DE68903796T2

DE68903796T2 - Lipidmembranstrukturen.

Info

Publication number: DE68903796T2
Application number: DE1989603796
Authority: DE
Inventors: Sadao Daiichi Pharmaceu Hirota; Yasuyoshi Daiichi Pharm Kawato; Hiroshi Daiichi Pharma Kikuchi; Munehiro Daiichi Phar Tomikawa; Hitoshi Daiichi Pharm Yamauchi
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1988-06-29
Filing date: 1989-06-28
Publication date: 1993-04-22
Anticipated expiration: 2009-06-29
Also published as: EP0348942A3; EP0348942A2; DE68903796D1; EP0348942B1; CA1330040C

Description

ANWENDUNGSGEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft Lipidmembranstrukturen, die bevorzugt zu Tumorzellen transportiert werden und deshalb als Arzneimittelträger in der medizinischen Behandlung brauchbar sind.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

In Untersuchungen von Liposomen, welche bevorzugt zu Tumorzellen befördert werden, wurde bisher über Methoden zur Modifizierung der Liposomenoberflächen mit monoklonalen Antikörpern berichtet, beispielsweise in Tadakuma, Iyaku Journal, Vol. 20, S. 643 (1984), Tadakuma, Saibo Kogaku, Vol. 1, S. 72 (1982), Ohsawa et al., Chemical and Pharmaceutical Bulletin, Vol. 35, S. 740 (1987) und Papahadjopoulos et al., Cancer Research, Vol. 46, S. 4904 (1986). Insbesondere berichtete Ohsawa et al., daß kleine unilamellare Liposomen, die mit anti-carcinoembryonischen Antigen-Antikörpern modifiziert waren, leicht von Tumorzellen aufgenommen wurden, wobei verstärkte Antitumoreffekte zu beobachten waren.
Nach gegenwärtigem Stand der Technik sind die monoklonalen Antikörper jedoch aufgrund der Schwierigkeiten bei der Massenproduktion nur schwer zu kommerzialisieren.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Lipidmembranstrukturen zur Verfügung zu stellen, welche bevorzugt zu Tumorzellen transportiert werden und mit guter Reproduzierbarkeit im Rahmen einer Massenproduktion hergestellt werden können.
Als Ergebnis intensiver Untersuchungen haben die Erfinder nun gefunden, daß die oben erwähnte erfindungsgemäße Aufgabe durch Lipidmembranstrukturen gelöst werden kann, welche in ihrer Lipidmembran eine Verbindung der Formel (I):
worin R&sub1; ein Wasserstoffatom oder einen Fettsäurerest mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen bedeutet;
R&sub2; ein Wasserstoffatom oder einen acyclischen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen bedeutet, unter der Voraussetzung, daß R&sub1; und R&sub2; nicht gleichzeitig ein Wasserstoffatom bedeuten und daß die Gesamtzahl der Kohlenstoffatome von R&sub1; und R&sub2; 10 bis 40 beträgt; R&sub3; eine Aminogruppe, Guanidinogruppe oder Amidinogruppe bedeutet; und n für eine ganze Zahl von 1 bis 6 steht, oder ein Salz davon enthalten, wobei das Molverhältnis von der Verbindung der Formel (I) oder eines Salzes davon zu dem Gesamtgehalt an Lipidkomponenten wenigstens etwa 1/40 beträgt.
In der Formel (I) bedeutet der Ausdruck "Fettsäurerest" eine von einer gesättigten oder ungesättigten Fettsäure, die eine Verzweigung durch Entfernung einer Hydroxygruppe aufweisen kann, abgeleitete Gruppe. Spezifische Beispiele für Fettsäurereste sind diejenigen mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 14 bis 20 Kohlenstoffatomen, beispielsweise Formyl, Acetyl, Propanoyl, Butanoyl, Pentanoyl, Hexanoyl, Heptanoyl, Octanoyl, Decanoyl, Dodecanoyl, Tridecanoyl, Tetradecanoyl, Pentadecanoyl, Hexadecanoyl, Heptadecanoyl, Octadecanoyl, Nonadecanoyl, Eicosanoyl, Heneicosanoyl, Docosanoyl, Tricosanoyl, Tetracosanoyl, Hexacosanoyl, Triacontanoyl, 9 -Hexadecenoyl, 9-Octadecenoyl, 9, 12-Octadecadienoyl, 9,12,15-Octadecatrienoyl, 11-Eicosenoyl, 11,14-Eicosadienoyl, 11,14,17-Eicosatrienoyl, 4,8,12,16-Eicosatetraenoyl, 13-Docosenoyl, 4,8,12,15,19-Docosapentaenoyl, 15-Tetracosenoyl, 2-Dodecylhexadecanoyl, 2-Tetradecylhexadecanoyl, 2-Dodecyltetradecanoyl, 2-Tetradecenylhexadecenoyl, 2-Tetradecylhexadecenoyl, 2-Tetradecenylhexadecanoyl und 2-Dodecyloctadecanoyl-Gruppen.
