DE673277C

DE673277C - Process for the production of a concentrated Kuecken provitamin D preparation from a sterling mixture

Info

Publication number: DE673277C
Application number: DEN38291D
Authority: DE
Inventors: Dr Albert Gerhardus Boer; Dr Johannes Van Niekerk; Dr Engbert Harmen Reerink; Dr Aart Van Wijk
Original assignee: Philips Patentverwaltung GmbH
Current assignee: Philips Intellectual Property and Standards GmbH
Priority date: 1935-06-23
Filing date: 1935-06-23
Publication date: 1939-03-20

Description

Verfahren zur Herstellung eines konzentrierten Kücken-Provitamin-D@präparats aus einem Steringemisch Seit es bekannt ist, daß Cholesterin kleine Mengen Provibanun-D enthält, hat man versucht, dieses Provitaniin-D-Sterin zu konzentrieren und so rein wie möglich zu isolieren. Insbesondere nach der Entdeckung von W a d d e 11 (Journ. of the Biol. Chemistry, Band io5, Juli 1934, Nr: 4, Seite 7i m739), daß dieses Provitamin sich hinsichtlich der Aktivierbarkeit zu Kückenvitamin-D von pflanzlichem Ergosterin unterscheidet, ist die Herstellung des praktisch reinen tierischen Provitamins-D bedeutungsvoll geworden. Zur Konzentrierung dieses -Provitamins hat man verschiedene Methoden anzuwenden versucht, z. B. fraktionierte Kristallisation, fraktionierte Verdampfung im Hochvakuum, fraktionierte Extraktion des Digiboninkomplexes, fraktionierte Adsorption mit bestimmten Adsorptign.sstoffen. Keine dieser Methoden hat jedoch ein nennenswertes Resultat gehabt.Process for the production of a concentrated chicken provitamin D @ preparation from a sterling mixture Since it was known that small amounts of Provibanun-D one has tried to concentrate this provitaniin-D-sterol and so pure isolate as possible. Especially after the discovery of W a d d e 11 (Journ. of the Biol. Chemistry, Volume io5, July 1934, No. 4, Page 7i m739) that this provitamin with regard to the ability to activate chick vitamin D of vegetable ergosterol is the production of the practically pure animal provitamin-D become meaningful. There are several ways to concentrate this vitamin Tried to apply methods, e.g. B. fractional crystallization, fractional Evaporation in a high vacuum, fractional extraction of the digibonin complex, fractional Adsorption with certain adsorptive substances. However, neither of these methods has had a noteworthy result.

Es wurde nun gefunden, daß: ges möglich ist, das Kücken-Provitamin-D erheblich zu konzentrieren und sogar in einem sehr reinen Zustand zu erhalten; wenn. man von einem Ester eines Provitamin-D enthaltenden Steringemisches ausgeht und den Provitamin-D-gehalt durch fraktionierte Adsorpti,on so weit, vorzugsweise bis mindesdbens 4o bis 5o%, steigert, daß diese Steigerung mittels Umkristallisieren aus einem Lösungsmittel, zweckmäßig aus Methylalkohol., fortgesetzt werden kann.It has now been found that: it is possible to use the chicken provitamin D to concentrate considerably and even to maintain it in a very pure state; if. one starts from an ester of a provitamin-D-containing sterile mixture and the provitamin D content by fractional adsorption so far, preferably up to at least 40 to 5o%, that this increase increases by means of recrystallization from a solvent, expediently from methyl alcohol., can be continued.

Für die Veresberung wird erfindungsgemäßeine Säure gewählt, die :an und für sich nicht zu einer besonders starken Adsorption AnlaB gibt, weil dadurch die Unterschiede in der Adsorbierbarkeit der verschiedenen im. Gemisch enthaltenen Sberirne, wodurch die Trennurig überhaupt möglich wird, verdeckt werden könnten.According to the invention, an acid is selected for the fermentation which: an and does not in itself give rise to particularly strong adsorption because it does so the differences in the adsorbability of the various im. Mixture contained Sberirne, whereby the separation is possible at all, could be covered.

