DE659882C

DE659882C - Process for separating the antirachitic vitamin from natural substances

Info

Publication number: DE659882C
Application number: DEI55138D
Authority: DE
Inventors: Dr Hans Brockmann
Original assignee: IG Farbenindustrie AG
Current assignee: IG Farbenindustrie AG
Priority date: 1936-05-31
Filing date: 1936-05-31
Publication date: 1938-05-17

Description

Verfahren zum Abtrennen des antirachitischen Vitamins aus Naturstoffen Es ist schon wiederholt versucht worden, das antirachitisch wirkende Vitamin D aus Naturstoffen zu isolieren. Es ist aber bisher nicht gelungen, das Vitamin D oder ein Derivat davon daraus in kristallisierter Form rein und frei von Vitamin A zu erhalten.Process for separating the antirachitic vitamin from natural substances Attempts have already been made to remove the anti-rachitic vitamin D from To isolate natural substances. But so far it has not been possible to get the vitamin D or a derivative thereof in crystallized form, pure and free from vitamin A. obtain.

Es wurde gefunden, daß man das antirachitische Vitamin aus Naturstof [en in reiner Form dadurch gewinnen kann, daß man aus Naturprodukten gewonnene Vitamin D enthaltende Fraktionen r. einer Entmischung mit einem wasserlöslichen und einem wasserunlöslichen Lösemittel, a. einer chrom.atographischen Adsorption und 3. einer Veresterung mit den üblichen Veresterungsmitteln für das Vitamin D aus Ergosterin, wonach das Veresterungsprodukt in üblicher Weise verseift wird, unterwirft.It has been found that the antirachitic vitamin is made from natural substances [en can be obtained in pure form by using vitamins obtained from natural products D containing fractions r. a segregation with a water-soluble and a water-insoluble solvents, a. a chrom.atographic adsorption and 3. a Esterification with the usual esterification agents for the vitamin D from ergosterol, after which the esterification product is saponified in the usual way, subjects.

Die Reihenfolge und die Anzahl der unter z. bis 3. beschriebenen Maßnahmen ist hierbei beliebig.The order and the number of under z. to 3. measures described is arbitrary here.

Als aus Naturprodukten gewonnene, Vitamin D enthaltende Fraktionen kommen insbesondere die aus Fischlebern oder Fischleberölen gewonnenen Vitaminkonzentrate in Frage.As fractions containing vitamin D obtained from natural products The vitamin concentrates obtained from fish livers or fish liver oils come in particular in question.

Für die Entmischung hat sich als wasserlösliches Lösemittel z. B. Methanol, Äthanol und Aceton als geeignet erwiesen. Als wasserunlösliches Lösemittel kommt beispielsweise Benzin und Ligroin in Frage. Als besonders geeignet hat sich eine Entmischung mittels Methanol und Benzin erwiesen. Die Entmischung wird zweckmäßig in Gegenwart von Wasser durchgeführt.For the demixing has been used as a water-soluble solvent z. B. Methanol, ethanol and acetone have been found suitable. As a water-insoluble solvent For example, gasoline and ligroin can be used. Has proven to be particularly suitable demixing by means of methanol and gasoline has been proven. The segregation is expedient carried out in the presence of water.

Vorteilhafterweise nimmt man die Entmischung so vor, daß man das in dem wasserunlöslichen Lösemittel gelöste und zu entmdschende Produkt mit dem wasserlöslichen und wasserhaltigen Lösemittel ausschüttelt. Die Frage, in welcher Phase sich das gesuchte Vitamin D befindet, wird durch den Tierversuch oder durch physikalische Methoden, z. B. Bestimmung,der Ultraviolettabsorption, die für das Vitamin D charakteristisch ist, entschieden.Advantageously, the demixing is carried out in such a way that the in The product dissolved in the water-insoluble solvent and to be dismantled with the water-soluble one and water-based solvents. The question in which phase is this The sought-after vitamin D is found through animal experimentation or physical Methods, e.g. B. Determination of the ultraviolet absorption characteristic of vitamin D. is decided.

Es hat sich gezeigt, daß die Löslichkeit des Vitamins D in der einen oder anderen Phase weitgehend von der bei der Entmischung anwesenden Wassermenge abhängig ist. So geht z. B. beim Ausschütteln einer Lösung des zu entmischenden, Vitamin D enthaltenden Produkts mit go°/oigem Methanol das Vitamin D in den Benzinanteil, während bei einer darauffolgenden Verteilung der aus dem Benzinanteil gewonnenen Trockensubstanz zwischen Benzin und 95°/oigem Methanol sich das Vitamin D hauptsächlich in der Methanolschicht befindet. Man führt das Entmischen zweckmäßig so lange durch, bis sich eine weitere Anreicherung des Vitamins D, die man nach den üblichen Methoden feststellt, nicht mehr erreichen läßt.It has been shown that the solubility of vitamin D in the one or other phase largely depends on the amount of water present during separation is dependent. So goes z. B. when shaking out a solution of the to be separated, Vitamin D containing product with high methanol the vitamin D in the gasoline part, while in a subsequent distribution that obtained from the gasoline component Vitamin D is mainly composed of dry matter between gasoline and 95% methanol located in the methanol layer. The segregation is expediently carried out for as long as until another Enrichment of vitamin D, which one after the usual methods can no longer be achieved.

Für die chromatographische Adsorption#; können als Adsorptionsmittel vorteilhaft die: Oxyde der Erdalkali- und Erdmetalle bzW.#, deren Hydrate verwendet werden. Alumi-' niumoxyd bzw. -hydroxyd hat sich als besonders geeignet erwiesen. Der Adsorption werden zweckmäßig Lösungen des Vitamins D in wasserunlöslichen Lösemitteln, z. B. Benzin, Benzol, Schwefelkohlenstoff oder Gemischen derselben, unterworfen.For chromatographic adsorption #; can act as an adsorbent advantageous the: oxides of the alkaline earth and earth metals or #, whose hydrates are used will. Aluminum oxide or hydroxide has proven to be particularly suitable. The adsorption are expediently solutions of vitamin D in water-insoluble solvents, z. B. gasoline, benzene, carbon disulfide or mixtures thereof, subjected.