Der Ausdruck "acyclischer Kohlenwasserstoffrest" bedeutet eine von einem gesättigten oder ungesättigten acyclischen Kohlenwasserstoff abgeleitete Gruppe, welcher eine Verzweigung durch Entfernung eines Wasserstoffatoms aufweisen kann. Spezifische Beispiele für acyclische Kohlenwasserstoffreste sind diejenigen mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 14 bis 20 Kohlenstoffatomen, beispielsweise Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, Dodecyl, Tridecyl, Tetradecyl, Pentadecyl, Hexadecyl, Heptadecyl, Octadecyl, Nonadecyl, Eicosyl, Heneicosyl, Docosyl, Tricosyl, Tetracosyl, Hexacosyl, Triacontyl, 9-Hexadecenyl, 9-Octadecenyl, 9,12-Octadecadienyl, 9,12,15-Octadecatrienyl, 11-Eicosenyl, 11,14-Eicosadienyl, 11,4,17-Eicosatrienyl, 4,8,12,16-Eicosatetraenyl, 13-Docosenyl, 4,8,12,15,19- Docosapentaenyl, 15-Tetracosenyl, 2-Dodecyltetradecyl, 2-Dodecylhexadecyl, 2-Tetradecylhexadecyl, 2-Tetradecylhexadecenyl, 2-Tetradecenylhexadecyl und 2-Dodecyloctadecyl- Gruppen.
"n" in Formel (I) steht vorzugsweise für 3 oder 4.
Von den Verbindungen der Formel (I) sind diejenigen bevorzugt, worin R&sub1; einen Fettsäurerest und R&sub2; einen acyclischen Kohlenwasserstoffrest bedeutet. Bei diesen bevorzugten Verbindungen liegt die Gesamtzahl der Kohlenstoffatome von R&sub1; und R&sub2; vorzugsweise im Bereich von 10 bis 40.
Die "Lipidmembranstrukturen" der vorliegenden Erfindung bedeuten lamellare Lipidpartikel, wobei polare Kopfgruppen eines polaren Lipids zur wäßrigen Phase einer Grenzfläche unter Bildung von Membranstrukturen ausgerichtet sind. Beispiele für Lipidmembranstrukturen sind Liposomen, Micellen und Microemulsionen.
Ein Verfahren zur Herstellung der Lipidmembranstrukturen, welche die Verbindung der Formel (I) oder ein Salz davon in ihrer Lipidmembran enthalten, ist unten beschrieben. (a) Herstellung von Liposomen, welche eine Verbindung (I) oder ein Salz davon in der Liposomenmenbran enthalten:
Eine wäßrige Liposomendispersion wird aus Membrankomponenten, wie phospholipiden (z .B. Phosphatidylcholin, Phosphatidylglycerol, Sphingomyelin, und Phosphatidylethanolamin), Glycolipiden und synthetischen grenzflächenaktiven Mitteln vom Dialkyl-Typ nach bekannten Verfahren, wie beispielse in Annual Review of Biophysics and Bioengineering, Vol. 9, S. 467 (1980) beschrieben, hergestellt. Die Liposomen können außerdem sterole (beispielsweie Cholesterol und Cholestanol), Dialkylphosphate, Diacylphosphatidinsäuren, Stearylamin oder α-Tocopherol in der Liposomenmembran enthalten.
Zu der so hergestellten Liposomendispersion gibt man eine wäßrige Lösung der Verbindung der Formel (I) oder eines Salzes davon und läßt die Mischung eine bestimmte Zeit stehen, vorzugsweise unter Erwärmen auf eine Temperatur oberhalb der Phasenübergangstemperatur der Membran oder oberhalb 40ºC. Anschließend wird gekühlt, um dadurch Liposomen herzustellen, welche die Verbindung der Formel (I) oder ein Salz davon in der Liposomenmembran enthalten. Alternativ kann man die gewünschten Liposomen auch herstellen, indem man vorher die oben beschriebenen Membrankomponenten und die Verbindung der Formel (I) oder ein Salz davon vermischt und die Mischung nach bekannten Verfahren zur Herstellung von Liposomen behandelt. (b) Herstellung von Micellen, welche die Verbindung (I) oder ein Salz davon in der Micellmembran enthalten:
Ein micellbildendes oberflächenaktives Mittel, wie Polyoxyethylensorbitan-fettsäureester, Polyoxyethylencastorölderivate, Polyoxyethylenderivate von gehärtetem Castoröl, Fettsäurenatriumsalze, Natriumcholate, Polyoxyethylenfettsäureester und Polyoxyethylen-alkylether, Alkylglycoside, wird zur Herstellung einer Micelldispersion zu Wasser in einer Konzentration oberhalb der kritischen Micellkonzentration gegeben. Zu der Micelldispersion gibt man eine wäßrige Lösung der Verbindung der Formel (I) oder eines Salzes davon und läßt die Mischung während einer bestimmten Zeit stehen, vorzugsweise unter Erwärmen auf 40ºC oder höher. Anschließend wird gekühlt, um dadurch Micellen herzustellen, welche die Verbindung der Formel (I) oder ein Salz davon in der Micellmembran enthalten. Alternativ kann man die gewünschten Micellen auch herstellen, indem man vorher die oben beschriebenen micellbildenden Substanzen und die Verbindung der Formel (I) oder ein Salz davon vermischt und die Mischung nach bekannten Methoden zur Micellbildung behandelt.
(c) Herstellung von Mikroemulsionen, welche die Verbindung (I) oder ein Salz davon in der Lipidmembran enthalten:
Zu den nach (b) hergestellten Micellen gibt man Fette und Öle, wie Sojabohnenöl, um die Micellen mit den Fetten und Ölen zu sättigen und die Ölphase derart zu vergrößern, daß keine irreversible Ölphasentrennung mehr erfolgen kann, um dadurch Mikroemulsionen herzustellen, welche die Verbindung der Formel (I) oder ein Salz davon in der Lipidmembran enthalten. Alternativ kann man die gewünschten Mikroemulsionen auch herstellen, indem man eine wäßrige Lösung der Verbindung der Formel (I) oder eines Salzes davon, zu vorher nach bekannten Verfahren hergestellten Mikroemulsionen gibt, die erhaltenen Emulsionen eine bestimmte Zeit stehen läßt, vorzugsweise unter Erwärmen auf 40ºC oder höher, und anschließend kühlt.
Bei den oben beschriebenen Verfahren kann in einigen Fällen die Form der erhaltenen Lipidmembranstrukturen dadurch variiert werden, daß man das Verhältnis von der Verbindung der Formel (I) oder eines Salzes davon zu dem Gesamtgehalt an Lipidkomponenten steuert. Wenn beispielsweise Phosphatidylcholin als alleinige Lipidkomponente verwendet wird, können Liposomen hergestellt werden, wenn das Molverhältnis von Verbindung der Formel (I) oder eines Salzes davon zu dem Gesamtgehalt an Lipidkomponenten auf etwa 2/3 oder weniger eingestellt wird; Micellen oder Mikroemulsionen können hergestellt werden, wenn das oben beschriebene Molverhältnis größer als 2/3 ist.
Um die erfindungsgemäßen Lipidmembranstrukturen bevorzugt zu Tumorzellen zu befördern, ist es üblicherweise wünschenswert, eine Verbindung der Formel (I) oder ein Salz davon in einem Molverhältnis von wenigstens etwa 1/40 zum Gesamtgehalt der Lipidkomponenten einzusetzen.
Die Verbindungen der Formel (I) können nach bekannten Verfahren hergestellt werden und typische Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I) werden nachfolgend erläutert.
(1) Herstellung von Verbindungen (I) [R&sub3; Guanidinogruppe]
worin R&sub1;&sub1; einen Fettsäurerest bedeutet; R&sub2;&sub1; einen acyclischen Kohlenwasserstoffrest bedeutet und n die oben angegebenen Bedeutungen besitzt.