Vorzugsweise werden Steringemische als Ausgangsmaterial benutzt, die bereits einen ziemlich hohen Gehalt an Kückm-Provitamin-D besitzen. Steringemische mit einem besonders hohen Gehalt können aus wirbellosen Tieren, wie Salzwassermuscheln, Teichmuscheln, Kreiselschnecken, Mehlwürmern, Erdschnecken, Wellhornschnecken, Regenwürmern und anderen, erhalten werden: Bei der Darstellung der für die Anwendung der Erfindung zu benutzenden Ausgangsstoffe aus den obengenannten wirbellosen Tieren muß man dem Umstand Rechnung tragen, daß das Kücken-Provitamin-D ein verhältnis-, mäßig instabiler und gegen Sauerstoff empfindlicher Stoff ist.Star mixtures are preferably used as starting material which already have a fairly high Kückm provitamin D content. Sterling mixes with a particularly high content, invertebrates such as saltwater clams, Pond mussels, top snails, mealworms, ground snails, whelks, earthworms and others, are obtained: In the presentation of the application of the invention to be used starting materials from the above-mentioned invertebrates one has to take into account the fact that the chicken provitamin D is a is moderately unstable and sensitive to oxygen.

Ein dafür geeignetes präparatives Verfahren, bei dem für das Provitamin-D schädliche Handlungen unterlassen werden, ist beispielsweise das folgende.A suitable preparative process in which the provitamin D Detrimental acts are omitted, for example, as follows.

