DE600630C

DE600630C - Method for obtaining and determining the effectiveness of a pigment cell hormone occurring in the pituitary gland

Info

Publication number: DE600630C
Application number: DEZ19875D
Authority: DE
Inventors: Dr Hans Krohn
Original assignee: BERNHARD ZONDEK DR
Current assignee: BERNHARD ZONDEK DR
Priority date: 1932-01-14
Filing date: 1932-01-14
Publication date: 1934-07-27

Description

Verfahren zur Gewinnung und Bestimmung der Wirksamkeit eines in der Hypophyse vorkommenden Pigmentzellenhormons Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Wirkungswerts eines in der Hypophyse neu aufgefundenen Pigmentzellenhormons sowie ein darauf gegründetes Verfahren zur Gewinnung dieses spezifischen Hormons aus der Hypophyse. Wie sich gezeigt hat, enthält die Hypophyse außer den bereits bekannten Hormonen, nämlich dem sog. Wachstumshormon nach E v a n s, dem übergeordneten Sexualhormon nach A s c h -h e i m und B. Z o n d e k, dem Oxytocin und Vasopressin noch ein Hormon, welches sich dadurch auszeichnet, daß es erweiternd auf die Pigmentzellen gewisser Tiere zu wirken vermag. Es wurde nämlich gefunden, daß dieses im nachfolgenden kurz als Pigmentzellenhormon bezeichnete, in der Hypophyse enthaltene Hormon bei Fischen aus der Familie der Karpfen, insbesondere bei der Elritze (phoxinus laevis), aber auch beim Bitterling, der jedoch viel schwächer, undeutlicher und nicht so spezifisch reagiert wie die Elritze, eine Erweiterung der roten Farbstoffzellen, der sogenannten Erythrophoren, verursacht, derart, daß % bis i Stunde nach der Injektion eine sehr augenfällige helle, purpurrote Verfärbung an den Ansatzstellen der Bauch-, Rücken- und Afterflossen auftritt, wie sie bei diesem Fisch sonst nur zur Laichzeit als sog. Hochzeitskleid zu beobachten ist.Process for obtaining and determining the effectiveness of one in the Pituitary pigment cell hormone. The invention relates to a method to determine the effect value of a pigment cell hormone newly found in the pituitary gland as well as a process based on it for the extraction of this specific hormone from the pituitary gland. As has been shown, the pituitary gland contains besides those already known hormones, namely the so-called growth hormone according to E v a n s, the parent Sex hormone according to A s c h e i m and B. Z o n d e k, oxytocin and vasopressin another hormone, which is characterized by the fact that it extends to the pigment cells of certain animals. Namely, it was found that this in the following briefly referred to as pigment cell hormone, hormone contained in the pituitary gland Fish from the carp family, especially minnow (phoxinus laevis), but also with bitterling, which, however, is much weaker, more indistinct and not so specifically reacts like the minnow, an extension of the red dye cells, the so-called erythrophores, so that% up to 1 hour after the injection a very noticeable bright, purple-red discoloration at the attachment points of the abdominal, Dorsal and anal fins occurs, as they otherwise only occur in this fish at spawning time can be observed as a so-called wedding dress.

Man kann hiernach als eine Phoxinuseinheit (i PE) diejenige geringste Hormonmenge bezeichnen, die imstande ist, 1/2 bis i Stunde nach der Zufuhr an der Ansatzstelle der Bauch-, Rücken- und Afterflossen der Elritze eine mindestens linsengroße, ausgesprochen purpurrote Färbung zu verursachen.According to this, one can call it a Phoxinus unit (i PE) the smallest Denote the amount of hormones that is capable of 1/2 to i hour after feeding at the The attachment point of the ventral, dorsal and anal fins of the minnow is at least the size of a lens, to cause pronounced purple coloring.

