DE68912155T2

DE68912155T2 - Antivirales Kombinationspräparat.

Info

Publication number: DE68912155T2
Application number: DE68912155T
Authority: DE
Inventors: J David Prof Dr Gangemi; Heinz-Kurt Dr Hochkeppel
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1988-02-13
Filing date: 1989-02-06
Publication date: 1994-06-16
Anticipated expiration: 2009-02-07
Also published as: IE63493B1; ATE99953T1; IE890435L; EP0329609A2; EP0329609A3; NZ227944A; JPH021410A; US5137720A; EP0329609B1; JP2781191B2; GB8803365D0; AU623876B2; KR0131077B1; DK62089D0; AU2894389A; DK62089A; CA1336578C; IL89248A; KR890012670A; PH26919A

Description

Die Erfindung betrifft ein pharmazeutisches Kombinationspräparat (Zusammensetzung), umfassend ein Interferon, ausgewählt aus bestimmten Arten von α-Interferonen und ein Muramylpeptid, die Kombination zur Verwendung bei der Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, insbesondere jenem, der unter verschiedenen von Viren- oder Tumorarten hervorgerufenen Erkrankungen leidet sowie die Verwendung des Interferons und des Muramylpeptids zur Herstellung eines pharmazeutischen Kombinationspräparats für die Verwendung bei der Behandlung von Warmblütern, einschließlich Menschen, die unter einer von Viren oder Tumoren verursachten Erkrankung leiden.
Die Erfindung betrifft insbesondere ein pharmazeutisches Kombinationspräparat, umfassend als Komponente A ein Hybrid-α-Interferon, dessen Struktur sich von Humaninterferon-α-D- und -α-B-genfragmenten ableitet und als Komponente B ein Muramylpeptid oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz eines Muramylpeptids mit mindestens einer salzbildenden Gruppe, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Ein als Komponente A verwendetes von Humaninterferon-α-D- und -α-B-genfragmenten abgeleitetes α-Interferon ist eine rekombinante Human-α-Interferon-B/D-Hybride, insbesondere ein Hybrid-α-Interferon wie in der Europäischen Patentanmeldung 205 404 beschrieben, z.B. die mit B&sub1;B&sub2;B&sub3;D&sub4;", "B&sub1;B&sub2;D&sub3;B&sub4;", "B&sub1;D&sub2;B&sub3;D&sub4;", "B&sub1;D&sub2;D&sub3;B&sub4;", "B&sub1;D&sub2;D&sub3;D&sub4;" bezeichneten Interferone oder vorzugsweise das mit "B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;" bezeichnete Interferon.
Ein betreffendes α-Interferon ist ebenfalls die mit "BD" bezeichnete Leukozyteninterferon-Hybride, offenbart in Spalte 3 in Zusammenhang mit Figur 3 in der US-Patentschrift 4 414 150. Die US-Patentschrift wird ausdrücklich in der vorstehend genannten Europäischen Patentanmeldung 205 404 erwähnt und diskutiert. Die Interferon-Hybride "BD" ist ziemlich identisch mit der Hybride "B&sub1;B&sub2;D&sub3;D&sub4;".
Die Hybrid-α-Interferone, die als Komponente A verwendet werden, weisen vorzugsweise etwa 166 Aminosäuren auf und bestehen vorzugsweise aus 4 Fragmenten menschlichen lymphoblastoiden oder Leukozyten-Interferonen-α-B und -α-D. Fragment B&sub1; besteht aus den Aminosäuren 1-60 von Interferon-α-B, Fragment B&sub2; besteht aus den Aminosäuren 61-92 von Interferon-α-B und Fragmente B&sub3; und B&sub4; bestehen aus Aminosäuren 93-150 bzw. 151-166 von Interferon-α-B. Ähnliche Fragmente D&sub1;, D&sub2;, D&sub3; und D&sub4; bestehen aus den Aminosäuren 1-60, 61-92, 93-150 bzw. 151-166 von Interferon-α-D. Hybrid-Interferone, die mit Fragment B&sub1; beginnen, sind bevorzugt. Komponente A ist daher insbesondere ein Hybrid-α-Interferon mit einer Gesamtzahl von 166 Aminosäuren und besteht aus 4 Untersequenzen, die im Hinblick auf Aminosäureidentität und -zahl mit den spezifischen Aminosäuresequenzen von humanlymphoblastoiden oder Leukozyten-Interferon-α-B oder -α-D übereinstimmen, wobei die Untersequenzen aus den Aminosäuren 1-60 von Interferon-α-B, Aminosäuren 61-92 von Interferon-α-B oder -α-D, Aminosäuren 93-150 von lnterferon-α-B oder -α-D bzw. Aminosäuren 151-166 von Interferon-α-B oder -α-D bestehen und worin jede Hybride mindestens eine der Untersequenzen von Interferon-α-B oder Interferon-α-D aufweist.
Das Hybrid-α-Interferon-Polypeptid "B&sub1;B&sub2;B&sub3;D&sub4;" hat die Formel
Das Hybrid-α-Interferon-Polypeptid "B&sub1;B&sub2;D&sub3;B&sub4;" hat die Formel
Das Hybrid-α-Interferon "B&sub1;D&sub2;B&sub3;D&sub4;" hat die Formel
Das Hybrid-α-Interferon "B&sub1;D&sub2;D&sub3;B&sub4;" hat die Formel
Das Hybrid-α-Interferon-Polypeptid "B&sub1;D&sub2;D&sub3;D&sub4;" hat die Formel
Das Hybrid-α-Interferon "B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;" hat die Formel
Das Muramylpeptid ist z.B. ein Muramyldipeptid oder ein Muramyltripeptid, wie in den Britischen Patentschriften 1 570 625 und 1 571 133 sowie in der Französischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 2 343 482 beschrieben oder vorzugsweise ein Muramylpeptid, substituiert mit einem Phosphatidylrest, z.B. wie in den Europäischen Patentschriften 25 495 und 102 319 beschrieben. Bevorzugte Myramyldipeptide sind N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin, N-Acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamin und N-Acetyl-desmethyl- muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin. Ein bevorzugtes Phosphatidylmuramylpeptid ist N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamid (abgekürzt: MTP-PE) mit der Formel:
Salzbildende Gruppen in einem Muramylpeptid sind insbesondere saure Gruppen, z.B. Carboxygruppen oder Phosphorsäuregruppen oder basische Gruppen, z.B. Aminogruppen. Pharmazeutisch verträgliche Salze von Muramylpeptiden mit einer sauren Gruppe sind z.B. Alkalimetallsalze, z.B. Kalium- oder vorzugsweise Natriumsalze oder Erdalkalimetallsalze, z.B. Calciumsalze oder Salze mit Ammoniak oder einem geeigneten organischen Amin, z.B. Triethylamin. Salze von Muramylpeptiden mit einer basischen Gruppe sind Säureadditionssalze mit geeigneten anorganischen oder organischen Säuren, z.B. Trifluoressigsäure.
Das Kombinationspräparat kann die Wirkstoffe A und B entweder in einer Form enthalten, die eine gleichzeitige Verabreichung in gleicher Weise erfordert oder kann die Wirkstoffe getrennt (Kit-of-parts) umfassen, zur Verabreichung zu verschiedenen Zeitpunkten und/oder auf verschiedenen Wegen.
Gemäß vorliegender Erfindung wurde überraschenderweise gefunden, daß die Bestandteile A und B zusammen in einer Weise wirken, daß eine Komponente die Aktivität der anderen verstärkt (synergistische Wirkung).