Eine Verbindung der Formel (IIa) kann mit Salpetersäure in einem geeigneten organischen Lösungsmittel in Anwesenheit von Schwefelsäure zu einer Verbindung der Formel (IIIa) umgesetzt werden. Die Verbindung der Formel (IIIa) kann mit einem Fettsäurechlorid (R&sub1;&sub1;Cl) in einem geeigneten organischen Lösungsmittel in Gegenwart einer Base, beispielweise Natriumhydroxid, umgesetzt werden, wobei die Verbindung der Formel (IVa) hergestellt wird, welche dann katalytisch in einem geeigneten organischen Lösungsmittel in Gegenwart eines Katalysators, beispielsweise Palladium auf Kohle, reduziert werden kann, wobei die gewünschte Verbindung der Formel (Ia) hergestellt wird. Die Verbindung der Formel (Ib) kann dann durch Veresterung der Verbindung der Formel (Ia) mit einer Verbindung der Formel R&sub2;&sub1;OH in einem geeigneten organischen Lösungsmittel in Gegenwart einer Säure erhalten werden.
Wenn man eine Verbindung der Formel (IIa) einer Veresterung unterwirft, kann man eine Verbindung der Formel (I) erhalten, worin R&sub1; ein Wasserstoffatom bedeutet, R&sub2; einen acyclischen Kohlenwasserstoffrest bedeutet und R&sub3; für eine Guanidinogruppe steht. (2) Herstellung von Verbindungen (I) [R&sub3;: Aminogruppe]
worin R&sub1;&sub1;, R&sub2;&sub1; und n die oben angegebenen Bedeutungen besitzen.
Die Verbindung der Formel (IIb) kann mit Benzyloxycarbonylchlorid in einem geeigneten organischen Lösungsmittel zur Reaktion gebracht werden, wobei die Verbindung der Formel (IIIb) hergestellt wird. Die Verbindung der Formel (IIIb) kann mit einem Fettsäurechlorid R&sub1;&sub1;Cl in einem geeigneten organischen Lösungsmittel in Gegenwart von Alkali, beispielsweise Natriumhydroxid, umgesetzt werden, wobei die Verbindung der Formel (IVb) hergestellt wird. Die Verbindung der Formel (IVb) kann in einem geeigneten organischen Lösungsmittel in Gegenwart eines Katalysators, beispielsweise Palladium-Kohle, katalytisch reduziert werden, wobei die Verbindung der Formel (Ic) hergestellt wird. Die Verbindung der Formel (Ic) kann dann mit einer Verbindung der Formel R&sub2;&sub1;OH in einem geeigneten organischen Lösungsmittel in Gegenwart einer Säure verestert werden, wobei die Verbindung der Formel (Id) erhalten wird.
Wenn man die Verbindung der Formel (IIb) einer Veresterung unterwirft, kann man eine Verbindung der Formel (I) herstellen, worin R&sub1; ein Wasserstoffatom bedeutet, R&sub2; einen acyclischen Kohlenwasserstoffrest bedeutet und R&sub3; für eine Aminogruppe steht.
Die Verbindung der Formel (I) kann in Form optischer Isomere vorliegen. Diese Isomere und eine Mischung davon sind von der vorliegenden Erfindung umfaßt.
Arzneimittel, welche in die erfindungsgemäßen Lipidmembranstrukturen eingekapselt werden können, variieren in Abhängigkeit von dem Membranstrukturtyp. Die Arzneimittel, welche beispielsweise in die Liposomen eingekapselt werden können, unterliegen keinen besonderen Beschränkungen und dazu zählen wasserlösliche Arzneimittel und lipidlösliche Arzneimittel, wie Methotrexat und Cisplatin. Zu Arzneimitteln, welche in den Micellen oder Mikroemulsionen eingekapselt sein können, zählen lipidlösliche Arzneimittel.
In den erfindungsgemäßen Lipidmembranen ist die Verbindung der Formel (I) oder ein Salz davon fest in die lamellare Lipidmembran durch hydrophobe Interaktion aufgenommen. Durch Gelfiltration und das nachfolgend beschriebene Testbeispiel 1 wurde bestätigt, daß das Verhältnis von der als freies Monomer vorliegenden Verbindung der Formel (I) oder eines Salzes davon zu der Verbindung in der Lipidmembran sehr gering ist.
Die erfindungsgemäßen Lipidmembranstrukturen besitzen ausgezeichnete spezifische Affinität zu Tumorzellen und können deshalb bevorzugt zu Tumorzellen befördert werden. Weiter können die Verbindungen der Formel (I) und die Salze davon chemisch in großem Maßstab produziert werden. Die erfindungsgemäßen Lipidmembranstrukturen können deshalb in großen Mengen mit guter Reproduzierbarkeit hergestellt werden.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der nachfolgenden Beispiele und Testbeispiele näher erläutert.