Man kann dieAdsorption so leiten, daß entweder in erster Linie die unwirksamen Begleitstoffe oder das Vitamin D adsorbiert werden. Zur Beseitigung der Begleitstoffe durch Adsorption geht man zweckmäßig so vor, daß man eine möglichst .große Menge Lösung des Vitamins D einer Adsorption an eine verhältnismäßig geringe Menge Adsorbens unterwirft. Dieser Verfahrensschritt beruht darauf, daß das Vitamin D und dessen unwirksame Begleitstoffe verschieden fest an dem Adsorbens haften. Will man aus der so vorgereinigten Lösung das Vitamin D adsorbieren, so empfiehlt es sich, das Verhältnis zwischen Menge des Adsörbens und angewandter Lösung etwas größer als bei der Voradsorption zu halten. Die Menge des jeweils anzuwendenden Adsorptionsmittels hängt weitgehend von seiner Adsorptionskraft ab.The adsorption can be directed in such a way that either primarily the ineffective accompanying substances or the vitamin D are adsorbed. For elimination of the accompanying substances by adsorption is expediently done in such a way that one as possible . Large amount of solution of vitamin D an adsorption to a relatively small one Subjects amount of adsorbent. This step is based on the fact that the vitamin D and its ineffective accompanying substances adhere to the adsorbent with different strengths. If you want to adsorb the vitamin D from the pre-cleaned solution, it is recommended the relation between the amount of adsorbent and the applied solution is somewhat to hold larger than with the pre-adsorption. The amount of each to be applied Adsorbent largely depends on its adsorptive power.

Da die Vitamin D führende Schicht des Chromatogramms wegen der Farblosigkeit des Vitamins D nicht ohne weiteres erkannt werden kann, ist man zur Entscheidung ,der Frage, wo sich die das Vitamin D führende Schicht im Chromatogramm befindet, zunächst auf .die üblichen Bestimmungsmethoden für das Vitamin D, z. B. Tierversuch, Ultraviolettabsorption oder kolorimetrische Methoden, angewiesen. Es wurde nun gefunden, daß man sich die Erkennung -der das Vitamin D führenden Schicht im Chromatogramm dadurch erleichtern kann, daß man die Ab- sorption in Gegenwart eines Farbstoffs vornimmt, der in seinen Adsorptionseigenschaften in dem angewendeten Lösemittel dem Vitamin D ähnelt. Als solche Farbstoffe kommen z. B. die in Benzin-Benzol löslichen Vertreter der Sudan-Gruppe, wie Sudan III (Farbstofftabellen von G. Schultz, 1931, erster Band, Nr. 532) in Frage.Since the layer containing vitamin D in the chromatogram cannot be easily recognized because of the colorlessness of vitamin D, the question of where the layer containing vitamin D is located in the chromatogram is first based on the usual methods of determining the vitamin D, e.g. Animal testing, ultraviolet absorption, or colorimetric methods. It has now been found that one can facilitate recognition -the the vitamin D-carrying layer in the chromatogram characterized in that the sorption exhaust performs in the presence of a dye which is similar in its adsorption properties in the applied solvent to the vitamin D. Such dyes come, for. B. the representatives of the Sudan group which are soluble in gasoline-benzene, such as Sudan III (color tables by G. Schultz, 1931, first volume, no. 532) are in question.

Die Elution wird vorteilhaft mittels wasserlöslicher organischer Lösemittel, z. B. Methanol oder Äthanol, gegebenenfalls in Mischung mit wasserunlöslichen Lösemitteln, wie Benzin oder Benzol, vorgenommen. Hierbei kann die Menge des wasserlöslichen Lösemittels im Verhältnis zum wasserunlöslichen Lösemittel verhältnismäßig gering sein. Beispielsweise hat sich das Anwenden von Benzin oder Benzin-Benzol-Lösungen, die o,5 bis 5 °/o Methanol enthalten, -als vorteilhaft erwiesen.The elution is advantageously carried out using water-soluble organic solvents, z. B. methanol or ethanol, optionally mixed with water-insoluble solvents, such as gasoline or benzene. Here, the amount of water-soluble Solvent relatively low in relation to the water-insoluble solvent be. For example, the use of gasoline or gasoline-benzene solutions, which contain 0.5 to 5% methanol have proven advantageous.

`.: Wird bei der Adsorption ein Farbstoff v er-.:*endet, so wird dieser bei der Elution im ,.aggemeinen mit in das Eluat übergehen. Sofern er nicht physiologisch unschädlich ist, ist es dann notwendig, ihn von dein ebenfalls im Eluat anwesenden Vitamin D zu trennen. Man kann beispielsweise so vorgehen, daß man den zusammen mit dem Vitamin D in einem .wasserunlöslichen Lösemittel gelösten Farbstoff chemisch verändert, beispielsweise .in wasserlösliche Form -falls es sich um eine Säure handelt, z. B. durch Überführen in ein Alkatisalz - bringt, worauf dann der so wasserlöslich gemachte Farbstoff durch Extraktion mit Wasser entfernt wird.`.: If a dye is used for adsorption, it will be during the elution in general with the eluate. Unless it is physiological is harmless, it is then necessary to remove it from what is also present in the eluate Separate vitamin D. One can, for example, proceed in such a way that they are together with the vitamin D chemically dissolved in a water-insoluble solvent changed, for example in water-soluble form - if it is an acid, z. B. by converting into an alkali salt - brings, whereupon it is so water-soluble made dye is removed by extraction with water.

Die Veresterung wird mit den üblichen Veresterungsmitteln für das Vitamin D aus Ergosterin,z. B. mit 3, 5-Dinitrobenzoylchlorid oder Cyanursäure, vorgenommen. Bei Verwenden eines Säurechlorids oder -anhydrids wird die Veresterung zweckmäßig in Gegenwart von Pyridin durchgeführt.The esterification is carried out with the usual esterification agents for the Vitamin D from ergosterol, e.g. B. with 3, 5-dinitrobenzoyl chloride or cyanuric acid, performed. When using an acid chloride or anhydride, the esterification expediently carried out in the presence of pyridine.

Sofern bei dieser Veresterung der Ester noch nicht in kristallisierter Form anfällt, kann das Veresterungsprodukt erneut einer chromatographischen Adsorption und Elution unterworfen werden.If the ester is not yet crystallized in this esterification Form is obtained, the esterification product can again undergo chromatographic adsorption and subjected to elution.