Ein erfindungsgemäßes Kombinationspräparat kann z.B. bei Warmblütern im Falle einiger Tumoren, insbesondere der Lunge, zur Verminderung oder Hemmung der Metastasenbildung verwendet werden, wie experimentell z.B. bei dem B&sub1;&sub6;-BL&sub6;-Melanom-Modell und bei dem Lewis-Lungen-Carcinom gezeigt, wobei Verabreichung in Liposomen besonders bevorzugt ist. Das Kombinationspräparat kann auch zur Prophylaxe und insbesondere zur Behandlung von Erkrankungen verwendet werden, die durch Viren bei Warmblütern, einschließlich beim Menschen, verursacht werden, insbesondere durch Viren, die nachstehend im einzelnen ausgewiesen werden [zur Nomenklatur vergleiche J.L. Melnick, Prog. med. Virol. 26, 214-232 (1980) und 28, 208-221 (1982)]: Picornaviridae, Myxoviren und insbesondere Herpesviridae. Myxoviren sind vorzugsweise Grippeviren vom Typ A und B und grippeähnliche Viren. Herpesviridae sind vorzugsweise Alphaherpesvirinae, wie insbesondere Simplexviren, z.B. Humanherpessimplexviren Typ 1 und 2, aber auch Betaherpesviren, wie insbesondere Humancytomegaloviren.
Die tägliche Dosis eines der vorstehend genannten α-Interferone zur Anwendung bei Warmblütern in Kombination mit einem Muramylpeptid beträgt etwa 10&sup4; bis etwa 10&sup7; Einheiten pro kg Körpergewicht, insbesondere etwa 10&sup5; bis etwa 10&sup6; Einheiten/kg, z.B. 5 x 10&sup6; Einheiten/kg oder etwa 10 ug/kg. Die Menge der Interferone kann nicht nur hinsichtlich des Gewichtes ausgedrückt werden, sondern auch in Form ihrer biologischen, z.B. antiviralen Aktivität und in "Einheiten" ausgedrückt werden. Die antiviraien Titer werden als Verminderung der zytopathischen Wirkung nach dem Verfahren von S. Rubinstein et al. [J. virol 37 755 (1981)] bestimmt unter Verwendung des vesiculären Stomatitis-Virus (VSV) als Expositionsvirus auf Rinder(MDBK)- und menschlichen (WISH)- Zellen [vergleiche A. Meister et al., J. gen. Virol. 67 (1986), 1633 bis 1643, insbesondere Seite 1634].
Die tägliche Dosis eines der vorstehend genannten Muramylpeptide, das Warmblütern verabreicht wird, in Kombination mit einem der α-Interferone beträgt etwa 0,005 mg/kg bis etwa 5 mg/kg, insbesondere etwa 0,01 mg/kg bis etwa 1 mg/kg, vorzugsweise etwa 0,1 mg/kg.
Die Dosis erhöht sich nicht in linearer Weise mit dem Körpergewicht. So ist die Dosis für einen Warmblüter von etwa 70 kg Körpergewicht, beispielsweise für einen Menschen, etwa 0,2 mg bis etwa 20 mg, vorzugsweise zwischen 1 und 10 mg des Muramylpeptids und des α-Interferons.
Das Gewichtsverhältnis des Muramylpeptids gegenüber dem Interferon, bei dem synergistische Wirkung auftritt, ist vorzugsweise 0,4/1 bis 400/1, insbesondere 1/1 bis 100/1, z.B. 10/1 bis 40/1.
Bevorzugt ist ein pharmazeutisches Kombinationspräparat zur Behandlung einer durch Viren hervorgerufenen Infektion oder zur Aktivierung von Makrophagen bei Warmblütern, umfassend eine antiviral wirksame oder Makrophagen-aktivierende Menge einer Kombination des Hybrid-α-Interferon-Polypeptids B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4; als Komponente A und eines pharmazeutisch verträglichen Salzes von N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamid als Komponente B, wobei das Gewichtsverhäitnis von B gegenüber A 1/1 bis 100/1 beträgt.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer antiviral wirksamen Menge oder einer die Metastasenbildung verhindernden Menge eines Hybrid-α-Interferons, dessen Struktur abgeleitet ist von Humaninterferon-α-D und -α-B-genfragmenten und einem Muramylpeptid in einem Gewichtsverhätltnis von B gegenüber A von 0,4/1 bis 400/1 zur Herstellung eines pharmazeutischen Kombinationspräparats zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung eines Warmblüters, einschließlich eines Menschen, der unter einer durch Viren oder Tumoren hervorgerufenen Krankheit leidet.
Die Wirkstoffe können auf unterschiedlichem Weg zu unterschiedlicher Zeit oder vorzugsweise auf gleichem Weg und gleichzeitig verabreicht werden. Der Verabreichungsweg hängt unter anderem von der zu heilenden Krankheit ab und ist insbesondere parenteral z.B. intravenös oder ist örtlich, einschließlich vaginal, rektal oder intranasal. Falls erforderlich, kann die Verabreichung der Wirkstoffe wiederholt werden, bis eine Verbesserung der Erkrankung auftritt. Häufig ist jedoch eine einzige Verabreichung nicht hinreichend.
Eine besondere Verabreichungsart und Dosierung wird durch den behandelnden Arzt ausgewählt, der die Besonderheiten des Patienten, die Erkrankung und den einbezogenen Krankheitszustand in Betracht zieht.
Bevorzugt ist die Verwendung einer Makrophagen-aktivierenden oder antiviral wirksamen Menge einer Kombination des Hybrid-α-Interferon-Polypeptids B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4; als Komponente A und eines pharmazeutisch verträglichen Salzes von N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl- sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamid als Komponente B, wobei das Gewichtsverhältnis von B gegenüber A 1/1 bis 100/1 beträgt, zur Herstellung eines pharmazeutischen Kombinationspräparats zur Verwendung bei einem Verfahren zur Aktivierung von Makrophagen oder zur Behandlung einer Infektion, hervorgerufen durch Herpesviridae bei einem Warmblüter.
Das in dem erfindungsgemäßen Präparat vorliegende pharmazeutisch verträgliche Trägermaterial kann Liposomen umfassen oder abweichend davon übliche anorganische oder organische feste oder flüssige pharmazeutisch verträgliche Träger.
In einigen Fällen, z.B. wenn immer ein Transport der Wirkstoffe zur Lunge erwünscht ist, ist es vorteilhaft, die Muramylpeptidkomponente oder das Interferon oder beide Komponenten in Liposomen einzukapseln.