VERGLEICHSBEISPIEL 1

Dipalmitoylphosphatidylcholin (nachfolgend als DPPC abgekürzt) und Cholesterol wurden in ein Probeglas in einem Molverhältnis von 1:1 bis zu einer Gesamtlipidmenge von 8 uMol gegeben und in Chloroform gelöst. Das Chloroform wurde dann unter einem Stickstoffstrom entfernt, wobei sich ein Lipidfilm auf der Innenwand des Glases bildete. Zwei ml einer phosphatgepufferten Saline (pH = 7,4, im folgenden als PBS abgekürzt) wurden zugegeben. Nach schütteln in einem Vortex- Mischer wurde die Mischung einer Ultraschallbehandlung unterworfen, wobei eine Liposomendispersion hergestellt wurde. Die Dispersion wurde auf 45 bis 50ºC erwärmt und dann durch ein Polycarbonatmembranfilter mit einer porengröße von 0,2 um gegeben, um eine Liposomendispersion mit einer Teilchengröße von nicht mehr als 0,2 um herzustellen. Die Dispersion wurde ultrazentrifugiert (150 000 x g, 1 Stunde, zweimal), der Überstand wurde entfernt und 5 ml PBS wurden zugegeben, wobei eine Liposomendispersion erhalten wurde.

BEISPIEL 1

DPPC, Cholesterol und Nα-Cocoyl-Argininethylester (im folgenden als CAEE abgekürzt) wurden in ein Probeglas in einem Molverhältnis von 1:1:0.05 bis zu einer Gesamtlipidmenge von 8 uMol gegeben und in einer 9:1 (auf das Volumen bezogen) - Mischung von Chloroform und Methanol gelöst. Die Lösung wurde dann in ähnlicher Weise wie im Vergleichsbeispiel 1 behandelt, um eine Liposomendispersion herzustellen.

BEISPIEL 2

DPPC, Cholesterol und CAEE wurden in ein Probeglas in einem Molverhältnis von 1:1:0,1 bis zu einer Gesamtlipidmenge von 8 uMol gegeben. Die Lösung wurde dann in ähnlicher Weise wie im Vergleichsbeispiel 1 behandelt, um eine Liposomendispersion herzustellen.

BEISPIEL 3

DPPC, Cholesterol und CAEE wurden in ein Probeglas in einem Molverhältnis von 1:1:0,15 bis zu einer Gesamtlipidmenge von 8 uMol gegeben und in einer 9:1 (auf das Volumen bezogen) - Mischung von Chloroform und Methanol gelöst. Die Lösung wurde anschließend in ähnlicher Weise wie im Vergleichsbeispiel 1 behandelt, um eine Liposomendispersion herzustellen.

BEISPIEL 4

DPPC, Cholesterol und Nα-Palmitoyl-L-arginin (im folgenden als PAA abgekürzt) wurden in ein Probeglas in einem Molverhältnis von 1:1:0,05 bis zu einer Gesamtlipidmenge von 8 uMol gegeben und in einer 9:1 (auf das Volumen bezogen) - Mischung von chloroform und Methanol gelöst. Die Lösung wurde anschließend in ähnlicher Weise wie im Vergleichsbeispiel 1 behandelt, um eine Liposomendispersion herzustellen.