An Hand dieses neuen Testverfahrens gelingt es, das Pigmentzellenhormon aus der Hypophyse von Menschen und Tieren zu gewinnen. Man kann sich dafür gemäß der Erfindung der für die Hormongewinnung üblichen Methoden bedienen, indem man die Anreicherung der hergestellten Fraktionen an dem neuen Hormon mittels des angegebenen Tests feststellt und die es enthaltenden Fraktionen allein weiterbehandelt.With the help of this new test method it is possible to determine the pigment cell hormone from the pituitary gland of humans and animals. One can choose for it according to use the invention of the usual methods for obtaining hormones by the enrichment of the fractions produced in the new hormone by means of the specified Tests and the fractions containing it are treated further.

Wie sich durch die Prüfung mit Hilfe des angegebenen Testobjekts weiterhin gezeigt hat, kommt das neue Hormon nicht nur im -Zwischen- und Hinterlappen, sondern auch im Vorderlappen der Hypophyse vor. Zwar erfolgt die Produktion dieses Hormons offenbar nur im Zwischenlappen, jedoch verbreitet sich das Hormon mittels Diffusion von dort durch die ganze Hypophyse. Da der Vorderlappen rund 7mal soviel wiegt wie der Hinterlappen, und etwa 8omal soviel wie der Zwischenlappen, so sind im Vorderlappen die besten Ausbreitungsmöglichkeiten gegeben. Wenn daher auch die Menge des in der Gewichtseinheit des Hypophysengewebes enthaltenen Hormons im Zwischen- oder Mittellappen bei weitem am größten ist, ist doch die im ganzen Vorderlappen enthaltene Menge wesentlich größer als diejenige im Mittellappen. So hats.ichbeispielsweise er,-eben, daßvon ein und derselben Hypophyse der Vorderlappen 4ooo PE, der Mittellappen 6oo PE und der Hinterlappen 25oo PE des neuen Hormons enthielt.How to continue through the test with the help of the specified test object has shown that the new hormone does not only come from the intermediate and posterior lobes, but also in the anterior lobe of the pituitary gland. It is true that this hormone is produced apparently only in the intermediate lobe, but widespread the hormone by means of diffusion from there through the whole pituitary gland. Since the anterior lobe around 7 times weighs as much as the posterior lobe and about eight times as much as the intermediate lobe, thus the best possibilities for spreading are given in the anterior lobe. If therefore also the amount of hormone contained in the unit of weight of the pituitary tissue is by far the largest in the intermediate or middle lobe, it is on the whole The amount contained in the anterior lobe is much greater than that in the middle lobe. So For example, he has that of one and the same pituitary gland of the anterior lobe 4ooo PE, the middle lobe 6oo PE and the rear lobe 25oo PE of the new hormone contained.

Die Feststellung des reichlichen Vorkommens des Pigmentzellenhormons im Vorderlappen ist deswegen von Bedeutung, weil der Vorderlappen nur wenig Oxytocin und Vasopressin enthält und daher die Gewinnung des neuen Hormons aus dem Vorderlappen am leichtesten gelingt. Die Abtrennung des im Vorderlappen enthaltenen Pigmentzellenhormons von dem übergeordneten Sexualhormon ist dadurch leicht möglich, daß ersteres wesentlich andere chemische Eigenschaften besitzt als letzteres.Establishing the abundance of pigment cell hormone in the anterior lobe is important because the anterior lobe has little oxytocin and contains vasopressin and therefore the extraction of the new hormone from the anterior lobe the easiest way to do it. The separation of the pigment cell hormone contained in the anterior lobe of the superordinate sex hormone it is easily possible that the former is essential has different chemical properties than the latter.

Es ist aber auch gelungen, das neue Hormon von dem Oxytocin und Vasopressin aus dem Hinterlappen zu trennen und so Extrakte zu gewinnen, die reichliche Mengen des neuen Hormons, aber keine oder nur geringe Mengen von Vasopressin und Oxytocin enthalten.But it also succeeded in the new hormone of the oxytocin and vasopressin separate from the rear lobe and thus obtain extracts that are copious amounts of the new hormone, but little or no vasopressin and oxytocin contain.