Liposomen wurden in der Literatur in zahlreichen Veröffentlichungen beschrieben. Ihre Struktur und Verwendung wurde Gegenstand intensiver Forschungsarbeit. In Abhängigkeit von ihrer Schalenstruktur wird ein Unterschied zwischen unilamellaren Liposomen oder Vesikeln (ULV) und multilamellaren Liposomen oder Vesikein (MLV) gemacht. In einigen Veröffentlichen gilt der Ausdruck "Vesikel" ausschließlich für unilamellare Liposomen. ULV haben eine sphärische Schale, bestehend aus einer Doppelschicht von Lipiden, insbesondere Phospholipiden, und MLV haben eine sphärische Schale, bestehend aus mehreren Doppelschichten, angeordnet in einem zwiebelschalenähnlichen Muster. Die sphärische Schale kann aus Phospholipiden, wie Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin oder Phosphatidsäure bestehen und gegebenenfalls "neutralen" Lipiden wie Cholesterin. Diese Schale kapselt ein inneres Volumen ein, das die wässerige Phase und pharmakologisch wirksame Verbindungen enthält.
In Abhängigkeit vom Lipophiliegrad und anderen Parametern wie Temperatur oder Konzentration liegen die eingekapselten Verbindungen in der eingeschlossenen wässerigen Phase und/oder den Doppelschicht(en) vor.
Pharmazeutische Verabreichungssysteme, auf der Grundlage von Liposomen wurden in einem allgemeinen Übersichtsartikel, herausgegeben von G. Gregoriadis, Liposome Technology, Bd. II, Incorporation of Drugs, Proteins and Genetic Material, CRC Press 1984, beschrieben. Solche Systeme haben den Vorteil, daß biologisch wirksames Material im Gewebe durch Phagocytose eingeführt werden kann, insbesondere in Gewebe des reticuloendothelialen Systems. Zum Beispiel ist ein Transportmechanismus für Antibiotika bei Einführung in infizierte Gewebe durch Phagocytose bekannt, womit verbesserte Beseitigung oder Zerstörung des infizierenden Mikroorganismus hervorgerufen wird. Endocytose ist ebenfalls ein hilfreicher Mechanismus, um Entzündungsherde zu bekämpfen. Antirheumatische Pharmazeutika, eingekapselt in Liposomen, werden, verglichen mit "gesunden" Geweben, vorzugsweise zu infizierten Geweben hin geleitet. Darüberhinaus können Zytostatika, allgemein bekannt als "Antikrebsmittel", in spezifische Organe des Reticulo-endothelialen Systems (Leber, Milz oder Knochenmark) eingeführt werden. Weiterhin kann biologisch wirksames Material, zum Beispiel Verbindungen mit immunomodulatorischen Eigenschaften aufgrund Filtration in den Lungenkapillaren und anschließendem Transport durch wandernde Monocyten in alveolären Makrophagen konzentriert werden. Dies führt zu einer verbesserten Wirkung auf metastatische Lungentumoren und zu einer gleichzeitigen Verminderung der Toxizität.
Für den Zweck der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise Liposomen, bestehend aus einem Phosphatidylcholin und einem Phosphatidylserin verwendet, insbesondere jene, bestehend aus synthetischem (1-Palmitoyl-2-oleyl-3-sn-phosphatidyl)-cholin und einem pharmazeutisch verträglichen Salz, z.B. einem Natriumsalz eines synthetischen (1,2-Dioleyl-3-sn- phosphatidyl)-L-serin, insbesondere in einem 7: 3-Molverhältnis.
Die Herstellung von Liposomen wird z.B. in der Europäischen Patentveröffentlichung 178 624 beschrieben. Wenn der einzukapselnde wirksame Bestandteil A oder B lipophil ist, wird ein homogenes Gemisch von Phospholipiden der wirksamen Komponente in einer wässerigen Phase dispergiert. Wenn die einzukapselnde wirksame Komponente A oder B wasserlöslich ist, wird ein homogenes Gemisch der Phosphorlipide in einer wässerigen Phase, enthaltend die wirksame Komponente A oder B, dispergiert. Falls erforderlich, wird die wässerige Dispersion auf einen pH-Wert zwischen etwa 7,0 und 7,8 gepuffert und eingeengt. Die Liposomen können auch aus der wässerigen Phase abgetrennt werden.
Das homogene Gemisch von Phospholipiden wird durch Bildung eines Films oder eines Lyophilisats von Phospholipiden hergestellt. Der Film wird durch Lösen der Phospholipide in einem organischen Lösungsmittel und Abstreifen des Lösungsmittels hergestellt.
Geeignete Lösungsmittel sind zum Beispiel nichtsubstituierte oder substituierte, beispielsweise halogenierte, aliphatische oder cycloaliphatische Kohlenwasserstoffe, wie n-Hexan, Cyclohexan, Methylenchlorid oder Chloroform, Alkohole, wie Methanol oder Ethanol, Niederalkancarbonsäureester oder Amide, wie Essigsäureethylester oder Dimethylformamid oder Ether, wie Diethylether, Tetrahydrofuran oder Dioxan oder Gemische dieser Lösungsmittel.
Das organische Lösungsmittel wird anschließend durch Anwenden verminderten Drucks, vorzugsweise Hochvakuum, abgestreift oder durch Überblasen mit einem Inertgas wie Stickstoff. Das Lyophilisat wird durch Lyophilisieren einer Lösung von Phospholipiden in einem organischen Lösungsmittel nach üblicher Weise gemäß dem Verfahren, beschrieben in der US-Patentschrift Nr. 4 311 712, hergestellt. Geeignete Lösungsmittel mit den Phospholipiden liegen bei der Temperatur des Lyophilisierungsverfahrens in fester Form vor und haben einen Schmelzpunkt von mehr als 0ºC, zum Beispiel Eisessig, Benzol oder Dioxan, insbesondere tert.-Butanol.
Ein homogenes Gemisch kann ebenfalls durch Sprühtrocknen einer Lösung von Phospholipiden in einem organischen Lösungsmittel mit einem niederen Siedepunkt, wie Chloroform hergestellt werden. Bei diesem Verfahren wird ein Pulver erhalten.
Das Verhältnis der Phosphatidyl-Serin-Komponente zur Phosphatidyl-Cholin-Komponente in dem homogenen Gemisch beträgt ungefähr 10 gegenüber 90 bis zu 50 gegenüber 50 Mol-%. Bevorzugt ist das Verhältnis 30 gegenüber 70 Mol-%. Das ungefähre Verhältnis der molaren Mengen des eingekapselten wirksamen Materials (Muramyldipeptid in Kombination mit α-Interferon) geteilt durch die gesamte Menge an Phospholipiden beträgt etwa 0,0001 bis 0,1 gegenüber 1,0, vorzugsweise 0,005 bis 0,01 gegenüber 1,0. Dies bedeutet, daß vorzugsweise etwa ein 100facher molarer Überschuß von Phospholipiden verwendet wird.
Die Disperison wird durch Bewegen der wässerigen Phase (heftiges Schütteln - Vortexmischer oder Rühren bei hoher Geschwindigkeit) ausgeführt. Ein Gemisch von kleinen, großen, unilamellaren oder multilamellaren Liposomen wird spontan in einem hohen Anteil ohne Zuführen äußerer Energie gebildet. Etwa 0,1 bis 40 Gew.-%, vorzugsweise 2 bis 20 Gew.-%, des homogenen Gemisches relativ zum Gesamtgewicht der wässerigen Dispersion, können in der wässerigen Phase dispergiert werden. Vorzugsweise werden solche Dispersionen weiter auf etwa 1 uMol Lipid pro ml verdünnt. Die Liposomendispersionen dieser Konzentration schließen ungefähr 2,5 ul wässerige Phase pro uMol Lipid ein.
