F. Parmley og J.M. Dovmey. 1985. Xanthine-oxydase I

as a source of free radical damage in myocardial ischemia. J. I

I Mol. Cell. Cardiol. 17:145. I

I 4. Clerc, P., A. Ryter, J. Mounier og P.J. Sansonetti. 1987. Pias- I

H mid-mediated early killing of eucaryotic cells by Shigella I

I flexneri as studied by infection of J774 macrophages. Infect. I

Η

Immun. 55:521. I

I 5. Clerc, P. og P.J. Sansonetti. 1987. Entry of Shigella flexneri I

H into HeLa cells : Evidence for directed phagocytosis involving I

I actin polymerization and myosin accumulation. Infect. Immun. I

I 55:2681. I

I 6. Conradi, H. 1903. Ueber ldsliche, durch aseptische Autolyse, I

erhaltene Giftstoffe von Ruhr - und Typhus Bazillen. Dtsch. Med. I

Wochenschr. 29:26. I

7. Dupont, H.L. og L.K. Pickering. 1980. Bacillary dysentery, s. I

61-82. 1 W.B. Greenough III og T.C. Merigan (red.), Infections I

DK 175464 B1 21 of the Gastrointestinal tract. Current Topics in Infectious Diseases, Plenum Medical Book Company, New York.

8. Formal, S.B., P. Gemski, Jr., L.S. Baron og E.H. Labrec. 1971. A chromosomal locus which controls the ability of Shigella flex-neri to evoke keratoconjunctivitis. Infect. Immun. 3:73.

9. Formal, S.B., T.L. Hale og P.J. Sansonetti. 1983. Invasive enteric pathogens. Rev. Infect. Dis.. 5:S702.

10. Gentry, M.K. og J.M. Dalrymple. 1980. Quantitative microtiter cytotoxicity assay for Shigella toxin. J. Clin. Microbiol.

12:361.

11. Gianantonio, C., M. Vitacco, F. Mendilaharzu, A. Rutty og J.

Mendilaharzu. 1964. The hemolytic-uremic syndrome. J. Pediatr.

I 64:478.

I 12. Hale, T.L. og S.B. Formal. 1980. Cytotoxicity of Shigella dysen- I teriae 1 for cultured mammalian cells. Am. J. Clin. Nutr.

I 33:2485.

I 13. Huynh, T.V. , R.A. Young og R.W. Davis. 1984. DNA cloning tech- I niques : a practical approach. D. Glover (red.), 1RL Press, I Oxford, s. 50.

I 14. Jackson, M.P., J.W. Newland, R.K. Holmes og A.D. O'Brien. 1987.

I Nucleotide sequence analysis of the structural genes for Shiga- I like toxin 1 encoded by bacteriophage 933J from Escherichia I coli. Microbial Pathogenesis 2:147.

I 15. Kavi, J., J. Chant, M. Maris og P.E. Rose. 1987. Cytopathic I effect of verotoxin on endothelial cells. Lancet i:1035.

I 16. Keusch, G.T. , G.F. Grady, L.J. Mata og J. Mclver. 1972. The I pathogenesis of Shigella diarrhea. 1. Enterotoxin production by I Shigella dysenteriae. J. Clin. Invest. 51:1212.

I 17. Keusch, G.T. og M. Jacewicz. 1975. The pathogenesis of Shigella I diarrhea. V. Relationship of Shiga enterotoxin and cytotoxin. J.

I Infect. Dis. 131:533.

I 18. Keusch, G.T. , M. Jacewicz, M.M. Levine, R.B. Hornick og S.

I Kochna. 1976. Pathogenesis of Shigella diarrhea. Serum anti- I cytotoxin antibody response produced by toxigenic and neutoxi- I genic Shigella dysenteriae 1. J. Clin. Invest. 57:194. | I 19. Keusch, G.T. og M. Jacewicz. 1977. The pathogenesis of Shigella I diarrhea. VI. Toxin and antitoxin in Shigella flexneri and Shi- I gel la sonnei infections in humans. J. Infect. Dis. 135:552.