BEISPIEL 5

DPPC, Cholesterol und PAA wurden in ein Probeglas in einem Molverhältnis von 1:1:0,1 bis zu einer Gesamtlipidmenge von 8 uMol gegeben und in einer 9:1 (auf das Volumen bezogen) - Mischung von Chloroform und Methanol gelöst. Die Lösung wurde anschließend in gleicher Weise wie im Vergleichsbeispiel 1 behandelt, um eine Liposomendispersion herzustellen.

BEISPIEL 6

DPPC, Cholesterol und PAA wurden in ein Probeglas in einem Molverhältnis von 1:1:0,15 bis zu einer Gesamtlipidmenge von 8 uMol gegeben und in einer 9:1 (auf das Volumen bezogen) - Mischung von Chloroform und Methanol gelöst. Die Lösung wurde anschließend in ähnlicher Weise wie im Vergleichsbeispiel 1 behandelt, um eine Liposomendispersion herzustellen.

VERGLEICHSBEISPIEL 2

In einem Probeglas wurden 5,54 uMol Eilecithin, 1,85 uMol Cholesterol und 0,62 uMol Phosphatidinsäure in einer 9:1 (auf das Volumen bezogen) -Mischung von Chloroform und Methanol gelöst und zu der Lösung wurden 4,0 uCi ³H-Dipalmitoylphosphatidylcholin gegeben. Das organische Lösungsmittel wurde aus der Lösung unter einem Stickstoffstrom entfernt, wobei sich ein Lipidfilm an der Innenwand des Probeglases bildete. Zu dem Probenglas wurden 5 ml PBS gegeben und die Mischung wurde in einem Wirbelmischer geschüttelt und anschließend einer ultraschallbehandlung unterworfen, wobei eine Liposomendispersion erhalten wurde. Die Dispersion wurde auf 40 bis 45ºC erwärmt und durch ein Polycarbonatmembranfilter mit einer Porengröße von 0,2 um gegeben, wobei eine Liposomendispersion mit einer Teilchengröße von nicht mehr als 0,2 um erhalten wurde.

BEISPIEL 7

In ein Probeglas wurden 4,8 uMol Eiphosphatidylcholin, 1,6 uMol Cholesterol, 1,07 uMol Phosphatidinsäure und 0,53 uMol CAEE gegeben. Die Lipide in dem Probeglas wurden in einer 9:1 (auf das Volumen bezogen) -Mischung von Chloroform und Methanol gelöst und mit 2 uCi ³H-Dipalmitoylphosphatidylcholin versetzt. Die Lösung wurde anschließend in ähnlicher Weise wie im Vergleichsbeispiel 2 beschrieben, behandelt, um eine Liposomendispersion herzustellen.

BEISPIEL 8

Eine Liposomendispersion wurde in ähnlicher Weise wie im Beispiel 7 hergestellt, wobei jedoch 4,24 uMol Eiphosphatidylcholin, 1,41 uMol Cholesterol, 1,41 uMol Phosphatidinsäure und 0,94 uMol CAEE verwendet wurden.

BEISPIEL 9

In einem Probeglas wurden 4,21 uMol Distearoylphosphatidylcholin, 2,11 uMol Dicetylphosphorsäure und 1,68 uMol CAEE in einer 9:1 (auf das Volumen bezogen) -Mischung von Chloroform und Methanol gelöst. Das organische Lösungsmittel wurde dann unter einem Stickstoffstrom entfernt, wobei sich ein Lipidfilm auf der Innenwand des Probeglases bildete. 5 ml einer PBS-Lösung von 1 mM Inulin, welche 300 uCi ³H-Inulin enthielt, wurden zu dem Probeglas gegeben und die Mischung wurde in ähnlicher Weise wie im Vergleichsbeispiel 2 behandelt, um eine Liposomendispersion herzustellen. Die erhaltene Liposomendispersion wurde ultrazentrifugiert (150 000 x g, 1 Stunde, zweimal) und der Überstand wurde abgetrennt, um das nicht in die Liposomen eingekapselte Inulin abzutrennen. Zum Rückstand wurde PBS gegeben, wobei 2,5 ml einer Liposomendispersion, die Inulin in ihrer inneren wäßrigen Phase eingekapselt enthielt, erhalten wurden.
Als Ergebnis des Enzymassays unter Verwendung des Cholinrestes des Distearoylphosphatidylcholin als Marker wurde gefunden, daß die Gesamtlipidmenge der erhaltenen Dispersion 2,2 uMol pro ml betragen hat. Weiter wurde gefunden, daß der Einkapselungsgrad von Inulin in den Liposomen 1,8% war.