Die Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß vorliegender Erfindung in Form von Liposomen kann ebenfalls durch bekannte Verfahren zur Herstellung von Liposomen ausgeführt werden, zum Beispiel durch Beschallen mit Ultraschallwellen, durch Infusionsverfahren oder durch Umkehrphasenverdampfung.
Der Dispersionsschritt wird bei Temperaturen unterhalb 60ºC, vorzugsweise bei Raumtemperatur, ausgeführt. Im Hinblick auf die potentielle thermische Empfindlichkeit des eingekapselten Materials wird die Dispersion unter Kühlung und gegebenenfalls unter Inertgasatmosphäre, zum Beispiel Stickstoff- oder Argonatmosphäre, ausgeführt.
Das Gemisch der Phospholipide (I) und (II), das zur Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden kann, weist nach Dispersion in der wässerigen Phase eine Phasenübergangstemperatur (Flüssig-Gelform) von weniger als etwa 37ºC auf. Die Liposomendispersion kann ohne Erhitzen hergestellt werden.
Die erhaltenen Liposomen können in der wässerigen Phase lagerstabil bis zu einigen Wochen oder Monaten nach Zugabe von Stabilisatoren, zum Beispiel Mannit oder Lactose, hergestellt werden.
Die Größe der gebildeten Liposomen hängt unter anderem von der Struktur des Wirkstoffs und der Lipidkomponente, dem Mischverhältnis der Komponenten und der Konzentration dieser Komponenten in der wässerigen Dispersion ab. So kann es zum Beispiel durch Erhöhen oder Reduzieren der Konzentration der Lipidkomponente möglich werden, wässerige Phasen mit einem hohen Anteil kleiner oder großer Liposomen herzustellen.
Die Abtrennung kleiner Liposomen von großen Liposomen wird mit Hilfe üblicher Trennverfahren bewirkt, zum Beispiel durch Sedimentation der größeren Liposomen in einer Ultrazentrifuge, Gelfiltration oder Extrusion durch geradporige Filter. Zum Beispiel werden beim Zentrifugieren, beispielsweise bei 5 bis 30 Minuten, in einem Rotationsfeld, das einen Anstieg für eine Trägheitskraft äquivalent dem Gravitationsfeld von 5000-40 000 x g ergibt, große Liposomen abgeschieden, während kleine Liposomen dispergiert verbleiben und abdekantiert werden können. Nach wiederholtem Zentrifugieren wird eine vollständige Abtrennung großer Liposomen von kleinen Liposomen erreicht.
Liposomen in der wässerigen Phase mit einem Durchmesser größer als 6,0 x 10&supmin;&sup8; m, zum Beispiel große multilamellare Liposomen, können durch Gelfiltration getrennt werden, beispielsweise mit Sepharose oder Sephacryl als Träger.
Durch Extrusion mit geradporigen Filtern, zum Beispiel Membranfiltern vom Nucleopor - oder Polycarbonattyp mit einem Porendurchmesser von etwa 1,0 x 10&supmin;&sup7; - 1,0 x 10&supmin;&sup9; m bei einem Druck von etwa 0,1 bis 1,5 bar und einer Filtriergeschwindigkeit von etwa 20 ml/h, ist es möglich, eine besonders gleichmäßige Größenverteilung der Liposomen zu erhalten.
Die Bildung von Liposomen und deren Anteil in der wässerigen Phase kann in an sich bekannter Weise mit Hilfe verschiedener physikalischer Analysenverfahren bestimmt werden, zum Beispiel durch Mikroskopie von Gefrierschnittproben und dünnen Schnitten in einem Elektronenmikroskop, durch Röntgenstrahldiffraktion, durch dynamische Lichtstreuung, durch Massebestimmung des Filtrats in einer analytischen Ultrazentrifuge und insbesondere durch Spektroskopie, zum Beispiel im kernmagnetischen Resonanzspektrum (¹H, ¹³C und ³¹P).
Die zur Herstellung der Liposomen verwendeten Phospholipide sind bekannt. Einige von ihnen sind kommerziell erhältlich (Avanti, Fluka, Serva). Die Herstellung von (1,2- Di-oleyl-3-sn-phosphatidyl)-(L)-serin und von analogen Verbindungen ist bei Browning J. und Seelig J. in Chem. and Phys. of Lipids 24 (1979) 103-118, beschrieben.
Die Pufferlösungen von pH 7,0 bis 7,8 sind vorzugsweise sterile Phosphatpufferlösungen, auf der Grundlage des Dihydrogenphosphat/Hydrogenphosphat-Gleichgewichtes (KH&sub2;PO&sub4;/Na&sub2;HPO&sub4;). Die Herstellung dieser Pufferlösungen ist in Standardhandbüchern beschrieben, zum Beispiel "Hager's Handbuch der Pharmazeutischen Praxis", Springer Verlag, Bd. 1, Seiten 357-359. Besonders sterile isotonische Calciumfreie Pufferlösungen von pH 7,2 (Dulbecco) oder Hank's Balanced Salt Solution (M.A. Bioproducts, Walkersville Md. USA) wird verwendet.
Zur parenteralen Verabreichung werden die Liposomen in einer sterilen wässerigen Lösung dispergiert, die als Trägerflüssigkeit dient, zum Beispiel sterile Calcium-freie isotonische Salz- oder Glucoselösung, gepuffert auf pH 7,0 7,8, vorzugsweise 7,2 - 7,4.
Zur örtlichen Anwendung wird die liposomenhaltige wässerige Dispersion, auf 7,0 bis 7,8, vorzugsweise 7,2 bis 7,4 gepuffert, mit gebräuchlichen festen Trägern, zum Beispiel Verdickungsmitteln, beispielsweise Hydroxypropylcellulose, und geeigneten Konservierungsstoffen, Antioxidantien oder Parfums vermischt und in Form einer Lotion oder eines Gels zur Anwendung auf der Haut oder den Schleimhautmembranen verwendet.
Die üblicheren parenteralen Formulierungen sind insbesondere injizierbare Flüssigkeiten, die in verschiedener Weise wirksam sind wie intravenös, intramuskulär, intraperitoneal, intranasal, intradermal oder subcutan. Solche Flüssigkeiten sind vorzugsweise isotonische wässerige Lösungen oder Suspensionen, die vor der Verwendung hergestellt werden können, zum Beispiel aus lyophilisierten Zubereitungen, die den Wirkstoff allein oder zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten. Die pharmazeutischen Präparate können sterilisiert vorliegen und/oder Hilfsstoffe enthalten, zum Beispiel Konservierungsstoffe, Stabilisatoren, Netzmittel und/oder Emulgatoren, Lösungsvermittler, Salze zum Regeln des osmotischen Druckes und/oder Puffer. Die vorliegenden pharmazeutischen Präparate, die, falls erforderlich, weitere pharmakologisch wertvolle Stoffe enthalten können, werden in üblicher Weise zum Beispiel mit Hilfe üblicher Lösungs- oder Lyophilisierungsverfahren hergestellt und enthalten ungefähr 0,1 % bis 20 %, insbesondere etwa 1 % bis etwa 10 %, und im Fall von Lyophilisaten bis zu 100 % Wirkstoff.
Die üblicheren örtlichen Formulierungen sind z.B. Suppositorien, Cremes, Salben, Pasten, Gele, Lippenstifte, Tropfen, Sprays, Schäume oder Tinkturen mit üblichen Trägermaterialien, die dem Fachmann bekannt sind, und beschrieben sind zum Beispiel in der Europäischen Patentschrift 102 319.
Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung. Die Temperaturen sind in ºC angegeben.