I DK 175464 B1 I 22

20. Kinsey, M.D., S.B. Formal, G.J. Dammin og R.A, Giannella. 1976. I

Fluid and electrolyte transport in Rhesus monkeys challenged I

intraceacally with Shigella flexneri 2a. Infect. Immun. 14:368. I

21. Kolter, R., M. Inuzuka og D.R. Jelinski. 1978. Transcomplementa- I

H tion-dependent replication of a low molecular weight origin I

fragment from plasmid R6K. Cell 15:1199. I

22. Koster, F., J. Levin, L. Walker, K.S.K. Tung, R.H. Gilman, M.M. I

Rajaman, M.A. Majid, S. Islam og R.C. Williams Jr. 1977. Hemoly- I

H tic-uremic syndrome after shigellosis. Relation to endotoxin and

H circulating immune complexes. N. Engl. J. Med. 298:927. I

23. Labrec, E.H., H. Schneider, T.J. Magnani og S.B. Formal. 1964. I

H Epithelial cell penetration as an essential step in the pathoge- I

H nesis of bacillary dysentery. J. Bacteriol. 88:1503. I

24. Lawlor, K.M., P.A. Daskaleros, R.E. Robinson og S.M. Payne.

1987. Virulence of iron transport mutants of Shigella flexneri H and utilization of host iron compounds. Infect. Immun. 55:594.

25. Levine, M.M., H.L. DuPont, S.B. Formal, R.B. Homick. A. Takeu* H chi, E.J. Gangarosa, M.J. Snyder og J.P. Libonati. 1973. Patho- H genesis of Shigella dysenteriae 1 (Shiga) dysentery. J. Infect.

I Dis. 127:261.

26. Maurelli, A.T., B. Blackmon og R. Curtis III. 1984. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect. Immun.

43:397.

I 27. Moyer, M.P., P.S. Dixon, S.W. Rothman og J.E. Brown. 1987.

Cytotoxicity of Shiga toxin for human colonic and ileal epithe- I lial cells. Infect. Immun. 55:1533.

28. Nassif, X., M.C. Mazert, J. Mounier og P.J. Sansonetti. 1987.

I Evaluation with an iuc::TnJ0 mutant of the role of aerobactin production in the virulence of Shigella flexneri. Infect. Immun.

I 55:1963.

I 29. Newland, J.W., N.A. Strockbine, S.F. Miller, A.D. O'Brien og I R.K. Holmes. 1985. Structural genes from a toxin converting I phage of E. coli. Science 230:170.

I 30. O'Brien, A.D., M.R. Thompson, P. Gemski, B.P. Doctor og S.B.

Formal. 1977. Biological properties of Shigella flexneri 2 A

toxin and its serological relationship to Shigella dysenteriae 1 I toxin. Infect. Immun. 15:796.

DK 175464 B1 23 31. O'Brien, A.D., T.A. Lively, M.E. Chen, S.W. Rothroan og S.B. Formal. 1983. Escherichia coll 0157:H7 strains associated with haemorrhagic colitis in the United States produce a Shigella dysenteriae 1 (Shiga) like cytotoxin. Lancet i:702.

* 32. O'Brien, A.D. og R.K. Holmes. 1987. Shiga and Shiga-like toxins.

Microbiol. Rev. 51:206.

33. Olsnes, S. og K. Eiklid. 1980. Isolation and characterization of Shigella Shiga cytotoxin. J. Biol. Chem. 255:284.

34. Pai, C.H., R. Gordon, H.V. Sims og L.E. Bryan. 1984. Sporadic cases of hemorrhagic colitis associated with Escherichia coli 0157:H7. Clinical, epidemiologic, and bacteriologic features.

Ann. Intern. Med. 101:738.

35. Piéchaud, M., S. Szturm-Rubinstein og D. Piéchaud. 1958. Evolution histologique de la kératoconjonctivite å bacilles dysen-tériques du cobaye. Ann. Inst. Pasteur 94:298.

36. Prado, D., T.G. Cleary, L.K. Pickering, C.D. Ericsson, A.V.

Bartlett III, H.L. DuPont og P.C. Johnson. 1986. The relation between production of cytotoxins and clinical features in shigellosis. J. Infect. Dis. 154:149.