Falls vor der Veresterung sich noch kleine Mengen Cholesterin vorfinden, so kann man diese in üblicher Weise, z. B. durch Digitoninfällung oder durch Ausfrieren, entfernen.If there are still small amounts of cholesterol before esterification, so you can do this in the usual way, for. B. by digitonin precipitation or by freezing, remove.

Das Verseifen des reinen Esters des Vitamins D erfolgt in üblicher Weise z. B. mit alkoholischer Kalilauge. Aus dem Verseifungsgemisch wird das freie Vitamin D in für das Vitamin D aus Ergosterin üblicher Weise, z. B mit Äther oder Petroläther oder einem Gemisch beider, ausgezogen. Nach Abdampfen des Extraktionsmittels fällt das Vitamin D als farbloses Öl an. Es zeigt das gleiche Ultraviolettabsorptionsspektrum wie das aus Ergosterin durch Bestrahlen hergestellte Vitamin Dz. Es zeigt, wie das aus Ergosterin hergestellte Vitamin D2, bei 265 m,u ein charakteristisches Absorptionsmaximum. Die Analyse stimmt auf die Formel C"H"0. Im Rattenschutzversuch erweist sich diese Substanz in Tagesdosen von o,o5 y als antirachitisch voll wirksam. Im Hühnchentest erweisen sich Tagesdosen von o,2 y als antirachitisch voll wirksam, während von dem Vitamin D2 aus Ergosterin für die Ausheilung der experimentell erzeugten Rachitis in .diesem Fall 13 y täglich benötigt werden. Während im Rattenversuch beide Vitamine fast gleiche Wirksamkeit zeigen, erweist sich im Hühnchenversuch das natürliche Vitamin D als rund 65mal wirksamer. Beispiel i 4oo g eines Thunfischleberölkonzentrats, das z. B. nach dem Verfahren gemäß Patent 634 76o gewonnen wird und sich im Rattenversuch zu io y Tagesdosis gegen Rachitis wirksam erweist und in bezug auf Vitamin A einen Reinheitsgrad von 29oo Cod Liver Oil (CLO)-Einheiten besitzt, werden zum Abtrennen des Vitamins A in 8 1 Normalbenzin gelöst und 16mal mit je 2 1 9o0(oigem Methanol ausgeschüttelt. Die Hauptmenge des Vitamins D geht in das Benzin über (Fraktion i), während sich das Vitamin A größtenteils im Methanol (Fraktion 2) befindet.The saponification of the pure ester of vitamin D is carried out in the usual way Way z. B. with alcoholic potassium hydroxide solution. The saponification mixture becomes the free one Vitamin D in the usual manner for vitamin D from ergosterol, e.g. B with ether or Petroleum ether or a mixture of both, extracted. After evaporation of the extractant the vitamin D is obtained as a colorless oil. It shows the same ultraviolet absorption spectrum like the vitamin Dz produced from ergosterol by irradiation. It shows how that Vitamin D2 produced from ergosterol, a characteristic absorption maximum at 265 m, u. The analysis agrees with the formula C "H" 0. This proves itself in the rat protection experiment Substance in daily doses of o, o5 y as fully antirachitic. In the chicken test Daily doses of o, 2 y prove to be fully antirachitic, while from the vitamin D2 from ergosterol for the healing of the experimentally produced rickets in this case 13 y are required daily. While in the rat experiment both vitamins show almost the same effectiveness, the chicken experiment proves the natural Vitamin D as around 65 times more effective. Example i 400 g of a tuna liver oil concentrate, the Z. B. is obtained by the method according to patent 634 76o and is in the rat experiment to io y daily dose proves effective against rickets and with regard to vitamin A one Purity of 29oo Cod Liver Oil (CLO) units are used for separation of vitamin A dissolved in 8 liters of regular gasoline and 16 times with 2 1 9o0 (oigem methanol shaken out. Most of the vitamin D goes into the gasoline (fraction i), while most of the vitamin A is in the methanol (fraction 2).

Nach dem Verdampfen des Benzins aus Fraktion i hinterbleiben 2o2 g eines Öls mit einem Reinheitsgrad in bezug auf Vitamin A von 58o CLO-Einheiten und einer Vitamin-D-Wirksamkeit von 5 y Tagesdosis an der Ratte gemessen. Diese 2o2 g Substanz aus Fraktion i werden zur weiteren Verteilung in 61 Normalbenzin gelöst und i 2mal mit j e 21 9,5%igem Methanol ausgeschüttelt. Die Benzinschicht enthält 76 g Trockensubstanz mit einer Wirksamkeit in bezug auf Vitamin D von 4o y Tagesgabe, an der Ratte gemessen (Fraktion 3).After evaporation of the gasoline from fraction i, 2o2 g remain of an oil with a purity in terms of vitamin A of 58o CLO units and a vitamin D activity of 5 y daily dose measured in the rat. This 2o2 g of the substance from fraction i are dissolved in 61 normal gasoline for further distribution and extracted twice with each 21 9.5% methanol. The gasoline layer contains 76 g dry matter with an effectiveness in relation to vitamin D of 40 y daily dose, measured on the rat (fraction 3).

Die Methanolschicht wird nach Verdünnen mit Wasser auf 5o 0/0 Methanol.gehalt mit Benzin ausgezogen. Die Benzinlösung hinterläßt i2o g Trockensubstanz, die zu 3 y Tagesgabe im Rattenversuch wirksam ist und 5oo CLO-Einheiten enthält (Fraktion 4).The methanol layer becomes after dilution with water to 50% methanol content undressed with gasoline. The gasoline solution leaves behind i2o g of dry matter, which too 3 y daily dose is effective in the rat experiment and contains 500 CLO units (fraction 4).

Statt, wfe im vorstehenden, zur Entmischung Normalbenzin und 9o % Methanol zu verwenden, kann man sich auch mengenmäßig gleicher Mengen von Naphthabenzin und 8o % Methanol oder 70 % Äthanol bedienen.Instead of, wfe in the above, normal gasoline and 90% to separate To use methanol, one can also use equal amounts of naphthabenzine and use 80% methanol or 70% ethanol.