Abkürzungen

CEF: Kükenembryonenfibroblasten
HBSS: Hank's Balanced Salt Solution
HSV-1: Herpessimplexvirus, Typ 1
MEM: Eagle's Minimum Essential Medium
MTP-PE : N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2- (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)- ethylamid-Natriumsalz
OOPS: synthetisches (1,2-Di-oleyl-3-sn-phosphatidyl)-L-se rin-Natriumsalz
PBS: phosphatgepufferte Salzlösung
POPC: synthetisches (1-Palmitoyl-2-oleyl-3-sn-phosphatidyl)-cholin
RPMI: Rosewell Park Memorial Institute, Buffalo, New York, USA

Beispiel 1 (Zytotoxizität)

A. Materialien und Verfahren

Tiere.

Spezifisch pathogenfreie weiße Ratten (Tif: RAI f) mit einem Gewicht zwischen 150 und 200 Gramm wurden verwendet. Diese Tiere wurden routinemäßig vor der Verwendung auf Vorliegen von Gefäßhauterregern untersucht.

Zellkulturen.

Makrophagen-vermittelte Zytotoxizität wurde bewertet gegen syngeneische MADB-200 Adenocarcinomtargetzellen, erhältlich von der American Type Culture Collection, ATCC. Diese Zellen wurden als Monolayerkulturen in MEM gehalten, ergänzt mit 10 % fötalem Kalbsserum. Die Kulturen wurden bei 37ºC in feuchter Atmosphäre mit 5 % CO&sub2; gehalten. Die Kulturen wurden routinemäßig hinsichtlich Vorliegen von Mycoplasma untersucht.

Sammeln und Züchten von Ratten-alveolären Makrophagen.

Alveoläre Makrophagen (AM) wurden durch transtracheale Wäsche gesammelt (Brownbill und Schumann, (Dancer Immunol. Immunother. 20, 11-17, 1985). Die aus den Waschflüssigkeiten gewonnenen Zellen wurden bei 400 x g für 10 Minuten zentrifugiert, in serumfreiem Medium suspendiert und in aus Plastik gefertigte Microtest II-Gewebskulturplatten mit 96 Vertiefungen mit 5 x 10&sup4; Zellen pro Vertiefung gegeben. Nach Inkubieren für 60 Minuten wurden die Zellen, die sich nach zytochemischen Kriterien bestimmt, als Makrophagen erwiesen, mit HBSS gewaschen, um nichtanhaftende Zellen u entfernen.

In vitro-Aktivierung von alveolären Ratten-Makrophagen.

Gereinigte Kulturen von alveolären Ratten-Makrophagen wurden bei 37ºC für eine Stunde mit 0,2 ml Kontrollmedium, rekombinantes α-B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;, MTP-PE oder einer Kombination von α-B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4; und MTP-PE inkubiert. Zu diesen behandelten Zellen wurden 5 x 10³ MADB-200 Tumorzellen gegeben und für 72 Stunden bei 37ºC inkubiert. Somit wurden 50 000 Makrophagen mit 5000 Tumorzellen inkubiert.

In vitro-Bestimmung von alveolärer Makrophagen-vermittelter Zytotoxizität.

Eine colorimetrische Bestimmung unter Anwendung von Kristallviolett zum Anfärben der verbliebenen MADB-200 Tumorzellen wird verwendet zur Bestimmung der Makrophagenzytotoxizität (Brownbill und Schumann, Cancer Immunol. Immunother. 20, 11-17, 1985). Kurzgefaßt, nach der Inkubation werden die Vertiefungen mit HBSS gewaschen und die verbliebenen Zellen mit Formalin fixiert und mit Kristallviolett angefärbt. Jede Vertiefung wird nach dem Anfärben sorgfältig gewaschen, die Zellen werden mit Alkohol entfärbt und der Extrakt wird mit einem Colorimeter vermessen. Die zytotoxische Aktivität in % von alveolären Makrophagen wird wie nachstehend berechnet:
1 - Extinktion der (behandelten alveolären Makrophagen + Tumorzellen) - Extinktion der alveolären Makrophagen allein / Extinktion der alveolären Kontrollmakrophagen + Tumorzellen x 100

B. Ergebnisse

Kombinierte Wirkungen von MTP-PE und rekombinantem α-B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;-Interferon auf die alveoläre Ratten-Makrophagenaktivierung

Beispiel 2 (Herpes pneumonitis):

A. Materialien und Verfahren

Tiere.