Die zu behandelnde gemahlene Masse wird entweder im Vakuum bei nur mäßig erhöhter Temperatur, z. B. etwa 5o°, getrocknet oder nach Zermahlen und gegebenenfalls Zerreiben mit Sand mittels Nag SO", Alkohol oder Aceton getrocknet. Aus dem auf diese Weise vorbehandelten. Grundstoff wird dann das Fett extrahiert, wobei zweckmäßig niedrig siedende Fettlösungsmittel, wie Äther oder Petroläther, verwendet und zweckmäßig halogenhaltige Extraktionsmittel, wie Chloroform oder Tetracblorkohlenstoff, vermieden werden, da diese zur Bildung von Salzsäure Anlaß geben können. Eine länger andauernde Berührung mit Äther ist zweckmäßig zu vermeiden, da er häufig Peroxyd enthält oder wenigstens bei seiner Verwendung die Bildung von Peroxyden schwer zu verhindern ist. Ist der Grundstoff mit Hilfe von Alkohol oder Aceton getrocknet -worden, so kann der darin gelöste Teil des Fettes durch Eindampfen des Lösungsmittels, im Vakuum oder durch Extrahieren mit Äther oder Petroläther nach Verdünnen mit Wasser gewonnen werden. Die Fettlösung wird durch Filtrieren von gegebenenfalls suspendierten Eiweißbestandteilen befreit und das Lösungsmittel durch Destillieren entfernt. Das Fett -wird dann auf übliche Weise verseift, -wobei zweckmäßig -nieder sehr hohe Temperaturen vermieden werden. und z. B.: eine Lösung von NaOH oder KOH in -wenigstens 8o%igemAlkohol verwendet wird. Die SeifenlösuDg kann. gewünschtenfalls durch Destillieren von- einem Teil des Alkohols befreit -werden, -vorauf der unverseifbare Teil entweder dadurch erhalten werden kann, daß die Seifenlösung reit Wasser verdünnt und dann der unverseifbare Teil mit Hilfe von Äther oder Petroläther extrahiert wird oder daß in der wässerigen Seifenlösung durch Behandlung mit einem Kalksalz die Kalkseifen niedergeschlagen und die zusammen mit den Kalkseifen niedergeschlagmen tuiverseifbaren Bestandteile z. B. mit Aceton aus ihnen extrahiert werden. Aus dem auf diese Weise erhaltenen unverseifbaren Teil kann oft die Sterinfraktion durch Umkristallisieren, z. B. aus Alkohol, abgeschieden werden; zur weiteren Reinigung kann mit Erfolg eine Umkristallisierung aus Methylalkohol angewendet werden, in dem bestimmte verunreinigende, z. B. ,ölhaltige Stoffe oder farbige Lipoidbestandteile sehr wenig löslich sind, so daß sie auf diese Weise entfernt werden können. Insbesondere in denjenigen Fällen, in denen die unverseifbaren Bestandteile erhebliche Mengen von Farbstoffen, -wie Carotinßiden, enthalten, kann unter dem Einfluß von Licht und Luft ein Teil des Provitamins verlorengehen; es ist daher erwünscht, auch diesem Umstand Rechnung zu tragen. Beispiel 7- eines 6,70/0 Provitamihacetatenthaltenden Sterin-Acetat-Gemisches, das aus einem aus Salzwassermuscheln (Mytilus edulis) gewonnenen Sterin hergestellt worden ist, wurden in io5 ccm eines Gemisches von Benzol und Petroläther (Siedepunkt 4o bis 6o°, Verhältnis. i : z) gelöst. Die Lösung wurde ,auf eine ,aus 315 g Aluminiumoxyd nach B r o ckmann hergestellte Adsorptionssäule von 33 mm Durchmesser gegossen, die mit Petroläther vorbehandelt war. Die Herstellung einer solchen Adsorptionssäule ist in der Arbeit von A. Wintersteiner und G. Stein (Z. f. Physiol. Chem., Bd. 22O, Seite 247 ff., 1933) beschrieben worden. Nachdem die Lösung in der Säule aufgenommen war, wurde mit im ganzen 520 ccm Lösungsmittel (Benzol-P,etroläther i: i) entwickelt. Das gesamte Filtrat, 625 ccm, enthielt 4,43 g Acetatgemisch mit nur sehr wenig Provitaminacetat. Nach Beendigung der Entwicklung wurden die oberen 2 cm der Säule, die durch Verunreinigungen gelblich gefärbt waren, mit einem Spate- vorsichtig entfernt und dann die ganze Säule mit 6oo ccm eines Gemisches von Benzol und Methylalkohol (i i : i) eluiert. Das Eluat enthielt 2,51 g Acetatge-misch mit i 5 01o Provitammacetat. 2,47g dieses Präparats wurden in 37,5 ccm Benzol-Petroläther-Gemisch (i : i ) gelöst und damit eine zweite Adsorption vorgenommen (Säule aus 112,5- A-203, 2o mm Durchmesser, Zoo ccm 'Entwicklungsflüssigkeit). Das Filtrat, 237,5 ccm, wurde verworfen, die -oberen 2 cm der Säule entfernt und der Rest der Säule mit Zoo ccm Benzol-Methylalkohol-Gemisch (i i : i) eluiert. Im Eluat befanden, sich 0,78 g Acetatgemisch mit etwa 30% Provitaminacetat. Mit diesem Präparat wurde eine dritte Adsorption vorgenommen: 0,779 würden in 12 ccm Benzol-Petroläther-Gemisch (i : i) gelöst (Säule aus 36g A1203, 1 i'mm Durchmesser, i 15 ccm Entwicklungsflüssigkeit). Das Filtrat wurde in zwei Teilen gesondert aufgefangen; die ersten 8o ccm sowie die oberen 2 cm der Säule wurden mach Vollendung der Entwicklung verworfen, die restlichen 47 ccm des Filtrats wurden mit dem mit iooccm Benzol-Methylalkohol -Gemisch (i i : i) gewonnenen Eluat vereinigt. Die Ausbeute betrug 22¢m9 eines etwa 57%igen Acet,atgemisches.The ground mass to be treated is either in a vacuum at only moderately elevated temperature, for. B. about 50 °, dried or dried after grinding and, if necessary, grinding with sand using Nag SO ", alcohol or acetone. The fat is then extracted from the raw material pretreated in this way, using low-boiling fat solvents such as ether or petroleum ether. and it is advisable to avoid halogen-containing extractants such as chloroform or carbon tetracloride, as these can give rise to the formation of hydrochloric acid If the base material has been dried with the help of alcohol or acetone, the part of the fat dissolved in it can be obtained by evaporating the solvent, in vacuo or by extracting with ether or petroleum ether after dilution with water Filtration of possibly suspended protein constituents ilen freed and the solvent removed by distillation. The fat is then saponified in the usual way, in which case it is advisable to avoid very high temperatures. and Z. E.g. a solution of NaOH or KOH in at least 80% alcohol is used. The soap solution can. if desired by distilling a part of the alcohol -be freed, -before the unsaponifiable part can either be obtained by diluting the soap solution with water and then extracting the unsaponifiable part with the aid of ether or petroleum ether or that by in the aqueous soap solution Treatment with a lime salt, the lime soaps are precipitated and the tuiverseifbaren components z. B. extracted from them with acetone. From the unsaponifiable part obtained in this way, the sterol fraction can often be recrystallized, e.g. B. from alcohol, are deposited; for further purification, a recrystallization from methyl alcohol can be used with success, in which certain contaminating, z. B., oily substances or colored lipoid components are very sparingly soluble, so that they can be removed in this way. Particularly in those cases in which the unsaponifiable constituents contain considerable amounts of colorants, such as carotenoid, some of the provitamin can be lost under the influence of light and air; it is therefore desirable to take this fact into account as well. Example 7 - a 6.70 / 0 provitamihacetat-containing sterol-acetate mixture, which has been prepared from a sterol obtained from sea mussels (Mytilus edulis), were in 105 ccm of a mixture of benzene and petroleum ether (boiling point 40 to 60 °, ratio. i: z) solved. The solution was poured onto an adsorption column of 33 mm diameter made from 315 g of aluminum oxide according to Brockmann, which had been pretreated with petroleum ether. The production of such an adsorption column has been described in the work of A. Wintersteiner and G. Stein (Z. f. Physiol. Chem., Vol. 22O, page 247 ff., 1933). After the solution had been taken up in the column, it was developed with a total of 520 ccm of solvent (benzene-P, etrolether i: i). The total filtrate, 625 cc, contained 4.43 g of acetate mixture with only very little provitamin acetate. After the development had ended, the upper 2 cm of the column, which had been colored yellow by impurities, was carefully removed with a spatula and the entire column was then eluted with 600 cc of a mixture of benzene and methyl alcohol (ii: i). The eluate contained 2.51 g of acetate mixture with 150% provitammacetate. 2.47 g of this preparation were dissolved in 37.5 cc of benzene-petroleum ether mixture (i: i) and a second adsorption was carried out with it (column of 112.5-A-203, 20 mm diameter, zoo cc of developing liquid). The filtrate, 237.5 cc, was discarded, the upper 2 cm of the column was removed and the remainder of the column was eluted with a zoo cc benzene-methyl alcohol mixture (ii: i). The eluate contained 0.78 g of an acetate mixture with about 30% provitamin acetate. With this preparation, a third adsorption was made: 0.779 benzene-petroleum ether mixture (i: i) would in 12 cc dissolved (column 36g A1203, 1 i'mm diameter, 15 cc i development liquid). The filtrate was collected separately in two parts; the first 80 ccm and the upper 2 cm of the column were discarded after the development was completed, the remaining 47 ccm of the filtrate were combined with the eluate obtained with 100% benzene-methyl alcohol mixture (ii: i). The yield was 22 μm of an approximately 57% strength acetone mixture.