Diese i2o g Substanz aus Fraktion 4 werden in 31 Benzin-Benzol-Gemisch (dieses auch im nachfolgenden noch erwähnte Benzin-Benzol-Gemisch besteht aus 4 Teilen Normalbenzin und einem Teil Benzol) gelöst und in sechs Anteilen einer Adsorption in einer Säule (17 cm Höhe; 5 cm Durchmesser) von Aluminiumoxyd unterworfen. Darauf wird mit insgesamt 7,21 Benzin-Benzol-Gemisch nachgewaschen. Aus den Säulen werden 73 g eines Öls mittels 61 eines Benzin-Benzol-Methanol-Gemischs (2o Teile Benzol, 8o Teile Benzin und 3 Teile Methanol) eluiert (Fraktion 5). Aus dem durch die Säule gelaufenen Filtrat werden nach Verdampfen ides Lösemittels 35 g eines Öls gewonnen (Fraktion 6), dessen Reinheitsgrad in bezug auf Vitamin A 5oo CLO-Einheiten und dessen antirachitische Wirksamkeit i y Tagesgabe an der Ratte beträgt. Für die weitere Verarbeitung wird Fraktion 6 in Anteilen von je io g geteilt, die mit je ioo mg Sudan III in je 6oo ccm Benzin-Benzol-Gemisch gelöst und durch eine Säule von Aluminiumoxyd (Höhe 17 cm; Durchmesser 5,2 cm) filtriert werden. Beim Nachwaschen mit 31 Benzin-Benzol-Gemisch bilden sich 4 Zonen aus: i. Zone = hellgelb, 2. Zone = rosa, 3. Zone = rot, 4. Zone = bräunlichgelb.These i2o g of substance from fraction 4 are in 31 gasoline-benzene mixture (This gasoline-benzene mixture, also mentioned below, consists of 4 Parts of regular gasoline and one part of benzene) and dissolved in six parts of an adsorption in a column (17 cm high; 5 cm diameter) subjected to aluminum oxide. Thereon is washed with a total of 7.21 gasoline-benzene mixture. Become out of the pillars 73 g of an oil by means of a gasoline-benzene-methanol mixture (2o parts benzene, 80 parts of gasoline and 3 parts of methanol) eluted (fraction 5). From the through the pillar The filtrate that has run is obtained after evaporation of the solvent, 35 g of an oil (Fraction 6), its degree of purity in terms of vitamin A 5oo CLO units and whose antirachitic effectiveness is i y daily dose in the rat. For the further Processing fraction 6 is divided into portions of 10 g each, each with 100 mg Sudan III dissolved in 6oo cc each of a gasoline-benzene mixture and passed through a column of aluminum oxide (Height 17 cm; diameter 5.2 cm) can be filtered. When washing with 31 gasoline-benzene mixture 4 zones are formed: i. Zone = light yellow, 2nd zone = pink, 3rd zone = red, 4th zone = brownish yellow.

Aus der dritten, roten Zone lassen sich 3,5 mal 2,9 g gleich io,i g, eines Öls (Fraktion 7) in der oben beschriebenen Weise eluieren. Die antirachitische Wirksamkeit dieses Öls be- trägt/> 4 + T^nA°g gemessen an der Ratte. Je 2,9 g der Fraktion 7 werden in je Zoo ccm Benzin-Benzol-Gemisch gelöst, wobei vom auskristallisierten Sudan III abfiltriert wird. Darauf wird durch eine Säule von Aluminiumoxyd (Höhe 16 cm; Durchmesser 3,3 cm) filtiert. Bei Nachwaschen mit 1,5 1 Benzin-Benzol-Gemisch bilden sich drei Zonen aus: i. Zone =hellgelb bis rosa, 2. Zone = rot, 3. Zone = gelb, Aus der zweiten Zone können 3,5 mal o,9 g, gleich 3,1 g eines Öls (Fraktion 8) in der vorher beschriebenen Weise eluiert werden. Der Reinheitsgrad des Öls in bezug auf Vitamin D beträgt 22 0/0.From the third, red zone, 3.5 times 2.9 g, equal to io, i g, of an oil (fraction 7) can be eluted in the manner described above. The anti-rachitic effectiveness of this oil carries / > 4 + T ^ nA ° g measured on the rat. 2.9 g each of fraction 7 are dissolved in each zoo ccm gasoline-benzene mixture, the crystallized Sudan III being filtered off. It is then filtered through a column of aluminum oxide (height 16 cm; diameter 3.3 cm). When washing with 1.5 1 gasoline-benzene mixture, three zones are formed: i. Zone = light yellow to pink, 2nd zone = red, 3rd zone = yellow, 3.5 times 0.9 g, equal to 3.1 g of an oil (fraction 8) can be eluted from the second zone in the manner described above . The purity of the oil in terms of vitamin D is 22%.

Das vom Lösemittel befreite Öl der Fraktion 8 wird zum Entfernen des noch beigemengten Farbstoffs mit etwa 1 1 Benzin aufgenommen und so lange mit 2o%iger methylalkoholischer Kalilauge durchgeschüttelt, bis die Benzinschicht frei von Farbstoff ist.The freed from the solvent oil of fraction 8 is used to remove the added dye with about 1 liter of gasoline and so long with 20% methyl alcoholic potassium hydroxide solution shaken until the gasoline layer is free of dye is.

Das nach dem Verdampfen des Benzins zurückbleibende Öl löst man in wenig Methanol, aus dem sich beim Erkalten Cholesterin abscheidet. Die letzte Spur Cholesterin wird aus dem Filtrat in an sich bekannter Weise mit Digitonin gefällt. Das zur Trockne verdampfte Filtrat vom Di:gitoninniederschlag wird erschöpfend mit heißem Benzin ausgezogen. Die Benzinschicht hinterläßt beim Verdampfen des Lösemittels die cholesterinfreie Fraktion 9 mit einem Reinheitsgrad von 27 0/0 in bezu:g auf Vitamin D.The oil that remains after the gasoline has evaporated is dissolved in little methanol, from which cholesterol is deposited when it cools. The last trace Cholesterol is precipitated from the filtrate in a manner known per se with digitonin. The filtrate from the digitonin precipitate, which has evaporated to dryness, is exhausted with it stripped of hot gasoline. The gasoline layer leaves behind when the solvent evaporates the cholesterol-free fraction 9 with a degree of purity of 27 0/0 in relation to: g Vitamin D.