37. Prentki, P. og M.M. Kirsch. 1984. In vitro insertional mutagenesis with a selectable DNA fragment. Gene 29:303.

38. Raghupathy, P., A. Date, J.C.M. Shastry, A. Sudarsanam og M.

Jadhav. 1978. Haemolytic-uremic syndrome complicating Shigella dysentery in south Indian children. Br. Med. J. 1:1518.

39. Rigby, P.W.J., M. Dieckmann, C. Rhodes og P. Berg. 1977. Labeling DNA to high specific activity in vitro by nick translation with DNA polymerase I. J. Hoi. Biol. 113:237.

40. Riley, L.W., R.S. Remis, S.D. Helgerson, H.B. McGee, J.G. Veils, B.R. Davis, R.J. Hebert, E.S. Olcott, L.M. Johnson. N.T. Hag-rett, P.A. Blake og M.L. Cohen. 1983. Hemorrhagic colitis associated with a rare Escherichia coli serotype. N. Engl. J. Med.

308:681.

41. Rout, W.R. , S.B. Formal, R.A. Giannella og G.J. Dammin. 1975.

The pathophysiology of Shigella diarrhea in the Rhesus monkey; intestinal transport, morphology and bacteriological studies. Gastroenterology 68:270.

I DK 175464 B1 I i

I 42. Sansonetti, P.J., D.J. Kopecko og S.B, Formal. 1981. Shigella I

H sonnei plasmids : evidence that a large plasmid is necessary for I

H virulence. Infect. Immun. 34:75. I

I 43. Sansonetti, P.J., D.J. Kopecko og S.B. Formal. 1982. Involvement I

of a plasmid in the invasive ability of Shigella flexneri. I

I Infect. Immun. 35:852. I

44. Sansonetti, P.J., T.L. Hale, G.I. Dammin, C. Kapper, H.H. Col- I

lins Jr. og S.B. Formal. 1983. Alterations in the pathogenesis I

of Escherichia coli K12 after transfer of plasmids and chromoso- I

mal genes from Shigella flexneri. Infect. Immun. 39:1392. I

I 45. Sansonetti, P.J., H. d'Hauteville, C. Ecobichon og C. Pourcel. I

1983. Molecular comparison of virulence plasmids in Shigella and I

entero-invasive Escherichia coli. Ann. Microbiol. (Inst. Pas- I

I teur) 134 A:295. I

46. Sansonetti, P.J., A. Ryter, P. Clerc, A.T. Maurelli og J. Mouni- I

H er. 1986. Multiplication of Shigella flexneri within HeLa cells I

: lysis of the phagocytic vacuole and plasmid-mediated contact I

hemolysis. Infect. Immun. 51:461. I

H 47. Sansonetti, P.J. og J. Mounier. 1987. Metabolic events mediating I

early killing of host cells by Shigella flexneri. Microbial I

Pathogenesis 3:53. I

I 48. Sekizaki, T., S. Harayaraa, G.M. Brazil og K.N. Timmis. 1987. I

Localization of stx, a determinant essential for high level I

production of Shiga-toxin by Shigella dysenteriae 1, near pyrT I

and generation of stx transposon mutants. Infect. Immun. I

55:2208. I

49. Sereny, B. 1957. Experimental keratoconjunctivitis shigellosa. I

Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung. 4:367. I

50. Silhavy, T.J., M.M. Berman og L.W. Enquist. 1984. DNA extraction I

from bacterial cells. 1 Experiments in gene fusion. Cold Spring I

Harbor Laboratory, s. 137. I

51. Simon, R., U. Priefer og A. Puhler. 1983. A broad host range I

mobilization system for in vivo genetic engineering : transposon I

mutagenesis in Gram negative bacteria. Biotechnology 1:784. I

52. Snyderman, R., M.C. Pike, D.G. Fisher og H.S. Koren. 1977. I

Biologic and biochemical activities of continuous macrophage I

cell lines P338 D1 and J774. J. Immunol. 119:2060. I

DK 175464 B1 25 53. Southern, E.M. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol.

98:503.