Drei vier Wochen alte weibkiche C3H/OLA-Mäuse wurden von Harlan Breeding Laboratories (England) bezogen. Die Mäuse wurden vor dem Versand hinsichtlich Sendai-Virus und anderen äußeren Gefäßhauterregern untersucht. Alle Mäuse wurden für einige Tage nach der Ankunft vor der Verwendung gehalten.

Reagentien.

RPMI 1640-Medium (ein Gewebskulturmedium mit allen erforderlichen Wachstumsfaktoren), MEM, HBSS und fötales Kalbsserum wurden von Grand Island Biological (GIBCO, New York, New York) erhalten. Rekombinantes α-B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;-Interferon enthält 0,1 mg = 1,5 x 10&sup7; Einheiten/ml. Liposom-eingekapseltes MTP-PE (lyophilisiert) enthält 1 mg in 250 mg synthetischen phospholipiden, bestehend aus POPC/OOPS in einem 7:3-Molverhältnis. Rekombinantes Ratten-γ-Interferon wurde vom Primatenzentrum TNO (Holland) in einer lyophilisierten Form erhalten. Human-α-B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;-Interferon ist in der Lage, an die Interferonrezeptoren von vielen unterschiedlichen Tierarten zu binden und eine biologische Reaktion hervorzurufen. Alle Reagentien waren endotoxinfrei, bestimmt durch Limulus-Amebocyten-Lysat-Bestimmung (Empfindlichkeitsgrenze von 0,125 ng/ml).

Viren und Zellkulturen.

Der VR3-Stamm vom Virus Herpes simplex Typ 1 (HSV-1) wurde in Vero-Zellen überführt unter Erhalt eines Arbeitsstammes des Virus. Der bei diesen Untersuchungen verwendete Virus hatte einen Titer von 7,5 x 10&sup7; plaquebildende Einheiten bei der Bestimmung auf Vero-Zellen und eine LD&sub5;&sub0; von 1000 bei intranasaler Verabreichung (0,05 ml) an drei Wochen alte C3H/OLA-Mäuse. Eine zwei Tages- Plaquebestimmung unter Anwendung von 0,5 % Agarose im Initialmedium-Overlay (MEM enthaltend 10 % fötales Kalbsserum) wurde verwendet. Lebendzellen wurden mit Neutralrot angefärbt und die Plaques wurden gezählt. In einigen Fällen wurden die Lungen infizierter Mäuse aseptisch entfernt, von kontaminierendem Blut freigewaschen und mit einen Dounce Homogenizer homogenisiert. Ein 10 %-iges Homogenisat wurde in RPMI hergestellt und für 15 Minuten bei 1000 x g zentrifugiert zur Entfernung zellulärer Debris. Diese Proben wurden bei -80ºC gelagert bis zur Bestimmung der Anwesenheit des infektiösen Virus unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Plaquebestimmungsmethode.

Herpes-Pneumonitis-Modell.

Die Pathobiologie der intranasalen Infektion mit dem VR3-Stamm von HSV-1-Virus wurde von Nachtigal et al. (Am. J. Pathol. 115 [1984]) und Gangemi et al. (J. Infect. Dis. 155 [1987], 510-517) beschrieben. Intranasale Beimpfung von vier Wochen alten Mäusen rief innerhalb von 10 bis 12 Tagen nach der Infektion den Tod hervor. Mikroskopische Untersuchung der toten Tiere oder von Tieren, getötet während der Spätphase der Erkrankung, zeigten ausgedehnte interstitielle Pneumonitis. Pulmonale Läsionen wurden durch zelluläres inflammatorisches Exsudat mit Neutrophilen, Monocyten und Lymphocyten charakterisiert. Zusätzlich zur Pneumonitis war adrenale Nekrose konstanter Befund bei infizierten Mäusen. Adrenale nekrotische Foci vergrößerten sich mit der Zeit nach der Infektion, zeigten jedoch sehr geringe inflammatorische Reaktion. Immunoanfärben mit einem monoklonalen Antikörper zum Herpesvirus zeigte Ablagerungen von viralem Antigen, gestreut über die Lunge und die adrenalen Drüsen. Beide Organe schienen die Primärorte der Virusreplikation zu sein, wenn der intranasale Infektionsweg verwendet wurde. Pulmonale Titer von HSV-1 erhöhten sich 48 Stunden nach der Infektion auf ein Maximum von 10&sup6; plaquebildenden Einheiten pro Feuchtgewebe.

Herstellung von Liposom-eingekapseltem MTP-PE und α- B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;-Interferon.

586 mg steriles tertiäres Butanol, 1 mg N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2- (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamid-Natriumsalz, 75 mg (95 %-ige Reinheit) Natrium-(1,2-Dioleyl-3-sn-phosphatidyl)-L-serin [hergestellt gemäß Browning J. und Seelig J., Chem. and Physics of lipids 24 (1979) 103- 118] und 175 mg (95 %-ige Reinheit) (1-Palmitoyl- 2-oleyl-3-sn-phosphatidyl)-cholin (Avanti, Polar Lipids) werden in einem Rundkolben gelöst. Die Lösung wird über Acrodisc (2,0 x 10&supmin;&sup7; m) sterilfiltriert, in ein steriles Fläschchen gefüllt und bei -45ºC eingefroren. Das Fläschchen wird im Vakuum getrocknet bis eine Temperatur von 25ºC erreicht ist und unter Argonatmosphäre abgedichtet.
α-Interferon wird in Calcium-freier und Magnesiumfreier PBS gelöst und 2,5 ml werden verwendet, um 250 mg lyophilisierte synthetische Lipide (POPC/OOPS, 7:3 Molverhältnis) mit 1 mg MTP-PE wiederherzustellen. Dieses Gemisch wird heftig in einem Vortexmischer für 2 Minuten geschüttelt und für 30 Minuten vor erneuter Vortexbehandlung und Zugabe weiterer 2,5 ml PBS belassen. Es wurde gefunden (unter verwendung von ¹²&sup5;I-markiertem α-Interferon), daß etwa 20% des Interferons nach diesem Wiederherstellungsverfahren an Liposomen gebunden sind. In dieser Weise hergestellte Liposomen haben die gleichen physikalischen Eigenschaften wie Liposomen, die nur MTP-PE enthalten und scheinen dem gleichen Körperverteilungsprofil zu gehorchen, das einer intravenösen Verabreichung bei Nagetieren folgt. Ungefähr 2-3mal mehr MTP-PE und Interferon erreicht die Lunge und beide Substanzen, in Liposomen eingebracht, wurden mit den nichtverkapselten Formen verglichen. Die Verbindung von α-Interferon zu MTP-PE-Liposomen scheint über einen Zeitraum von 8 Stunden, gelagert bei 40ºC, stabil zu sein.