Die Trennung des, neuen Hormons von den Begleitsubstanzen und den im betreffenden Teil der Hypophyse mit enthaltenen anderen Hormonen gelingt auf Grund der im nachfolgenden angegebenen besonderen chemischen Eigenschaften des neuen Hormons. Es ist kochbeständig und verträgt Behandlung mit Säuren gut. Es ist in einigen organischen Lösungsmitteln, wie Äther, Aceton und Essigester, unlöslich, in einigen anderen, wie Chloroform und Benzol, schwer löslich, in Äthyl-und Methylalkohol besser löslich, hingegen unlöslich in Propyl- und Butylalkohol.The separation of the, new hormone from the accompanying substances and the in the relevant part of the pituitary gland with contained other hormones succeeds on Reason for the special chemical properties of the new one specified below Hormone. It is boil-proof and tolerates treatment with acids well. It is in insoluble in some organic solvents such as ether, acetone and ethyl acetate, sparingly soluble in some others, such as chloroform and benzene, in ethyl and methyl alcohol more soluble, but insoluble in propyl and butyl alcohol.

Unter Benutzung dieser besonderen chemischen Eigenschaften des neuen Hormons gelingt seine Gewinnung insbesondere in der Weise, daß aus der zerkleinerten Hypophysenmasse durch Auskochen mit Säuren, wie verdünnter Essigsäure, zunächst eine eiweißhaltige Lösung hergestellt wird, die im nachfolgenden als Stammlösung bezeichnet wird (z g Hypophysentrockenpulver - 30 ccm Stammlösung).Using these special chemical properties of the new hormone, its extraction succeeds in particular in such a way that a protein-containing solution is first produced from the crushed pituitary mass by boiling with acids such as dilute acetic acid, which is referred to below as the stock solution (e.g. dry pituitary powder - 30 ccm stock solution).

Diese Stammlösung kann dann in irgendeiner bekannten Weise, z. B. durch Behandeln mit Sulfosalicylsäure,Trichloressigsäure,Ammoniumsulfat, durch Adsorption mittels Kieselgur, Kaolin, Kohle o. dgl., Fällung mittels löslicher oder unlöslicher Schwermetallsalze, unlöslicher Hydrate, wie Ferrihydroxyd, Aluminiumhydroxyd o. dgl., sowie durch Dialyse vom Eiweiß befreit werden. Das eiweißfreie Filtrat enthält dann das neue Pigmentzellenhormon.This stock solution can then be used in any known manner, e.g. B. by treatment with sulfosalicylic acid, trichloroacetic acid, ammonium sulfate, by adsorption by means of kieselguhr, kaolin, coal or the like, precipitation by means of soluble or insoluble Heavy metal salts, insoluble hydrates such as ferric hydroxide, aluminum hydroxide, etc. Like., And be freed from protein by dialysis. The protein-free filtrate contains then the new pigment cell hormone.

Geht man bei dieser Herstellung vom Hypophysenvorderlappen aus, so enthält das Filtrat im wesentlichen nur dieses Hormon neben verhältnismäßig geringen Mengen von Vasopressin und Oxytocin, da das ursprünglich im Vorderlappen noch enthalten gewesene übergeordnete Sexualhormon durch den vorangegangenen Kochprozeß bereits zerstört worden ist.If one proceeds from the anterior pituitary lobe in this production, then the filtrate contains essentially only this hormone in addition to a relatively small amount Amounts of vasopressin and oxytocin, as originally contained in the anterior lobe already been the superordinate sex hormone through the previous cooking process has been destroyed.