Die Fraktion 9 (etwa 2 g) wird in 8 ccm reinstem, über Baryt getrocknetem Pyri:din gelöst und mit einer Lösung von 2,3 g reinem 3, 5-Dinitrobenzoylchlorid in 6 ccm Pyridin versetzt. Nach kurzem Erwärmen auf dem Wasserbad wird das Reaktionsgemisch zwei Tage bei 2o° C. unter Kohlensäure aufbewahrt. Zur Aufarbeitung wird-in°-Natriumbicarbonatlösung gegossen finit 43elzol durchgeschüttelt. Die zuer, -nit Bäcarbouat- Lösung und dann mit verdünnter Essig- oder Oxalsäure und zuletzt mit Wasser gewaschene Benzollösung hinterläßt beim Verdampfen ein 01, das in 140 ccm Benzin-Benzol-Gemisch gelöst wird, wobei von einem geringen schmierigen Rückstand abgetrennt wird.Fraction 9 (about 2 g) is dissolved in 8 cc of the purest pyridine dried over barite, and a solution of 2.3 g of pure 3,5-dinitrobenzoyl chloride in 6 cc of pyridine is added. After briefly warming up on the water bath, the reaction mixture is stored under carbonic acid at 20 ° C. for two days. For work-up, sodium bicarbonate solution is poured into ° sodium bicarbonate solution and shaken finitely 43elzol. The zuer, -nit Bäcarbouat- Solution and then with dilute acetic or oxalic acid and finally benzene solution washed with water leaves an oil on evaporation, which is dissolved in 140 cc of gasoline-benzene mixture, which is separated from a small, greasy residue.

Beim Filtrieren durch eine Säule von Aluminiumoxyd (Höhe 16 cm; Durchmesser 2,1 cm) und Nachwaschen mit dem Lösemittel bilden sich 4. Zonen aus. Das in der oben beschriebenen Weise gewonnene Eluat der untersten Zone hat einen Reinheitsgral in bezug auf Vitamin D von 40 °[o. Die aus dem Eluat gewonnene Trockensubstanz wird mittels einer Aceton-Methanol-Lösung zur Kristallisation gestellt. Die über Nacht ausgeschiedenen Kristalle werden mit leicht siedendem Petroläther ausgewaschen und das kristalline Rohprodukt aus Benzolmethanol oder Acetonmethanol umkristallisiert. Es bildet gelbe, büschlig vereinigte Prismen vom F. 128 bis 129' C. Die Analyse stimmt auf die Summenformel C34 H46 06 N... Spezifische Drehung [a]D = ioo°. Die Substanz ist schwer löslich in Methanol und leicht löslich in siedendem Petroläther, gut löslich in Chloroform, Benzol und Aceton.When filtering through a column of aluminum oxide (height 16 cm; diameter 2.1 cm) and washing with the solvent, 4th zones are formed. That in the The eluate of the lowest zone obtained in the manner described above has a grail of purity in relation to vitamin D of 40 ° [o. The dry matter obtained from the eluate becomes made to crystallize by means of an acetone-methanol solution. The overnight Precipitated crystals are washed out with low-boiling petroleum ether and the crystalline crude product recrystallized from benzene methanol or acetone methanol. It forms yellow, bundled prisms from F. 128 to 129 ° C. The analysis corresponds to the empirical formula C34 H46 06 N ... Specific rotation [a] D = ioo °. the Substance is sparingly soluble in methanol and easily soluble in boiling petroleum ether, easily soluble in chloroform, benzene and acetone.

Zur Freilegung des Vitamins D wird dieses Kristallisat mit methylalkoholischer Kalilauge versetzt. Nach dem Verdünnen des Verseifungsgemischs mit Wasser wird mit einem Äther-Petroläther-Gemisch ausgezogen. Der in üblicher Weise gewaschene und getrocknete Petrolätherauszug liefert nach Verdampfen des Lösemittels das reine natürliche Vitamin D. Beispiel 2 26o g eines aus Heilbuttlebern nach ,dem Verfahren des Patents 63476o gewonnenen Konzentrats werden zur Abtrennung des Vitamins A in 41 Normalbenzin gelöst und 16mal mit je iooo ccm goo%oigem Methanol ausgeschüttelt. Die Hauptmenge des Vitamins D geht in das Benzin über (Fraktion i), während sich das Vitamin A größtenteils im Methanol (,Fraktion 2) befindet.To expose vitamin D, this crystallizate is mixed with methyl alcohol Potash added. After diluting the saponification mixture with water, it becomes with an ether-petroleum ether mixture. The one washed in the usual way and dried petroleum ether extract provides the pure after evaporation of the solvent natural vitamin D. Example 2 26o g of halibut liver according to the process of the patent 63476o obtained concentrate are used to separate vitamin A in 41 normal gasoline dissolved and extracted 16 times with 10000 ccm of goo% methanol each time. The main amount of vitamin D goes into the gasoline (fraction i), while Most of the vitamin A is in methanol (, fraction 2).

Nach dem Verdampfen des Benzins aus Fraktion i hinterbleiben 117 g eines Öls, von einem Reinheitsgrad in bezug auf Vitamin A von 700 CL O-Einheiten.After evaporation of the gasoline from fraction i, 117 g of an oil remain, with a degree of purity in relation to vitamin A of 700 CL O units.

Je 58,5 g der Fraktion i werden in je i5oo ccm Normalbenzin gelöst und 12mal mit je 5oo ccm 95o/6igem Methanol ausgeschüttelt. Nach Verdünnen der Methanolschicht mit Wasser auf einen Wassergehalt von etwa 5o 6/6 wird mit frischem Benzin ausgeschüttelt, wobei das Vitamin D in 1 die Benzinschicht übergeht. Die aus den Benzinlösungen erhaltenen Fraktionen 3 werden nach Einengen auf je 4oo ccm zur Verringerung des Vitamin -A-Gehalts nochmals 5mal mit je Zoo ccm 95o/oigem Methanol durchgeschüttelt. Nach Verdünnen der Methanolschicht mit Wasser und Ausziehen mit Benzin werden aus der Benzinschicht je 2o g (insgesamt 40 g) einer Substanz (Fraktion 4.) gewonnen, die eine D-Wirksamkeit von 6oo Internationalen Einheiten (I. E.) im Milligramm und eine A-Wirksamkeit von 400 CLO-Einheiten aufweisen.58.5 g each of fraction i are dissolved in each 500 cc of normal gasoline and extracted 12 times with 5oo ccm 95o / 6igem methanol each time. After diluting the methanol layer with water to a water content of about 5o 6/6 is shaken out with fresh gasoline, where the vitamin D in 1 passes over the gasoline layer. The ones from the gasoline solutions obtained fractions 3 are concentrated to 4oo ccm to reduce the Vitamin A content shaken 5 times with each zoo ccm 95% methanol. After diluting the methanol layer with water and drawing off with gasoline, the 2o g (total 40 g) of a substance (fraction 4.) obtained from the gasoline layer, which have a D potency of 600 international units (I.E.) in milligrams and have an A potency of 400 CLO units.