Verfahren.

Mäuse wurden intravenös mit 0,2 ml entweder Placeboliposomen, suspendiert in PBS, ohne B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;-Interferon in PBS, Liposomen-eingekapseltem MTP-PE oder einer Kombination von Liposomen-eingekapseltem MTP-PE und Interferon-B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4; beimpft. Sie wurden intranasal mit 0,05 ml Virusstamm, verdünnt 1:10 mit HBSS, enthaltend 0,2 % Rinderserumalbumin, 2-3 Stunden nach der Arzneibehandlung infiziert.
Lungen der infizierten Mäuse wurden 48 Stunden nach der Infektion entnommen und ein 10 %-iges Homogenisat wurde hergestellt. Das Homogenisat wird dann auf einer Monolayer von Vero-Zellen nach Plaque untersucht. Die Virustiter werden auf der Grundlager der Anzahl der Plaques in den Duplikatvertiefungen von aus Plastik gefertigten (32mm) Gewebskulturplatten mit 6 Vertiefungen ausgedrückt. Lungengewichte wurden vor der Homogenisierung als 10 %-ige Suspension gemessen. 3 Lungen pro Behandlungsgruppe wurden analysiert. Die Standardabweichungswerte räpresentieren die Variabilität der Duplikatproben von 3 Lungen.
Die Dosierung von in diesen Experimenten verwendetem α-Interferon ist äquivalent 1 ug Protein, somit ist das MTP- PE:Interferon-Verhältnis aufs Gewicht bezogen 40:1.

B. Ergebnisse.

Wie in der nachstehenden Tabelle erläutert, ist die Virusreplikation in den Lungen von Mäusen, die liposomeneingekapseltes MTP-PE und α-Interferon erhielten, bedeutend niedriger als wenn jedes Mittel allein verwendet wird. Virustiter in den Lungen von Mäusen, die Liposomen-eingekapseltes α-B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4;-Interferon und MTP-PE erhielten Behandlung plaquebildende Einheiten pro Gramm Gewicht Lunge 48 Stunden nach Infektion +/- Standardabweichung Placebo Einheiten/Maus

Beispiel 3:

A. Materialien und Verfahren

Tiere.

Weibliche Albino-Meerschweinchen vom Pirbrightstamm mit einem Gewicht von 200-300 g wurden verwendet, um ein virales Modell von Herpes genitalis zu erstellen.

Virus und Zellkulturen.

Herpessimplexvirus Typ 2/MS, erhalten von ATCC (VR 540), wird vermehrt und in Monoschichten von humanembryonalen Lungenfibroblasten erhalten (HEL; FLOW 2002). Die Zellen werden bei 35ºC inkubiert bis 85 - 90 % zerstört sind (48 - 72 Stunden).
Der Virus wird durch Frieren und Auftauen von Medium und Zellen gewonnen; diese Suspension wird bei 1000 U/min für 10 Minuten zentrifugiert und 0,5 ml des Überstands werden in Cryotubes (NUNC) überführt und bei -180ºC gelagert.

Herpes genitalis beim Meerschweinchen

Infektion.

Weibliche Albino-Meerschweinchen vom Pirbrightstamm mit einem Gewicht von 200-300 g wurden intravaginal nach vorsichtigem Öffnen des Scheideneingangs mit einer Pinzette infiziert. Anschließend wurden Fibrinschaumstücke (SEVAC, Prag) in den Abmessungen 5 x 5 x 4 mm mit 0,5 ml, enthaltend etwa 10&sup4; PFU von HSF 2/MS aus Kulturen in HEL imprägniert. Diese Stücke wurden intravaginal eingesetzt (1- 2). Die Tiere wurden in Gruppen von 4-5 in Typ-4-Macrolonkäfigen gehalten.

Behandlung.

Drei Tage nach der Infektion, zu der Zeit bewegten sich die örtlichen symptomatischen Bewertungen bei etwa 90 % der Tiere von 3 bis 6 (siehe nachstehend), wurden diese Tiere in zufälliger Weise in Gruppen von 10-15 pro Zubereitung und eine unbehandelte Kontrolle geteilt. Die Behandlung wird 72 Stunden nach der Infektion begonnen und zweimal täglich für 5 Tage verabreicht. Ein Zehntel ml wird intravaginal und 0,1 ml werden extravaginal verabreicht.

Bewertung der Symptome.

Vom dritten Tag beginnend wurden die örtlichen Symptome dreimal wöchentlich bewertet. Die bei der Bewertung zur Anwendung kommenden Kriterien der therapeutischen Wirkung der Behandlung sind Geschwindigkeit und Ausmaß der Rückgangs offener Infektionsanzeichen bei den einzelnen Tieren. Der Grad und die Schwere der örtlichen Symptome wurde gemäß dem nachfolgenden Punktsystem bewertet:

A Hyperaemie

leicht, beschränkt auf Teile der Vulva und der Vagina 1
deutlich, die gesamte Vulva und Vagina beeinträchtigend 2
schwer, die gesamte Vulva und Vagina beeinträchtigend 3

B Ödeme

leicht, beschränkt auf Teile der Vulva und der Vagina 1
deutlich, die gesamte Vulva und Vagina beeinträchtigend 2
schwer und ausgedehnt, die gesamte Vulva/Vagina und Perineum beeinträchtigend 3

C Bläschenbildung, Geschwürbildung (vulvovaginal)

vereinzelte Bläschen in 1-2 Quadranten 1
zusammenfließende Bläschen in 1-2 Quadranten oder Bläschen in 3-4 Quadranten, Geschwürbildung 2
zusammenfließende Bläschen in allen Quadranten, Geschwürbildung 3
Maximale Bewertungszahl (A-C) 9
Geschwürbildung wurde häufig ab dem 14. Tag nach der Infektion beobachtet.