Geht man hingegen für die Gewinnung des neuen Hormons vom Zwischen- und Hinterlappen bzw. von der ganzen Hypophyse aus, so enthält die vom Eiweiß befreite Lösung noch reichliche Menge Oxytocin und Vasopressin, deren Entfernung durch besondere Behandlung in der weiterhin angegebenen Weise vorgenommen werden kann.If, on the other hand, one goes for the production of the new hormone from the intermediate and the posterior lobe, or from the whole pituitary gland, then contains that which has been freed from protein Solution still copious amount of oxytocin and vasopressin, their removal by special Treatment can be carried out in the manner indicated below.

Da das neue Pigmentzellenhormon in Alkohol leichter löslich ist als Oxytocin und Vasopressin, so kann man durch Alkoholextraktion eine erhebliche Anreicherung an dem neuen Hormon gegenüber Oxytocin und Vasopressin erzielen. Da ferner das im Vorderlappen enthaltene übergeordnete Sexualhormon in Alkohol unlöslich ist, so läßt sich eine Trennung desselben von dem Pigmentzellenhormon auch durch Ausziehen der aus der Stammlösung zu gewinnenden Trockensubstanz mit absolutem Alkohol erreichen.Because the new pigment cell hormone is more soluble in alcohol than Oxytocin and vasopressin can be enriched considerably by alcohol extraction on the new hormone against oxytocin and vasopressin. Furthermore, since the im Anterior lobe contained parent sex hormone is insoluble in alcohol, so it can also be separated from the pigment cell hormone by pulling out the dry substance to be obtained from the stock solution with absolute alcohol.

Aus den gleichen Gründen ist es auch möglich, das neue Pigmentzellenhormon unmittelbar durch Extraktion der Drüsen mit Alkohol ohne vorhergehende Herstellung einer Stammlösung zu gewinnen.For the same reasons, it is also possible to use the new pigment cell hormone directly by extracting the glands with alcohol without prior preparation to win a stock solution.

1?ine weitere Reinigung des Pigmentzellenhormons von Vasopressin und Oxytocin gelingt durch das Entmischungsverfahren mit organischen Lösungsmitteln, wie beispielsweise durch Versetzen der alkoholischen Lösung mit Essigester und Wasser. Von den sich hierbei bildenden zwei Schichten enthält.die wäßrige die größere Menge des neuen Hormons, während die andere die größere Menge des Oxytocins und Vasopressins, in Alkoholessigester gelöst, enthält. Auch durch Behandeln mit z- bis 2°/oiger Natronlauge ist eine solche Reinigung möglich, da Oxytocin und Vasopressin im Gegensatz zu dem neuen Pigmentzellenhormon dabei vollständig zerstört werden.1? Ine further purification of the pigment cell hormone from vasopressin and Oxytocin is achieved through the separation process with organic solvents, for example by adding ethyl acetate and water to the alcoholic solution. Of the two layers formed in this process, the aqueous contains the larger amount of the new hormone, while the other the larger amount of oxytocin and vasopressin, dissolved in alcohol acetic ester, contains. Also by treatment with 2% to 2% sodium hydroxide solution Such cleaning is possible because oxytocin and vasopressin in contrast to that new pigment cell hormone are completely destroyed in the process.

Schließlich läßt sich eine Reinigung und Anreicherung des neuen Hormons auch noch dadurch erzielen, daß man konzentrierte wäßrige Lösungen, welche es enthalten, in siedendes Aceton gießt, worin dieses Hormon unlöslich ist, während viele Begleitsubstanzen, wie Lipoide u. dgl., darin löslich sind. Das neue Hormon scheidet sich bei der Abkühlung des Acetons als Bodensatz aus.Finally, a cleansing and enrichment of the new hormone can be achieved can also be achieved by using concentrated aqueous Solutions, which contain it, pour into boiling acetone, in which this hormone is insoluble, while many accompanying substances such as lipids and the like are soluble therein. The new When the acetone cools, the hormone is deposited as a sediment.