:27 g der Fraktion 4. werden alsdann der Voradsorption unterworfen. Sie werden mit Zoo mg Sudan III (Schultz, Farbstofftabellen, 7. Auflage, Bd. i, 1933, S. 217) in 6oo ccm .des im Beispiel i erwähnten Benzol-Benzin-Gemischs gelöst und durch eine Säule von Aluminiumoxyd (Höhe 17 cm; Durchinesser 5 cm) filtriert, worauf mit 2 1 Lösemittel nachgewaschen wird.: 27 g of fraction 4 are then subjected to pre-adsorption. They are dissolved with Zoo mg Sudan III (Schultz, Farbstofftabellen, 7th edition, vol. I, 1933, p. 217) in 600 ccm of the benzene-gasoline mixture mentioned in example i and passed through a column of aluminum oxide (height 17 cm; diameter 5 cm) filtered, whereupon it is washed with 2 liters of solvent.

Aus der Säule wird eluiert 8,5 g Öl (Fraktion 5).8.5 g of oil (fraction 5) are eluted from the column.

Aus dem Filtrat wird gewonnen 16,7 g 01 (Fraktion 6).16.7 g of 01 (fraction 6) are obtained from the filtrate.

Zur Chromatographierung wird die Fraktion 6 in 2 Teile geteilt. 7,5 g der Fraktion 6 in 5oo ccm des Benzin-Benzol-Gemischs gelöst, läßt man durch eine Säule von Aluminiumoxyd (Höhe 17 cm; Durchmesser 5,2 cm) filtrieren. Durch Nachwaschen mit i5oo ccm Lösemittel wird das Chromatogramm entwickelt, wobei sich 4 Zonen ausbilden: i. Zone enthält 2,4 g Öl D = 300 IE im Milligramm.Fraction 6 is divided into 2 parts for chromatography. 7.5 g of fraction 6, dissolved in 500 cc of the gasoline-benzene mixture, are filtered through a column of aluminum oxide (height 17 cm; diameter 5.2 cm). The chromatogram is developed by rewashing with 1500 cc of solvent, whereby 4 zones are formed: i. Zone contains 2.4 g of oil D = 300 IU per milligram.

2. Zone rot enthält 2,9 g Öl D = 240o IE im Milligramm. Fraktion 7.2. Zone red contains 2.9 g of oil D = 240o IU in the milligram. Group 7.

3. Zone enthält 0,4 g 01 D = 700 IE im Milligramm.3rd zone contains 0.4 g 01 D = 700 IU in the milligram.

Zone enthält 2,2 g 01 D = io IE im Milligramm.Zone contains 2.2 g 01 D = io IU in the milligram.

Es werden insgesamt 5,8 g der Fraktion 7 erhalten. Diese werden in 4oo ccm des Benzin-Benzol-Gemischs gelöst und nochmals durch eine Säule von Aluminiumoxyd (Höhe 16 cm; Durchmesser 5 cm) filtriert, worauf mit .4 1 Lösemittel nachgewaschen wird. Es bilden sich 3 Zonen aus: i. Zone enthält 2,75 g Öl D = 300 IE im Milligramm.A total of 5.8 g of fraction 7 are obtained. These are dissolved in 400 ccm of the gasoline-benzene mixture and filtered again through a column of aluminum oxide (height 16 cm; diameter 5 cm), whereupon it is washed with .4 liters of solvent. 3 zones are formed: i. Zone contains 2.75 g of oil D = 300 IU per milligram.

2. Zone enthält 2,85 g 01 D 5ooo IE im Milligramm (Fraktion 8).2. Zone contains 2.85 g 01 D 5,000 IU in the milligram (fraction 8).

3. Zone enthält 0,3 g 01 D = 6ooo IE im Milligramm (Fraktion 9).3. Zone contains 0.3 g 01 D = 6,000 IU in the milligram (fraction 9).

Aus der Fraktion 8 wurde zunächst der Indikatorfarbstoff entfernt und dann die Hauptmenge der Sterine durch Ausfrieren, der Rest mit Digitonin abgetrennt. Der im Vergleich zu Fraktion 8 höhere Vitamingehalt der Fraktion erklärt sich durch die geringe Beimengung von Sterinen. Fraktion 8 und Fraktion 9 wurden in der früher beschriebenen Weise mit frisch destilliertem 3, 5-Dinitrobenzoylchlorid in Pyridin verestert.The indicator dye was first removed from fraction 8 and then the bulk of the sterols by freezing, the rest separated with digitonin. The higher vitamin content of the fraction compared to fraction 8 is explained by the small addition of sterols. Faction 8 and Faction 9 were in the earlier described way with freshly distilled 3, 5-dinitrobenzoyl chloride esterified in pyridine.

Eine Lösung von 1,8 g Rohester der Fraktion 8 in i 5o ccin Benzol-Benzin i : 4 wurde durch eine Säule von Aluminiumoxyd (Höhe 16 cm; Durchmesser 3,5 cm) filtriert und mit 4.oo ccm Lösemittel nachgewaschen. Es bildeten sich 4 Zonen aus, deren D-Vitamingehalt kolorimetrisch ermittelt wurde. In Übereinstimmung mit den Befunden am Thunfischleberöl enthielten die ersten beiden Zonen nur wenig Vitamin D, die Hauptmenge befand sich in der 4. Zone. Das aus dieser Zone erhaltene Öl konnte aus seiner Lösung in Aceton durch vorsichtigen Zusatz von Methanol zur Kristallisation ,gebracht werden.A solution of 1.8 g of crude ester of fraction 8 in 15occ benzene-gasoline i: 4 was passed through a column of aluminum oxide (height 16 cm; diameter 3.5 cm) filtered and washed with 400 cc solvent. 4 zones formed whose D vitamin content was determined colorimetrically. In accordance with the Findings on tuna liver oil contained only a small amount of vitamins in the first two zones D, the main crowd was in the 4th zone. The oil obtained from this zone could from its solution in acetone by carefully adding methanol for crystallization ,to be brought.