TESTBEISPIEl 1

Das Zetapotential jeder der im Vergleichsbeispiel 1 und in den Beispielen 1 bis 6 hergestellten Liposomendispersionen wurde mit einem Zetasizer II (Warenzeichen; hergestellt von Malvern Co., Ltd.) gemessen. Die Messung erfolgte unter Verwendung einer Zelle vom Kapillartyp mit einem inneren Durchmesser von 0,7 mm bei einer Temperatur von 25ºC, einer Lösungsviskosität von 0,8903 Poise; einem Brechungsindex der Lösung von 1,33; einer Zellspannung von 90 V; und einem Zellstrom von 2 mA. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 1 gezeigt. TABELLE 1 -Potential der Liposomensuspensionen Beispiel Nr. (Molverhältnis) -Potential Vergleichsbeispiel Beispiel DPPC:Cholesterol DPPC:Cholesterol:CAEE DPPC:Cholesterol:PAA
Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen, daß die Verbindungen 25 der Formel (I) in die Liposomenmembran aufgenommen werden.

TESTBEISPIEL 2

1) Eine Suspension einer MH-134-Kultur (Murinhepatomzellen) (Medium: RPMI-1640; pH = 7) wurde zentrifugiert (1,000 Upm, 10 min.) und der Überstand wurde entfernt. Man gab PBS zu dem Präzipitat, um die Zellen zur Herstellung einer Zellsuspension erneut zu suspendieren. Portionen von 4 ml der Zellsuspension, die jeweils 4 x 10&sup6; Zellen enthielten, wurden in 18 Probegläschen gegeben und bei 37ºC gehalten.
Jede der gemäß dem Vergleichsbeispiel 2 und den Beispielen 7 und 8 hergestellten und vorher auf 37ºC erwärmten Liposomendispersionen wurde in 6 der die Zellsuspension enthaltenen 18 Probegläschen in einer derartigen Menge gegeben, daß der Gesamtlipidgehalt 0,32 uMol war. Drei der 6 Probegläschen pro Probe wurden 1 Stunde und die anderen drei Probegläschen pro Probe 3,5 Stunden bei 37ºC ohne Schütteln inkubiert. Jede Mischung wurde zentrifugiert (1 000 Upm, 10 min, zweimal in PBS), um die Zellen alleine zu isolieren. Die Lipidaufnahme durch die Tumorzellen wurde durch Messung der Radioaktivität nach der Flüssigscintillationsmethode bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Zahl der Zellen nach der Inkubation wurde durch quantitative Proteinbestimmung nach der Lowry-Methode korrigiert.
2) Die Testung wurde in gleicher Weise wie oben unter 1) durchgeführt, außer daß die zur re-Suspension der Tumorzellen verwendete PBS 5% fötales Rinderserum enthielt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
3) Die Testung wurde in gleicher Weise wie oben unter 1) durchgeführt, außer daß Humanleukämiezellen HL-60 anstelle von MH-134 verwendet wurden. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. TABELLE 2 Lipidaufnahme durch die Tumorzellen MH-134 (nMol/4 x 10&sup6; Zellen) n =3 Inkubationszeit Vergleichsbeispiel Beispiel (Mittelwert ± Standardabweichung) TABELLE 3 Lipidaufnahme durch die Tumorzellen MH-134 mit fötalem Rinderserum (nMol/4 x 10&sup6; Zellen) n = 3 Inkubationszeit Vergleichsbeispiel Beispiel (Mittelwert ± Standardabweichung) TABELLE 4 Lipidaufnahme durch die Tumorzellen HL-60 (nMol/4 x 10&sup6; Zellen) n = 3 Inkubationszeit Vergleichsbeispiel Beispiel (Mittelwert ± Standardabweichung)
Wie den Tabellen 2 bis 4 zu entnehmen ist, werden die erfindungsgemäßen Liposomen im Vergleich zu dem Vergleichsbeispiel 2 ausgezeichnet durch Tumorzellen aufgenommen.
Es wurde daher bestätigt, daß die erfindungsgemäßen Lipidmembranstrukturen eine spezifische Affinität zu Tumorzellen besitzen und bevorzugt zu den Tumorzellen befördert werden.