Dieses 57 o/oi,ge Acetatgemisch wurde dreimal aus Methylalkohol (2o,15 und 12 ccm) umkristallisiert und ergab dann q.9 mg gut kristallisiertes, praktisch reines Provitaminacetat, das nach nochmaliger Kristallisation ans Methylalkohol ganz rein ist. Im eva. kuierten Schmelzpunktröhrchen schmilzt es bei 16o bis i61°, die Drehung beträgt [aID--78° (in Benzol).This 57% acetate mixture was extracted three times from methyl alcohol (2o, 15 and 12 ccm) recrystallized and then gave q.9 mg well crystallized, practically pure provitamin acetate, which after repeated crystallization to form methyl alcohol is completely pure. In eva. With a melting point tube, it melts at 16o to i61 °, the rotation is [aID - 78 ° (in benzene).

Aus diesem Acetat kann durch Verseifung und Kristallisation aus Methylalkohol das reine Kücken-Provitamin-D gewonnen werden. Es schmilzt im.Vakuum bei 149,5 bis i 5o' ([aID- 118° [in Benzol), sein Adsorptionsspektrum unterscheidet sich fast' nicht von. dem des Ergosterins. Dieses Kücken-Provitamn-D ist ein. bisher unbekannter Stoff, der sich durch Schmelzpunkt und Drehung, durch Schmelzpunkt und Drehung seines Acetats sowie durch seine Aktivierbarkeit mit ultraviolettem Licht zu einem speziell für Kücken wirksamen Vitamin D von Ergosterin unterscheidet. Für die Herstellung des verfahrensgemäß anzuwendenden Ausgangsstoffes wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung kein Schutz verlangt.This acetate can be saponified and crystallized from methyl alcohol the pure chicken provitamin D can be obtained. It melts in a vacuum at 149.5 to i 50 '([aID- 118 ° [in benzene), its adsorption spectrum differs almost' not from. that of ergosterol. This chick provitamn-D is a. previously unknown Substance that is characterized by its melting point and rotation, by its melting point and its rotation Acetats as well as its ability to be activated with ultraviolet light to a special one Vitamin D differs from ergosterol, which is effective for chicks. For the production the starting material to be used according to the process is within the scope of the present Invention does not require protection.

Claims

PATENT CLAIMS: i. Process for the preparation of a concentrated Chicken provitamin D preparation from a sterling mixture containing provitamin D by means of fractional adsorption, characterized in that the first Mixture of sters with an acid that in and of itself is not particularly strong Adsorption gives rise to esterified, then the provitan- # n-D-content by fractionated Adsorption so far, preferably up to at least 40 to 5o%, that this increases Increase through further purification by means of recrystallization from a solvent, like methyl alcohol. can, after which it is saponified if desired.

2. The method according to claim i, characterized in that one of one, invertebrates Animal-preserved sterling mix is assumed.