Wie die Untersuchungen ergeben haben, besitzt das neue Hormon auch therapeutische Bedeutung, insbesondere gegenüber Stoffwechselstörungen der Hypophyse. Ausführungsbeispiele i. Nach Entnahme aus dem Körper wird die Hypophyse in Aceton gelegt und nach 2-.stündigem Liegen in den Vorderlappen einerseits, den Zwischen- und Hinterlappen andererseits geteilt. Die Massen werden dann zerkleinert, mehrere Tage mehrmals mit Aceton gewaschen und hierauf getrocknet. Das so erhaltene Hypophysenpulver wird nun mit 1/,1 %oiger Essigsäure mehrmals, z. B. dreimal, jedesmal etwa 5 bis io Minuten, ausgekocht. Man erhält so aus ioo g der Trockensubstanz des Hypophysenvorderlappens 3000 ccm Stammlösung.As the studies have shown, the new hormone is also of therapeutic importance, in particular against metabolic disorders of the pituitary gland. Embodiments i. After removal from the body, the pituitary gland is placed in acetone and, after lying for 2 hours, is divided into the anterior lobes on the one hand and the intermediate and posterior lobes on the other. The masses are then crushed, washed several times with acetone for several days and then dried. The pituitary powder obtained in this way is then treated with 1 /, 1% acetic acid several times, e.g. B. three times, each time about 5 to 10 minutes, boiled. In this way, 3000 cc of stock solution is obtained from 100 g of the dry substance of the anterior pituitary lobe.

Die Stammlösung wird zur Trockne eingedampft und der Trockenrückstand mit 300 ccm absolutem Alkohol extrahiert. Aus dem Extrakt wird der Alkohol abgedampft. Der Rückstand wird in ioo ccm Wasser aufgenommen. Er enthält das neue Hormon, das so in etwa 2o- bis 4o°/oiger Ausbeute gewonnen wird.The stock solution is evaporated to dryness and the dry residue is extracted with 300 cc of absolute alcohol. The alcohol is evaporated from the extract. The residue is taken up in 100 cc of water. It contains the new hormone, which is obtained in about 20 to 40 per cent yield.

Statt den Alkohol durch Abda-inpfen zu entfernen, kann man die gegebenenfalls eingeengte alkoholische Lösung auch in die etwa 20fache Menge siedenden Acetons gießen. Es entsteht dann beim Abkühlen ein feiner Niederschlag, der in Wasser gelöst wird und das neue Hormon enthält.Instead of removing the alcohol by inoculation, you can optionally concentrated alcoholic solution in about 20 times the amount of boiling acetone to water. A fine precipitate is then formed on cooling, which is dissolved in water and contains the new hormone.

Will man die Stammlösung zunächst vom Eiweiß befreien, so kann man ioo ccm davon mit so viel 2o°%iger Sulfosalicylsäure oder konzentrierter Trichloressigsäure oder konzentriertem Ammoniumsulfat versetzen, bis eine Eiweißflockung nicht mehr auftritt. Nach mehrstündigem Stehen erfolgt dann Filtration und Neutralisation, bis die Lösung beim Kochen schwach sauer reagiert.If you want to remove the protein from the stock solution first, you can 100 cc of it with as much 20% sulfosalicylic acid or concentrated trichloroacetic acid or concentrated ammonium sulphate until a protein flocculation no longer occurs occurs. After standing for several hours, filtration and neutralization take place, until the solution reacts slightly acidic when boiled.

2. Die gemäß Beispiel i erhaltene Stammlösung wird auf % ihres Volumens eingeengt und in die io- bis 20fache Menge kochenden Acetons gegossen. Es entsteht eine weißgelbliche, ziemlich grobflockige Fällung, die mehrmals mit Wasser ausgekocht wird. Die filtrierte Lösung enthält dann das neue Hormon in entsprechender Ausbeute wie gemäß Beispiel i.2. The stock solution obtained according to Example i is reduced to% of its volume concentrated and poured into 10 to 20 times the amount of boiling acetone. It arises a whitish-yellowish, rather coarse flaky precipitate that has been boiled several times with water will. The filtered solution then contains the new hormone in a corresponding yield as in example i.