Um das Rohkristallisat der 4. Zone, das nach der kolorimetischen Bestimmung nahezu rein war, auf Einheitlichkeit zu prüfen, wurde es aus Aceton-Methanol umkristallisiert. Der zuerst auskristallisierende Anteil wird als Fraktion io, der durch Einengen der Mutterlauge erhaltene Teil als Fraktion i i bezeichnet. Durch starkes Einengen der Mutterlauge von Fraktion i i wird ein kleiner Teil der eingesetzten Menge als schlecht kristallisierende 3. Fraktion erhalten.To the raw crystals of the 4th zone, which according to the colorimetric determination was nearly pure, to check for uniformity, it was recrystallized from acetone-methanol. The portion that crystallizes out first is called fraction io, that by concentration the part obtained from the mother liquor is referred to as fraction i i. By severe constriction the mother liquor from fraction i i is a small part of the amount used as poorly crystallizing 3rd fraction obtained.

Fraktion io schmilzt bei 1a4°. Es sind büschIig vereinigte Nädelchen, die sich bei mikroskopischer Betrachtung als verunreinigt mit geringen Mengen einer in farblosen Nädelchen kristallisierenden Substanz erweisen. Beim Digerieren der Fraktion io mit leicht siedendem Petroläther bleibt die Hauptmenge dieser Begleitsubstanz zurück, während der Vitaminester in Lösung geht. Der farblose Rückstand (Schmelzpunkt 183°) ist vielleicht der Ester eines höheren Alkohols. Die Petrolätherlösung des Vitaminesters wird verdampft und der Rückstand aus Aceton-Methanol umkristallisiert. Schmelzpunkt 126°. Nach nochmaligem Umkristallisieren aus verdünntem Aceton liegt der Schmelzpunkt bei 1-28 bis 129°. Ein Gemisch mit 3, 5-Dinitrobenzoat des Vitamins D aus Thunfischleberöl (Schmelzpunkt 128 bis 129') sowie ein Gemisch mit einem Dinitrobenzoat von Vitamin D3 (Schmelzpunkt 129°) aus 7-Dehydrocholesterin zeigt keine Schmelzpunktdepression.Fraction io melts at 1a4 °. They are tufted needles, which, when viewed microscopically, are contaminated with small amounts of a crystallizing substance turn out to be in colorless needles. When digesting the Fraction io with low-boiling petroleum ether remains the main amount of this accompanying substance back while the vitamin ester goes into solution. The colorless residue (melting point 183 °) is perhaps the ester of a higher alcohol. The petroleum ether solution of Vitamin ester is evaporated and the residue is recrystallized from acetone-methanol. Melting point 126 °. After repeated recrystallization from dilute acetone lies the melting point at 1-28 to 129 °. A mixture with 3,5-dinitrobenzoate of the vitamin D from tuna liver oil (melting point 128 to 129 ') and a mixture with a dinitrobenzoate of vitamin D3 (melting point 129 °) from 7-dehydrocholesterol shows no melting point depression.

DieAnalysetrifftaufdie Formel Cs4H46 0o N.., zu. [a];,° = 98,6 (-I- 2°) in Chloroform. Fraktion i i schmilzt bei 124°. Nach dem Urnkristallisieren aus Aceton-Methanol werden büschlig vereinigte gelbe Nädelchen von Schmelzpunkt 128 bis 129° erhalten. Nochinaliges Umkristallisieren aus Aceton erhöht den Schmelzpunkt auf 129°. Gemischt mit Fraktion i o oder mit 3, 5-Dinitrobenzoat des Vitamins D3 tritt keine Schmelzpunkt.depression auf. Beispiel 3 98g eines Vitaminkonzentrats, das durch Verseifen des Leberöls eines Bluefin-Thune in üblicher Weise gewonnen wurde, werden zur 'Abtrennung von Vitamin A in 2 1 Normalbenzin gelöst und 16mal mit je 500 ccm 9oo/oigen Methanols ausgeschüttelt. Aus der Benzinschicht gewinnt man .durch Abdampfen des Lösemittels 50,3 g eines Öls, das in bezug auf Vitamin D einen Reinheitsgrad von Zoo Internationalen Einheiten (IE) und in bezug auf Vitamin A einen solchen von 8o CLO-Einheiten besitzen (Fraktion i).The analysis applies to the formula Cs4H46 0o N ... [a] ;, ° = 98.6 (-I- 2 °) in chloroform. Fraction ii melts at 124 °. After crystallization from acetone-methanol, small combined yellow needles with a melting point of 128 ° to 129 ° are obtained. Further recrystallization from acetone increases the melting point to 129 °. When mixed with fraction io or with 3,5-dinitrobenzoate of vitamin D3, there is no depression of the melting point. EXAMPLE 3 98 g of a vitamin concentrate obtained by saponifying the liver oil of a bluefin tuna in the usual way are dissolved in 2 liters of normal gasoline to separate off vitamin A and shaken out 16 times with 500 cc of 900% methanol each time. By evaporation of the solvent, 50.3 g of an oil are obtained from the gasoline layer, the purity of which is Zoo International Units (IU) for vitamin D and 80 CLO units for vitamin A (fraction i) .

Zur Vereinfachung des Arbeitsverfahrens wird unter Verzicht auf eine nochmalige Verteilung zwischen Normalbenzin und 95°/oigem Methanol die Fraktion i zusammen mit 9oo Milligramm Indikatorrot 33 in 625 ccm eines Benzol-Benzin-Gemisches (i : 4) gelöst und die Lösung an Aluminiumhydroxyd, wie in den vorherigen Beispielen beschrieben, adsorbiert. Beim Nachwaschen mit 1500 ccm Lösemittel bilden sich .I Zonen aus: i. Zone = rotbraun, 2. Zone = rot, 3. Zone = braun, Zone = hellgelb.In order to simplify the working process, the fraction i is dissolved together with 900 milligrams of indicator red 33 in 625 ccm of a benzene-gasoline mixture (i: 4) and the solution is aluminum hydroxide, such as described in the previous examples, adsorbed. When washing with 1500 cc of solvent, .I zones form: i. Zone = red-brown, 2nd zone = red, 3rd zone = brown, zone = light yellow.

Aus der 2. Zone werden 11,2 g eines Öls eluiert, das in bezug auf Vitamin D einen Reinheitsgrad von 8oo I. E. zeigt (Fraktion 2).11.2 g of an oil are eluted from the 2nd zone, which is based on Vitamin D shows a degree of purity of 8oo I.E. (fraction 2).