TESTBEISPIEL 3

Die gemäß Beispiel 9 hergestellte Liposomendispersion wurde zu 2 ml einer Suspension einer Kultur von MH-134-Zellen in RPMI-1640-Medium (Zellzahl: 1,6 x 10&sup6;/2 ml) in einem Gesamtlipidgehalt von 0,16 uMol gegeben. Als Kontrolle wurde eine PBS-Lösung von 2,62 nMol Inulin mit einem Gehalt von 0,157 uCi an ³H-Inulin zu 2 ml einer weiteren Suspension einer Kultur von MH-134-Zellen gegeben. Die Mischung wurde in ähnlicher Weise wie im Testbeispiel 2 inkubiert und die Probenahme erfolgte nach 0,5, 1, 2 und 3 Stunden. Die Inulinaufnahme durch die Tumorzellen wurde in ähnlicher Weise wie im Testbeispiel 2 durchgeführt. Die Zahl der Zellen nach der Inkubation durch quantitative Proteinbestimmung nach der Lowry-Methode korrigiert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. TABELLE 5 Inulinaufnahme durch die Tumorzellen MH-134 (%/1,6 x 10&sup6; Zellen), n = 3 Inkubationszeit Beispiel Kontrolle (nur Inulin)
Wie der Tabelle 5 zu entnehmen ist, werden die erfindungsgemäßen Liposomen von Tumorzellen aufgenommen und das in den Liposomen eingeschlossene Inulin wird von den Tumorzellen gleichzeitig aufgenommen.
Die Erfindung wurde detailliert und unter Bezug auf spezifische Ausführungsformen beschrieben, es ist für den Fachmann jedoch offensichtlich, daß verschiedene Änderungen und Modifikationen vorgenommen werden können, ohne vom Wesen und Umfang der Erfindung abzuweichen.

Claims

1. Lipidmembranstrukturen, die in der Lipidmembran davon eine Verbindung der Formel (I)

worin R&sub1; für ein Wasserstoffatom oder einen Fettsäurerest mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen steht; R&sub2; für ein Wasserstoffatom oder einen acyclischen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 30 Kohlenstoffatoinen steht, vorausgesetzt, daß R&sub1; und R&sub2; nicht gleichzeitig Waserstoffatoine darstellen und daß die Gesamtzahl der Kohlenstoffatome von R&sub1; und R&sub2; 10 bis 40 ist; R&sub3; für eine Aminogruppe, eine Guanidinogruppe oder eine Amidinogruppe steht; und n für eine ganze Zahl von 1 bis 6 steht; oder ein Salz davon enthalten, wobei das Molverhältnis der Verbindung der Formel (I) oder eines Salzes davon zu dem Gesamtgehalt der Lipidkomponenten mindestens etwa 1/40 ist.

2. Lipidmembranstrukturen nach Anspruch 1, worin der Fettsäurerest 14 bis 20 Kohlenstoffatome enthält.

3. Lipidmembranstrukturen nach Anspruch 1 oder 2, worin der acyclische Kohlenwasserstoffrest 14 bis 20 Kohlenstoffatome enthält.

4. Lipidmembranstrukturen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin n für 3 oder 4 steht.

5. Lipidmembranstrukturen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin R&sub1; für einen Fettsäurerest und R&sub2; für einen acyclischen Kohlenwasserstoffrest steht, wobei die Gesamtzahl der Kohlenstoffatome des Fettsäurerestes und des acyclischen Kohlenwasserstoffrestes 10 bis 40 ist.

6. Lipidmembranstrukturen nach einem der Anspüchen 1 bis 5, worin die Membranstrukturen Liposome, Micellen oder Microemulsionen sind.