3. Geht man vom Zwischen- bzw. Hinterlappen aus, so erfolgt die Bereitung der Stammlösung in der bei Beispiel i angegebenen.Weise, nur mit dem Unterschied, daß man sich hier eine Stammlösung herstellt, bei welcher o,i bis o,2 g Trockensubstanz auf 30 ccm der Stammlösung kommen. Diese Stammlösung ist wesentlich eiweißärmer als diejenige aus dem Vorderlappen, da nur 1/1o bis 1/5 der in jenem Falle verwandten Drüsenmenge benutzt wird. Beim Auskochen dieser Stammlösung mit Alkohol in der im Beispiel i angegebenen Weise, Abdampfen des Extrakts zur Trockne und mehrmaligen Auskochen des Trockenrückstandes mit Wasser erhält man eine Lösung, die pro ccm 300 PE des neuen Hormons enthält und frei ist von Oxytocin, Vasopressin u. dgl. Man kann zur Trennung des neuen Hormons vom Oxytocin und Vasopressin aber die alkoholische Lösung noch auf ein kleines Volumen (2- bis io ccm) einengen, mit der dreifachen Menge Essigester versetzen und dann 1/3 des Gesamtvolumens Wasser hinzufügen. Beim Schütteln findet dann Entmischung statt, und die wäßrige Schicht, welche das neue Hormon enthält, wird abgelassen, während der zurückbleibende Alkoholessigester die übrigen Hormone enthält.3. If one starts from the intermediate or rear lobe, the stock solution is prepared in the manner indicated in example i, with the only difference that a stock solution is produced here in which o, i to o, 2 g Dry matter come to 30 ccm of the stock solution. This stock solution is considerably poorer in protein than that from the anterior lobe, since only 1/10 to 1/5 of the amount of glands used in that case is used. When boiling this stock solution with alcohol in the manner indicated in Example i, evaporating the extract to dryness and boiling the dry residue several times with water, a solution is obtained which contains 300 PU of the new hormone per ccm and is free of oxytocin, vasopressin and the like To separate the new hormone from oxytocin and vasopressin, the alcoholic solution can be reduced to a small volume (2 to 10 ccm), three times the amount of ethyl acetate and then 1/3 of the total volume of water. When shaken, segregation then takes place, and the aqueous layer containing the new hormone is drained off, while the remaining alcohol acetic ester contains the remaining hormones.

Claims

PATENT CLAIMS: i. Procedure for determining the effect value of Preparations of a pigment cell hormone found in the pituitary gland, thereby characterized in that as a test reaction the expansion of the erythrophores in fish from the carp family, especially the minnow (phoxinus laeo is) will.

2. Process for obtaining a pigment cell hormone found in the pituitary gland, characterized in that the pituitary gland of humans or animals is used for hormone production conventional methods treated, the accumulation of the pigment cell hormone means of the test according to claim i and the fractions containing the hormone can be used on their own.

3. The method according to claim 2, characterized in that that the anterior pituitary gland is destroyed with the destruction of the non-heat-resistant sex hormones with water, optionally in the presence of acids such as acetic acid, which boils out Solution, if necessary, freed from the protein in a known manner and from the obtained Hormone mixture dissolves the pigment cell hormone with alcohol, whereupon you may the alcoholic extract obtained after adding water by shaking with Ethyl acetate further cleans. q ..

Method according to claims 2 and 3, characterized in that the optionally freed from protein solution or the alcoholic extract obtained therefrom is precipitated with acetone.

5. Procedure according to Claim z, characterized in that the starting material used is the pituitary middle lobe Used alone or together with the anterior or posterior lobes, or both.