Der Versuch wird wiederholt und 2o,6 g der Fraktion 2 in 750 ccm des erwähnten Benzol-Benzin-Gemisches gelöst, die Lösung an Aluminiumhydroxyd adsorbiert, worauf das Chromatogramm mit 6 1 Lösemittel nachgewaschen wird. Es bilden sich 3 Zonen aus: i. Zone = hellgelb, 2. Zone = rot, 3. Zone = braungelb.The experiment is repeated and 2o.6 g of fraction 2 are dissolved in 750 cc of the benzene-gasoline mixture mentioned, the solution is adsorbed on aluminum hydroxide, whereupon the chromatogram is washed with 6 l of solvent. 3 zones are formed: i. Zone = light yellow, 2nd zone = red, 3rd zone = brown-yellow.

Aus Zone 2 lassen sich 9,6g eines Öls eluieren [(D) = i 6oo IE; Fraktion 31. Die Fraktion 3 wird zusammen mit 200 Milligramm Indikatorrot 33 in 6oo ccm Benzol-Benzin gelöst und die Lösung erneut an Aluminiumhydroxyd adsorbiert. Es wird mit 3,5 1 Lösemittel nachgewaschen, wobei sich 4 Zonen ausbilden: i. Zone = gelbrot, 2. Zone = rot, 3. Zone = braungelb, Zone = Filtrat hellgelb.9.6 g of an oil can be eluted from zone 2 [(D) = i 600 IU; Fraction 31. Fraction 3 is dissolved together with 200 milligrams of indicator red 33 in 600 cc of benzene-gasoline and the solution is again adsorbed on aluminum hydroxide. It is washed with 3.5 l of solvent, 4 zones being formed: i. Zone = yellow-red, 2nd zone = red, 3rd zone = brown-yellow, zone = filtrate light yellow.

. Aus der 2. Zone werden nach Entfernen des Farbstoffs 3,11 g eines Öls von (D) = 4ooo IE; (Fraktion q.) gewonnen.. 3.11 g of one are obtained from the 2nd zone after the dye has been removed Oils of (D) = 4,000 IU; (Fraction q.) Won.

Aus Zone 3 erhält man o,863 g eines Öls von (D) = 4000 IE (Fraktion 5).From zone 3, 0.863 g of an oil of (D) = 4000 IU (fraction 5).

Aus den Fraktionen .4 und 5 werden, wie in Beispiel i beschrieben, Reste des Farbstoffs und beigemengte Sterine, wie Cholesterin, entfernt, worauf die gereinigten Fraktionen in der in den vorhergehenden Beispielen beschriebenen Weise mit frisch destilliertem 3, 5-Dinitrobenzoylchlörid in Pyrindinlösung verestert werden. Das V eresterunzszemisch wird, wie in Beispiel i beschrieben, aufge beitet und die Esterlösung in einem B Benzin-Gemisch (i : 4) durch eine Säult Aluminiumhydroxyd filtriert. Es entstehi- ei Chromatogramm, aus dessen unterster Zöne ein gelbes 01 eluiert wird. Das 01 wird in !-- aufgenommen. Aus dieser Lösung kristallisiert der Vitaminester in gelben, büschlig vereinigten Nädelchen vom F. P. 125 bis i26° aus. Die Kristalle werden noch zweimal aus verdünntem Aceton umkristallisiert. Dabei steigt der Schmelzpunkt auf 128 bis z29°. Im Gemisch mit dem 3, 5-Dinitrobenzoesäureester des Vitamins D3, der ebenfalls aus verdünntem Aceton umkristallisiert wurde, tritt keine Schmelzpunkterniedrigung ein.As described in Example i, residues of the dye and added sterols such as cholesterol are removed from fractions .4 and 5, whereupon the purified fractions are esterified in the manner described in the preceding examples with freshly distilled 3,5-dinitrobenzoylchloride in pyrindine solution will. The V eresterunzszemisch is, as described in example i, up and the ester solution in a B Gasoline mixture (i: 4) through a column Aluminum hydroxide filtered. It arises Chromatogram from the bottom zone of which a yellow 01 is eluted. The 01 is in !-- recorded. From this In solution, the vitamin ester crystallizes out in yellow, büschlig unified needles from FP 125 to i26 °. The crystals are recrystallized twice more from dilute acetone. The melting point rises to 128 to z29 °. When mixed with the 3,5-dinitrobenzoic acid ester of vitamin D3, which was also recrystallized from dilute acetone, no lowering of the melting point occurs.

Die spezifische Drehung des neuen Produktes beträgt [a]2' =-f- 98,3° (-I- i°) in Chloroform. Der 3, 5-Dinitrobenzoesäureester des Vitamins D, aus 7-Dehydrocholesterin zeigt eine spezifische Drehung von: [a]2 =-E- 97,4° (-I- i,7°). Nach derElementaranalyse kommt dem neuen Produkt die Summenformel: C34 H, 0, N3 zu.The specific rotation of the new product is [a] 2 '= -f- 98.3 ° (-I- i °) in chloroform. The 3,5-dinitrobenzoic acid ester of vitamin D, from 7-dehydrocholesterol shows a specific rotation of: [a] 2 = -E- 97.4 ° (-I- i, 7 °). After the elementary analysis, the new product has the empirical formula: C34 H, 0, N3.

Claims

PATENT CLAIMS: i. Process for separating the antirachitic vitamin from natural substances, characterized in that fractions containing vitamin D obtained from natural substances are firstly separated from a water-soluble and a water-insoluble solvent, secondly by chromatographic adsorption and thirdly by esterification with the esterifying agents customary for vitamin D from ergosterol, after which the esterification product is saponified in the customary manner is subject, the order and the number of the measures mentioned being arbitrary.

2. The method according to claim i, characterized in that the demixing is carried out in the presence of water.

3. Process according to Claims z and 2, characterized in that the adsorption with the help of oxides of alkaline earth and earth metals or their hydrates.

4. Process according to Claims i to 3, characterized in that the adsorption performs in the presence of a dye; in the solvent used in his Adsorption properties are similar to that of vitamin D.

5. The method according to claims i to 4, characterized in that as obtained from natural products, containing vitamin D. Fractions are the vitamin concentrates obtained from fish livers or fish liver oils used «to earth.