54. Strockbine, N.A., L.R.M. Marques, R.K. Holmes og A.D. O'Brien.

♦ 1985. Characterization of monoclonal antibodies against Shiga- like toxin from Escherichia coli. Infect. Immun. 50:695.

55. Takeuchi, A., H. Spring, E.H. LaBrec og S.B. Formal. 1965.

Experimental acute colitis in the Rhesus monkey following peroral infection with Shigella flexneri. Am. J. Pathol. 52:503.

56. Takeuchi, A. 1967. Electron microscope studies of experimental Salmonella infection. I. Penetration into cells of the intestinal epithelium by Salmonella typhimurium. Am. J. Pathol.

47:1011.

57. Timmis, K.N., S. Sturm og H. Uatanabe. Genetic dissection of I pathogenesis determinants of Shigella and enteroinvasive Esche- I richia coli. 1 Development of Vaccines and Drugs against I Diarrhea (J. Holmgren, A. Lindberg og R. Mollby, red.) 11th I Nobel Conf. Stockholm, 1985, s. 107-126.

I 58. Vieira, J. og J. Messing. 1982. The pUC plasmids, an Mflmp? I derived system for insertion mutagenesis and sequencing with I synthetic universal primers. Gene 19:259.

I 59. Young, R.A. og R.W. Davis. 1983. Yeast RNA polymerase 13 gene: I Isolation with antibody probes. Science 222:778.

I 60. Bernardini et al. 1989. Identification of icsA, a plasmid locus I of Shigella flexneri that governs bacterial intra- and inter- I cellular spread through interaction with F-actin. Proc. Natl.

I Acad. Sci. USA 86:3867-3871.

I 61. Lett et al. 1989. Identification of the virG protein and deter- I mination of the complete coding sequence: A plasmid-coded viru- I lence gene of Shigella flexneri. J. of Bacteriology 171:353- I 359.

I 62. Mobley og Summers. 1987. Plasmid-encoded ion transport systems.

I Ion Transport in Prokaryotes. Academic Press, Inc., 305-326.

I 63. Nies og Silver. 1989. Plasmid-determined inducible efflux is I responsible for resistance to cadmium, zinc and cobalt in Alca- I ligenes eutrophus. J. of Bacteriology 171(2):896-900.

I DK 175464 B1

I 26 I

H 64. Nucifora et al. 1989. Cadmium resistance from Staphylococcus I

aureus plasmid pI258 cadA gene results from a cadmium'efflux I

ATPase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86. I

65. Barrineau et al. 1984. J. of Molec. and Appl. Genetics 2:601- 619' H 66. Ozenberger et al. 1987. Genetic organization of multiple fep H genes encoding ferric enterobactin transport functions in E.

H coli. J. of Bacteriology 169(8):3638-3646.

DK 175464 B1 27 TABEL 1

Stararaer, plasraider, fager og deres relevante karakteristika

Stararae Art Genotype Plasmid/ 5 fag SC500 S. dysenteriae 1 thi,nad,trp,met pHS7200 SC501 S. dysenCeriae 1 thi ,nad, trp ,met, tox ,spcr pHS7200 SC502 S. dysenteriae 1 thi,nad,trp,met

10 SC503 S. dysenteriae 1 thi,nad,trp,met,tox,spcT

Y1089 E. coli AlacUI69 proA+ Δίοη araD139 strA hfl A150[chr::TnlOJ pMC9 AGTll Y1090 E. coli AlacU169 proA+ &lon araD139 15 strA supFftrpC22::TnlO) pMC9

JM83 E. coli F", araAlac-pro strA

thi, phiSOdlacz ΔΜ15 pUC8 pHS7201 pHS7202 20 pHP45 SMIOApir E. coli recA, RP4-2 TC::Mu Kmr Xpir thi, thr, leu, sulli pJM703.1 PHS7203