Bewertung der therapeutischen Wirkung

a) Zahl der Tiere, die Rückgang von örtlichen Symptomen mit ≥ 66 % zwischen Tagen 7 und 14 zeigen, im Vergleich mit jenen von Tag 3.
b) Zahl der Tiere, die kompletten Rückgang zwischen Tagen 20 und 21 zeigen.
c) Verlauf des Rückgangs (durchschnittlicher Wert) zwischen den Tagen 3 und 21.
Unterschiede zwischen behandelten und unbehandelten Gruppen können mit Hilfe des χ²-Testes (Zufallstabellen) geprüft werden, das Signifikanzmaß ist α = 0,01.
Die vollständige Beschreibung dieses Modells kann in zwei Publikationen von Luk s et al. gefunden werden [Archiv ges. Virusforsch. 44, 153-155 (1974) und Arch. Virol. 49, 1- 11 (1975) Springer Verlag].

Verfahren.

Die in der nachstehenden Tabelle angeführte Zahl von weiblichen Albinomeerschweinchen vom Pirbrightstamm (150-180 g Körpergewicht) werden intravaginal mit -10&sup4; PFU (plaquebildenden Einheiten) von Herpessimplexvirus Typ 2, gezüchtet in HEL (humanembryonalen Lungenzellen), wie beschrieben von B. Luk s et al., Arch. ges. Virusforsch. 44, 153-155 (1974), infiziert.
Beginnend 72 Stunden nach der Infektion werden die Tiere intravaginal zweimal täglich für 5 Tage mit 0,2 ml eines Gels behandelt, das eines der nachstehenden Mittel enthielt: i) α-Interferon-B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4; bei 1,5 x 10&sup6; Einheiten/kg; ii) liposomeneingekapseltes MTP-PE bei 1 mg/kg und iii) ein Gemisch von beiden. Den Meerschweinchen, die eine Placebobehandlung erhielten, wird ein Gel ohne Wirkstoffe gegeben. Dieses Gel hatte die nachstehende Zusammensetzung:
2,25 % Natriumcarboxymethylcellulose (Hercules, USA)
10 % Glycerin
aufgefüllt auf 100 % mit bidestilliertem Wasser
Die bei unbehandelten Tieren auftretenden Symptome sind bei B. Luk s et al., Arch. Virol. 49, 1 - 11 (1975) beschrieben.

B. Ergebnisse

Die nachstehende Tabelle faßt die Daten eines Versuchs zusammen, bei dem α-Interferon-B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4; entweder einzeln oder in Kombination für die Behandlung von Meerschweinchen mit Herpes genitalis gegeben wurden. Wie in den Versuchen 1 und 2 erläutert, sind die therapeutischen Wirkungen (wie bestimmt durch durchschnittliche Läsionsbewertung) von α-Interferon-B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4; und MTP-PE erhöht, wenn beide Arzneistoffe kombiniert werden. Die Dosierung von verwendetem α-Interferon-B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4; ist äquivalent zu 10 ug/kg, während die Dosierung von MTP-PE 1000 ug/kg ist. Dieses MTP- PE:Interferonverhältnis von 100:1 ist daher vergleichbar mit jenem, das in Beispiel 2 verwendet wurde. Örtliche Wirkungen von α-Interferon B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4; und MTP-PE einzeln und in Kombination bei mit HSV-2/MS intravaginal infizierten Meerschweinchen durchschnittlische Läsionsbewertung ± Standardfehler Tage nach der Infektion Placebo Interferon

Claims

1. Pharmazeutisches Kombinationspräparat, umfassend als Komponente A ein Hybrid-α-Interferon, dessen Struktur abgeleitet ist von Humaninterferon-α-D und -α-B-genfragmenten und als Komponente B ein Muramylpeptid oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz eines Muramylpeptids mit mindestens einer salzbildenden Gruppe zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

2. Präparat nach Anspruch 1, wobei Komponente A ein Hybrid-α-Interferon mit einer Gesamtheit von 166 Aminosäuren ist und zusammengesetzt ist aus vier Untersequenzen, entsprechend in Hinblick auf die Aminosäureidentität und -zahl den spezifischen Aminosäuresequenzen von humanlymphoblastoiden oder Leukozyten-Interferon-α-B oder -α-D, wobei die Untersequenzen aus Aminosäuren 1-60 von Interferon-α-B, Aminosäuren 61-92 von Interferon-α-B oder -α-D, Aminosäuren 93-150 von Interferon-α-B oder -α-D bzw. Aminosäuren 151-166 von Interferon-α-B oder -α-D bestehen, wobei jede Hybride mindestens eine der Untersequenzen von Interferon-α-B und Interferon-α-D aufweist.

3. Präparat nach Anspruch 1 oder 2, wobei Bestandteil A ein Hybrid-α-Interferon-Polypeptid, ausgewählt aus B&sub1;B&sub2;B&sub3;D&sub4;, B&sub1;B&sub2;D&sub3;B&sub4;, B&sub1;B&sub2;D&sub3;D&sub4;, B&sub1;D&sub2;B&sub3;D&sub4;, B&sub1;D&sub2;D&sub3;B&sub4;, B&sub1;D&sub2;D&sub3;D&sub4; und B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4; ist.

4. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei Bestandteil B ausgewählt ist aus N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D- isoglutamin, N-Acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamin, N-Acetyl-desmethylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin und N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamid und einem pharmazeutisch verträglichen Salz davon.

5. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei Bestandteil A ein Hybrid-α-Interferon-Polypeptid B&sub1;D&sub2;B&sub3;B&sub4; ist.

6. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei Bestandteil B ein pharmazeutisch verträgliches Salz von N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamid ist.

7. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Gewichtsverhältnis von B gegenüber A 0,4/1 bis 400/1 ist.

8. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Gewichtsverhältnis von B gegenüber A 1/1 bis 100/1 ist.

9. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Gewichtsverhältnis von B gegenüber A 10/1 bis 40/1 ist.

10. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der pharmazeutisch verträgliche Träger Liposomen, hergestellt aus synthetischem Phosphatidylcholin und einem pharmazeutisch verträglichen Salz von synthetischem Phosphatidylserin umfaßt.

11. Pharmazeutisches Kombinationspräparat, umfassend als Komponente A ein Hybrid-α-Interferon, dessen Struktur von Humaninterferon-α-D oder -α-B-genfragmenten abgeleitet ist und als Bestandteil B ein Muramylpeptid oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz eines Muramylpeptids mit mindestens einer salzbildenden Gruppe nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.

12. Verwendung der Bestandteile A und B gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung eines pharmazeutischen Kombinationspräparats zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung eines Warmblüters, einschließlich eines Menschens, der unter einer von Viren oder Tumoren hervorgerufenen Erkrankung leidet.

13. Verwendung nach Anspruch 12 zur Behandlung einer von Herpes viridae hervorgerufenen Infektion.

14. Verwendung nach Anspruch 12 zur Behandlung einer Infektion, hervorgerufen durch Herpes simplex-Viren Typ 1 oder 2.