25 HB101 E. coli RB', MB', recA, supEM

(su2)lacY, leuB6 proA2 thi -1 SnF

I DK 175464 B1 I

I 28 i

I TABEL 1 (fortsat) I

Stamme Plasmid/fag Relevante karakteristika I

I SC500 pHS7200 Invasion af HeLa-celler I

I SC501 pHS7200 Invasion af HeLa-celler I

I SC502 I

I SC503 I

I Y1089 pMC9 Apr, pBR322-Iac i 3 I

I AGTll lac5Δ (shindIIIX2-3) srIX3* I

I cI857 srIXi* nin5 srIX5* I

I samlOO I

I Y1090 PMC9 Apr, pBR322-Jac i 9 I

I JM83 pUC8 Apr, kloningsvektor I

I pHS720i Apr, Shiga-toxin-gener subklonet i I

I pUC8 I

I pHS7202 Apr Spcr Ω er indsat ved Hpal-stedet I

I af pHS6001 I

I pHP45 Apr Spcr indeholder Ω-elementet I

I SMIOApir Xpir indeholder pir-funktionen fra R6K- I

I replikationsorigin I

pJM703.1 selvmordskloningsvektor Apr, kan I

I mobiliseres i SMIOApir I

I pHS7203 Mutageniserede toxin-gener klonet i I

I pJM703.1 Apr Spr I

I HB101 I

Claims (11)

1. Fremgangsmåde til modifikation af en viidtypestamme af en enteroinvasiv I Shigella til fremstilling af en modificeret stamme af Shigella, der kan anvendes til I 5 fremstilling af en vaccine mod vildtypestammen af Shigella, I kendetegnet ved, at den omfatter et trin, hvor genomet af vildtypestam- I men af Shigella transformeres på en sådan mide, at Shige/la'en i det væsentlige I ikke kan invadere værtsceller og i det væsentlige ikke kan spredes i inficerede I celler og fra inficerede til ikke-inficerede værtsceller og ikke kan producere I 10 toxiner, som vil dræbe betydelige antal af inficerede samt ikke-inficerede celler I hos værten; idet genomet af vildtypestammen af Shigella er transformeret på en I sådan måde, at mindst a) et første gen, der koder for et første protein, som er I nødvendigt, for at vildtypestammen af Shigella kan invadere celler samt væv i I værten, og b) et andet gen, der koder for et andet protein, som er nødvendigt, for I 15 at vildtypestammen af Shigella kan spredes i inficerede celler og blandt inficerede I og ikke-inficerede værtsceller, helt eller delvist fjernes eller permanent I inaktiveres. I

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 20 kendetegnet ved, at Shigella er en S. flexneri, og at det første gen koder for S. flexneri's produktion eller udnyttelse af aerobactin.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, I kendetegnet ved, at det andet gen koder for intra-intercellulær spredning. I 25

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, I kendetegnet ved, at Shigella er en S. dysenteriae 1, hvis genom er I . modificeret på en sådan måde, at et tredje gen, der koder for S. dysenteriae l's I produktion eller udnyttelse af Shiga-toxin, helt eller delvist fjernes eller I 30 permanent inaktiveres. I 35

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, I kendetegnet ved, at det første gen af S. dysenteriae 1 koder for S. I dysenteriae l's produktion eller udnyttelse af entero-chelin. I DK 175464 B1 I 30

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at det andet gen koder for intra-intercellulær spredning.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 5, 5 kendetegnet ved, at det første gen omfatter ent F-, Fep E-, Fep C- og Fep D-underenhedsgenerne af S. dysenteriae l's enterochelin-operon.

8. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7, kendetegnet ved, at ét eller flere af det første, andet og tredje gen er H 10 mutageniseret.

9. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7, kendetegnet ved, at ét eller flere af det første, andet eller tredje gen inaktiveres ved allel-udskiftning med ét eller flere in vitro-mutageniserede gener, 15 især mutageniserede gener, hvorfra betydelige dele er blevet deleteret, specielt mutageniserede gener, i hvilke der er indsat markørgener.

10. Shigella, I kendetegnet ved; a) at den er modificeret ved en fremgangsmåde ifølge et 20 hvilket som helst af kravene 1-9, hvorved mindst det første og andet gen er fuldstændigt eller delvist fjernet eller permanent inaktiveret; eller b) er en efterkommer af den modificerede Shigella, der i det væsentlige har de samme I egenskaber som den modificerede Shigella. I 25

11. Vaccine, kendetegnet ved, at den er fremstillet ud fra Shigel/a'e n ifølge krav 10.